JP2013215141A - メモリーｔ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗体等を使用することなく簡便かつ迅速に、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞群を大量に調製する方法や、かかる方法により作製したメモリーＴ細胞群を主成分とする医薬用組成物等の提供。
【解決手段】採取されたリンパ球細胞を活性化培養し、培養しているリンパ球細胞群細胞密度が一定の閾値を越えたことを指標として、リンパ球細胞群中のメモリーＴ細胞の占有率が望ましい値に達したことを検知し、かかる細胞群を収穫し、凍結保存する。かかる凍結保存細胞を解凍し、培養して増殖させることにより、メモリーＴ細胞を主成分とする大量のリンパ球細胞群を製造する。
【選択図】図３

Description

本発明は、Ｔ細胞を含有する末梢血由来のＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性のＴ細胞群や、ＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞群を簡便に大量に得るための、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の大量製造方法、かかるリンパ球細胞群を含有する医薬組成物、並びにかかるリンパ球細胞群の製造システム（装置等の手段の組合せ）等に関する。

リンパ球細胞は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。リンパ球細胞の表面には分化抗原と称される抗原型が発現しており、リンパ球細胞はこの抗原型により様々なサブセットに分類されている。例えば、リンパ球細胞は、ＣＤ３（ＣＤはcluster of differentiationの略）発現の有無をモノクローナル抗体の反応性により検出することにより、細胞性免疫に関与するＴリンパ球細胞（ＣＤ３陽性、ＣＤ３＋とも表す；以下陽性を＋、陰性を−と記載することもある）と液性免疫に関与するＢリンパ球細胞等（ＣＤ３陰性、ＣＤ３−とも表す）とに区別される。そしてこれらのリンパ球細胞はその機能も異なる。さらに、細胞性免疫に関与するＴリンパ球細胞（Ｔ細胞ともいう）は、ＣＤ４を発現するＣＤ４陽性細胞とＣＤ８を発現するＣＤ８陽性細胞とに分類される。従来、ＣＤ４陽性細胞はヘルパー機能を果たし、ＣＤ８陽性細胞は細胞障害性機能を果たすと考えられてきたことから、今日までＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞とを分離しての研究が多数行われている。

リンパ球細胞を形態で区別することは困難であるが、上記のように抗原型を基に各サブセットに分けて機能を解析することが多数行われている。しかし、その大半が、それぞれの細胞の抗原型に対する主としてモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ４モノクローナル抗体や抗ＣＤ８モノクローナル抗体を使用したものである。そして、磁気マイクロビーズに結合した抗体をリンパ球細胞と反応させ、容器外部より当てた磁石の磁力で磁気マイクロビーズを集め、かかるビーズに抗体を介して結合した細胞を分離したり、分離カラムを利用したりして分離する方法である。また、ＣＤ４陽性細胞やＣＤ８陽性細胞を大量に得るために、マイクロビーズ法によってそれぞれを分離した後に、さらに活性化して増幅培養することも行われている（特許文献２参照）。また、最近では、測定機器の進歩により、それぞれの表面抗原に対する蛍光標識抗体でリンパ球細胞を染色し、セルソーターを使用して分別する方法も実施されている。この方法では、細胞表面抗原に対する抗体を予め蛍光色素で標識し、標識抗体をリンパ球細胞に結合させ、このリンパ球細胞をセルソーターによる測定に供して表面抗原の発現状態を検出し、さらにはサブセットを分離する。しかし、この方法では小規模での適用となる点が問題である（非特許文献２参照）。いずれの従来法を採用するにせよ、高価な抗体でリンパ球細胞を標識する等の煩雑な作業を避けることはできず、大量の細胞を得るには、費用と労力とを要するものであった。

活性化Ｔリンパ球細胞の製造方法は、関根らによる報告が最初である。これは活性化Ｔリンパ球細胞群の増殖を選択的に刺激し、増殖した活性化Ｔリンパ球細胞群を得る方法を初めて報告したものであり、具体的にはヒトの末梢血リンパ球細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell）を、抗ＣＤ３抗体のひとつであるＯＫＴ３抗体の固相化された培養フラスコ中で第一期培養し、そのように培養した細胞をＯＫＴ３抗体非存在下で第二期培養するものである。この方法で得られた活性化リンパ球細胞群は、さらにインターロイキン２（ＩＬ−２）存在下での培養を経て、がんの養子免疫療法として、当該末梢血を採取した患者に投与することができる（特許文献１参照）。また、同様にして、ドナー由来の末梢血リンパ球細胞をＯＫＴ３抗体が固相化された培養容器でＩＬ−２存在下に培養し、得られた活性化リンパ球細胞群からＣＤ４陽性細胞を分離し、分離したＣＤ４陽性細胞が総細胞に対して９０％以上含有する製剤とした、感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物は、患者に投与することもできる（特許文献２参照）。これらのリンパ球細胞源としては、腫瘍浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ：Tumor Infiltrating Lymphocyte）、臍帯血、骨髄等が使用可能である（特許文献２参照）。

別の機能的観点から、リンパ球細胞をナイーブリンパ球細胞とメモリーリンパ球細胞とに分類することがある。ナイーブリンパ球細胞は、未だ抗原刺激を受けていない、ＣＤ４５ＲＡ抗原を細胞表面に発現しているリンパ球細胞であり、局所リンパ節等で抗原と出会い刺激を受ける中で活性化されるとされている。メモリーリンパ球細胞は、特異的刺激か非特異的刺激かを問わず、既に抗原刺激を受けてＣＤ４５ＲＯ抗原を発現しているリンパ球細胞である。Ｔリンパ球細胞やＢリンパ球細胞もそれぞれの状態に応じてナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞や、ナイーブＢ細胞とメモリーＢ細胞とに分けることができる。メモリーＴ細胞はさらにエフェクターメモリー（effector memory；ＥＭ）Ｔ細胞とセントラルメモリー（central memory；ＣＭ）Ｔ細胞に分けることができる。セントラルメモリーＴ細胞には、リンパ節にホーミングして体内に侵入してくる異物や抗原を迎え撃つ機能があり、エフェクターメモリーＴ細胞には本来あるべき部位に所属して異物や抗原を捕らえる作用がある。したがって、メモリーＴ細胞群を主成分として含有する製剤は、養子免疫療法において高い治療効果が得られることが予想された。そこで、大隅らは、養子免疫療法に使用される活性化リンパ球細胞の作用メカニズムを解明するために、メモリーＴ細胞サブセットに着目して、活性化増幅培養して得られた活性化リンパ球細胞群の機能を解析した。その結果、活性化リンパ球細胞群に含まれるエフェクターメモリーＴ細胞が、腫瘍細胞との共培養開始２４時間後にはがん細胞に対する細胞障害活性を発現していたこと、一方、セントラルメモリーＴ細胞はがん細胞と共培養を開始して腫瘍抗原を認識した４８時間後にがん細胞に対する細胞障害活性を発現したもので、そのときエフェクターメモリーＴ細胞へと分化していたことが明らかとなった（非特許文献２参照）。

メモリーＴ細胞を採取した報告は、関根らによる２０００年の文献に遡り（特許文献３参照）、これは臍帯血由来のリンパ球細胞を抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２との存在下に活性化培養し、７日間活性化増殖させた結果、ＣＤ３陽性細胞の割合が９８％、さらにＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の割合が７３％の細胞集団を採取したものである。しかしながら、この時期の細胞は増殖が十分ではなく細胞数が少ないという問題があった。

上記の活性化リンパ球細胞は、増殖培養後速やかに患者に投与する必要があり、病状に即した迅速な投与や安定した品質管理が困難であった。そこで、患者の便を考慮して、患者血よりリンパ球細胞を調製するに際し、活性化培養後にリンパ球細胞を凍結保存した報告がある（非特許文献１参照）。ここでは凍結解凍したリンパ球細胞を再度活性化培養して得られる活性化リンパ球細胞中のＣＤ４リンパ球細胞及びＣＤ８リンパ球細胞の占有率が算出されており、ほとんど全てのポピュレーションがほぼ並行的に増殖していると結論付けている。非特許文献３では、臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞を分離した後、一旦凍結保存し、解凍後に活性化培養した際のサブセット変化を培養期間中追跡した結果が開示されている。臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞はいずれも、メモリーＴ細胞のサブセットであるセントラルメモリーＴ細胞が培養開始後速やかに増殖し６日から７日で増殖のピークに達してその後減少すること、エフェクターメモリーＴ細胞が培養後期に増殖することが報告されている。また、関根らは、患者のリンパ球細胞をインビトロで増殖・活性化培養させた後に超低温フリーザー内で凍結・保存し、使用時に凍結状態から解凍した直後に、生理食塩液を加えて懸濁して投与用製剤とする投与用製剤の製造方法（特許文献４参照）を開示している。

上記のとおり養子免疫療法におけるメモリーＴ細胞の利用の有効性が示唆され、メモリーＴ細胞に富んだ画分を大量に簡便に採取することは社会的要求といえる。しかし、リンパ球細胞提供者に多大な負担を強いることなく、臨床に供するために必要なメモリーＴ細胞を大量に簡便に採取する方法はないのが現状である。

特開平３−８００７６号公報 特許第４３８９０３９号公報 特開２００２−１７１９６６号公報 特許第４３９５６４４号公報

Sekine T., Human Cell, 5(3) 243-245 (1992) 第３２回癌免疫外科研究会 プログラム・抄録集 １０３ページ 平成２３年４月 Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 257-262 (2009)

末梢血由来リンパ球細胞群は、活性化培養を施す前にはそのおよそ５０％をナイーブＴ細胞が占めているが、活性化培養によりその比率は低下する。一方、培養開始前には半数以下であったメモリーＴ細胞の占有率は活性化培養により増加して９５％にも達するが、さらに培養を継続すると漸減する。本発明は、抗体等を使用することなく簡便かつ迅速な高増殖培養法により、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞群を大量に調製する方法や、かかる方法により作製したメモリーＴ細胞群を主成分とする医薬用組成物等を提供することを課題とする。

本発明者らは、活性化リンパ球細胞に含まれるメモリーＴ細胞の比率を上昇させることを目的として様々な条件で検討を重ねて努力をした結果、末梢血リンパ球細胞を抗ＣＤ３抗体固相化フラスコにＩＬ−２を含む培養液中で活性化培養すると、時間の経過と共に細胞表面抗原がＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋）のＴ細胞群や、ＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陰性（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−）のＴ細胞群、すなわちメモリーＴ細胞群が増加し、リンパ球細胞群中に占める割合が上昇することを見いだしていた。しかしながら、この時点ではまだ総細胞数が少ないためにさらに培養を継続する必要があるが、培養を継続するとメモリーＴ細胞群の割合が減少に転じることが判明した。そこで本発明者らは、メモリーＴ細胞群の割合を減少させずに、リンパ球細胞を増殖させ、メモリーＴ細胞群を主成分とする群を大量に製造する方法について鋭意検討した。その結果、メモリーＴ細胞を大量に得るために、活性化培養中のリンパ球細胞群中の表面抗原がＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋及び／又はＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−であるＴ細胞群の比率が望ましい比率に上昇するまで培養を継続すること、そしてその望ましい比率にまで上昇したリンパ球細胞群を収穫するにあたっては、細胞密度が一定の閾値を越えることを指標とし、かかる収穫した細胞を凍結保存した後、再び活性化増幅培養することにより上記課題を解決した。

すなわち、メモリーＴ細胞群の占有率の上昇と活性化培養リンパ球細胞群の細胞密度との関係を見いだしたことにより、細胞の収穫の指標とする一定の閾値以上の細胞密度であることが、上記メモリーＴ細胞群が望ましい占有率に達したことを意味することとなった。それにより、細胞密度の測定という簡便かつ低コストの手段によって、十分な細胞数かつ高いメモリーＴ細胞群の占有率を有する細胞群の収穫に最適の時期が検知できるようになった。さらに、播種時の細胞密度を管理することにより、収穫までの培養期間を最適にコントロール可能なことも見いだし、短時間で十分な細胞数かつ高いメモリーＴ細胞群の占有率を有する細胞群を収穫することができた。このように、抗体等を使用することなく、簡便でコストの少ないメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の大量製造方法を開発するに至ったものである。

すなわち、本発明は［１］（ａ）採取されたリンパ球細胞を活性化培養する工程；（ｂ）メモリーＴ細胞群の占有率上昇をリンパ球細胞密度に基づいて検知し、工程（ａ）のリンパ球細胞を凍結保存する工程；（ｃ）凍結されたリンパ球細胞を解凍し、活性化培養する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えた高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法や、［２］工程（ｂ）のメモリーＴ細胞群の占有率上昇のリンパ球細胞密度に基づいた検知が、培養液中に浮遊するリンパ球細胞数を指標とすることを特徴とする前記［１］に記載の製造方法や、［３］工程（ｂ）のリンパ球細胞密度が、培養液中に浮遊するリンパ球細胞数が４×１０^５細胞／ｍＬ以上であることを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載の製造方法や、［４］活性化培養が、ＩＬ−２及び固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で培養することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか１に記載の製造方法からなる。

また、本発明は［５］工程（ｃ）が、解凍後２週間以内に完了することを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか１に記載の製造方法や、［６］メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群が、リンパ球細胞群のメモリーＴ細胞の占有率が７５％以上であるリンパ球細胞群であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか１に記載の製造方法や、［７］メモリーＴ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞をリンパ球細胞群の７０％以上含むことを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１に記載の製造方法や、［８］単離されたリンパ球細胞が、ヒト末梢血由来であることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれか１に記載の製造方法や、［９］リンパ球細胞群が、第三者に投与するためのものであることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれか１に記載の製造方法からなる。

また、本発明は［１０］リンパ球細胞群の７５％以上のメモリーＴ細胞を含むことを特徴とするリンパ球細胞群や、［１１］リンパ球細胞群の７０％以上のセントラルメモリーＴ細胞を含むことを特徴とする前記［１０］に記載のリンパ球細胞群や、［１２］前記［１０］又は［１１］に記載のリンパ球細胞群を有効成分とする医薬組成物や、［１３］（Ａ）リンパ球細胞の活性化培養手段；（Ｂ）リンパ球細胞密度に基づく、メモリーＴ細胞群の占有率上昇の検知手段；（Ｃ）リンパ球細胞の凍結保存手段；（Ｄ）凍結されたリンパ球細胞の解凍手段；の（Ａ）〜（Ｄ）の手段を備えた、高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システムからなる。

本発明によれば、末梢血由来の活性化リンパ球細胞に含有されるＣＤ４５ＲＯ＋かつＣＤ６２Ｌ＋やＣＤ４５ＲＯ＋かつＣＤ６２Ｌ−であるメモリーＴ細胞群を主成分とするリンパ球細胞群を、簡便かつ大量に提供することができる。活性化リンパ球細胞群に含まれるメモリーＴ細胞群の増殖を追跡するに当たって、従来法で行われる細胞表面抗原の解析といった高価な抗体を使用しての煩雑な方法を用いることなく、活性化培養液中の細胞数、特に浮遊リンパ球細胞数を計測して細胞密度を算出し、予め設定された一定の閾値と比較するという、極めて簡便かつ安価な方法でメモリーＴ細胞の増殖及び占有率の状況を把握することができる。それにより、細胞収穫に最適の時期を見出して細胞を収穫することができ、さらにこの収穫した細胞を凍結保存することにより、メモリーＴ細胞の占有率が増加した状態のリンパ球細胞群を維持し適宜使用することを可能とする。さらに、凍結したメモリーＴ細胞群を、解凍後に再度活性化培養することにより、高いメモリーＴ細胞群の占める割合を維持しつつ細胞群が増幅される結果、メモリーＴ細胞群を主成分とする大量のリンパ球細胞群を得ることを可能とするものである。また、本発明の製造方法は、リンパ球細胞数と培養時間、そして最終的に得られるメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の量とについて詳細に検討した結果、解凍後２週間以内という短期間でメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群を大量製造することができるという効果をも有する。

本発明では、セントラルメモリーＴ細胞とエフェクターメモリーＴ細胞を含むメモリーＴ細胞群の、活性化培養による占有率増加を検知し、凍結処理を行う工程を経て、高いメモリーＴ細胞占有率を有するリンパ球細胞群を製造する。セントラルメモリーＴ細胞には、リンパ節にホーミングして体内に侵入してくる異物や抗原を迎え撃つ機能があり、エフェクターメモリーＴ細胞には本来あるべき部位に所属して異物や抗原を捕らえる作用がある。したがって、かかるメモリーＴ細胞群を主成分とするリンパ球細胞群は、同一生体に戻す養子免疫療法や第三者へ投与する医薬組成物として用いることができ、従来養子免疫療法等に使用されてきたメモリーＴ細胞の占有率が低いリンパ球細胞群よりはるかに高い治療効果が期待できるものである。

活性化培養期間１、５、６、１３日目のリンパ球細胞を、細胞表面抗原（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３）の有無により分類した結果を示す図である（ｎ＝３）。末梢血リンパ球細胞に占めるＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋のＴリンパ球細胞（ＣＭ）及びＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−のＴリンパ球細胞（ＥＭ）の合計であるメモリーＴ細胞（memory）の占有率は５日目、６日目には９０％を超えるが、培養の継続につれて低下する。 凍結保存前に活性化培養後の細胞群において占有率が上昇したメモリーＴ細胞群は、凍結解凍後、活性化培養及び増幅培養の過程にあっても高い存在比率で維持されることを示す図である（ｎ＝３）。 本発明のメモリー細胞を主成分とした医療組成物の製造工程の概要を表す図である。 凍結保存しない従来法で作製した活性化リンパ球細胞群（Ａ）と、本発明の方法により作製した活性化リンパ球細胞群（Ｂ）における、各細胞の存在比率を細胞表面抗原（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３）の有無に基づき分類し調べた結果を示す図である。ＰＢＭＣ：培養開始時の、末梢血管より採血分離した単核球細胞（リンパ球細胞リッチ画分）、＋５０：培養開始後４日目に５０ｍＬの培地を添加する直前の細胞、＋１５０及びFreeze：培養開始後５日目に２度目の培地添加又は凍結処理を行う直前の細胞、生ＢＰ：凍結工程に廻さず、＋１５０でさらに培養規模を拡大する直前の細胞、生Ｈ：上記生ＢＰの培養を終了して収穫直前の細胞、ＴＷ（Thaw）：凍結細胞を解凍した直後の細胞、ＯＫＴ：拡大培養終了後の、ＯＫＴ３抗体による活性化培養２直前の細胞、解凍ＢＰ：増幅培養に入る直前（活性化培養２後）の細胞、解凍Ｈ（Harvest）：増幅培養２後の細胞、を表す。

本発明において「メモリーＴ細胞」とは、リンパ球細胞表面抗原としてＣＤ４５ＲＯを発現するＴ細胞をいい、かかるメモリーＴ細胞としてはセントラルメモリーＴ細胞やエフェクターメモリーＴ細胞を例示することができる。リンパ球細胞は、その表面に多様な細胞表面抗原を発現しており、表面抗原に基づいて多数のサブセットに分類区別することが可能である。例えば、リンパ球細胞はＴ細胞とＢ細胞に分けられるが、Ｔ細胞はその表面にＣＤ３表面抗原を有することでＢ細胞と区別される。さらに、表面抗原として、ＣＤ４５ＲＯやＣＤ４５ＲＯのアイソフォームであるＣＤ４５ＲＡ抗原があり、これらの抗原の有無による分類がある。ＣＤ４５ＲＯは、ＣＤ４５ＲＡを発現するナイーブなリンパ球細胞が、特異的であれ非特異的であれ抗原刺激を受けた際にＣＤ４５ＲＡに代わって発現するメモリー細胞の指標の１つとなる抗原型である。ＣＤ６２Ｌは、セレクチンファミリーに属する７４ｋＤａの糖タンパク質であり、大半のリンパ球細胞に発現しており、リンパ球細胞のリンパ節へのホーミングに関与する細胞接着分子である。これは細胞表面抗原としてナイーブ細胞でも発現するが、ＣＤ４５ＲＯの発現を伴う場合、ＣＤ６２Ｌの発現強度によって、セントラルメモリーやエフェクターメモリーといったメモリー細胞サブセットの区別が可能となる。そして、ＣＤ４５ＲＯ＋かつＣＤ６２Ｌ＋の表面抗原を有するＴ細胞はセントラルメモリーＴ細胞と、ＣＤ４５ＲＯ＋かつＣＤ６２Ｌ−の表面抗原を有するＴ細胞はエフェクターメモリーＴ細胞とされている。

すなわち、リンパ球細胞表面に抗原ＣＤ３を発現している、ＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）のＴ細胞のうち、細胞表面抗原ＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性のＴ細胞群（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋）はセントラルメモリーＴ細胞群、細胞表面抗原ＣＤ４５ＲＯ陽性かつＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞群（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−）はエフェクターメモリーＴ細胞群であり、これらセントラルメモリーＴ細胞群とエフェクターメモリーＴ細胞群は合わせてメモリーＴ細胞群を構成する。かかる細胞表面抗原の検出は、蛍光色素で標識した抗体（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体）を用いてリンパ球細胞を染色し、例えばFACS Calibur（ベクトン・ディッキンソン社製）等のフローサイトメーターによって、その蛍光色素標識抗体の有無及び細胞数を計測することができる。また、リンパ球細胞を蛍光色素標識抗体や一次抗体及び蛍光標識二次抗体で染色し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察することもできる。

通常、健常人の末梢血リンパ球細胞群におけるメモリーＴ細胞の占有率は４０％前後であるが、本発明の製造方法により、その占有率を上昇させることが可能である。本発明における「メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群」（以下、「メモリーＴ細胞高含有リンパ球細胞群」ともいう）としては、メモリーＴ細胞高含有リンパ球細胞群におけるメモリーＴ細胞の占有率が、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のリンパ球細胞群を意味する。なかでも、リンパ球細胞群におけるメモリーＴ細胞の占有率が７５％以上であることが好ましい。さらに、本発明のリンパ球細胞群としては、リンパ球細胞群の７０％以上、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上がセントラルメモリーＴ細胞であることが好ましい。なお、本発明のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群は、メモリーＴ細胞以外のＴ細胞の混入を除外するものではない。

また、本発明のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法においては、工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えた高増殖培養法により、同一生体に戻す養子免疫療法の実施や第三者に投与する医薬組成物の調製のための十分な量のメモリーＴ細胞高含有リンパ球細胞群を提供することができる。ここで、高増殖培養法とは、採血試料中のリンパ球数を５００倍以上、好ましくは６００倍以上、７００倍以上、８００倍以上より好ましくは９００倍以上に増殖させることができる培養方法であり、かかる培養法により、例えば、５０ｍＬの血液から得られるメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群における総リンパ球数が、好ましくは５×１０^８個以上、より好ましくは８×１０^８個、さらに好ましくは１×１０^９個以上、最も好ましくは３×１０^９個以上、メモリーＴ細胞を高含有するリンパ球細胞群を得ることができる。また、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の細胞密度としては５×１０^４個／ｍＬ以上、好ましくは１×１０^５個／ｍＬ以上、５×１０^５個／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０^６個／ｍＬ以上のメモリーＴ細胞高含有リンパ球細胞群を得ることができる。

また、工程（ａ）における「採取されたリンパ球細胞」としては、常法により採取された末梢血や臍帯血由来、さらに骨髄由来のリンパ球細胞を例示することができるが、採取の機会や採取の容易さから末梢血由来のリンパ球細胞が好ましい。かかる末梢血としては、他者由来末梢血や自己由来末梢血があげられるが、養子免疫療法に用いるときには自己由来末梢血が有利に用いられる。腫瘍及びその再発、ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患に対する予防及び治療の観点から、臓器又は骨髄移植等を受けた患者の場合は、移植臓器又は骨髄等の提供者由来の末梢血であることが好ましい。また、採取されたリンパ球細胞として単離されたリンパ球細胞を用いることが好ましく、かかる単離されたリンパ球細胞は、血管からの採血やフェレーシス等により採取された末梢血、好ましくは静脈から採取された末梢血を一般的手法で処理することにより得ることができる。末梢血からのリンパ球細胞の分離は、ショ糖や市販のリンパ球細胞分離剤等を用いた不連続密度勾配遠心法などの周知のリンパ球細胞分離法によって取得できる。リンパ球細胞単離用の末梢血は、血液の凝固が起こらないように、ヘパリンやクエン酸を加えたものを使用することができる。かかる末梢血の量は特に制限されず、ドナーの負担、採血の手間、リンパ球細胞の分離操作等に基づいて適宜設定することができ、一回に採血する量を０．０１ｍＬから１００ｍＬ程度、より好ましくは５ｍＬから５０ｍＬ程度、さらに好ましくは１０ｍＬから２０ｍＬとすることができる。

またリンパ球細胞の由来は特にヒトのみに制限されず、サル、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスターを挙げることもできるが、本発明のリンパ球細胞群をヒトに投与する場合は、ヒト由来であることが好ましい。また、本発明のリンパ球細胞群は、投与対象由来でも、投与対象以外の個体由来でもよく、すなわちドナーとレシピエントは同一でも一致しなくてもよい。

工程（ａ）や工程（ｃ）における「活性化培養」としては、インビトロ培養により、メモリーＴ細胞群の占有率を上昇しうる、例えば特開平３−８００７６号公報に記載のような周知のリンパ球細胞の活性化培養であれば特に制限されないが、インターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下に培養することが好ましく、ＩＬ−２と抗ＣＤ３抗体の存在下に培養することがより好ましい。例えば、ＩＬ−２を含む培養用培地にリンパ球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器中での培養を好適に例示することができる。さらに、必要により各種マイトージェンを使用してリンパ球細胞の活性化を行うことができる。かかる抗ＣＤ３抗体としては、リンパ球細胞表面のＣＤ３表面抗原を認識して増殖・活性化を促進できる抗体であれば、どのようなものでも使用できる。リンパ球細胞の活性化刺激に使用する抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を使用して動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、容易性に優れた市販品のＯＫＴ−３抗体（製造元：ｅＢＩＯ社）を有利に使用することができる。そして、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システムにおけるリンパ球細胞の活性化培養手段としては、細胞の培養に通常用いられる手段、例えば、細胞培養容器、細胞培養装置、細胞培養槽等を挙げることができる。

上記活性化培養における培養法としては、高増殖培養法の実施完了後にメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群が高増殖率で大量に製造される限りその条件は特に制限されない。活性化培養は、抗ＣＤ３抗体の刺激情報がリンパ球細胞に伝達されること、及びメモリーＴ細胞群が増殖してリンパ球細胞群に対する占有率を上昇させ、さらにかかる上昇した占有率が大幅に減少しないことが前提となるため、活性化培養の培養期間としては、十分な数のリンパ球細胞が得られるまで、１〜１０日間、より好ましくは２〜８日間、さらに好ましくは３〜７日間、特に好ましくは４〜６日間を例示することができる。この培養期間中の培地の交換頻度に特に制限はないが、培養液の劣化及びＩＬ−２活性の低下を防ぐために、１〜７日に１回行うことが好ましく、添加前の培養液中の液量に対して０．１〜５倍程度の量を添加することが好ましい。

工程（ａ）において、リンパ球細胞の活性化培養を行うが、通常、活性化培養リンパ球細胞には、フラスコ底面に付着して増殖する細胞もあり、活性化を受けた後培養液中に浮遊しながら増殖していく細胞もある。付着して増殖する細胞は、浮遊細胞と同様に生細胞である。培養液が活性化培養開始時の培養液と同量である培養方法とすることもできるが、培養途中でさらに培養液を添加して数日、例えば１〜２日活性化培養を継続してリンパ球細胞をさらに増殖する培養方法とすることもできる。かかる培養液の添加量は、活性化培養開始時の培養液量の０．５〜２倍量が好ましく、中でも活性化培養開始時の培養液量と同量の培養液を好適に例示することができる。上記培養液をさらに添加しての継続培養に際しては、培養液中に浮遊するリンパ球細胞のみを植継ぐこともできるが、浮遊リンパ球細胞に加えて培養容器に接着したリンパ球細胞の双方を植継ぐこともできる。

また工程（ａ）の活性化培養において、培養開始時のリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延し、逆に多すぎると早期にプラトーに達し、培養液を添加して全体量を増やすなどの方法を採用できないため、十分な量の細胞を得ることができない。したがって、リンパ球細胞の増殖の立ち上がりを速やかにし、同時に前記Ｔ細胞群が増殖して活性化リンパ球細胞中に占める割合が速やかに上昇し、十分量の細胞を得られるように、開始時の播種数を調整することが好ましい。例えば、１．０×１０^５〜１．０×１０^６細胞／ｍＬ、好ましくは１．５×１０^５〜６．０×１０^５細胞／ｍＬ、より好ましくは４．０×１０^５〜６．０×１０^５細胞／ｍＬに調製して培養を開始することが好ましい。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ^２フラスコに培養液５０ｍＬや、２５ｃｍ^２フラスコに５ｍＬ培養液を使用する例を挙げることができる。

上記のように、本発明における活性化培養では、抗ＣＤ３抗体は、リンパ球細胞の増殖効率や操作の容易性の観点から、固相化して使用することが好ましい。抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としてはガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質からなる各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。入手が容易であるため、市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養用フラスコ等の器具を使用することもでき、その大きさは適宜選択することができる。前記抗体の固相化方法は、非特異的吸着や化学結合による方法でも行えるが、固相化した抗ＣＤ３抗体によりリンパ球細胞が刺激できる固相化方法であればいずれの方法でもよい。固相化は、前記抗ＣＤ３抗体の希釈液を固相化する器具に分注し、例えば４〜３７℃で２〜２４時間静置することによって行うことができる。前記抗ＣＤ３抗体の希釈液は、抗ＣＤ３抗体を、滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１〜３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈して希釈液として用いることが好ましい。固相化した器具は、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時に前記希釈液を除去して、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄することが好ましい。また上記のように、本発明における活性化培養では、培養用培地液中にインターロイキン２（ＩＬ−２）を使用することがリンパ球細胞の増殖効率の観点から望ましい。ＩＬ−２は、培養用培地液の濃度が１〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように希釈して使用することが好ましい。かかるＩＬ−２としては市販品を用いることができる。ＩＬ−２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができる。また一旦溶解したものは、活性の低下を防ぐために冷蔵保存することが好ましい。

また、上記活性化培養における培養液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、血清等の生物由来の成分を含有する培養液や平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地が使用できる。具体的には、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ−Ｖ等を挙げることができ、中でもＡＩＭ−Ｖが特に好ましい。培養用培地は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れて好ましい。これらの培地及びヒト血清は、市販品を用いることができる。培養は、一般的な細胞培養の方法に従うことができる。例えば、ＣＯ_２インキュベーター内で行うことができる。ＣＯ_２濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、温度は３０〜４０℃、特に３７℃が好ましく、湿度は９０〜１００％、特に９５％が好ましい。

本発明における高増殖培養法においては、上記活性化培養の前後に、リンパ球細胞の増殖のための培養を行うこともできる。かかる培養としては、ＩＬ−２存在下で抗ＣＤ３抗体の非存在下の培養（拡大培養や増幅培養）を挙げることができ、その培地成分は適宜調節することができる。例えば、工程（ｃ）における解凍したリンパ球細胞の活性化培養に続いて実施される増幅培養では、浮遊リンパ球細胞及び接着リンパ球細胞を植継ぎ、４〜１３日実施する培養を挙げることができる。また、上記拡大培養や増幅培養における培養液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、血清等の生物由来の成分を含有する培養液や平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地が使用でき、市販品を入手することができる。具体的には、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ−Ｖ等を挙げることができ、なかでもＡＩＭ−Ｖが特に好ましい。

また、工程（ｂ）における「リンパ球細胞密度に基づいて検知」とは、工程（ａ）でのリンパ球細胞のインビトロでの活性化培養において、必要に応じて逐次培養液中の細胞数を計測しながら細胞密度が一定の閾値以上となるまで活性化培養を継続する判断をすることをいうものである。細胞密度が一定の閾値、例えば４×１０^５細胞／ｍＬ以上となった場合に、活性化培養液中のメモリーＴ細胞の占有率上昇を検知するものである。かかるリンパ球細胞密度に基づいての検知には、顕微鏡によるリンパ球細胞数の直接測定や細胞計数装置を用いての直接測定の他一定の細胞培養条件下から間接的にリンパ球細胞数を検知することが含まれる。すなわち、あらかじめ特定の細胞数のリンパ球を一定の活性化培養条件下で培養したときの細胞数の測定データに基づいて間接的にリンパ球細胞数を推測することによる検知も含まれる。また、リンパ球を活性化培養すると、一部の細胞は培養容器の底面に付着して活性化増殖し、一部の細胞は培養液中に浮遊して増殖する。一方、活性化培養中には逐次培養液中の細胞数を計測しながら培養を継続する。そのため複数回にわたりリンパ球細胞数を計測することがある。その場合に、底面に付着したリンパ球細胞をピペット等により剥離して剥離リンパ球細胞と浮遊リンパ球細胞とを均一な懸濁液として計測すると、剥離したリンパ球細胞がその後増殖を停止してしまうことがある。このことはより多くのリンパ球細胞を収穫する観点から問題があるため、培養中の細胞数の計測は、付着した細胞を剥離させずに浮遊リンパ球細胞数を計測することが望ましい。浮遊リンパ球細胞数と付着リンパ球細胞数や総リンパ球細胞数とはある程度相関するものと考えられることから、浮遊リンパ球細胞数を計測することにより増殖の趨勢を推し量ることができる。そこで、操作簡便の簡便性と、それによるコンタミネーションの防止の観点、さらに増殖促進の観点から、浮遊リンパ球細胞の計測が有用である。また、培養を終了する際には、タッピングにより培養容器底面に付着した細胞も剥がして総リンパ球細胞数を計測することが収率等の観点からは望ましい。

したがって、工程（ｂ）における「メモリーＴ細胞群の占有率上昇」とは、工程（ａ）において活性化培養されたリンパ球細胞の総数におけるメモリーＴ細胞の占める割合の上昇、具体的にはメモリーＴ細胞の占有率が、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、より好ましくは９５％以上となることを意味する。このメモリーＴ細胞の占有率は、抗体を用いてフローサイトメーターによりＣＤ３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ等の細胞表面抗原を直接調べることにより算出することもできる。そして、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システムにおける、リンパ球細胞密度に基づくメモリーＴ細胞群の占有率上昇の検知手段としては、リンパ球細胞数の測定に通常用いられる手段、例えば、浮遊リンパ球細胞の細胞計数装置等を挙げることができる。

工程（ｂ）における「凍結保存」は、一般的な細胞凍結の手法に従って行うことができる。例えば、リンパ球細胞をバンバンカー（リンフォテック社製）やＣＰ−１（極東製薬工業株式会社製）等の細胞凍結保存液製品に懸濁して凍結保存容器に格納し、その容器をバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、−８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で一時保管して２日後に、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として液体窒素中で保存することができる。また、凍結・解凍後の活性化培養における増殖の立ち上がりの観点から、１つの凍結保存容器に格納するリンパ球細胞数を調整することが望ましく、１つの凍結保存容器あたり１×１０^７〜５．０×１０^７個を保存することが好ましい。複数の凍結保存容器に保存した細胞を合わせて凍結解凍後の培養に用いてもよいが、操作の容易性及び品質管理の観点から１つの凍結保存容器のリンパ球細胞を１つ又は２以上の培養容器に移して培養することが好ましい。そして、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システムにおけるリンパ球細胞の凍結保存手段としては、細胞の凍結保存に通常用いられる手段、例えば、凍結保存容器、バイセル、超低温フリーザー、液体窒素タンク等を挙げることができる。

工程（ｃ）における、凍結されたリンパ球細胞の「解凍」は、一般的な凍結細胞の解凍手法に従って行うことができる。例えば、３７℃のドライサーモユニット（タイテック社製）等を用いて４分間加熱処理することにより解凍することができる。かかる解凍したリンパ球細胞を適量の培地に移しいれた後に室温にて遠心操作を行い、上清を除去することにより細胞凍結保存液を除去することが好ましい。またかかる解凍後のリンパ球細胞の活性化培養は、抗ＣＤ３抗体の存在下の活性化培養後、さらに抗ＣＤ３抗体の活性化刺激無しの増幅培養を継続して行うこともできる。すなわち、抗ＣＤ３抗体を固相化していない器具、例えば培養用フラスコ、ローラーボトル、ガス透過性培養バッグ等で大量の細胞を得るまで培養を継続することができる。このとき、インターロイキン２（ＩＬ−２）存在下とすることが好ましい。これら条件でのリンパ球細胞の培養は、抗ＣＤ３抗体の刺激がないこと以外は、ヒト血清の濃度等、活性化刺激がある培養の条件と同じであることが好ましく、無血清培地を適時使用することが、作業性、コスト性、安全性等においてより好ましい。そして、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システムにおける凍結されたリンパ球細胞の解凍手段としては、凍結細胞の解凍に通常用いられる手段、例えば、ドライサーモユニット等を挙げることができる。

本発明のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法によると、７５％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のメモリーＴ細胞を含むリンパ球細胞群や、７０％以上、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上のセントラルメモリーＴ細胞を含むリンパ球細胞群を得ることができる。また本発明は、これらのメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群を有効成分として含有する養子免疫療法や第三者に投与するための医薬組成物とすることができる。かかる医薬組成物は、抗腫瘍剤、ＨＩＶ治療薬、ウイルス感染症治療薬、自己免疫疾患治療薬、細胞または臓器の移植後の移植細胞または臓器の生着促進薬、腫瘍の再発予防薬として使用することができる。また、本発明のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群は、メモリーＴ細胞群の比率が８０％以上と高いため、リンパ球細胞群の細胞表面に存在する表面抗原に対する抗体等を用いてメモリーＴ細胞群を分離する等の煩雑な単離濃縮操作を施すことなく、医薬の材料として、適当な溶液に懸濁したものを使用することができる。本発明の医薬組成物の形態としては、非経口投与が好ましく、本発明のリンパ球細胞群を懸濁した、注射剤、点滴剤等の液体形状が好ましい。特に、ヒト血清アルブミンを０．０１〜５％となるように添加した輸液用生理食塩液等に本発明のリンパ球細胞群を懸濁した注射剤や点滴剤がより好ましいが、これに限定されるものではない。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が望ましい。投与する液量は、投与方法、投与する部位によって異なるが、通常は１〜５００ｍＬとするのが好ましく、この液量中に後述するリンパ球投与量のリンパ球細胞数が含まれるようにするのが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、メモリーＴ細胞高含有リンパ球細胞群の他に、安定剤や緩衝液成分、他の治療薬やサプリメント等を含有していてもよい。本発明の医薬組成物の投与量、投与回数、投与期間等、及び本発明の医薬組成物におけるリンパ球細胞群の濃度は特に制限されず、投与対象の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができ、通常の場合においては、投与対象の体重１Ｋｇあたりのリンパ球投与量を、１×１０^２個〜１×１０^９個を目安として設定することが好ましい。さらに有効とするためには、体重１Ｋｇあたりのリンパ球投与量を１×１０^３個以上とすることが好ましいが、５×１０^８個を超えても効力増大が見込めないことから、体重１Ｋｇ当たりの投与量を１×１０^３個〜５×１０^８個とすることが最も好ましい。投与頻度は、１回／日〜１回／月を好適に例示することができ、また投与回数は少なくとも１回以上は必要である。本発明の医薬組成物の使用においては、他の手術や投薬治療を併用することもできる。

以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定されるものではない。

［リンパ球細胞の活性化増殖］
（１）末梢血リンパ球細胞の調製
同意を得た健常者３名の末梢血各５０ｍＬを静脈からヘパリンを加えて採血した。各採血検体を２５０ｍＬの遠沈管（ＢＤファルコン；352075）に移し、検体毎に洗浄用液（０．１％ヒトアルブミン加生理食塩水：生理食塩液５００ｍＬ 製造元；大塚製薬、２５％ヒト献血アルブミン２．０ｍＬ 製造元；田辺三菱製薬）１００ｍＬを加え静かに混和して３倍に希釈した。本操作を含む以下の操作は無菌的に行った。１検体あたり、１５ｍＬのフィコール（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を分注した５０ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン；352070）４本に、３倍希釈した血液を重層し、その遠沈管を１８００ｒｐｍで２０分間、室温でブレーキをかけずに遠心した（遠心機：株式会社コクサン製；H-700）。中間層の単核球層を、予め洗浄用液を分注した５０ｍＬ遠沈管に回収した。遠沈管の蓋を閉めて２〜３回転倒混和して１８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心後に上清を除去し、ペレットを分散させた後に洗浄用液を添加し、総量５０ｍＬの細胞懸濁液とした。前記懸濁液を１８００ｒｐｍ、１０分間、常温にて遠心し、得られたペレットに５０ｍＬの培地１（２％ヒト血清（リンフォテック社製）及び３５０Ｕ／ｍＬ ｒＩＬ−２（プロロイキン：ノバルティス社製）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社製））を加えて懸濁して細胞懸濁液とした。
４０μＬのチュルク氏液（武藤化学薬品社製）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを加えて混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤（エルマー社製；9731）上に流し込み、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製；211320）下に細胞数を算出した。
また、２０μＬのトリパンブルー染色液（SIGMA社製；93595）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤に流し込み、顕微鏡下に染色されていない生細胞を計測し、生存率を算出した。

（２）ＯＫＴ３固相化フラスコの調製
ＯＫＴ３（輸入発売元：ヤンセン協和株式会社、製造元：オーソファーマスーティカル：ＯＫＴ３注）溶液を生理食塩液で５μｇ／ｍＬに調製し、調製液１０ｍＬを底面積２２５ｃｍ^２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）に分注し、その底面全面がＯＫＴ３溶液で覆われるようにした。３時間以上静置後にフラスコ内のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬）を注ぎ込み、フラスコの蓋を閉めて激しく振蕩した後に、中の液を捨てた。再度、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬）をフラスコに流し込み、固相化面を下にして室温で１５分間静置した。その後、蓋を閉めて１分間激しく振蕩し、中の液を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取り、ＯＫＴ３固相化フラスコとした。調製当日に使用しない場合は、少量の生理食塩液を残して使用時まで４℃で保存した。
底面積２５ｃｍ^２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS2105R）にも上記記載と同様に、固相化処理を施した。

（３）播種リンパ球細胞数の検討−１
（１）で調製した細胞懸濁液を８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。細胞密度を培地１により、それぞれ０．２×１０^５個／ｍＬ、１．０×１０^５個／ｍＬ、２．０×１０^５個／ｍＬ、２．０×１０^６個／ｍＬ、６．０×１０^６個／ｍＬに調製した。各細胞密度の細胞懸濁液５ｍＬを上記（２）で調製したＯＫＴ３固相化２５ｃｍ^２フラスコにそれぞれ分注播種し、培地１を用いてテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養期間中に適宜、浮遊細胞数と生存率を（１）と同様の方法で計測・算出し、増殖状態に応じて培養液の色調変化を観察しながら適宜培地１を添加して１０日間培養を継続した。また、培養終了時には、培養フラスコをタッピングして、底面に付着したリンパ球細胞も回収し、総リンパ球細胞数及び生存率を（１）と同様の方法で計測・算出した。

結果：
表１から、播種細胞密度が０．２×１０^５個／ｍＬでは、１０日間培養しても十分な細胞数が得られないこと、また、６×１０^６個／ｍＬでは、増殖が低下し、生存率も不良であることより、両播種細胞密度は不適当と判定した。さらに生存率が９０％以下になることがない播種細胞密度１．０×１０^５個／ｍＬと２．０×１０^６個／ｍＬとの間で、播種細胞密度を再検討することとした。また、本検討では、培養液の色調変化と浮遊細胞数を指標として適宜培地１を追加したが、手技をより簡便なものとし、より速やかな細胞増殖を得るために、細胞密度と培養日数から培地の追加時期を決定するべく、培養液追加時期の検討を行うこととした。

（４）培養液追加時期の検討
同意を得た健常者３名より（１）と同様の手順で末梢血リンパ球細胞を調製し、細胞数を計測した。
調製したリンパ球細胞を（３）と同様に遠心し、培地１を用いて細胞密度がそれぞれ０．５×１０^５個／ｍＬ、１×１０^５個／ｍＬ、２．０×１０^５個／ｍＬ、４×１０^５個／ｍＬ、８×１０^５／個ｍＬとなるように調製した。各細胞密度の細胞懸濁液５０ｍＬを上記（２）で調製したＯＫＴ３固相化２２５ｃｍ^２フラスコ（住友ベークライト株式会社製；ＭＳ−２１８０Ｒ）に分注し、培地１を用いてテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養を開始した。培養効率化の観点から、培養開始３日目に各フラスコに培養液５０ｍＬを追加したが、培養液追加前に浮遊細胞数を、追加翌日４日目の細胞回収時に総細胞数を、（１）と同様の手法で計測した。

結果：
表２から、播種細胞数を２．０×１０^７（４．０×１０^５個／ｍＬ）又は４．０×１０^７（８．０×１０^５個／ｍＬ）とした場合に培養後総細胞数を播種細胞数で除した増殖率が２．５倍以上となる検体があった。すなわち検体１の４日目（１．１×１０^８個及び１．３×１０^８個）ならびに検体３の４日目（１．０×１０^８個）である。培養液添加後に得られた総細胞数が１０^８を超えた検体では、当該検体の培養液追加前の浮遊細胞数は、１．９×１０^７個及び６．３×１０^７（検体１の３日目）ならびに２．０×１０^７個（検体３の３日目）であった。そこで培養開始３日目以降で、浮遊細胞数が３．８×１０^５個／ｍＬ以上、あるいは４．０×１０^５個／ｍＬに到達したときに培養液を添加することとした。

（５）播種リンパ球細胞数の検討−２
同意を得た健常者３名より（１）と同様の手順で末梢血リンパ球細胞を調製し、細胞数を計測した。
調製したリンパ球細胞を（３）の播種リンパ球細胞数の検討−１と同様に遠心し、培地１を用いて細胞密度がそれぞれ１．０×１０^５個／ｍＬ、１．５×１０^５個／ｍＬ、２．０×１０^５個／ｍＬ、４．０×１０^５個／ｍＬ、６×１０^５個／ｍＬ、８×１０^５個／ｍＬとなるように調製し、各細胞懸濁液５ｍＬを上記（２）で調製したＯＫＴ３固相化２５ｃｍ^２フラスコに分注し、培地１を用いてテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始後浮遊細胞数及び生細胞率を（１）と同様な方法で漸次計測し、細胞密度４×１０^５個／ｍＬ以上となったときに各フラスコに培養液５ｍＬを追加し、最長計６日間培養した。培養終了時には、底面に付着したリンパ球細胞を（３）と同様に処理して全ての細胞を採取し、（１）と同様な方法で総細胞数及び生存率を計測・算出した。

結果：
本検討においては、最短日数で活性化培養を行い最多の細胞を得ることを目標とした。
播種細胞密度１．０×１０^５個／ｍＬでは、培養５日目でも３検体中２検体において、浮遊細胞数が４×１０^５個／ｍＬに到達しなかった。播種細胞密度１．０×１０^５個／ｍＬの検体３、１．５×１０^５個／ｍＬの検体１〜３、２．０×１０^５個／ｍＬの検体１〜３、及び４．０×１０^５個／ｍＬの検体１では、浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬを超えたのは５日目であり、培養液５ｍＬを追加したところ、翌日６日目に大半で総細胞数が１．２×１０^７を超えていた。４．０×１０^５個／ｍＬの検体２及び３、６．０×１０^５個／ｍＬの検体１〜３、ならびに８．０×１０^５個／ｍＬの検体１〜３は、いずれも４日目に浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬを超え、培養液を追加した翌５日目には全てで総細胞数が１．２×１０^７個を超えていた。
以上まとめると、培養開始時播種細胞密度は、１．５×１０^５個／ｍＬでは５日目に４×１０^５個／ｍＬを超えて翌日には培養を終了し、４．０×１０^５個／ｍＬでは４日目にほぼ４×１０^５個／ｍＬを超えて翌日には培養を終了し、６．０×１０^５個／ｍＬ及び８．０×１０^５個／ｍＬでは、４日目で全例が４×１０^５個／ｍＬを超えて翌日に培養を終了した。これより、培養期間を短縮するためには、播種細胞密度を４．０×１０^５個／ｍＬ以上、８．０×１０^５個／ｍＬ以下に設定することが適当と思われた。

［活性化培養時のリンパ球細胞表面抗原の推移］
（１）リンパ球細胞の調製及び活性化培養
同意を得た健常者３名より実施例１の（１）と同様の手順で末梢血リンパ球細胞を調製し、細胞数を計測した。
調製したリンパ球細胞を実施例１の（３）と同様に遠心し、培地１を用いてリンパ球細胞の細胞密度を６×１０^５個／ｍＬに調製した。この細胞懸濁液５０ｍＬを実施例１の（２）で作製した２２５ｃｍ^２ＯＫＴ３固相化フラスコ（住友ベークライト株式会社製：MS-2180R）に分注し、実施例１の（３）と同様に培地１を用いてテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養時に、随時浮遊細胞を採取して実施例１の（１）と同様に浮遊細胞数を計測した。培養４日目に４×１０^５個／ｍＬ以上となったため、５０ｍＬの培地１を追加し、培養を継続した。培養５日目に再度５０ｍＬの培地１を追加し、培養を継続した。培養６日目に、固相化フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて細胞浮遊液とした。この２５ｍＬをＯＫＴ３が固相化されていない２２５ｃｍ^２フラスコに分注し、さらに７５ｍＬの培地１を添加して培養を継続した。培養９日目に１００ｍＬの培地１を添加してさらに培養を１３日目まで継続した。培養１３日目にフラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて細胞浮遊液として回収し、培養を終了した。
この間、培養開始時、培養開始５日目（培地添加直前）、６日目（付着細胞剥離前／後）、及び１３日目に、細胞浮遊液の一部を採取し、直ちに採取リンパ球細胞の表面抗原を解析した。なお、このときリンパ球細胞のほぼ１００％がＣＤ３陽性細胞であることがわかっている（非特許引用文献３）。

（２）リンパ球細胞表面抗原の解析方法
上記（１）のスケジュールで採取した細胞浮遊液の各５ｍＬを１５ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン；352097）に取り、１８００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心した。得られたペレットにアルブミンシース液（ベックマンコールター社製：アイソフロー）を添加して１．０×１０^７個／ｍＬに各細胞懸濁液を調製した。５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン）に蛍光色素で標識した各抗体（抗ＣＤ３抗体 ベクトン・ディッキンソン社製349201、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体 同340438、抗ＣＤ６２Ｌ抗体 ベクトン・ディッキンソン・ファーミンジェン社製 555544）１０μＬをそれぞれ分注し、次に前記各細胞懸濁液５０μＬを各チューブに分注し、遮光、４℃で３０分静置反応させた。反応後の各チューブにアルブミンシース液２ｍＬを添加し、１８００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。上清を吸引除去し、各ペレットにセルフィックス（ベクトン・ディッキンソン社製）５００μＬを添加して懸濁液とし、目的の抗体染色リンパ球細胞集団について、フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製；FACS Calibur）を使用して細胞数１０，０００個を測定した。

（３）抗体染色リンパ球細胞集団の解析
上記（２）の方法で作製した抗体染色リンパ球細胞集団の解析を行った。
結果：
通常、末梢血リンパ球細胞に占めるＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球細胞とＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔリンパ球細胞の比率は２０〜４０％程度である（表４）。しかし、活性化培養を施すことにより、５日目には既にその占有率が９０％を超え、６日目には９５％を超えた。しかし、培養を継続すると上昇した占有率が４０％台へと当初のレベルに低下することが判明した（表４、図１）。NaiveはＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋のナイーブＴ細胞を、EffectorはＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ３＋のエフェクターＴ細胞を、ＣＭはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞を、ＥＭはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ３＋のエフェクターメモリーＴ細胞を、ＣＭ＋ＥＭ又はmemoryとしてＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋／−、ＣＤ３＋のメモリーＴ細胞を表す。
したがって、活性化培養中の浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬ以上となり培地を追加した翌日以降にはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔリンパ球細胞とＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−Ｔリンパ球細胞の占有率上昇を確認できた。そこで、収穫メモリー細胞数を増やすために、浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬ以上となり培地を追加した翌日以降で、なおかつメモリーＴ細胞占有率の低下が起きる前に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収することとした。

［凍結工程における凍結細胞密度の検討］
本発明の方法により得られるＴ細胞群を含有する製剤は、治療に使用するものであり、最終的に得られるリンパ球細胞の数は多い方が効率的である。そこで、凍結保存時の１チューブあたりの細胞数がその後の活性化増幅培養に影響する可能性を検討した。

（１）凍結細胞密度の検討−１ 活性化培養
同意を得た健常者３名より実施例１の（１）と同様の手順で末梢血リンパ球細胞を調製し、細胞数を計測した。
調製したリンパ球細胞を実施例１の（３）と同様に遠心し、培地１を用いてリンパ球細胞の細胞密度を６×１０^５個／ｍＬに調製した。この細胞懸濁液５０ｍＬを実施例１の（２）で作製した２２５ｃｍ^２ＯＫＴ３固相化フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）に分注し、実施例１の（３）と同様にテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始３日目に浮遊細胞数が４×１０^５個／ｍＬを超えていたことから、５０ｍＬの培地１を添加して翌日まで培養を継続した。培養開始４日目に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収して培地１による細胞懸濁液を得た。前記懸濁液中の細胞数を実施例１の（１）と同様の手順で計測した。

（２）凍結細胞密度の検討−２ 凍結保存
上記（１）で計測した細胞密度を元に、３検体について、凍結保存チューブ（コーニング社製）１本あたりのリンパ球細胞数を０．５×１０^７個、１．０×１０^７個、３．０×１０^７個、５．０×１０^７個となるように培地１を加えて調製し、１５ｍＬ遠沈管に分注して１２００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。遠心後、各遠沈管中の上清を除去し、得られたペレットを分散させ、凍結保存チューブ１本あたり１．８ｍＬの液量となるように細胞凍結保存液（ＣＰ−１：極東製薬工業株式会社製）を添加して細胞を懸濁して凍結保存チューブに分注し、その凍結保存チューブをバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、−８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で一時保管２日後に液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として保存した。

（３）凍結細胞密度の検討−３ 解凍処理
各細胞密度で凍結保存した凍結保存チューブを液体窒素タンクより取り出し、３７℃に設定したドライサーモユニット（タイテック社製）中で４分間加温し、凍結リンパ球細胞を解凍した。解凍したリンパ球細胞を、１０ｍＬの培地１を用いて懸濁しながら１５ｍＬ遠沈管に移しいれ、１２００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを分散させ１０ｍＬの培地１を添加して細胞懸濁液とし、実施例１の（１）と同様に細胞数を計測した。解凍したリンパ球細胞は、チューブ毎に細胞数が異なるため、そのまま同量の培地で懸濁播種すると、播種細胞数の差が増殖に影響する可能性がある。この可能性を排除するために、解凍した細胞を播種して培養する工程では、播種前及び工程毎にリンパ球細胞数を計測し、播種時の細胞密度はもとより、添加する培養液量を調製して細胞密度をほぼ一定とした（７．５×１０^５個／ｍＬ）。凍結保存チューブにより異なる細胞数を培養開始時に液量調整するこの手法は、次の拡大培養、活性化培養、増幅培養においても採用した。表５に、各工程における培養液量と添加液量を示す。
解凍時の操作として、表５に示す液量の前記懸濁液をプレーン２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ウェル当たり２ｍＬずつ播種し、播種日を第１日として、３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内で２日間培養した。

（４）拡大培養と活性化培養
前記（３）で解凍処理後に培養したリンパ球細胞を、３日目に２４穴マルチウェルプレートよりそれぞれプレーンのフラスコに移し、表５に記載されるそれぞれの添加液量の培地１で２４穴マルチウェルプレートのウェル内を洗浄して残った細胞を回収し、フラスコ内の液量を表５に記載される液量に調製した。各フラスコをテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内でさらに２日間培養した（表５、拡大培養）。
前記拡大培養後に、培養フラスコ中の細胞懸濁液を、活性化培養を行うために、実施例１の（２）と同様に調製した表５に示した容量のＯＫＴ３固相化フラスコ内に移し、前記培養フラスコの中を培地１で洗浄して残った細胞を回収し、最終的にＯＫＴ３固相化フラスコ内の液量を表５に記載の液量に調製し、各フラスコをテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％でさらに２日間培養した（表５、活性化培養２）。

前記活性化培養後に、各ＯＫＴ３固相化フラスコをタッピングして底面に付着した細胞を剥離させて細胞懸濁液とした。得られた細胞懸濁液を表５に記載の新規のプレーン培養フラスコ（住友ベークライト社製）又は新規ガス透過性培養バッグ（１０００ｍＬ、コージンバイオ社製16087528）に移しいれ、さらに各フラスコ内を表５に示す添加液量の培地２（１％ヒト血清（リンフォテック社製）、１７５Ｕ／ｍＬ ｒＩＬ−２（プロロイキン；ノバルティス社製）を含むＡＩＭ−Ｖ培地：インビトロジェン製）で洗浄し、前記洗浄液を前記プレーンフラスコまたはガス透過性培養バッグ内の細胞懸濁液に併せて、テーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％でさらに３日間培養した（表５、増幅培養１）。

前記増幅培養１後に、前記培養容器に、表５に記載の添加液量の培地２を添加し、３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内でさらに４日間培養を継続した。ここで培養容器としてフラスコを新たに追加した場合は、培養中のフラスコに添加液量の培地２を添加し、フラスコを振蕩して細胞懸濁液を攪拌し、新たなフラスコ内に容量の半量を移して培養を継続した。培養容器としてフラスコからバッグに移行した場合は、２つのフラスコに添加液量の培地２を分注し、フラスコを振蕩して細胞懸濁液を攪拌し、新たなバッグに内容量の全てを移して培養を継続した。培養容器としてバッグを新たに増やして使用する場合は、新たに使用する培養バッグに表５に記載の添加液量の培地２を添加し、これを前記増幅培養１で培養していた培養バッグに無菌的に接合し、両バッグ内の内容物を良く混合し、さらに培養を継続した（表５、増幅培養２）。

（３）及び（４）に記載した各手技を行う際に、各検体の細胞数と生存率を実施例１の（１）と同様に計測・算出した。その結果を表６に示す。
結果：凍結保存チューブに格納する細胞数をそれぞれの設定値に調整して凍結保存したが、各処理工程において３検体間に大きな差異は認められなかった。しかし、本発明の方法で製造したメモリーＴリンパ球細胞群は治療用であり、効率の観点から、一連の培養から得られる細胞数は多い方が望ましい。したがって、適切な培養規模が望まれることから、凍結保存チューブ一本あたりの細胞数は、１．０×１０^７個〜５．０×１０^７個が妥当と考えた。本実施例（１）〜（４）の工程では、培養増殖に対する播種細胞密度の影響を除外するために、表５に示すように、添加液により細胞密度を一定に調節していた。一方、増幅培養１の培養開始時細胞数を１×１０^８個、２×１０^８個、３×１０^８個に設定して培養開始時液量を一定として培養を行ったところ、１×１０^８個では増幅が約２日遅れたが、２×１０^８個及び３×１０^８個では有意差なく上記の増幅培養２の工程後に十分量のメモリーＴリンパ球細胞群を得られることが確認できた。上記の凍結保存チューブ一本あたりの細胞数を１．０×１０^７〜５．０×１０^７個とすると、この条件を満たすことができる。

[凍結保存を経て活性化増幅する工程でのリンパ球細胞表面抗原の推移]
（１）凍結保存細胞の作製
実施例２において、細胞凍結前の活性化培養では、培養液中の細胞密度が４×１０^５個／ｍＬ以上となった段階で培養液中の細胞中のメモリーＴ細胞群の占有比率が上昇することが判明していた。
そこで実施例３の（１）と同様に、同意を得た健常者３名より実施例１の（１）と同様の手順で末梢血リンパ球細胞を調製し、得られた細胞懸濁液の細胞数を計測して細胞密度を６×１０^５個／ｍＬに調製し、その５０ｍＬを実施例１の（２）と同様の手順で作製したＯＫＴ３固相化フラスコ２２５ｃｍ^２に分注してテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始３日目に浮遊細胞数が４×１０^５個／ｍＬを超えていたことから、メモリーＴ細胞群の占有比率が上昇したものとして、５０ｍＬの培地１を添加して翌日まで培養を継続した。翌日、つまり培養開始４日目に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収して培地１により細胞懸濁液とした。前記懸濁液中の細胞数及び生存率を実施例１の（１）と同様の手順で計測し、７．０×１０^７個の細胞相当量の懸濁液を５０ｍＬ遠沈管に移しいれ、１２００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。遠沈管中の上清を除去し、ペレットに３．６ｍＬのＣＰ−１細胞凍結保存液（極東製薬製）を添加して懸濁した。前記懸濁液を、１．８ｍＬずつ２本の凍結保存チューブに分注し、実施例３の（２）と同様に、凍結保存した。

（２）凍結保存細胞の解凍処理
凍結保存細胞を、１週間後に液体窒素タンクより取り出し、実施例３の（３）凍結細胞密度の検討−３と同様に解凍処理した。３７℃に設定したドライサーモユニット（タイテック社製）中で４分間加温し、凍結リンパ球細胞を解凍した。解凍したリンパ球細胞を、１０ｍＬの培地１を用いて懸濁しながら１５ｍＬ遠沈管に移しいれ、１２００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを分散させ４０ｍＬの培地１を添加して細胞懸濁液とし、実施例１の（１）と同様に細胞数を計測した。なお、凍結保存後のリンパ球細胞のほぼ１００％がＣＤ３陽性細胞であることがわかっている（非特許引用文献１）。

（３）凍結保存細胞の拡大活性化増幅培養
前記懸濁液を、実施例３の（４）と同様にプレーン２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ウェル当たり２ｍＬずつ播種し、播種日を第１日として、３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養したリンパ球を、３日目に２４穴マルチウェルプレートよりプレーンのフラスコに移し、培地１で２４穴マルチウェルプレートのウェル内を洗浄して残った細胞を回収し、フラスコ内の細胞懸濁液の液量を９０ｍＬに調製した。前記フラスコをテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内でさらに２日間培養した（拡大培養）。前記培養後に、培養フラスコ内の細胞懸濁液を、活性化培養を行うために２２５ｃｍ^２のＯＫＴ３固相化フラスコ内に移し、前記培養フラスコの中を培地１で洗浄して残った細胞を回収し、最終的にＯＫＴ３固相化フラスコ内の液量を２４０ｍＬに調整し、フラスコをテーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％でさらに２日間培養した（活性化培養２）。前記活性化培養後に、ＯＫＴ３固相化フラスコをタッピングして底面に付着した細胞を剥離させて細胞懸濁液とした。得られた細胞懸濁液を新規ガス透過性培養バッグ（１０００ｍＬ、コージンバイオ社製 16087528）に移しいれ、さらにフラスコ内を培地２（１％ヒト血清（リンフォテック社製）、１７５Ｕ／ｍＬ ｒＩＬ−２（プロロイキン；ノバルティス社製）を含むＡＩＭ−Ｖ培地：インビトロジェン製）で洗浄し、前記洗浄液を前記ガス透過性培養バッグ内の細胞懸濁液に併せて液量を１０００ｍＬとし、テーハー式ＣＯ_２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％でさらに３日間培養した（増幅培養１）。前記培養後、新たに使用する培養バッグに１０００ｍＬの培地２を添加し、これを前記増幅培養１で培養していたガス透過性培養バッグに無菌的に接合し、両バッグ内の内容物を良く混合し、さらに培養を継続した。前記培養容器は３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内でさらに４日間培養した（増幅培養２）。

（４）抗体染色リンパ球細胞集団の解析
本実施例４の（２）から（３）の工程において、凍結細胞を解凍した日を第１日とし、プレーンのフラスコ（２２５ｃｍ^２）で培養終了してＯＫＴ３固相化フラスコでの活性化培養を開始する直前を第５日目とし、活性化培養を終了してガス透過性培養バッグ（１０００ｍＬ、コージンバイオ社製 16087528）での培養を開始する直前を第７日目とし、ガス透過性培養バッグでの培養を終了してもう１つのガス透過性培養バッグを接合しての培養が終了した日を第１４日目とし、第１日目（解凍直後）、第５日目（活性化直前）、第７日目（活性化直後）、及び第１４日目（終了直前）に培養中の細胞懸濁液の一部を無菌的に採取して、得られた細胞のサブセットの解析を、実施例２の（２）と同様な方法で、抗ＣＤ３抗体（ベクトン・ディッキンソン社製349201）、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製340438）及び抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトン・ディッキンソン・ファーミンジェン社製555544）に関して実施した。

結果：
表７に示す。凍結保存前に活性化培養細胞の中で占有率が上昇したメモリーＴ細胞群は、凍結解凍後、通常の培養及び活性化培養の過程にあってもよく高い存在比率が維持されることが判明した。第７日目にセントラルメモリーＴ細胞の存在比が若干の低下を示すものの、培養継続により回復が認められ、メモリーＴ細胞群としては緩やかな存在比の低下を示すものの、占有率は８０％を超えていた。上記より、被験者より末梢血リンパ球細胞の採取を行った直後のリンパ球細胞サブセット像に比較して、メモリーＴ細胞群が高率に存在する活性化リンパ球細胞を得られることが明らかとなった（図２）。NaiveはＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋のナイーブＴ細胞を、EffectorはＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ３＋のエフェクターＴ細胞を、ＣＭはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞を、ＥＭはＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ３＋のエフェクターメモリーＴ細胞を、ＣＭ＋ＥＭ又はmemoryとしてＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋／−、ＣＤ３＋のメモリーＴ細胞を指す。

（５）凍結保存細胞の安定性
上記実施例４（１）と同様の方法で、同時に凍結保存した細胞を１週間、１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月間液体窒素下で保管し、凍結保存細胞の安定性について検討を行った（ｎ＝３）。
解凍後の細胞数、細胞表現型や解凍後の細胞増幅率及び増幅細胞の細胞表現型を解析した結果、凍結保存後６ヶ月までは解凍後の細胞数、生存率及び細胞表現型、また解凍後の培養工程における細胞増幅率及び細胞表現型においても何ら差は認められなかった。したがって、凍結保存細胞は少なくとも６ヶ月間は安定であり、凍結保存細胞は安定に長期保存できることが示された。

本発明のメモリー細胞を主成分とした医療組成物を製造した。製造工程の概要を図３に示す。
［本発明のメモリー細胞を主成分とした医療組成物の製造］
１．活性化培養１工程
抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を固相化した２２５ｃｍ^２の活性化フラスコに、実施例１（１）と同様に調整した５０ｍＬの細胞浮遊液を分注し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のテーハー式ＣＯ_２培養器内で培養した。調製した細胞浮遊液量が１００ｍＬを超える場合は２つの活性化フラスコに５０ｍＬずつ細胞浮遊液を分注した。細胞浮遊液量が５０ｍＬ以上１００ｍＬ未満の場合は５０ｍＬを分注した。培養開始３日目に培養液０．０１ｍＬを採取して浮遊細胞数を計測した（工程内検査II）。浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬ以上の場合は培養液１を５０ｍＬ追加した（培養液追加）。
培養開始３日目の工程内検査IIで浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬに達していない場合は、更に１日培養を続け、翌日（培養開始４日目）浮遊細胞数を計測し、浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬ以上の場合は培養液追加工程に進めた。
培養開始６日目までに浮遊細胞密度が４×１０^５個／ｍＬに達していれば培養液追加工程に進むが、達していない場合は培養を中止し、再度採血を行う。

２．凍結保存工程
培養液を追加した翌日フラスコ底面に付着した細胞を剥離させ、均一に懸濁し、工程内検査III用サンプルとして１ｍＬをサンプリングした。細胞懸濁液より室温１２００ｒｐｍ５分間遠心により細胞を回収して、細胞を３×１０^７個／チューブで凍結する。ここで細胞は３×１０^７個／チューブで細胞凍結保存液ＣＰ−１（極東製薬製）に浮遊させ、凍結保存チューブに格納し、そのチューブをバイセルに入れて−８０℃フリーザー内で急速に凍結させた。翌日−８０℃フリーザーから凍結チューブを取り出し、液体窒素中で保存した。

３．解凍処理工程
凍結保存細胞を格納したチューブを液体窒素タンクより取り出し、３７℃に加熱したドライサーモユニットで４分間加温し、凍結細胞を解凍した。１０ｍＬの培地１の入った１５ｍＬの遠心管に解凍した細胞液を加え、転倒混和によりよく攪拌し、室温で１２００ｒｐｍ、３分間遠心した。上清を除去し、細胞を分散させた後４０ｍＬの培地１を用い均一に浮遊させた。細胞をよく混和し、０．５ｍＬをサンプリングして工程内検査IVのサンプルとした。
残りの細胞浮遊液をプレーンの２４穴マルチウェルプレートに２ｍＬ／ｗｅｌｌで分注し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のＣＯ_２培養庫内で２日間培養した。

４．拡大培養工程
培養３日目に２４穴マルチウェルプレートから細胞をプレーンの２２５ｃｍ^２フラスコに移した。培地１を用いて２４穴マルチウェルプレートを洗浄して残った細胞を回収した。最終的に計９０ｍＬとなるように培地１を用いて細胞を浮遊させ、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のＣＯ_２培養器内で２日間培養した。

５．活性化培養２工程
２日間培養後、プレーンの２２５ｃｍ^２フラスコ内の細胞を抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）が固相化された活性化フラスコに移した。培地１でプレーンの２２５ｃｍ^２フラスコを洗浄し、残った細胞を回収して最終的に培養液量を２５０ｍＬとした。温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のＣＯ_２培養庫内で２日間培養した。

６．増幅培養１工程
２日間培養後、活性化フラスコの底面に付着した細胞を剥離させ細胞浮遊液を得た。１ｍＬの細胞浮遊液をサンプリングして工程内検査Ｖのサンプルとした。残りの細胞浮遊液２５０ｍＬを７５０ｍＬの培地２（１７５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ヒト血清添加培地）を充填したガス透過性培養バッグに移し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のＣＯ_２培養庫内で３日間培養した（総培養液量約１Ｌ）。

７．増幅培養２工程
３日間培養した培養バッグと１Ｌの培地２を充填したガス透過性培養バッグとを無菌的に接合し、２つの培養液をよく混合し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ_２濃度５．０±０．２％のＣＯ_２培養器内で４日間培養した（総培養液量約２Ｌ）。

８．調製及び充填工程
増幅培養２開始後、４日目（通算１４〜１７日目）に２連結された培養バッグの一方から２５０ｍＬの遠心管４本に２５０ｍＬずつ培養液を移し、室温１，５００ｒｐｍ、８分間遠心した。上清を除去し、残り１バッグの培養液を前記の２５０ｍＬの遠心管に移した。始めのバックと同条件で遠心し、上清を除去した。２５０ｍＬ遠心管４本の細胞を分散させた後、０．１％ヒトアルブミン加生理食塩水５００ｍＬで懸濁し、２本の２５０ｍＬ遠心管に集め、４℃で１，７００ｒｐｍ、８分間遠心し、細胞を洗浄した。同様の操作を繰り返し、細胞を２回洗浄した。洗浄した細胞を分散させ、４℃に冷却した１％ヒトアルブミン加生理食塩水２１０ｍＬに懸濁させた。懸濁させた細胞液の１０ｍＬを採取して出荷検定用のサンプルとした。残りの２００ｍＬを製品充填用バッグに充填し製品とした。

［本発明のメモリー細胞を主成分とした医療組成物の解析］
本発明の方法により得られた活性化リンパ球細胞と、従来法にて作製した活性化リンパ球細胞のサブセットの解析を、実施例２の（２）と同様な方法で、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）及び抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトン・ディッキンソン・ファーミンジェン社製）に関して実施した（図４）。
本発明の方法は実施例５に記載の方法で行った。培養開始時の末梢血管より採血分離した単核球細胞（リンパ球細胞リッチ画分）（ＰＢＭＣ）をＯＫＴ固相化フラスコで活性化培養した。この４×１０^５／ｍＬ以上に達した活性化培養後４日目にサンプル（＋５０）を採取した後、５０ｍＬの培地１を添加し、一日間培養し、サンプル（Freeze）を採取した後凍結保存工程を行った。凍結細胞の解凍直後にサンプル（ＴＷ（Thaw））を採取して拡大培養工程を行い、その後に活性化培養２をＯＫＴ固相化フラスコで行った。活性化培養２の直前にサンプル（ＯＫＴ）を採取し、直後にサンプル（解凍ＢＰ）を採取した。その後培養バッグで増幅培養２を行ってリンパ球細胞を収穫したが、収穫直前に細胞サンプル（解凍Ｈ（Harvest））を採取した。

従来法においては、培養開始時の末梢血管より採血分離した単核球細胞（リンパ球細胞リッチ画分）（ＰＢＭＣ）を培地１で細胞懸濁液とし、その懸濁液５０ｍＬをＯＫＴ固相化フラスコで活性化培養した。この４×１０^５／ｍＬ以上に達した活性化培養後４日目にサンプル（＋５０）を採取した後、５０ｍＬの培地１を添加し、一日間培養した。５日目にサンプル（＋１５０）を採取して１５０ｍＬの培地１を加え培養した。さらに翌日サンプル（生ＢＰ）を採取した。１００ｍＬの培地１を加えて培養し、培養終了直前にサンプル（生Ｈ）を採取した。なお＋１５０及びFreezeサンプルは、凍結群と非凍結群に分けた直後に採取するサンプルであるので、実質的に同じものである。

上記サンプルの細胞サブセットを調べた結果、従来法の凍結処理工程を含まない方法では、得られたリンパ球細胞群においてメモリーＴ細胞の割合が４０％程度と、ＰＢＭＣと同程度となったが（図４Ａ）、本発明の方法を用いると、得られたリンパ球細胞群においてメモリーＴ細胞が約７５％を占めた（図４Ｂ）。したがって、本発明の方法により、採取したリンパ球細胞を凍結保存することで利便性を高めることができただけでなく、養子免疫療法等において有効成分であるメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群を得ることができた。

大隅らが、養子免疫療法に使用される活性化リンパ球細胞の作用メカニズムを解明するために、活性化増幅培養して得られた活性化リンパ球細胞の機能をメモリーＴ細胞サブセットに着目してこれを解析した。その結果、活性化リンパ球細胞に含まれるエフェクターメモリーＴ細胞が癌細胞に対して２４時間で細胞障害活性を示したこと、そしてセントラルメモリーＴ細胞が腫瘍抗原を認識した後に活性化されてエフェクターメモリーＴ細胞へと分化して４８時間で細胞障害活性を発現することが明らかとなった。
以下に、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞の腫瘍細胞に対する効果を示す。活性化自己リンパ球細胞（ＫＣ−３６２）を、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）及び抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトン・ディッキンソン・ファーミンジェン社製）の有無を指標にしてフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製；FACS Calibur）によりセントラルメモリーＴ細胞（ＣＭ）とエフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）群に分けた（ＣＭ純度９９．６％、ＥＭ純度９８．５％）。次に、分けた各細胞群とＫＴ−３６２（患者由来腫瘍細胞株）との共培養を行い、細胞障害活性を解析した（表８）。

ＫＴ−３６２単独（コントロール）では細胞数が培養開始時点の細胞数と比較して、２４時間で２．５倍に、４８時間で５．３倍に増加した。一方、ＣＭとの共培養では２４時間で０．９倍と増殖抑制が認められ、４８時間では０．３倍に減少した。培養後４８時間時点でリンパ球細胞を回収してフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社製；FACS Calibur）で解析したところ、ＣＭの抗原型はＥＭに変化していた。
ＫＴ−３６２とＥＭとの共培養では、コントロールの培養開始時点の細胞数と比較して、２４時間で０．２倍に細胞数が減少し、４８時間では生細胞は認められなかった。
したがって、ＣＭ及びＥＭはいずれも細胞障害活性を有し、なかでもＣＭは、障害活性の発現に時間差はあるものの、ＥＭに比べてその寿命が遥かに長いことより、長期に亘りＥＭの安定的供給源となるものと考えられ、この点からＣＭを選択的に増幅したリンパ球細胞群を含有する組成物は効果的な治療剤となることが示唆される。

従来法で得られる活性化リンパ球細胞群は、ＰＢＭＣ採取後活性化培養３〜７日程度の限られた期間しかセントラルメモリーＴ細胞占有率が高い活性化リンパ群を得ることができず、しかもこの期間はいまだ細胞数が十分に増えておらず、そして細胞数が十分に増えた後は、セントラルメモリーＴ細胞占有率が２０％以下に低下しているという問題があった（非特許文献３）。それに対し、本願発明の方法によれば、十分に細胞数を増やし、かつＥＭに比べてＣＭが圧倒的多数となる本発明の活性化リンパ球細胞群を得ることができ、細胞障害活性ではＥＭに比べると活性発現に若干の遅れはあるものの、活性そのものはＥＭのそれと遜色のないその投与により、細胞障害活性が高いＥＭの長期安定な供給が得られ、有効な治療効果が実現すると考えられる。しかも、細胞凍結段階を含み、その凍結期間は特に制限されないことから、長期保管並びに急な要請に対しても迅速にメモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞占有率の高い活性化リンパ球細胞群を調製することができる点で利便性が大変高い。

本発明は、活性化リンパ球細胞を含む治療剤の分野等に好適に利用することができる。

Claims (13)

1. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えた高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法。
   （ａ）採取されたリンパ球細胞を活性化培養する工程；
   （ｂ）メモリーＴ細胞群の占有率上昇をリンパ球細胞密度に基づいて検知し、工程（ａ）のリンパ球細胞を凍結保存する工程；
   （ｃ）凍結されたリンパ球細胞を解凍し、活性化培養する工程；
2. 工程（ｂ）のメモリーＴ細胞群の占有率上昇のリンパ球細胞密度に基づいた検知が、培養液中に浮遊するリンパ球細胞数を指標とすることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 工程（ｂ）のリンパ球細胞密度が、培養液中に浮遊するリンパ球細胞数が４×１０^５細胞／ｍＬ以上であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 活性化培養が、ＩＬ−２及び固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 工程（ｃ）が、解凍後２週間以内に完了することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群が、リンパ球細胞群のメモリーＴ細胞の占有率が７５％以上であるリンパ球細胞群であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. メモリーＴ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞をリンパ球細胞群の７０％以上含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 単離されたリンパ球細胞が、ヒト末梢血由来であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. リンパ球細胞群が、第三者に投与するためのものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. リンパ球細胞群の７５％以上のメモリーＴ細胞を含むことを特徴とするリンパ球細胞群。
11. リンパ球細胞群の７０％以上のセントラルメモリーＴ細胞を含むことを特徴とする請求項１０に記載のリンパ球細胞群。
12. 請求項１０又は１１に記載のリンパ球細胞群を有効成分とする医薬組成物。
13. 以下の（Ａ）〜（Ｄ）の手段を備えた、高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造システム。
    （Ａ）リンパ球細胞の活性化培養手段；
    （Ｂ）リンパ球細胞密度に基づく、メモリーＴ細胞群の占有率上昇の検知手段；
    （Ｃ）リンパ球細胞の凍結保存手段；
    （Ｄ）凍結されたリンパ球細胞の解凍手段；