TW202237822A - 腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申請關於一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的方法，其包括：使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。本申請還關於一種使用本申請的腫瘤浸潤淋巴細胞預防和/或治療腫瘤的方法。
Description
本申請關於生物醫藥領域，具體的關於一種腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法及其用途。
使用過繼性自體轉移腫瘤浸潤淋巴細胞治療腫瘤是一種治療預後不良患者的有效方法。但是過繼性自體轉移腫瘤浸潤淋巴細胞治療腫瘤需要大量的腫瘤浸潤淋巴細胞，而且目前來自患者腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞的擴增能力弱，細胞功能不強。因此如何提供一種穩健可靠的腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法是亟待解決的問題。
本申請提供了一種腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法，該培養方法具有選自以下組的一種或多種的效果：TIL細胞的數量增加，TIL細胞的分泌能力提高，TIL細胞的殺傷能力提高，TIL細胞的比例改變，中心記憶
T細胞比例增加，調節性T細胞的比例降低，活化T細胞比例增加，腫瘤特異性T細胞比例增加，和幹細胞樣T細胞比例增加。
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，該經擴增的TIL為經過體外擴增的TIL。
在一種實施方式中，該經擴增的TIL為使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少一個階段的體外擴增後獲得的TIL。
在一種實施方式中，與該源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL相比，該經擴增的TIL的數量增加至少1倍。
在一種實施方式中，其中該經擴增的TIL經該共培養後數量增加至至少50倍。
在一種實施方式中，其中該經擴增的TIL經該共培養後數量增加至約50-20000倍。
另一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少一個階段的體外擴增，其中在單個體外擴增階段中，使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，在第一個階段的體外擴增中，使該未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少兩個階段的體外擴增，且在第二個階段的體外擴增中，使經體外擴增TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，使該源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過第一階段體外擴增和第二階段體外擴增，且在該第二階段體外擴增中，使該TIL與該飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，該第一階段體外擴增進行至少約7天。
在一種實施方式中，該第一階段體外擴增進行約7天至約14天。
在一種實施方式中，該第二階段體外擴增進行至少約7天。
在一種實施方式中，該第二階段體外擴增進行約7天至約14天。
在一種實施方式中，與在單個體外擴增階段中使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸同時與飼養細胞共培養相比，在單個體外擴增階段中使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養提高TIL的擴增效果和/或顯示出改善的TIL特性。
在一種實施方式中，該改善的TIL特性包含選自以下組的一種或多種：增加的TIL細胞數量，增加的活細胞比例，增加的存續能力，改善的T細胞亞群比例，提高的細胞因子分泌能力，提高的腫瘤細胞殺傷
能力，提高的T細胞受體(TCR)選殖多樣性和提高的組織和/或腫瘤中TIL細胞數量。
在一種實施方式中，該提高TIL的擴增效果包括選自以下組的一種或多種：增加TIL細胞的數量，改變TIL細胞的比例，提高TIL細胞的分泌能力，和提高TIL細胞的殺傷能力。
在一種實施方式中，該改變TIL細胞的比例包括選自以下組的一種或多種：增加TIL中中心記憶T細胞比例，降低調節性T細胞的比例，增加活化T細胞比例，增加腫瘤特異性T細胞比例，和增加幹細胞樣T細胞比例。
在一種實施方式中，該一定時間為至少約2小時。
在一種實施方式中，該一定時間為約6到72小時。
在一種實施方式中，該一定時間為約12到48小時。
在一種實施方式中，該一定時間為約6、12、24、48或72小時。
在一種實施方式中，使該TIL在與該T細胞激活劑和/或該T細胞生長因子接觸約12小時或更多時間之後與該飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，使該TIL在與該T細胞激活劑和/或該T細胞生長因子接觸約12小時、約24小時、約48小時或約72小時之後與該飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，該T細胞共刺激分子選自以下組的一種或多種：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、特異性結合CD3的抗體、特異性結合CD28的抗體、特
異性結合HVEM的抗體、特異性結合CD40L的抗體、特異性結合OX40的抗體和特異性結合4-1BB的抗體。例如，T細胞共刺激分子選自以下組的一種或多種：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配體(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它們的功能活性片段。例如，T細胞共刺激分子選自以下組的一種或多種靶點的激動劑：CD3、CD28、皰疹病毒進入介質(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
在一種實施方式中，該T細胞激活劑包含CD3激動劑和/或CD28激動劑。
在一種實施方式中，該T細胞激活劑包含CD3激動劑。
在一種實施方式中，該T細胞激活劑包含抗CD3的抗體和/或其抗原結合片段。
在一種實施方式中，該T細胞激活劑包含CD28激動劑。
在一種實施方式中，該T細胞激活劑包含抗CD28的抗體和/或其抗原結合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一種實施方式中，該T細胞共刺激分子為特異性結合CD3的抗體。
在一種實施方式中，使一種該T細胞共刺激分子、或多種T細胞共刺激分子的每一種與該TIL單獨接觸。
在一種實施方式中，使多種該T細胞共刺激分子與該TIL同時接觸。
在一種實施方式中，分別單獨加入一種該T細胞共刺激分子、或多種T細胞共刺激分子的每一種到該TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，同時加入多種該T細胞共刺激分子到該TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，一種該T細胞共刺激分子以以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞共刺激分子的工程化細胞，包含該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和包含該T細胞共刺激分子的聚合物。
在一種實施方式中，多種該T細胞共刺激分子以選自以下組的形式加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞共刺激分子的工程化細胞，包含多種該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和包含多種該T細胞共刺激分子的聚合物。
在一種實施方式中，該T細胞生長因子選自以下組的一種或多種：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干擾素。
在一種實施方式中，該T細胞生長因子選自以下組的一種或多種：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干擾素。
在一種實施方式中，該T細胞生長因子為IL-2和/或其功能活性片段。
在一種實施方式中，每一種該T細胞生長因子在該TIL的細胞培養基中的初始濃度各自獨立地為至少約300IU/mL。
在一種實施方式中，該IL-2在該TIL的細胞培養基中的初始濃度為至少1000IU/mL。
在一種實施方式中，使一種該T細胞生長因子、或多種T細胞生長因子的每一種與該TIL單獨接觸。
在一種實施方式中，使多種該T細胞生長因子與該TIL同時接觸。
在一種實施方式中，分別單獨加入一種該T細胞生長因子、或多種T細胞生長因子的每一種到該TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，同時加入多種該T細胞生長因子到該TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，一種該T細胞生長因子以選自以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞生長因子的工程化細胞，包含該T細胞生長因子的奈米顆粒，和包含該T細胞生長因子的聚合物。
在一種實施方式中，多種該T細胞生長因子以選自以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞生長因子的工程化細胞，包含多種該T細胞生長因子的奈米顆粒，和包含多種該T細胞生長因子的聚合物。
在一種實施方式中，該TIL為源自腫瘤組織的碎片的TIL和/或源自冷凍保存後復蘇的TIL。在一種實施方式中，該TIL為源自該腫瘤組織的碎片的TIL。
在一種實施方式中，該碎片的體積約為1-27立方毫米。
在一種實施方式中，該碎片的體積約為27立方毫米。
在一種實施方式中，該飼養細胞包括抗原呈遞細胞。
在一種實施方式中，該飼養細胞包括選自以下組的一種或多種：外周單個核細胞，樹突狀細胞，和人工抗原呈遞細胞。
在一種實施方式中，該飼養細胞為外周單個核細胞。
在一種實施方式中，該飼養細胞為經過輻照的飼養細胞。
在一種實施方式中，該TIL和飼養細胞共培養包括將該飼養細胞的表面與該TIL的表面相接觸。
在一種實施方式中，該TIL和飼養細胞共培養包括將該飼養細胞加入該TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，以約40：1-約400：1的該飼養細胞與該TIL的比例，將該飼養細胞添加至該TIL的細胞培養基中。
在另一方面，本申請提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該TIL經過本申請所述的方法獲得。
在另一方面，本申請提供一種組成物，其包含本申請所述的TIL。
在另一方面，本申請提供一種醫藥組成物，其包含本申請所述的TIL和/或本申請所述的組成物，以及視需要地藥學上可接受的載體。
在另一方面，本申請提供一種影響腫瘤細胞生長的方法，包括向受試者施用本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物。例如，該影響腫瘤細胞生長的方法可以是體外方法。例如，該影響腫瘤細胞生長的方法可以是離體方法。例如，該影響腫瘤細胞生長的方法可以是非診斷且非治療目的方法。例如，該影響腫瘤細胞生長的方法可以是非治療目的方法。例如，該影響腫瘤細胞生長的方法可以是非診斷目的方法。
在另一方面，本申請提供一種本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物在製備藥物中的應用，該藥物用於預防和/或治療腫瘤。
在一種實施方式中，該腫瘤選自實體瘤。
在一種實施方式中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
在另一方面，本申請提供一種預防和/或治療腫瘤的方法，包括向受試者施用本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物。
在一種實施方式中，該腫瘤選自實體瘤。
在一種實施方式中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
在另一方面，本申請提供一種本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤。
在另一方面，本申請提供一種本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤，其中，該腫瘤選自實體瘤。
在另一方面，本申請提供一種本申請所述的TIL和/或本申請所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤，其中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是針對供者A-1、A-2、A-3和A-4，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養時，TIL增殖能力對比。
圖2顯示的是針對供者B-1和B-2，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD8+中或CD4+中CD45RA-CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例對比。
圖3顯示的是針對供者B-3、B-4和B-5，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD8+中或CD4+中CD45RA-CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例對比。
圖4顯示的是針對供者C-1和C-2，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例對比。
圖5顯示的是針對供者D-1和D-2，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD8+中或CD4+中PD1+活化T細胞和LAG3+活化T細胞比例對比。
圖6顯示的是針對供者D-3、D-4和D-5，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD8+中CD28+活化T細胞比例對比。
圖7顯示的是針對供者E-1和E-2，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，CD8+中或CD4+中CD103+CD39+腫瘤特異性T細胞比例對比。
圖8顯示的是針對供者F-1和F-2，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL中，TCF1+幹細胞樣T細胞比例對比。
圖9顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞增殖能力結果圖。
圖10顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD45RA-CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例結果圖。
圖11顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的TCF1+幹細胞樣T細胞比例。
圖12顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD4+CD25+ Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例。
圖13顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(PD1+)比例。
圖14顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD103+CD39+腫瘤特異性T細胞比例。
圖15顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(CD28+)比例。
圖16顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(41BB+)比例。
圖17顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(CD25+)比例。
圖18顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的胞內因子表達檢測結果。
圖19顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞因子分泌檢測結果。
圖20顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞增殖能力結果圖。
圖21顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD8+T細胞比例。
圖22顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD45RO+CD62L+T細胞比例。
圖23顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的NK T細胞比例。
圖24顯示的是加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例。
圖25顯示的是加入OKT3和IL-2的48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞殺傷能力結果。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“表達”通常是指編碼目標多肽的基因在細胞內發生的轉錄和/或翻譯過程。可以藉由測量存在於細胞中的相應mRNA的量來確定宿主細胞中編碼目標多肽的基因的轉錄水平。例如，可藉由PCR或藉由RNA雜交對編碼目標多肽的基因轉錄的mRNA進行定量測量(參見Sambrook等，分子選殖：實驗手冊，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))。可以藉由多種方法測量編碼目標多肽的基因的翻譯水平，例如藉由ELISA，藉由多肽生物活性測試，或藉由蛋白質印跡或放射免疫測試法(參見Sambrook等，同上)。
在本申請中，術語“一個階段的體外擴增”、“單個體外擴增階段”、或“第一個階段的體外擴增”等中的“階段”通常是指TIL在體外經過的一段擴增過程。在一種實施方式中，每一個階段之間可以是藉由TIL細胞數量的變化來劃分的，在一種實施方式中，當TIL細胞的數量增加至少約1倍時，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。在一些實施方式中，當TIL細胞的數量增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至
少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、或者至少約50倍時，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。在一種實施方式中，每一個階段之間也可以是藉由TIL細胞培養的條件來劃分的。在一種實施方式中，當細胞培養基中添加了或補充添加了T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。在一種實施方式中，當TIL細胞進行了離心和/或細胞洗滌後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。在一種實施方式中，每一個階段之間也可以是藉由TIL細胞培養的天數來劃分的。在一種實施方式中，當TIL細胞體外培養約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約30天、約40天、約50天或約100天後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。
在本申請中，術語“第一個階段的體外擴增”通常是指從組織中獲得初級TIL後，使用T細胞生長因子進行擴增的階段。在一種實施方式中，該組織可以是腫瘤組織。在一種實施方式中，該擴增可以是自體或者異體進行的體內擴增，或者可以是體外擴增。該第一階段擴增也可以稱為preREP(快速擴增前)階段。
在本申請中，術語“第二個階段的體外擴增”通常是指從受試者體內取出的組織並進行擴增後，再次進行擴增的階段。在一種實施方式
中，與經第一階段擴增的TIL相比，該經第二階段擴增的TIL細胞數量增加，例如可以增加至少約10倍(或至少約20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一種實施方式中細胞的數量可以增加至少約100倍。在一種實施方式中，第二階段擴增可以與第一階段擴增的培養條件不同，例如加入的培養物質可以不同。該第二階段擴增也可以稱為REP(快速擴增)階段。
在本申請中，術語“體內”通常是指發生在受試者體內的事件。
在本申請中，術語“體外”通常是指在受試者體外發生的事件。
在本申請中，術語“離體”通常是指關於對已從受試者體內移除的細胞、組織和/或器官進行治療或進行手術的事件。在一種實施方式中，該細胞、組織和/或器官可以藉由手術或治療方法返回到受試者的身體。
在本申請中，術語“分泌”通常是指細胞將表達的多肽或蛋白轉移到細胞外環境。
在本申請中，術語“分泌能力”通常是指細胞表達多肽或蛋白並將該多肽或蛋白轉移到細胞外環境的能力。
在本申請中，術語“輻照”通常是指藉由射線對物質進行的處理。例如，在一種實施方式中，輻照可以是指藉由X射線、α射線、β射線或γ射線對物質進行輻照。
在本申請中，術語“工程化細胞”通常是指將DNA或RNA形式的額外遺傳物質加入細胞的總遺傳物質而被基因修飾的細胞。在一種實
施方式中，工程化細胞可以經過基因修飾以表達根據本申請的T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子的TIL。
在本申請中，術語“共培養”通常是指將兩個或更多個不同群體的細胞在它們之間有一定程度的接觸的情況下培養。該兩個或更多個不同群體的細胞的“接觸”，在一種實施方式中可以藉由直接接觸，即其中一個群體的細胞與另一個群體的細胞直接物理接觸。或者在一種實施方式中可以藉由共用培養基所介導的間接接觸。該共用的培養基可以含有由共培養細胞的至少一個群體所產生和釋放的代謝產物，並用於培養另一個群體的細胞。
在本申請中，術語“接觸”通常是指兩個或更多個不同類型的物質以任何順序、任何方式以及任何時長接觸在一起。在一種實施方式中可以藉由直接接觸，例如可以將一種飼養細胞、T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子加入TIL細胞的培養基，在一種實施方式中可以藉由間接接觸，例如可以將飼養細胞產生和釋放的代謝產物，用於培養TIL細胞。
在本申請中，術語“混合物”通常是指兩個或更多個不同物質的組合。
在本申請中，術語“同時接觸”、“共同接觸”、“與...接觸同時”、“同時”和“共同”通常是指向受試者施用兩種以上物質，使得物質同時存在於受試者和/或受試者培養的環境中。同時接觸可以包括以不同的組成物同時施用、以不同的組成物在不同時間施用，或以其中存在兩種以上活性藥物成分的組成物施用。
在本申請中，術語“擴增”通常是指在一段時間內細胞的數量增加若干倍。在一種實施方式中細胞的數量可以增加至少約3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，在一種實施方式中細胞的數量可以增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一種實施方式中細胞的數量可以增加至少約100倍。在本申請中，術語“經擴增”通常是指該細胞經過上述一種或多種擴增。
在本申請中，術語“聚合物”通常是指由連接在一起的單獨化學部分組成的分子，該部分可相同或不同。在一種實施方式中，術語“聚合物”可以指尾尾相連而形成線性分子的單獨化學部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)結構形式連接在一起的單獨化學部分。在一種實施方式中聚合物可以包括例如水凝膠、聚乙二醇、或泊洛沙姆。泊洛沙姆是非離子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈，側連兩條聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈。本申請包含的物質可以與本文所描述的或本領域已知的任何聚合物一起配製，或與它們一起給予。
在本申請中，術語“抗體”通常是指對指定蛋白質或肽或其片段有反應性的免疫球蛋白。此類抗體包括但不限於人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、單特異性抗體、多株抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變型抗體、嫁接偶聯抗體(即偶聯或融合至其它蛋白質、放射性標記物、細胞毒素的抗體)、和體外生成的抗體。抗體可來自任何類的抗體，包括但不限於IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE，及來自任何亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗體。抗體可具有選自例如IgG1、IgG2、
IgG3、或IgG4的重鏈恆定區。抗體還可具有選自例如卡帕(κ)或拉姆達(λ)的輕鏈。該抗體可衍生自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、家兔、雞、和牛。抗體的恆定區可進行改變，例如突變，以修飾抗體的特性(例如以提高或降低下述一項或多項：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基的數目、效應器細胞功能、或補體功能)。通常，抗體特異性結合預定抗原，例如與病症有關的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神經變性性的、代謝的、和/或惡性的病症。
在本申請中，術語“抗CD3抗體”通常是指靶向CD3的抗體或其變體，例如單株抗體，包括人、人源化、嵌合或鼠抗體，其針對成熟T細胞的T細胞抗原受體中的CD3受體。抗CD3抗體可以包括OKT-3。抗CD3抗體還可以包括其他抗CD3抗體包括例如在一種實施方式中奧昔珠單抗(otelixizumab)、特利珠單抗(teplizumab)和維昔利珠單抗(visilizumab)。
在本申請中，術語“IL-2”或“IL2”通常是指稱為白細胞介素2的T細胞生長因子，並包括所有形式的IL-2，可以包括在一種實施方式中人和哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖型修飾或變體，或其活性片段。編碼IL2基因的GeneID可以為3558。
在本申請中，術語“抗原呈遞細胞”、“抗原遞呈細胞”、或“APC”通常是指，在其表面上展示與主要組織相容性複合物(MHC)複合的外源抗原的免疫系統細胞，如輔助細胞(例如，B細胞、樹突細胞等)。T細胞可以使用其T細胞受體(TCR)識別這些複合物。APC可以加工抗原並將
其遞呈至T細胞。在一種實施方式中，抗原呈遞細胞可以包括選自以下組：外周單個核細胞，樹突狀細胞，和人工抗原呈遞細胞。
在本申請中，術語“TIL特性”通常是指TIL細胞經過本申請培養方法獲得的特性。TIL特性的變化可以包含：增加的TIL細胞數量，增加的活細胞比例，增加的存續能力，改善的T細胞亞群比例，提高的細胞因子分泌能力，提高的腫瘤細胞殺傷能力，提高的T細胞受體(TCR)選殖多樣性和提高的組織和/或腫瘤中TIL細胞數量，或它們的任何組合。本申請的變化可以是提高或者降低。在本申請中，術語“擴增效果”通常是指細胞經過擴增後出現的效果。擴增效果的變化可以包括，細胞的數量和/或比例變化，分泌能力變化，殺傷能力變化或表達能力的變化，或它們的任何組合。該變化可以是提高或者降低。
在本申請中，術語“經擴增”通常是指經過培養以產生細胞的數量的變化，經擴增的細胞也可以產生細胞的數量和/或比例變化，分泌能力變化，殺傷能力變化或表達能力的變化，或它們的任何組合。該變化可以是提高或者降低。
在本申請中，術語“奈米顆粒”通常是指至少一個尺寸小於100nm的微觀顆粒。通常，奈米顆粒具有50nm至500nm(即0.05μm至0.5μm)範圍內的直徑；在生理環境中結構穩定；且可以容納更小的分子(如藥物或其他生物活性劑)，然後可以將該分子遞送至希望的部位。
在本申請中，術語“人工抗原呈遞細胞”通常是指人工構建的用於展示與主要組織相容性複合物(MHC)複合的外源抗原的免疫系統細胞。在一個實施方案中，可以包括分離的人工抗原呈遞細胞(aAPC)，其可
以包含表達HLA-A/B/C(編碼其的基因GeneID可以為3105、3106或3107)、CD64(編碼其的基因GeneID可以為2209)、CD80(編碼其的基因GeneID可以為941)、ICOS-L(編碼其的基因GeneID可以為23308)和CD58(編碼其的基因GeneID可以為965)的細胞，並可以被修飾以表達一種以上共刺激分子，該以上可以包含本數。
在本申請中，術語“融合蛋白”通常是指含有第一多肽或蛋白質或其片段、類似物或衍生物的氨基酸序列和異源多肽或蛋白質(即，不同於第一多肽或蛋白質或其片段、類似物或衍生物的第二多肽或蛋白質或其片段、類似物或衍生物，或者通常不是第一多肽或蛋白質或其片段、類似物或衍生物的一部分)的氨基酸序列的多肽或蛋白質。在某些情形中，融合蛋白可包含與異源蛋白、多肽或肽融合的預防性或治療性藥物。其中，該異源蛋白、多肽或肽可以是或不是不同類型的預防性或治療性藥物。例如，可將具有免疫調節活性的兩種不同蛋白質、多肽或肽融合到一起形成融合蛋白。在某些情形中，與異源蛋白、多肽或蛋白質融合前的初始多肽或蛋白質的活性相比，融合蛋白可以保留或提高了活性。
在本申請中，術語“殺傷能力”通常是指藉由使該細胞接觸有效量的物質從而殺傷靶細胞來實現。在一個實施方案中，該物質可以是TIL細胞。該殺傷可以包括藉由自身或者促進其它細胞或物質的CDC、凋亡、ADCC、和/或吞噬作用，或藉由兩種或更多種這些機制的組合以殺傷細胞。
在本申請中，術語“施用”通常是指藉由本領域已知的任意途徑，將物質遞送給有此需要的受試者。藥用載體和製劑或組成物也是本領
域眾所周知的。給藥途徑可以包括：靜脈內的、肌肉內的、真皮內的、皮下的、透皮的、黏膜的、瘤內的和/或黏膜的。
在本申請中，術語“試劑盒”通常是指一起被包裝在容器、接受器或其它容器中的兩種或更多種組分，其中一種對應於本申請的物質。例如，包含本申請的TIL細胞。
在本申請中，術語“受試者”通常是指細胞或動物，可以是哺乳動物，諸如人、非人靈長類動物(猿、長臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、獼猴)、家畜(狗和貓)、農場動物(家禽如雞和鴨、馬、牛、山羊、綿羊、豬)和實驗動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受試者包括胎兒、新生兒、嬰兒、青少年和成人受試者。受試者包括動物疾病模型，例如腫瘤動物模型，和所屬技術領域具有通常知識者已知的其它動物模型。
在本申請中，術語“試劑盒”通常是指一起被包裝在容器、接受器或其它容器中的兩種或更多種組分，其中一種對應於本申請的物質。例如，包含本申請的TIL細胞。
在本申請中，術語“飼養細胞(feeder)”通常是指體外生長和分泌至少一種因子至培養基並且可以用於支持培養的另一種所關注的細胞的生長的培養細胞。在一種實施方式中，飼養細胞可以包括抗原呈遞細胞。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指識別特異性抗原，但是基本不識別或結合樣品中其它分子的抗體。例如，如果一種抗體可以特異性結合來自一個物種的該特異性抗原，則該抗體還可以特異性結合來自其它的一個或多個物種的該抗原或同源抗原。這種種間反應性本身可以
不會改變抗體作為特異性的分類。在某些情形中，特異性結合至抗原的抗體還可以結合至抗原的不同等位形式。
在本申請中，術語“完整的培養過程”通常是指將細胞從患者體內分離的腫瘤組織中分離開始，經過一次或一次以上的擴增，最終獲得可以施用於受試者的細胞的完整過程。
在本申請中，術語“細胞培養基”通常是指細胞例如哺乳動物細胞在其中生長的營養液。細胞培養基的配製在本領域中是熟知的。典型地，細胞培養基包括緩衝液、鹽、碳水化合物、胺基酸、維生素以及必要的微量元素。細胞培養基可以含有或不含有血清、蛋白陳、和/或蛋白質。細胞培養基可以補充有另外的組分或濃度增加的組分，如胺基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長因子、緩衝液、抗生素、脂質、微量元素等，這取決於有待培養的細胞的要求和/或所希望的細胞培養參數。
在本申請中，術語“藥物製劑”或“醫藥組成物”通常是指一種製備物，該製備物可以允許有效成分的生物活性有效，並且可以不含有對於將會施用該製劑的受試者不可接受地有毒的額外組分。這類製劑是無菌的。“可藥用的”賦形劑(載體、添加物)是可以合理地施用至受試哺乳動物以提供有效劑量的所用有效成分的那些賦形劑。
在本申請中，術語“腫瘤浸潤淋巴細胞”或“TIL”通常是指最初作為白細胞獲得的細胞群，該細胞已經離開受試者的血流並遷移到腫瘤中。TIL可以包括但不限於CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1和Th17CD4+T細胞、天然殺傷細胞、樹突細胞和M1巨噬細胞。TIL可以包括初級TIL和次級TIL。“初級TIL”可以是從受試者組織樣品獲得的那些
TIL細胞，“次級TIL”可以是本申請中已擴增或經擴增的任何TIL細胞群。在一些實施方式中，該腫瘤浸潤淋巴細胞可以是未經分離純化的，或者可以是與腫瘤細胞相互浸潤的。在一種實施方式中，本申請的TIL可以是指TIL細胞群。
在本申請中，“CD4+細胞”通常是指CD4陽性的細胞，例如可以是T細胞。術語“CD4+細胞”，“CD4陽性細胞”可以同義使用。這些細胞可藉由本領域知道的方法來鑑定，例如藉由用螢光標記的針對CD4的抗體對細胞染色和使用螢光激活細胞分選。例如，已有的數據可以證明，CD4+細胞比例的提高可以使得細胞群分泌IFN-γ和/或TNF的能力提高，並可以提高T細胞群的促進腫瘤抑制的效果。例如，請見Tay,R.E.,Richardson,E.K.等人(2020).Cancer Gene Therapy,1-13.但是，本領域缺少一種提高CD4+細胞比例的方法，本申請可以提供一種影響CD4+細胞比例的方法。
在本申請中，“CD8+細胞”通常是指CD8陽性的細胞，例如可以是T細胞。術語“CD8+細胞”，“CD8陽性細胞”可以同義使用。這些細胞可藉由本領域知道的方法來鑑定，例如藉由用螢光標記的針對CD8的抗體對細胞染色和使用螢光激活細胞分選。
在本申請中，術語“中心記憶T細胞”通常是指具有長期記憶性的，並能夠接受抗原再刺激的T細胞。中心記憶T細胞可以具有CD45RA- CCR7+的表型，例如可以是藉由CD45RA-和CCR7+來鑑定中心記憶T細胞。又例如，中心記憶T細胞可以具有CD45RO+CD62L+的表型，例如可以是藉由CD45RO+和CD62L+來鑑定中心記憶T細胞。中心記憶T細胞可以相比普通T細胞具有更強的抗腫瘤生長的能力。
在本申請中，術語“調節性T細胞”通常是指一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群。調節性T細胞可以具有CD4+CD25+Foxp3+的表型，例如可以是藉由CD4+、CD25+和Foxp3+來鑑定調節性T細胞。調節性T細胞可以具有抑制T細胞的抗腫瘤生長的能力。
在本申請中，術語“活化T細胞”通常是指經過活化而可以具有抗腫瘤生長的能力的T細胞。活化T細胞可以具有PD1+、LAG3+或CD28+的表型，例如可以是藉由PD1+、LAG3+或CD28+來鑑定活化T細胞。活化T細胞可以具有抗腫瘤生長的能力。
在本申請中，術語“腫瘤特異性T細胞”通常是指可以特異性抗腫瘤生長的T細胞。腫瘤特異性T細胞可以具有CD103+CD39+的表型，例如可以是藉由CD103+和CD39+來鑑定腫瘤特異性T細胞。腫瘤特異性T細胞可以相比普通T細胞具有更特異性的抗腫瘤生長的能力。
在本申請中，術語“幹細胞樣T細胞”通常是指可以具有自我增殖和/或分化的潛能的一類T細胞。幹細胞樣T細胞可以具有TCF1+的表型，例如可以是藉由TCF1+來鑑定幹細胞樣T細胞。腫瘤特異性T細胞可以相比普通T細胞具有更強和/或更長期的抗腫瘤生長的能力。
在本申請中，術語“NK細胞”也稱為“自然殺傷細胞”，通常是指一種細胞質中具有大顆粒的細胞。NK細胞由骨髓淋巴樣幹細胞發育而成，可以依賴於骨髓或胸腺微環境分化、發育。在本申請中，TIL細胞中的NK細胞的比例可以藉由本申請的方法加以改變。
在本申請中，術語“腫瘤碎片”通常是指從受試者體內取出腫瘤組織後，可以藉由破碎的方法，形成的腫瘤碎片。
在本申請中，術語“組成物”或“醫藥組成物”通常是指至少一種細胞以及至少一種和視需要多於一種的其他藥學上可接受的化學組分如運載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、助懸劑、增稠劑和/或賦形劑的混合物。
在本申請中，術語“藥學上可接受的載體”通常是指不干擾活性成分的生物活性的有效性的一種或多種非毒性材料。這類製劑常規地可以含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載體、以及視需要地其他治療劑。這類藥學上可接受的製劑還可以含有適合於給予人的相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質。可以用於在此所描述的配製品中的其他設想的載體、賦形劑、和/或添加劑可以包括：例如，調味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質、蛋白質賦形劑(如血清白蛋白、明膠、酪蛋白)、成鹽平衡離子(如鈉)等等。適合用於在此所描述的配製品中的這些和另外已知的藥物載體、賦形劑和/或添加劑是本領域中已知的。
在本申請中，術語“T細胞共刺激分子”通常是指與T細胞上的相應結合受體結合的配體，並介導T細胞共刺激反應。共刺激分子可以是有效免疫應答所需的除抗原受體或其配體之外的細胞表面分子。共刺激分子可以包括但不限於MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整聯蛋白、信號淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、NK細胞活化受體、BTLA(編碼其的基因GeneID可以為151888)、Toll配體受體、OX40(編碼其的基因GeneID可以為7293)、CD2(編碼其的基因GeneID可以為914)、CD7(編碼其的基因GeneID可以為924)、CD27(編碼其的基因GeneID可以為939)、CD28(編碼其的基因GeneID可以為940)、CD30(編碼其的基因GeneID可以為943)、CD40(編碼其的基因GeneID可以為
958)、CDS、ICAM-1(編碼其的基因GeneID可以為3383)、LFA-1(CD11a/CD18)(編碼其的基因GeneID可以為3689)、4-1BB(CD137)(編碼其的基因GeneID可以為3604)、B7-H3(編碼其的基因GeneID可以為80381)、ICOS(CD278)(編碼其的基因GeneID可以為29851)、GITR(編碼其的基因GeneID可以為8784)、BAFFR(編碼其的基因GeneID可以為115650)、LIGHT(編碼其的基因GeneID可以為8740)、HVEM(LIGHTR)(編碼其的基因GeneID可以為8764)、KIRDS2、SLAMF7(編碼其的基因GeneID可以為57823)、NKp80(KLRF1)(編碼其的基因GeneID可以為51348)、NKp44(編碼其的基因GeneID可以為9436)、NKp30(編碼其的基因GeneID可以為259197)、NKp46(編碼其的基因GeneID可以為9437)、CD19(編碼其的基因GeneID可以為930)、CD4(編碼其的基因GeneID可以為920)、CD8α(編碼其的基因GeneID可以為925)、CD8β(編碼其的基因GeneID可以為926)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL7Rα(編碼其的基因GeneID可以為)、ITGA4(編碼其的基因GeneID可以為3676)、VLA1(編碼其的基因GeneID可以為3672)、CD49a(編碼其的基因GeneID可以為3672)、IA4(編碼其的基因GeneID可以為3732)、CD49D(編碼其的基因GeneID可以為3676)、ITGA6(編碼其的基因GeneID可以為3655)、VLA-6(編碼其的基因GeneID可以為3655)、CD49f(編碼其的基因GeneID可以為3655)、ITGAD(編碼其的基因GeneID可以為3681)、CD11d(編碼其的基因GeneID可以為3681)、ITGAE(編碼其的基因GeneID可以為3682)、CD103(編碼其的基因GeneID可以為3682)、ITGAL(編碼其的基因GeneID可以為3683)、CD11a(編碼其的基因GeneID可以為3683)、LFA-1(編碼
其的基因GeneID可以為3683)、ITGAM(編碼其的基因GeneID可以為3684)、CD11b(編碼其的基因GeneID可以為3684)、ITGAX(編碼其的基因GeneID可以為3687)、CD11c(編碼其的基因GeneID可以為3687)、ITGB1(編碼其的基因GeneID可以為3688)、CD29(編碼其的基因GeneID可以為3688)、ITGB2(編碼其的基因GeneID可以為3689)、CD18(編碼其的基因GeneID可以為3689)、LFA-1(編碼其的基因GeneID可以為3689)、ITGB7(編碼其的基因GeneID可以為3695)、NKG2D(編碼其的基因GeneID可以為22914)、NKG2C(編碼其的基因GeneID可以為3822)、TNFR2(編碼其的基因GeneID可以為7133)、TRANCE/RANKL(編碼其的基因GeneID可以為8600)、DNAM1(CD226)(編碼其的基因GeneID可以為10666)、SLAMF4(CD244、2B4)(編碼其的基因GeneID可以為51744)、CD84(編碼其的基因GeneID可以為8832)、CD96(Tactile)(編碼其的基因GeneID可以為10225)、CEACAM1(編碼其的基因GeneID可以為634)、CRTAM(編碼其的基因GeneID可以為56253)、Ly9(CD229)(編碼其的基因GeneID可以為4063)、CD160(BY55)(編碼其的基因GeneID可以為11126)、PSGL1(編碼其的基因GeneID可以為6404)、CD100(SEMA4D)(編碼其的基因GeneID可以為10507)、CD69(編碼其的基因GeneID可以為969)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)(編碼其的基因GeneID可以為114836)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)(編碼其的基因GeneID可以為6504)、BLAME(SLAMF8)(編碼其的基因GeneID可以為56833)、SELPLG(CD162)(編碼其的基因GeneID可以為6404)、LTBR(編碼其的基因GeneID可以為4055)、LAT(編碼其的基因GeneID可以為27040)、GADS
(編碼其的基因GeneID可以為9402)、SLP-76(編碼其的基因GeneID可以為3937)、PAG/Cbp(編碼其的基因GeneID可以為55824)、CD19a、和特異性結合CD3的配體、特異性結合CD28的配體、特異性結合HVEM的配體、特異性結合CD40L的配體、特異性結合OX40的配體、和特異性結合4-1BB的配體。共刺激胞內信號傳導結構域指共刺激分子的胞內部分。胞內信號傳導結構域可以包含從中衍生它的分子的完整胞內部分或完整天然胞內信號傳導結構域或其功能性片段。
在本申請中，術語“T細胞生長因子”通常是指引起細胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物。在一種實施方式中，T細胞生長因子可以選自以下組的一種或多種：IL-2(編碼其的基因GeneID可以為3558)、IL-4(編碼其的基因GeneID可以為3565)、IL-7(編碼其的基因GeneID可以為3574)、IL-10(編碼其的基因GeneID可以為3586)、IL-12(編碼其的基因GeneID可以為3592或3593)、IL-15(編碼其的基因GeneID可以為3600)、和γ干擾素(編碼其的基因GeneID可以為3458)。
在本申請中，術語“基本上同時”通常是指接觸過程的一段時間內TIL可以與兩種以上的物質同時接觸，但是可以不限於在整個接觸過程中TIL總是與兩種以上的物質同時接觸。例如，基本上同時可以是指一段時間內TIL可以與至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的兩種以上的物質的每種物質同時接觸。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指任何新的病理性的組織增生。本申請的腫瘤可能是良性的，也可能是惡性的。本申請的腫瘤可能是實體的，也可能是血液的。術語“腫瘤”可以選自以下組的一種或多種：黑
色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
在本申請中，術語“腫瘤組織”通常是指來自對象中的腫瘤，包括對象中的任何實體腫瘤和/或非實體腫瘤的任何組織的樣品。
在本申請中，術語“約”和“大約”通常是指在統計上有意義的數值範圍內。這樣的範圍可以在給定值或範圍的一個數量級內，可以包括在50%內，可以包括在20%內，可以包括在10%內，可以包括在5%內。術語“約”或“大約”所包含的可允許變化取決於所研究的特定系統，並且所屬技術領域具有通常知識者可以容易地理解。術語“以上”、“以下”、“至多”和“至少”可以包括本數。
發明詳述
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法。其中，可以使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：可以使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一段時間之後與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該經擴增的TIL可以為經過體外擴增的TIL。
在一種實施方式中，該經擴增的TIL為使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL可以經過至少一個階段的體外擴增後獲得的TIL。例如，可以經過至少2個階段的體外擴增、可以經過至少3個階段的體外擴增、可以經過至少4個階段的體外擴增、可以經過至少5個階段的體外擴增、可以經過至少6個階段的體外擴增、可以經過至少7個階段的體外擴增、
可以經過至少8個階段的體外擴增、可以經過至少9個階段的體外擴增、或者可以經過至少10個階段的體外擴增。
例如，每一個階段體外擴增之間可以是藉由TIL細胞數量的變化來劃分的，例如，當TIL細胞的數量增加至少約1倍時，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。在一些實施方式中，當TIL細胞的數量增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍、或者至少約1000倍時，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。例如，每一個階段的體外擴增之間也可以是藉由TIL細胞培養的條件的變化來劃分的。例如，當細胞培養基中添加了或補充添加了T細胞激活劑和/或T細胞生長因子後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。例如，本申請中T細胞激活劑可以和T細胞共刺激分子相互替換使用。例如，當細胞培養基中添加了或補充添加了IL-2後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。例如，當細胞培養基中添加了或補充添加了飼養細胞後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。例如，當TIL細胞進行了離心和/或細胞洗滌的操作後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。例如，每一個階段之間也可以是藉由TIL細胞培養的天數來劃分的。例如，當TIL細胞體外培養約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、
約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約30天、約40天、約50天或約100天後，可以認為TIL細胞進入了下一個階段的體外擴增。
例如，該第二階段體外擴增可以進行至少約7天。例如，該第二階段體外擴增可以進行至少約9天。例如，該第二階段體外擴增可以進行至多約14天。例如，該第二階段體外擴增可以進行至多約13天。例如，該第二階段體外擴增可以進行約7天至約14天、約9天至約14天、約7天至約13天或約9天至約13天。例如，本申請的第二階段體外擴增可以進行至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、或至少約14天。例如，本申請的第二階段體外擴增可以進行約9天至約14天，例如，本申請的第二階段體外擴增可以進行約9天至約14天、約10天至約14天、約11天至約14天、約12天至約14天、約13天至約14天、約9天至約13天、約10天至約13天、約11天至約13天、約12天至約13天、約9天至約12天、約10天至約12天、約11天至約12天、或約10天至約11天。例如，本申請的第二階段體外擴增可以認為是REP(rapid expansion protocol)階段。
例如，該第一階段體外擴增可以進行至少約7天。例如，該第一階段體外擴增可以進行約7天至約14天。例如，本申請的第一階段體外擴增可以進行至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、或至少約14天。例如，本申請的第一階段體外擴增可以進行約7天至約14天、約8天至約14天、約9天至約14天、約10天至約14天、約11天至約14天、約12天至約14天、約13天至約14天、約9天至約13天、約10天至約13天、約11天
至約13天、約12天至約13天、約9天至約12天、約10天至約12天、約11天至約12天、或約10天至約11天。例如，本申請的第一階段體外擴增可以認為是preREP階段。
例如，本申請第二階段體外擴增進行的天數可以是從第二階段體外擴增的開始時刻進行計算。例如，第二階段體外擴增開始的當時，可以認為是第二階段體外擴增進行了約0天。例如，第二階段體外擴增開始後進行了約24小時，可以認為是第二階段體外擴增進行了約1天。例如，第二階段體外擴增開始的當天，可以認為是第二階段體外擴增進行了約0天。例如，本申請第二階段體外擴增進行的天數可以是藉由第二階段體外擴增進行的天數進行計算。例如，第二階段體外擴增開始後的第二天，可以認為是第二階段體外擴增進行了約1天。
例如，本申請培養方法可以按照兩步驟劃分方式進行劃分。例如，(A)可以使源自腫瘤組織且未經體外擴增的第一TIL群與T細胞生長因子接觸，其中，經該步驟(A)得到第二TIL群；(B)可以使該第二TIL群在與T細胞激活劑和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，其中，經該步驟(B)得到第三TIL群。例如，該步驟(A)可以進行約7天至約14天。例如，該步驟(B)可以進行約7天至約14天。
例如，本申請培養方法可以按照三步驟劃分方式進行劃分。例如，(A)可以使源自腫瘤組織且未經體外擴增的第一TIL群與T細胞生長因子接觸，其中，經該步驟(A)得到第二TIL群；(B)可以使該第二TIL群與T細胞激活劑和/或T細胞生長因子接觸，其中，經該步驟(B)得到第三TIL群；(C)可以使該第三TIL群與飼養細胞共培養，其中，經該步驟
(C)得到第四TIL群。例如，該步驟(A)可以進行約7天至約14天。例如，該步驟(B)可以進行約0天至約8天。例如，該步驟(C)可以進行約5天至約14天。
例如，本申請培養方法可以按照四步驟劃分方式進行劃分。例如，(A)可以使源自腫瘤組織且未經體外擴增的第一TIL群與T細胞生長因子接觸，其中，經該步驟(A)得到第二TIL群；(B)可以使該第二TIL群與T細胞激活劑和/或T細胞生長因子接觸，其中，經該步驟(B)得到第三TIL群；(C)可以使該第三TIL群的視需要的基因的表達提高或降低和/或活性增強或減弱，其中，經該步驟(C)得到第四TIL群；(D)可以使該第四TIL群與飼養細胞共培養，其中，經該步驟(D)得到第五TIL群。例如，該步驟(A)可以進行約7天至約14天。例如，該步驟(B)可以進行約0天至約4天。例如，該步驟(C)可以進行約0天至約4天。例如，該步驟(D)可以進行約5天至約14天。
例如，本申請的改善的TIL特性包含選自以下組的一種或多種：增加的TIL細胞數量，增加的活細胞比例，增加的存續能力，改善的T細胞亞群比例，提高的細胞因子分泌能力，提高的腫瘤細胞殺傷能力，提高的T細胞受體(TCR)選殖多樣性和提高的組織和/或腫瘤中TIL細胞數量。
在一種實施方式中，可以使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，可以使經擴增的TIL在與T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，可以使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸之
後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，可以使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與至少一部分飼養細胞共培養。例如，一部分飼養細胞與經擴增的TIL共培養可以是在經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸的同時，至少另一部分的飼養細胞與經擴增的TIL共培養是在經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後。例如至少另一部分的飼養細胞可以包含全部所用飼養細胞的約100%、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、或約0.1%。
在一種實施方式中，該經擴增的TIL細胞可以是在體外進行擴增。在一種實施方式中，該經擴增的TIL細胞可以是在自體體內進行擴增。在一種實施方式中，該經擴增的TIL細胞可以是在異體體內進行擴增。在一種實施方式中，該經擴增的TIL細胞可以是在離體進行擴增。
在一種實施方式中，與該源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL相比，該經擴增的TIL的數量可以增加至少1倍。例如，與該源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL相比，該經擴增的TIL的數量可以增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、或者至少約50倍。
在一種實施方式中，該經擴增的TIL細胞，與從腫瘤組織獲得且未經體外擴增的TIL相比，該經擴增的TIL細胞數量可以增加50倍以上。例如，與從腫瘤組織獲得的TIL相比，該經擴增的TIL細胞數量可以增加約50倍以上、約60倍以上、約70倍以上、約80倍以上、約90倍以上、約100倍以上、約200倍以上、約300倍以上、約400倍以上、約500倍以上、約600倍以上、約700倍以上、約800倍以上、約900倍以上、約2000倍以上、約3000倍以上、約4000倍以上、約5000倍以上、約6000倍以上、約7000倍以上、約8000倍以上、約9000倍以上、約10000倍以上、約15000倍以上、或者約20000倍以上。。
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法。其中，使經第一階段擴增的TIL經受第二階段擴增，其中在該第二階段擴增中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，在該第二階段擴增中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，在該第二階段擴增中，可以使該TIL在與T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，在該第二階段擴增中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，在該第二階段擴增中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與至少一部分飼養細胞共培養。例如，在該第二階段擴增中，一部分飼養細胞與TIL共培養可以是在TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸的同時，至少另一部分的飼
養細胞與TIL共培養是在TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後。例如至少另一部分的飼養細胞可以包含全部所用飼養細胞的約100%、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、或約0.1%。
例如，本申請可以以約40：1-約400：1的本申請飼養細胞與本申請TIL的比例，將本申請飼養細胞添加至本申請TIL的細胞培養基中。例如，本申請可以以約40：1-約400：1、以約40：1-約300：1、以約40：1-約200：1、以約40：1-約100：1、以約40：1-約90：1、以約40：1-約80：1、以約40：1-約70：1、以約40：1-約60：1、以約40：1-約50：1、以約50：1-約400：1、以約60：1-約400：1、以約70：1-約400：1、以約80：1-約400：1、以約90：1-約400：1、以約100：1-約400：1、以約200：1-約400：1、或以約300：1-約400：1的本申請飼養細胞與本申請TIL的比例，將本申請飼養細胞添加至本申請TIL的細胞培養基中。
在一種實施方式中，與第一階段擴增的TIL相比，該經第二階段擴增的TIL細胞數量可以增加約50倍以上。例如，與第一階段擴增的TIL相比，該經第二階段擴增的TIL細胞數量可以增加約50倍以上、約60倍以上、約70倍以上、約80倍以上、約90倍以上、約100倍以上、約200倍以上、約300倍以上、約400倍以上、約500倍以上、約600倍以
上、約700倍以上、約800倍以上、約900倍以上、約1000倍以上、約2000倍以上、約3000倍以上、約4000倍以上、約5000倍以上、約6000倍以上、約7000倍以上、約8000倍以上、約9000倍以上、約10000倍以上、約15000倍以上、或者約20000倍以上。在一種實施方式中，TIL細胞的數量增加可以用擴增倍數表示，該擴增倍數可以是，第二階段擴增結束後相比於第二階段擴增開始前，TIL細胞數量擴增至的倍數。例如，如果第二階段擴增開始前TIL細胞數量為1×108，第二階段擴增結束後TIL細胞數量為1×109，可以認為TIL細胞的擴增倍數為10。
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：可以使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少一個階段的體外擴增，其中在單個體外擴增階段中，可以使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
在另一種實施方式中，可以使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少兩個階段的體外擴增，其中在第二個階段的體外擴增和/或之後的單個體外擴增階段中，可以使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
例如，可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過一個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
例如，可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過兩個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過兩個階段的體外擴增，其中在第二個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
例如，也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過兩個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第二個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
例如，可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第二個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第三個階段的體外擴增中，可以使經體外擴
增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
例如，也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第二個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。例如，也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第三個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。例如，也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第二個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第三個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。例如，也可以是使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過三個階段的體外擴增，其中在第一個階段的體外擴增中，可以使未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第二個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生
長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養，且其中在第三個階段的體外擴增中，可以使經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法。其中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在同一個階段的擴增中。
在一種實施方式中，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，可以使的TIL在與T細胞共刺激分子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，可以使TIL在與T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，可以使TIL在與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，可以使TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與至少一部分飼養細胞共培養。例如，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增，一部分飼養細胞與TIL共培養可以是在TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸的同時，至少另一部分的飼養細胞與TIL共培養是在TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後。例如至少另一部分的飼養細胞可以包含全部所用飼養細胞的約100%、約90%、約80%、約70%、約
60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、或約0.1%。
在一種實施方式中，該TIL在完整的培養過程中可以經過兩個以上階段的擴增。例如，該TIL在完整的培養過程中可以經過2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100個以上階段的擴增。
在一種實施方式中，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中和/或第二個階段擴增中。在一種實施方式中，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中、第二個階段擴增中和/或第三個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第二個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第三個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中和第二個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中和第三個階段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第二個階段擴增中和第三個階
段擴增中。例如，TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸與該TIL和飼養細胞共培養可以發生在第一個階段擴增中、第二個階段擴增中和第三個階段擴增中。
在一種實施方式中，與在該TIL與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸同時使該TIL和飼養細胞共培養相比，在該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間間隔後使該TIL和飼養細胞共培養可以提高該TIL的擴增效果。例如，該提高TIL的擴增效果可以包括選自以下組：增加TIL細胞的數量，改變TIL細胞的比例，提高TIL細胞的分泌能力，和提高TIL細胞的殺傷能力。在一種實施方式中，在該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間間隔後使該TIL和飼養細胞共培養可以增加TIL細胞的數量。在一種實施方式中，在該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間間隔後使該TIL和飼養細胞共培養可以提高TIL細胞的分泌能力。在一種實施方式中，在該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間間隔後使該TIL和飼養細胞共培養可以提高TIL細胞的殺傷能力。
在一種實施方式中，在該TIL與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間間隔後使該TIL和飼養細胞共培養可以改變TIL細胞的比例。例如，該可以改變TIL細胞的比例可以包括選自以下組：可以增加TIL中中心記憶T細胞(Tcm)比例，可以增加調節性T細胞(Treg)以外的TIL細胞的比例，可以降低調節性T細胞(Treg)的比例，可以增加活化T細胞比例，可以增加腫瘤特異性T細胞比例，和可以增加幹細胞樣T細胞比例。例如，該可以改變TIL細胞的比例包括選自以下組：可以增
加TIL中CD45RA-CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例，可以增加CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)以外的TIL細胞的比例，可以降低CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)的比例，可以增加活化T細胞比例，可以增加CD103+CD39+腫瘤特異性T細胞比例，和可以增加TCF1+幹細胞樣T細胞比例。又例如，本申請改變TIL細胞的比例可以包括增加TIL中CD45RO+CD62L+中心記憶T細胞(Tcm)比例。例如，該可以增加活化T細胞比例包括選自以下組：增加PD1+細胞比例、增加LAG3+細胞比例和增加CD28+細胞比例。該改變TIL細胞的比例可以包括本申請方法培養的TIL細胞中中心記憶T細胞比例，活化T細胞比例，腫瘤特異性T細胞比例，和/或幹細胞樣T細胞，與在該TIL與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸同時使該TIL和飼養細胞共培養相比，增加至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、至少約98%或者至少約99%。該改變TIL細胞的比例可以包括本申請方法培養的TIL細胞中調節性T細胞(Treg)，與在該TIL與T細胞共刺激分子和T細胞生長因子接觸同時使該TIL和飼養細胞共培養相比，減少至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70
%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、至少約98%或者至少約99%。
在一種實施方式中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該之後可以是指之後2小時以上。例如，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸6到72小時、或12到48小時之後，與飼養細胞共培養。例如，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時之後，與飼養細胞共培養。例如，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、或約14天之後，與飼養細胞共培養。
在一種實施方式中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該T細胞共刺激分子可以選自以下組的一種或多種：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、特異性結合CD3的抗體、特異性結合CD28的抗體、特異性結合HVEM的抗體、特異性結合CD40L的抗體、特異性結合OX40的抗體和特異性結合4-1BB的抗體。
在一種實施方式中，該TIL與T細胞共刺激分子接觸可以包括一種或多種該T細胞共刺激分子與該TIL單獨接觸和/或多種該T細胞共刺激分子與該TIL同時接觸。在一種實施方式中，可以包括一種或多種該T細胞共刺激分子與該TIL單獨接觸。在一種實施方式中，可以包括多種該T細胞共刺激分子與該TIL同時接觸。例如，一種或多種該T細胞共刺激分子可以單獨加入到該TIL的細胞培養基中，例如，多種該T細胞共刺激分子可以同時加入到該TIL的細胞培養基中。例如，一種該T細胞共刺激分子可以以以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞共刺激分子的工程化細胞，嵌合該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和嵌合該T細胞共刺激分子的聚合物。例如，多種該T細胞共刺激分子可以以選自以下組的形式加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞共刺激分子的工程化細胞，嵌合多種該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和嵌合多種該T細胞共刺激分子的聚合物。例如，T細胞共刺激分子可以為特異性結合CD3的抗體，例如可以是Miltenyi Biotech的OKT3。
在一種實施方式中，可以使該TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸之後，與飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該T細胞生長因子可以選自以下組的一種或多種：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、和γ干擾素。例如，T細胞生長因子可以為IL-2。在一種實施方式中，該IL-2在該TIL的細胞培養基中的初始濃度可以為約1000IU/mL以上。在一種實施方式中，該IL-2在該TIL的細胞培養基中的初始濃度可以為約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約
2600IU/mL、約2700IU/mL、約2800IU/mL、約2900IU/mL、約3000IU/mL、約3100IU/mL、約3200IU/mL、約3300IU/mL、約3400IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL、約8000IU/mL、約8500IU/mL、或約9000IU/mL以上。
在一種實施方式中，該TIL與T細胞生長因子接觸可以包括一種或多種該T細胞生長因子與該TIL單獨接觸和/或多種該T細胞生長因子與該TIL同時接觸。在一種實施方式中，可以包括一種或多種該T細胞生長因子與該TIL單獨接觸。在一種實施方式中，可以包括多種該T細胞生長因子與該TIL同時接觸。例如，一種或多種該T細胞生長因子可以單獨加入到該TIL的細胞培養基中，例如，多種該T細胞生長因子可以同時加入到該TIL的細胞培養基中。例如，一種該T細胞生長因子可以以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞生長因子的工程化細胞，嵌合該T細胞生長因子的奈米顆粒，和嵌合該T細胞生長因子的聚合物。例如，多種該T細胞生長因子可以以選自以下組的形式加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞生長因子的工程化細胞，嵌合多種該T細胞生長因子的奈米顆粒，和嵌合多種該T細胞生長因子的聚合物。
在一種實施方式中，該TIL可以為源自該腫瘤組織的碎片的TIL。在一種實施方式中，可以藉由將腫瘤組織處理成腫瘤碎片獲得該TIL。在一種實施方式中，該腫瘤碎片的體積約為1-27立方毫米。在一種實施方式中，該腫瘤碎片的體積約為約1立方毫米、約2立方毫米、約3立方毫
米、約4立方毫米、約5立方毫米、約6立方毫米、約7立方毫米、約8立方毫米、約9立方毫米、約10立方毫米、約11立方毫米、約12立方毫米、約13立方毫米、約15立方毫米、約17立方毫米、約19立方毫米、約20立方毫米、約21立方毫米、約23立方毫米、約24立方毫米、約25立方毫米、約26立方毫米或27立方毫米。
在一種實施方式中，該飼養細胞可以包括抗原呈遞細胞。在一種實施方式中，該飼養細胞可以包括選自以下組的一種或多種：外周單個核細胞，樹突狀細胞，和人工抗原呈遞細胞。例如，該飼養細胞可以為外周單個核細胞。例如，該飼養細胞可以為樹突狀細胞。例如，該飼養細胞可以為人工抗原呈遞細胞。例如，該飼養細胞可以為分離的人工抗原呈遞細胞(aAPC)，其可以包含表達HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58的細胞，並可以被修飾以表達一種以上共刺激分子。在一種實施方式中，該飼養細胞可以經過輻照。例如，可以經過伽馬射線輻照，或可以經過X射線輻照。
在一種實施方式中，該TIL可以和飼養細胞共培養。在一種實施方式中，該共培養可以是TIL和飼養細胞的表面相接觸，例如可以將該飼養細胞加入該TIL的細胞培養基中。在一種實施方式中，該共培養可以是TIL和飼養細胞的表面相接觸。在一種實施方式中，可以將該飼養細胞固定在裝置上並加入該TIL的細胞培養基中。在一種實施方式中，可以將該飼養細胞與TIL的細胞藉由膜、網、柵格分離，但是可以進行物質交換或可以進行部分程度的接觸。在一種實施方式中，可以將該飼養細胞的細胞代謝產物加入該TIL的細胞培養基中。例如，本申請可以以約40：1-
約400：1的上述本申請飼養細胞與本申請TIL的比例，將本申請飼養細胞添加至本申請TIL的細胞培養基中。例如，本申請可以以約40：1-約400：1、以約40：1-約300：1、以約40：1-約200：1、以約40：1-約100：1、以約40：1-約90：1、以約40：1-約80：1、以約40：1-約70：1、以約40：1-約60：1、以約40：1-約50：1、以約50：1-約400：1、以約60：1-約400：1、以約70：1-約400：1、以約80：1-約400：1、以約90：1-約400：1、以約100：1-約400：1、以約200：1-約400：1、或以約300：1-約400：1的本申請飼養細胞與本申請TIL的比例，將本申請飼養細胞添加至本申請TIL的細胞培養基中。
一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法。從受試者組織樣品獲得的TIL細胞的方法可以是患者手術取得原位腫瘤樣本或轉移腫瘤樣本，重量可以至少約1g，也可以多塊組織合併。腫瘤組織在基礎培養基內約2-8度運輸，48小時內處理。組織塊可以機械破碎至每塊約1-27立方毫米大小，轉移入透氣培養袋或Grex中，加入T細胞無血清培養基和濃度為1000-9000IU/mL(例如可以是6000IU/mL)IL-2培養約3-14天。收集培養基中細胞，可以與組織塊共同轉移入透氣培養袋、或Grex、或Xuri設備，T細胞無血清培養基可以添加CD3抗體約30ng/mL，IL-2(1000-9000IU/mL)，活化一定時間後添加輻照PBMC(TIL與PBMC按照比率1：40-1：400)，擴增培養約3-14天。過濾組織塊，可以使用細胞處理系統收集培養基中細胞，清洗凍存，並檢測。最終產品CD3比例可以大於80%，細胞活率可以大於70%，大於80%的T細胞可以為記憶效應
T細胞和效應T細胞。經刺激後可以分泌IFNγ，可以具有活化T細胞比例上調的特徵。
一方面，本申請提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該TIL可以根據本申請的培養方法培養得到。在一種實施方式中，本申請提供的TIL可以包含一種或一個批次的本申請的培養方法培養得到TIL。在一種實施方式中，本申請提供的TIL可以包含多種或多個批次的本申請的培養方法培養得到並以任意比例組合的TIL。
在一些實施方式中，可以將使用本申請方法擴增的TIL作為醫藥組成物施用於患者。在一些實施方式中，醫藥組成物可以是TIL在無菌緩衝液中的懸液。使用本申請的PBMC擴增的TIL可以藉由本領域已知的任何合適途徑施用。在一些實施方式中，T細胞可以以單次動脈內或靜脈內輸注施用，輸注可以持續約30至60分鐘。其他合適的施用途徑可以包括腹膜內、鞘內和淋巴管內施用。
可以施用任何合適劑量的TIL。在一些實施方式中，例如當腫瘤是黑色素瘤時，可以施用約2.3×109至約13.7×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約1×109至約12×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約1.2×1010至約4.3×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約3×1010至約12×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約4×1010至約10×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約5×1010至約8×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約6×1010至約8×1010個TIL。在一些實施方式中，可以施用約7×1010至約8×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約2.3×109至約13.7×1010。在一些實施方式中，治療
有效劑量可以為約1×109至約12×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約1.2×1010至約4.3×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約3×1010至約12×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約4×1010至約10×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約5×1010至約8×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約6×1010至約8×1010個TIL。在一些實施方式中，治療有效劑量可以為約7×1010至約8×1010個TIL。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的數量可以為約1×106、約2×106、約3×106、約4×106、約5×106、約6×106、約7×106、約8×106、約9×106、約1×107、約2×107、約3×107、約4×107、約5×107、約6×107、約7×107、約8×107、約9×107、約1×108、約2×108、約3×108、約4×108、約5×108、約6×108、約7×108、約8×108、約9×108、約1×109、約2×109、約3×109、約4×109、約5×109、約6×109、約7×109、約8×109、約9×109、約1×1010、約2×1010、約3×1010、約4×1010、約5×1010、約6×1010、約7×1010、約8×1010、約9×1010、約1×1011、約2×1011、約3×1011、約4×1011、約5×1011、約6×1011、約7×1011、約8×1011、約9×1011、約1×1012、約2×1012、約3×1012、約4×1012、約5×1012、約6×1012、約7×1012、約8×1012、約9×1012、約1×1013、約2×1013、約3×1013、約4×1013、約5×1013、約6×1013、約7×1013、約8×1013，或約9×1013。在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL數量的範圍可以為約1×106至5×106、約5×106至1×107、約1×107至5×107、約5×107至1×108、約1×108至5×108、約5×108至1×109、約1×109至5×109、約5×109至1×1010、
約1×1010至5×1010、約5×1010至1×1011、約5×1011至1×1012、約1×1012至5×1012，或約5×1012至1×1013。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的濃度可以小於組成物的例如約100%、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、約0.01%、約0.009%、約0.008%、約0.007%、約0.006%、約0.005%、約0.004%、約0.003%、約0.002%、約0.001%、約0.0009%、約0.0008%、約0.0007%、約0.0006%、約0.0005%、約0.0004%、約0.0003%、約0.0002%，或約0.0001%w/w、w/v或者v/v。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的濃度可以大於組成物的約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19.75%、約19.50%、約19.25%、約19%、約18.75%、約18.50%、約18.25%、約18%、約17.75%、約17.50%、約17.25%、約17%、約16.75%、約16.50%、約16.25%、約16%、約15.75%、約15.50%、約15.25%、約15%、約14.75%、約14.50%、約14.25%、約14%、約13.75%、約13.50%、約13.25%、約13%、約12.75%、約12.50%、約12.25%、約12%、約11.75%、約11.50%、約11.25%、約11%、約10.75%、約10.50%、約10.25%、約10%、約9.75%、約9.50
%、約9.25%、約9%、約8.75%、約8.50%、約8.25%、約8%、約7.75%、約7.50%、約7.25%、約7%、約6.75%、約6.50%、約6.25%、約6%、約5.75%、約5.50%、約5.25%、約5%、約4.75%、約4.50%、約4.25%、約4%、約3.75%、約3.50%、約3.25%、約3%、約2.75%、約2.50%、約2.25%、約2%、約1.75%、約1.50%、約125%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、約0.01%、約0.009%、約0.008%、約0.007%、約0.006%、約0.005%、約0.004%、約0.003%、約0.002%、約0.001%、約0.0009%、約0.0008%、約0.0007%、約0.0006%、約0.0005%、約0.0004%、約0.0003%、約或0.0002%，或者約0.0001%w/w、w/v或v/v。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的濃度範圍可以為組成物的約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%，或約1%至約10%w/w、w/v或者v/v。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的濃度範圍可以為組成物的約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、
約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、或約0.1%至約0.9%w/w、w/v或者v/v。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的量可以等於或小於約10g、約9.5g、約9.0g、約8.5g、約8.0g、約7.5g、約7.0g、約6.5g、約6.0g、約5.5g、約5.0g、約4.5g、約4.0g、約3.5g、約3.0g、約2.5g、約2.0g、約1.5g、約1.0g、約0.95g、約0.9g、約0.85g、約0.8g、約0.75g、約0.7g、約0.65g、約0.6g、約0.55g、約0.5g、約0.45g、約0.4g、約0.35g、約0.3g、約0.25g、約0.2g、約0.15g、約0.1g、約0.09g、約0.08g、約0.07g、約0.06g、約0.05g、約0.04g、約0.03g、約0.02g、約0.01g、約0.009g、約0.008g、約0.007g、約0.006g、約0.005g、約0.004g、約0.003g、約0.002g、約0.001g、約0.0009g、約0.0008g、約0.0007g、約0.0006g、約0.0005g、約0.0004g、約0.0003g、約0.0002g，或者約0.0001g。
在一些實施方式中，本申請的組成物中提供的TIL的量可以大於約0.0001g、約0.0002g、約0.0003g、約0.0004g、約0.0005g、約0.0006g、約0.0007g、約0.0008g、約0.0009g、約0.001g、約0.0015g、約0.002g、約0.0025g、約0.003g、約0.0035g、約0.004g、約0.0045g、約0.005g、約0.0055g、約0.006g、約0.0065g、約0.007g、約0.0075g、約0.008g、約0.0085g、約0.009g、約0.0095g、約0.01g、約0.015g、約0.02g、約0.025g、約0.03g、約0.035g、約0.04g、約0.045g、約0.05g、約0.055g、約0.06g、約0.065g、約0.07g、約0.075g、約0.08g、約0.085g、約0.09g、約0.095g、約0.1g、約0.15g、約0.2g、約0.25g、約0.3g、約
0.35g、約0.4g、約0.45g、約0.5g、約0.55g、約0.6g、約0.65g、約0.7g、約0.75g、約0.8g、約0.85g、約0.9g、約0.95g、約1g、約1.5g、約2g、約2.5g、約3g、約3.5g、約4g、約4.5g、約5g、約5.5g、約6g、約6.5g、約7g、約7.5g、約8g、約8.5g、約9g、約9.5g，或者約10g。
在一些實施方式中，TIL可以單劑量施用。此種施用可以藉由注射，例如靜脈內注射。在一些實施方式中，TIL可以多劑量施用。劑量可以是每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。劑量可以是每月一次、每兩週一次、每週一次或每2天一次。在一些實施方式中，TIL的施用可以連續施用。
在另一方面，本申請提供一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法。從受試者組織樣品獲得的TIL細胞的方法可以是患者手術取得原位腫瘤樣本或轉移腫瘤樣本，重量可以至少約1g，也可以多塊組織合併。腫瘤組織在樣本運輸液，例如可以是商業常用的腫瘤組織運輸液、腫瘤組織保存液或腫瘤組織轉運液，內約2-8度運輸，48小時內處理。組織塊可以機械破碎至每塊約1-27立方毫米大小，轉移入透氣培養袋或Grex中，加入T細胞無血清培養基和濃度為300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2培養約3-14天。可以將收穫的TIL細胞凍存後再復蘇，也可以直接收集培養基中細胞，轉移入透氣培養袋、或Grex、或Xuri設備，T細胞無血清培養基可以添加本申請的CD3抗體、濃度為300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2，活化本申請的TIL一定時間後，添加輻照PBMC(TIL與PBMC按照比率約1：40-約1：400)，擴增培養約3-14天。
可以使用細胞處理系統收集培養基中細胞，清洗凍存，並檢測。最終產品CD3比例可以大於80%，細胞活率可以大於50%，大於80%的T細胞可以為記憶效應T細胞和效應T細胞。經刺激後可以分泌IFN-γ，和/或可以具有活化T細胞比例上調的特徵。
一方面，本申請提供一種藥物製劑。在一些實施方式中，其可以包含本申請所述的TIL和/或本申請所述的組成物，與藥學上可接受的載體。
一方面，本申請提供一種試劑盒，該試劑盒可以包含本申請所述培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)方法的T細胞共刺激分子、T細胞生長因子和/或飼養細胞與記載本申請培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)方法的步驟的說明書。一方面，本申請提供一種試劑盒，該試劑盒可以包含本申請所述的TIL和/或本申請所述的藥物製劑。
一方面，本申請提供一種影響腫瘤細胞生長的方法，可以包括向受試者施用本申請所述的TIL和/或本申請所述的藥物製劑。在一些實施方式中，影響腫瘤生長可以包含腫瘤的體積減少到施用前的例如約99%、約95%、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約13%、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%或約0.1%。
一方面，本申請提供本申請所述的TIL和/或本申請所述的藥物製劑在製備藥物中的應用，該藥物可以用於預防和/或治療腫瘤。在一
些實施方式中，該腫瘤選自實體瘤。在一些實施方式中，該腫瘤可以選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
一方面，本申請提供一種預防和/或治療腫瘤的方法，可以包括向受試者施用本申請所述的TIL和/或本申請所述的藥物製劑。在一些實施方式中，該腫瘤選自實體瘤。在一些實施方式中，該腫瘤可以選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
一方面，本申請提供一種本申請所述的TIL和/或本申請所述的藥物製劑，其可以用於預防和/或治療腫瘤。在一些實施方式中，該腫瘤選自實體瘤。在一些實施方式中，該腫瘤可以選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的TIL培養方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)細胞的培養方法
1.1 飼養細胞接收及製備
1.1.1 單採血接收
記錄單採血信息，批號及體積，並複溫至室溫。
1.1.2 PBMC(外周血單個核細胞)手動分離及凍存
使用75%酒精消毒血袋，轉移至生物安全櫃內。使用無菌剪刀剪開血袋後，將單採血轉移至50mL離心管內，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理鹽水清洗血袋，將洗滌液一併轉入50mL離心管內。每個50mL離心管內液體體積可以不超過30mL。將單採血3000g離心10分鐘。離心過程中準備6-8支50mL離心管，加入已複溫的淋巴細胞分離液(天津灝洋Ficoll)，20mL/支。離心結束後，棄掉上層血漿，使用PBS或生理鹽水稀釋細胞沉澱，將稀釋後的血細胞混合液緩慢滴加上淋巴細胞分離液上層，可以不破壞界面，每管約加25mL樣品，可以不超過28mL。
離心使用水平轉子，500-600g離心15-30分鐘，溫度18-22℃，離心結束後得到的白膜層將處於生理鹽水及Ficoll的分界面處。吸棄上層血漿及生理鹽水，用移液管吸取中間白膜層至另一乾淨的50mL離心管內。使用PBS或生理鹽水稀釋收集到的白膜層，600g離心10分鐘，室溫。離心結束後棄上清，PBS或生理鹽水清洗細胞一次，500g離心5分鐘，室溫。
如紅細胞較多，離心結束後可以進行裂紅，按照細胞沉澱體積與紅細胞裂解液1：2至1：3加入紅細胞裂解液，混勻，室溫裂解10分鐘中，中間輕柔混勻離心管2-3次，保證裂解效果，裂解完成後加入PBS或生理鹽水清洗細胞。裂解紅細胞後清洗細胞兩次，400g離心6分鐘，最後一次離心前取樣計數。
棄上清，基礎培養基重新懸浮細胞，調整細胞密度約2-3×107/mL，液面高度可以不超過1釐米，每T225培養瓶中體積可以低於200mL；平鋪狀態下，X射線輻照50Gy。離心棄上清，根據計數結果凍存
細胞，約1-2×108/mL，1-2mL/支；將細胞放入程序降溫盒內轉移至-80℃冰箱內凍存。
1.1.3 PBMC自動分離及凍存
將血袋的管路與cpro分離套件(Cytiva)輸入端無菌接管。若血量大於120mL，進行預濃縮步驟，可以將血液體積濃縮至120mL以內。可以使用neatcell程序進行PBMC分離及洗滌，洗滌液為生理鹽水，中間體積20mL；重新懸浮液為基礎培養基，添加80mL/批。分離後每供者PBMC為一袋100mL，在平鋪狀態下，液面高度可以不超過1釐米，X射線輻照50Gy。輻照後取樣計數，將3-5名供者PBMC懸液按照0.5：1至1：2的比例混合，使用culture wash程序收集細胞並洗滌三次，洗滌液為生理鹽水；設置中間體積及終體積，使得每1×109個細胞不少於2mL；加入等量至2倍凍存液混勻。使用1倍凍存液調整細胞密度約為1×107/mL至2×108/mL，分裝20mL/袋，程序降溫儀內凍存，液氮保存。
1.2 腫瘤組織接收及處理
1.2.1 組織接收
接收供者的腫瘤組織及血樣，核對樣品信息並記錄，打印相應樣品標簽。
1.2.2 組織處理及培養
使用75%酒精消毒樣品管及採血管，轉移至生物安全櫃內。根據上述PBMC手動分離及凍存操作程序分離血樣中PBMC細胞並進行凍存。取一種具有透氣表面的培養瓶和袋子，例如G-Rex100培養瓶(Wilson Wolf Manufacturing)，加入300mL已複溫的完全培養基，完全培養基可以
任意地選用X-vivo 15培養基或其它商用的T細胞培養基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T細胞培養基，並可以添加必須胺基酸及抗生素，並添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。取數個10釐米培養皿，加入適量培養基，使用無菌眼科鑷從樣品管中取出腫瘤組織於10釐米培養皿中，培養基量以剛沒過腫瘤組織為准，觀察組織形態並記錄。洗滌組織並更換培養皿。使用眼科剪及眼科鑷將進行初步剪切，去除脂肪組織及壞死組織，每塊組織塊繼續剪碎至約27立方毫米大小。取非懸浮腫瘤組織塊，使用20mL注射器去除內部活塞後，與培養袋連接，使用移液管將約1g組織塊藉由注射器轉入培養袋內。將培養袋放入二氧化碳培養箱內進行培養。清理剪刀及鑷子，並用75%酒精進行初步消毒後，超聲清洗後進行滅菌，獲得初級TIL。
1.3 第一階段擴增及收穫
1.3.1 第一階段擴增
根據細胞生長狀態，每3-7天補液或半量換液，保證細胞營養。使用完全培養基，完全培養基可以任意地選用X-vivo 15培養基或其它商用的T細胞培養基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T細胞培養基，並可以添加必須胺基酸及抗生素，並添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。第一階段擴增的3-14天，例如可以第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天時取樣計數，若細胞數目處於5×105至5×108之間時進入下述第一階段擴增的收穫步驟。
1.3.2 第一階段擴增的收穫
收集第一階段擴增結束細胞，離心，棄去培養基，使用PBS或生理鹽水洗滌細胞一次，獲得經第一階段擴增的TIL，並取樣計數留取約5×105至2×108細胞量進入下述第一階段擴增步驟；取約5×105細胞量可以進行質量控制檢測；其餘細胞量加入等量2倍凍存液凍存。
1.4 第二階段擴增
1.4.1 第二階段擴增的TIL活化
取5×105至2×108的第一階段擴增的細胞量，使用完全培養基，完全培養基可以任意地選用X-vivo 15培養基或其它商用的T細胞培養基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T細胞培養基，並可以添加必須胺基酸及抗生素，調整細胞密度為5×105至2×106/mL，於懸浮24孔培養板內，1mL/孔，添加CD3抗體，例如OKT3約30ng/mL，添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。
1.4.2 第二階段擴增的擴大培養
第二階段擴增加入OKT3和IL-2後的若干時間Tn以後(Tn可以取0小時到14天)，復蘇1-5名供者混合的飼養細胞；將活化的TIL細胞，組織塊及飼養細胞轉入G-Rex100培養瓶或者透氣袋內，補充完全培養基，每1-3天取樣計數，並根據細胞狀態補液或半量換液直至細胞總數大於1×109或第二階段擴增培養達14天，終止培養。
1.4.3 腫瘤浸潤淋巴細胞的收穫
取第二階段擴增的細胞，離心後棄去培養基上清，並使用PBS或生理鹽水或複方電解質溶液清洗三次，獲得經第二階段擴增的TIL，第三次清洗時取樣計數，根據計數結果，最後一次離心後棄上清，取3×106
細胞送質量控制檢測；其餘全部細胞加入凍存液，調整細胞密度1-3×108/mL凍存。
1.5 腫瘤浸潤淋巴細胞的應用
可以將復蘇後的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞給予受試者靜脈滴注。
實施例2飼養細胞不同添加時間培養的TIL增殖能力對比
在實施例1的1.4的第二階段擴增的TIL活化中，第二階段擴增加入OKT3和IL-2後的若干時間Tn以後(Tn可以取0小時到14天)，將飼養細胞加入腫瘤浸潤淋巴細胞培養袋中。本實施例中Tn選取0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、5天、7天、和9天獲得飼養細胞不同添加時間培養的TIL，並進行細胞計數的對比試驗。
飼養細胞不同添加時間培養的TIL的增殖能力分析如圖1所示。飼養細胞不同添加時間培養TIL的各組圖中縱坐標的數值表示，第二階段擴增結束後相比於第二階段擴增開始前，TIL細胞數量擴增至的擴增倍數。4名供者來源的TIL增殖結果顯示，加入OKT3和IL-2後的0小時後(即同時)添加飼養細胞培養的TIL，增殖能力弱於加入OKT3和IL-2後的24小時或48小時後加飼養細胞培養的TIL。
實施例3飼養細胞不同添加時間培養的TIL流式檢測對比
在實施例1的1.4的第二階段擴增的TIL活化中，第二階段擴增加入OKT3和IL-2後的若干時間Tn以後(Tn可以取0小時到14天)，將飼養細胞加入腫瘤浸潤淋巴細胞培養袋中。本實施例中Tn選取0小時、
6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、5天、7天、和9天獲得飼養細胞不同添加時間培養的TIL，並進行流式檢測的對比試驗。
TIL流式檢測試驗材料的來源
轉錄因子緩衝組(Transcription Factor Buffer Set)，廠家BD，貨號562574；V底96孔板，廠家Corning，貨號3894；流式管，廠家Corning，貨號352052。
本實施例流式抗體購自BD或Biolegend。將每組1×105至5×105個細胞樣品，加入流式管或V底96孔板內。600g離心3分鐘，棄上清。PBS清洗一次，流式管1mL/管，96孔板250μL/孔，棄上清。加入配製好的抗體工作液進行細胞表面染色，抗體(BD或Biolegend)濃度為1：100至1：200，含活性檢測染料1：10000。流式管100μL/管，96孔板50μL/孔染色，2-8℃避光孵育30分鐘。染色過程中配製轉錄因子染色所需試劑：使用轉錄因子緩衝組(BD，Transcription Factor Buffer Set)稀釋4×固定破膜液(BD，Fixation/Permeabilization)為1×工作液A；使用雙蒸水稀釋5×通透清洗液(BD，Perm/Wash Buffer)為1×工作液B，四度預冷待用。染色結束後加入適量PBS清洗細胞2次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，600g離心3分鐘，離心後棄上清。細胞固定、破膜：充分重新懸浮細胞，加入適量(96孔板100μL/孔，流式管1mL/管)1×工作液A進行固定破膜，2-8℃避光孵育40-50分鐘。固定破膜結束，加入1×工作液B清洗細胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃離心，350g離心6分鐘，清洗兩次。使用1×工作液B配製胞內抗體，抗體濃度為1：100至1：200，96孔板50μL/孔，流式管100μL/管，2-8℃避光染色30分鐘。染色
結束後，加入1×工作液B清洗細胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃離心，350g離心6分鐘，清洗兩次。表面染色結束後，PBS清洗細胞一次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，室溫600g離心3分鐘，離心後棄上清。使用100-500μL PBS重新懸浮細胞，進行流式上機檢測。
飼養細胞不同添加時間培養的TIL的流式結果分析如圖2到圖8所示。
圖2到圖3表示加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD45RA-CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高中心記憶T細胞的比例。
圖4表示加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更少的調節性T細胞的比例。
圖5到圖6表示加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的活化T細胞的比例，例如PD1+、LAG3+和/或CD28+細胞比例更高。
圖7表示加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD103+CD39+腫瘤特異性T細胞比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的腫瘤特異性T細胞的比例。
圖8表示加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的TCF1+幹細胞樣T細胞比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的幹細胞樣T細胞的比例。
實施例4飼養細胞不同添加時間培養的TIL的結果統計
在實施例1的1.4的第二階段擴增的TIL活化中，取第一階段擴增的細胞量，調整細胞密度為5×105至2×106/mL，於懸浮24孔培養板內，1mL/孔，添加CD3抗體，例如OKT3約30ng/mL，添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2後的0小時、24小時、48小時以後，將飼養細胞加入腫瘤浸潤淋巴細胞的培養環境中。其中，TIL與飼養細胞可以按照比率1：40-1：400加入，第二階段擴增培養約9-14天後收集全部細胞，檢測和統計培養所得TIL的結果。
增殖能力檢測
對於上述飼養細胞不同添加時間培養獲得的TIL進行細胞計數。
不同供者腫瘤來源的TIL作為各自不同的批次；將各個批次的加入OKT3和IL-2同時(0h組)加入飼養細胞的試驗組的數據作為基準1，將同批次其它時間點試驗組的數據進行標準化處理，統計各試驗組在第二階段擴增相對於0h組的相對增殖能力。
圖9顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞增殖能力結果圖。相比於加入OKT3和IL-2後的0小時後(即同時)添加飼養細胞培養的TIL，加入OKT3和IL-2後的24小時或48小時後加飼養細胞培養的TIL增殖能力顯著增強。
流式檢測TIL細胞組成
對於上述飼養細胞不同添加時間培養獲得的TIL群進行流式檢測。
不同供者腫瘤來源的TIL作為各自不同的批次；將各個批次的加入OKT3和IL-2同時(0h組)加入飼養細胞的試驗組的數據作為基準1，將同批次其它時間點試驗組的數據進行標準化處理，統計各試驗組在第二階段擴增相對於0h組的細胞組成比例。
流式檢測的試驗流程可以參照本申請實施例3的內容。
圖10顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD45RA- CCR7+中心記憶T細胞(Tcm)比例結果圖。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高CD8+中和/或CD4+中的中心記憶T細胞的比例。
圖11顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的TCF1+幹細胞樣T細胞比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高CD8+中的幹細胞樣T細胞的比例。
圖12顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更少的調節性T細胞的比例。
圖13顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(PD1+)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的活化T細胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的PD1+細胞比例更高。
圖14顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD103+CD39+腫瘤特異性T細胞比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的CD8+中和/或CD4+中的腫瘤特異性T細胞的比例。
圖15顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞
(CD28+)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的活化T細胞的比例，例如CD8+CD28+細胞比例更高。
圖16顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(41BB+)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的活化T細胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的41BB+細胞比例更高。
圖17顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的活化T細胞(CD25+)比例。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的活化T細胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的CD25+細胞比例更高。
胞內因子表達檢測
試驗準備
配製胞內因子表達檢測所需培養基：取T細胞培養基，按照體積比1：500添加CD107a抗體(BD)。
檢測步驟
取各個試驗組的TIL離心後，使用600μL上述胞內因子表達檢測所需培養基重新懸浮為1×106個細胞/mL，加入96孔板內，100μL/孔，置於37℃培養箱孵育過夜。
孵育結束後，200μL/孔PBS洗滌一次，600g離心3分鐘，棄上清。配製抗體混合工作液進行細胞表面染色CD3/CD4/CD8(BD)，抗體濃度為1：100，viability(1：10000)，50μL/組染色，2-8℃避光孵育30分鐘。染色結束後清洗細胞，使用PBS重新懸浮，進行流式上機檢測。
圖18顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的胞內因子表達檢測結果。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的胞內因子表達能力。例如，更高的CD3+中、CD8+中和/或CD4+中的CD107a表達能力。
細胞因子分泌檢測
細胞因子分泌檢測方法可以參照細胞因子檢測試劑盒(BD)的說明書，將人Th1/Th2/Th17細胞因子標準品凍乾粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀釋液(BD)複溶(標準品原液各細胞因子濃度均為5000pg/mL)並按順序：1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512，1：1024梯度稀釋，標記為“標準品管”。取1管僅含有Assay Diluent稀釋液作為參照。按照2μL/Beads/孔加入每種Capture Beads(BD)，然後按照10μL/孔加入PE Detection Reagent檢測試劑(BD)並混合配製為混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板內，隨後按照10μL/孔加入各標準品和試驗組的上清並混合，室溫下避光孵育3小時。
孵育結束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g離心3分鐘。離心結束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重新懸浮，進行流式分析。
圖19顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞因子分泌檢測結果。結果顯示，24小時或48小時後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的細胞因子分泌能力。例如，更高的TNF-α分泌能力、或更高的IFN-γ分泌能力。
實施例5飼養細胞不同添加時間培養的TIL的結果統計
在實施例1的1.4的第二階段擴增的TIL活化中，取第一階段擴增的細胞量，調整細胞密度為5×105至2×106/mL，於懸浮24孔培養板內，1mL/孔，添加CD3抗體，例如OKT3約30ng/mL，添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2後的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天以後，將飼養細胞加入腫瘤浸潤淋巴細胞的培養環境中。其中，TIL與飼養細胞可以按照比率1：40-1：400加入，例如1：200，第二階段擴增培養約9-14天後收集全部細胞，檢測和統計培養所得TIL的結果。
增殖能力檢測
對於上述飼養細胞不同添加時間培養獲得的TIL進行細胞計數。
圖20顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞增殖能力結果圖。相比於加入OKT3和IL-2後的0小時後(即同時)添加飼養細胞培養的TIL，加入OKT3和IL-2後的12小時或更多時間後加飼養細胞培養的TIL增殖能力顯著增強。
流式檢測TIL細胞組成
對於上述飼養細胞不同添加時間培養獲得的TIL群進行流式檢測。
不同供者腫瘤來源的TIL作為各自不同的批次；將各個批次的加入OKT3和IL-2同時(0h組)加入飼養細胞的試驗組的數據作為基準1，將同批次其它時間點試驗組的數據進行標準化處理，統計各試驗組在第二階段擴增相對於0h組的細胞組成比例。
流式檢測的試驗流程可以參照本申請實施例3的內容。
圖21顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD8+T細胞比例。結果顯示，加入OKT3和IL-2後的12小時或更多時間後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的CD8+T細胞的比例。
圖22顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD45RO+CD62L+T細胞比例。結果顯示，加入OKT3和IL-2後的12小時或更多時間後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的記憶T細胞(Tcm，CD45RO+CD62L+)的比例。
圖23顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的NK T細胞比例。結果顯示，加入OKT3和IL-2後的
12小時或更多時間後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更高的NK T細胞的比例。
圖24顯示的是，加入OKT3和IL-2的0小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、或5天後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)比例。結果顯示，加入OKT3和IL-2後的12小時或更多時間後添加飼養細胞培養的TIL，相比同時添加飼養細胞培養的TIL，具有更少的調節性T細胞的比例。
實施例6本申請培養的TIL的殺傷能力檢測
對於實施例1的1.4的第二階段擴增的TIL活化中，取第一階段擴增的細胞量，調整細胞密度為5×105至2×106/mL，於懸浮24孔培養板內，1mL/孔，添加CD3抗體，例如OKT3約30ng/mL，添加濃度約為1000~9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2後的12小時至14天後，例如48小時以後，將飼養細胞加入腫瘤浸潤淋巴細胞的培養環境中。其中，TIL與飼養細胞可以按照比率1：40-1：400加入，第二階段擴增培養約9-14天後收集全部細胞，檢測和統計培養所得TIL的細胞殺傷能力檢測。
細胞準備
準備用於檢測的各個試驗組獲得的TIL和用於共培養的靶細胞(例如A375黑色素瘤細胞和/或Hela宮頸癌細胞)。
檢測步驟
用CFSE(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，Sigma，21888-25MG-F)標記腫瘤細胞：用PBS清洗腫瘤細胞，重新懸浮腫瘤細胞於500μL的PBS中；將CFSE加入500μL的PBS中，與500μL的腫瘤細胞PBS重新懸浮液混合，至CFSE的終濃度為0.5μmol/L。37℃孵育6分鐘後，加含10% FBS的培養基清洗，600g離心5分鐘，用X-vivo 15培養基或其它商用的T細胞培養基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T細胞培養基重新懸浮腫瘤細胞濃度為1×106個細胞/mL。對各個試驗組的TIL群600g離心5分鐘，按照效靶比(TIL細胞與腫瘤細胞的比例)3：1重新懸浮TIL細胞(即重新懸浮TIL細胞濃度為3×106個細胞/mL)。於U底96孔板(Corning)中加入腫瘤細胞和TIL細胞各100μL，每組設置三個複孔。同時設置一組只包含腫瘤細胞的對照組。將孔板200g離心1分鐘，置於37℃孵育4小時至過夜。其中，TIL與腫瘤細胞共培養時，可以不加激活TIL細胞的物質作為無激活組，或者加入transACT(Miltenyi，包含CD3抗體和CD28抗體的奈米基質材料)作為激活組。
孵育完成後，600g離心3分鐘，棄上清，每孔加入20μL胰酶，37℃培養箱內孵育3-5分鐘消化腫瘤細胞，消化完成後加入180μL含10%FBS的培養基終止消化。將Dapi(碧雲天，C0060)用1：100稀釋，然後每孔加入20μL稀釋後的Dapi。進行流式上機檢測。
殺傷率%=Dapi+CFSE+細胞數/總CFSE+×100%，或殺傷率可以藉由Dapi+細胞數/總腫瘤細胞數表示。
圖25顯示的是，加入OKT3和IL-2的48小時後添加飼養細胞培養的TIL，培養所得的TIL細胞的細胞殺傷能力結果。結果顯示，加入OKT3和IL-2後的48小時後添加飼養細胞培養的TIL均具有顯著的腫瘤細胞殺傷能力，例如黑色素瘤和/或宮頸腫瘤。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本文所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
Claims (56)
- 一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項1所述的方法，其中該經擴增的TIL為經過體外擴增的TIL。
- 如請求項1或2所述的方法，其中該經擴增的TIL為使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少一個階段的體外擴增後獲得的TIL。
- 如請求項3所述的方法，其中與該源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL相比，該經擴增的TIL的數量增加至少1倍。
- 如請求項1至4中任一項所述的方法，其中該經擴增的TIL經該共培養後數量增加至至少50倍。
- 如請求項1至5中任一項所述的方法，其中該經擴增的TIL經該共培養後數量增加至約50-20000倍。
- 一種培養腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的方法，其包括：使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少一個階段的體外擴增，其中在單個體外擴增階段中，使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項7所述的方法，其中在第一個階段的體外擴增中，使該未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項7所述的方法，其中使源自腫瘤組織且未經體外擴增的TIL經過至少兩個階段的體外擴增，且在第二個階段的體外擴增中，使經體外擴增TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項7至9中任一項所述的方法，其中與在單個體外擴增階段中使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸同時與飼養細胞共培養相比，在單個體外擴增階段中使經體外擴增和/或未經體外擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸一定時間之後與飼養細胞共培養獲得的TIL顯示出改善的TIL特性。
- 如請求項10所述的方法，其中該改善的TIL特性包含選自以下組的一種或多種：增加的TIL細胞數量，增加的活細胞比例，增加的存續能力，改善的T細胞亞群比例，提高的細胞因子分泌能力，提高的腫瘤細胞殺傷能力，提高的T細胞受體(TCR)選殖多樣性和提高的組織和/或腫瘤中TIL細胞數量。
- 如請求項11所述的方法，其中該改變TIL細胞的比例包括選自以下組的一種或多種：增加TIL中中心記憶T細胞比例，降低調節性T細胞的比例，增加活化T細胞比例，增加腫瘤特異性T細胞比例，和增加幹細胞樣T細胞比例。
- 如請求項1至12中任一項所述的方法，其中使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸至少約2小時之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項1至13中任一項所述的方法，其中使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸約6到72小時之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項1至14中任一項所述的方法，其中使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸約12到48小時之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項1至14中任一項所述的方法，其中使經擴增的TIL在與T細胞共刺激分子和/或T細胞生長因子接觸約6、12、24、48或72小時之後與飼養細胞共培養。
- 如請求項1至16中任一項所述的方法，其中該T細胞共刺激分子選自以下組的一種或多種：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、特異性結合CD3的抗體、特異性結合CD28的抗體、特異性結合HVEM的抗體、特異性結合CD40L的抗體、特異性結合OX40的抗體和特異性結合4-1BB的抗體。
- 如請求項1至17中任一項所述的方法，其中該T細胞共刺激分子為特異性結合CD3的抗體和/或其抗原結合片段。
- 如請求項1至18中任一項所述的方法，其中使一種該T細胞共刺激分子、或多種T細胞共刺激分子的每一種與該TIL單獨接觸。
- 如請求項1至18中任一項所述的方法，其中使多種該T細胞共刺激分子與該TIL同時接觸。
- 如請求項1至19中任一項所述的方法，其中分別單獨加入一種該T細胞共刺激分子、或多種T細胞共刺激分子的每一種到該TIL的細胞培養基中。
- 如請求項1至18和20中任一項所述的方法，其中同時加入多種該T細胞共刺激分子到該TIL的細胞培養基中。
- 如請求項1至19和21中任一項所述的方法，其中一種該T細胞共刺激分子以以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞共刺激分子的工程化細胞，包含該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和包含該T細胞共刺激分子的聚合物。
- 如請求項1至18、20和22中任一項所述的方法，其中多種該T細胞共刺激分子以選自以下組的形式加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞共刺激分子的工程化細胞，包含多種該T細胞共刺激分子的奈米顆粒，和包含多種該T細胞共刺激分子的聚合物。
- 如請求項1至24中任一項所述的方法，其中該T細胞生長因子選自以下組的一種或多種：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干擾素。
- 如請求項1至25中任一項所述的方法，其中該T細胞生長因子選自以下組的一種或多種：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干擾素。
- 如請求項1至26中任一項所述的方法，其中該T細胞生長因子為IL-2和/或其功能活性片段。
- 如請求項1至27中任一項所述的方法，其中該IL-2在該TIL的細胞培養基中的初始濃度為至少1000IU/mL。
- 如請求項1至28中任一項所述的方法，其中使一種該T細胞生長因子、或多種T細胞生長因子的每一種與該TIL單獨接觸。
- 如請求項1至28中任一項所述的方法，其中使多種該T細胞生長因子與該TIL同時接觸。
- 如請求項1至29中任一項所述的方法，其中分別單獨加入一種該T細胞生長因子、或多種T細胞生長因子的每一種到該TIL的細胞培養基中。
- 如請求項1至28和30中任一項所述的方法，其中同時加入多種該T細胞生長因子到該TIL的細胞培養基中。
- 如請求項1至29和31中任一項所述的方法，其中一種該T細胞生長因子以選自以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：表達該T細胞生長因子的工程化細胞，包含該T細胞生長因子的奈米顆粒，和包含該T細胞生長因子的聚合物。
- 如請求項1至28、30和32中任一項所述的方法，其中多種該T細胞生長因子以選自以下組的形式的一種或多種加入到該TIL的細胞培養基中：混合物，融合蛋白，表達多種該T細胞生長因子的工程化細胞，包含多種該T細胞生長因子的奈米顆粒，和包含多種該T細胞生長因子的聚合物。
- 如請求項1至34中任一項所述的方法，其中該TIL為源自所述腫瘤組織的碎片的TIL。
- 如請求項35所述的方法，其中該碎片的體積約為1-27立方毫米。
- 如請求項35或36所述的方法，其中該碎片的體積約為27立方毫米。
- 如請求項1至37中任一項所述的方法，其中該飼養細胞包括抗原呈遞細胞。
- 如請求項1至38中任一項所述的方法，其中該飼養細胞包括選自以下組的一種或多種：外周單個核細胞，樹突狀細胞，和人工抗原呈遞細胞。
- 如請求項1至39中任一項所述的方法，其中該飼養細胞為外周單個核細胞。
- 如請求項1至40中任一項所述的方法，其中該飼養細胞為經過輻照的飼養細胞。
- 如請求項1至41中任一項所述的方法，其中該TIL和飼養細胞共培養包括將該飼養細胞的表面與該TIL的表面相接觸。
- 如請求項1至42中任一項所述的方法，其中該TIL和飼養細胞共培養包括將該飼養細胞加入該TIL的細胞培養基中。
- 一種腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，該TIL藉由如請求項1至43中任一項所述的方法獲得。
- 一種組成物，其包含如請求項44所述的TIL。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項44所述的TIL和/或如請求項45所述的組成物，以及視需要地藥學上可接受的載體。
- 一種影響腫瘤細胞生長的方法，包括向受試者施用如請求項44所述的TIL和/或如請求項46所述的醫藥組成物。
- 一種如請求項44所述的TIL和/或如請求項46所述的醫藥組成物在製備藥物中的應用，該藥物用於預防和/或治療腫瘤。
- 如請求項48所述的應用，其中，該腫瘤選自實體瘤。
- 如請求項48或49所述的應用，其中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
- 一種預防和/或治療腫瘤的方法，包括向受試者施用如請求項44所述的TIL和/或如請求項46所述的醫藥組成物。
- 如請求項51所述的方法，其中，該腫瘤選自實體瘤。
- 如請求項51或52所述的方法，其中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
- 如請求項44所述的TIL和/或如請求項求46所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤。
- 如請求項44所述的TIL和/或請求項46所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤，其中，該腫瘤選自實體瘤。
- 如請求項44所述的TIL和/或如請求項46所述的醫藥組成物，其用於預防和/或治療腫瘤，其中，該腫瘤選自以下組的一種或多種：黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、和腎癌。
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