KR101925778B1 - 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템 - Google Patents

Abstract

세포를 복수의 배양 용기에 차례로 옮겨서 배양할 경우에 오염의 리스크를 저감함과 동시에 배양 용기 내에서의 세포의 잔존을 감소시키고 배지의 가온 기구를 생략할 수 있다. 복수의 배양 용기 (2a), (2b), (2c)가 다른 용기와의 내용물 이송용 포트를 하나 갖추고, 제1 용기 (2a)에 세포 현탁액을 수용하고, 배지를 공급하는 배지 용기 (1)와 배양 용기를 튜브 (3)를 사용하여 접속하고 세포 배양을 개시하고, 제1 용기에서의 배양이 끝난 후 해당 용기에 접속된 제2 용기 (2b)에 세포 현탁액을 이송하고, 제1 용기에 배지 용기에서 배지를 공급하여 소정 시간 경과 후 제2 용기에 제1 용기에서 배지를 공급하고, 제2 용기에 있어서 세포 배양을 실시하고, 다음의 배양 용기가 있는 경우 다음의 배양 용기에 대한 세포 현탁액의 이송 해당 배양 용기에의 배지의 공급, 다음의 배양 용기에의 해당 배양 용기로부터의 배지의 공급 및 다음의 배양 용기에서의 세포 배양을, 나머지의 배양 용기에 대해서 반복 실시한다.

Description

세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템{CELL CULTURE METHOD AND CELL CULTURE SYSTEM}

본 발명은 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 배양하는 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 관한 것이다.

최근 의약품 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다. 이와 같은 세포 배양에 있어서는 배지 내의 세포 밀도가 높아짐에 따라 증식에 필요한 성분의 고갈, 세포 자신의 대사 산물의 축적이 일어나서 증식 속도가 저하하고 세포 밀도는 포화에 이른다. 이 때문에 세포를 어느 정도의 규모로 배양하는 경우에는 일반적으로 세포 밀도가 적정하게 유지되도록 계대를 반복하며 배양을 하고 있다.

이 계대 시에 용량이 작은 배양 용기에서, 용량이 더 큰 배양 용기에 세포를 옮기는 경우가 있다. 예를 들면 세포 배양 웰 플레이트를 사용해서 배양의 초기 단계에 적합한 세포 밀도가 되도록 배지와 함께 세포를 각각의 웰에 가해서 배양을 개시하고, 웰 내에서 세포를 충분히 증식시키고 나서 세포 배양 플라스크로 옮겨서 세포 증식에 맞추어 배지를 추가하여 배양하는 일이 행해지고 있었다. 또한 세포가 일정량으로 증식한 시점에서 다시 대용량의 백 등에 옮겨서, 배지의 보급과 계대를 반복실시하여 세포가 대량 배양되고 있었다(예를 들면 특허 문헌 1[0027]단락 등 참조).

또한 냉동 보존된 세포를 사용할 때, 융해하여 복원한 후에 세포 본래의 기능을 회복하기 위해서 웰 플레이트를 사용하여 수일간의 배양을 하고(이하, 양생 배양이라 하는 경우가 있다), 세포의 기능을 본래 상태로 회복시킨 후에 플라스크에 옮겨서 배양하고(이하, 확대 배양이라고 하는 경우가 있다), 그 후 활성화 배양을 하는 방법도 있었다(예를 들면 특허 문헌 2[0057]단락 등 참조).

그러나 이와 같은 세포 배양에 있어서는 웰 플레이트에서 플라스크로 옮길 때에 피페팅(pipetting) 작업을 몇번이고 반복할 필요가 있고, 계대 때마다 새로운 플라스크와 백 등의 배양 용기에 세포를 옮겨야 하며, 작업이 번거로울 뿐만 아니라, 세포에 타격을 줄 가능성이 있었다. 또한 오염의 리스크가 크다는 문제도 있었다.

한편 오염의 리스크를 저감할 수 있는 세포 배양 장치 등이 특허 문헌 3 및 특허 문헌 4에 기재되어 있다.

즉, 특허 문헌 3에는 인큐베이터 내에 밀폐에 형성된 세포 배양기를 설치하고, 배양기에 밀폐상태로 접속된 송액 관을 통해서 배지 용기와 세정액 용기와 골수액 용기의 액을 선택적으로 배양기에 주입하는 송액 수단과, 배양기 내의 액을 배액관을 통해서 배출하는 배액 수단을 갖춘 자동 배양 장치가 개시되어 있다. 그리고 이 구성에 의해서 배양기에 접착한 줄기 세포를 선택적으로 분리한 다음, 배지를 배양기에 주입하여 줄기 세포를 배양하고 이어서 분화 배양용 배지를 배양기에 주입하여 목적하는 조직 세포로 분화시키는 기술이 공개되어 있다.

또한 특허 문헌 4에는 복수의 배양 용기를 사용하여 밀폐계에서 부착 세포의 계대 배양을 할 수 있는 자동 계대 배양 장치가 개시되어 있다. 구체적으로는 복수의 배양 용기에 배지가 수용된 배지 공급 탱크와, 세정액이 수용된 세정액 공급 탱크와, 박리액이 수용된 박리액 공급 탱크와, 처리 용기가 접속되어 처리 용기 내에 세포의 통과를 저지하기 위한 필터가 설치되고, 필터의 표면에 세포를 모은 다음, 필터의 바깥쪽에서 배지를 공급하여 세포를 배지에 의해서 떠밀려서 이송하는 기술이 공개되어 있다

[특허 문헌 1]일본특허 공개공보 2011-241159호 공보 [특허 문헌 2]일본특허 공개공보 2013-215141호 공보 [특허 문헌 3]일본특허 공개공보 2007-312668호 공보 [특허 문헌 4]일본특허 공개공보 2005-198626호 공보

그러나 이들 세포 배양 장치 등은 복수의 배양 용기를 사용하여 세포를 대량으로 배양하는 경우에 최적인 것이라고는 할 수 없었다.

즉, 특허 문헌 3의 세포 배양장치에 의하면 하나의 배양기에서 줄기 세포를 배양하고, 또한 목적하는 조직 세포로 분화시킬 수는 있지만, 세포를 대량 배양하기 위해서 필요한 계대 등에 알맞게 사용할 수 있는 것은 아니었다.

또한, 특허 문헌 4의 자동 계대 배양 장치에서는 복수의 배양 용기를 사용하여 세포의 계대 배양을 하지만, 최초로 하나의 배양 용기에서 배양된 세포를 필터의 표면에 모은 후, 필터의 바깥쪽에서 배지를 공급하여 세포를 3개의 배양 용기에 이송하여 재차 배양하고, 이 재차 배양한 세포를 필터의 표면에 모은 다음, 필터의 바깥쪽에서 배지를 공급하여 세포의 일부 또는 전부를 회수하는 구성으로 되어있다. 이 배양 장치에서는 재차 배양한 세포의 일부를 계대 배양할 수는 있지만, 전부 다 할 수는 없으므로 세포의 대량 배양에 최적인 것이라고는 할 수 없으며 또한 조작 순서가 번잡하다는 문제가 있었다. 또한 세포를 배지나 세정액과 함께 송류(送流)하여 필터로 막은 후 배양 용기로의 이송이나 세포를 꺼내기 위한 것이기 때문에 세포에 손상을 입힐 우려가 있었다.

또한 복수의 배양 용기를 사용하여 세포 배양을 할 경우 종전에는 세포의 이송에 있어서 배양 용기 내에 세포가 잔존해 버린다는 문제가 있었다. 이러한 배양 용기 내에서의 세포의 잔존이 생기면 모든 세포를 이용할 수가 없고, 세포의 일부 폐기로 이어지기 때문에 세포의 증식 효율이 저감함으로 중대한 문제였다.

또한 세포 배양에서 사용하는 배지는 저온에서 보존하지 않으면 품질이 열화함으로 사용할 때까지는 냉각하여 보존되고 있다. 그런데 세포 배양은 37℃ 정도로 진행되기 때문에 이 냉각된 배지를 세포와 배지가 봉입된 배양 용기에 그대로 공급하면 세포의 증식 효율이 떨어진다는 문제가 있었다.

그래서 종래는, 예를 들면 특허 문헌 3의 문단 0018에 기재되어 있는 바와 같이, 히터 등의 가온 기구에 의해서 배지를 가온하고 나서 배양 용기에 공급함으로써 이와 같은 문제를 해결하고 있었다.

그러나 세포 배양 시스템에서 가온 기구를 설치하면 구성이 번잡하고 대형화하기 때문에 가온 기구는 설치하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이뤄진 것이며 복수의 배양 용기를 사용하여 세포 배양을 하는 경우에 오염의 리스크를 저감함과 동시에, 세포의 이송에 있어서 배양 용기 내에서의 세포의 잔존을 감소시키고 또한 배지의 가온 기구를 생략하는 것이 가능한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템의 제공을 목적으로 한다.

본 발명에 관한 세포 배양 방법은 복수의 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법이며, 상기 복수의 배양 용기가 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고, 상기 복수의 배양 용기에서의 제1의 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하고, 상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와 상기 제1의 배양 용기를 튜브를 사용하여 접속하는 동시에, 상기 제1의 배양 용기에 상기 복수의 배양 용기에서의 그 밖의 배양 용기를 순차적으로 튜브를 사용하여 접속하고, 상기 제1의 배양 용기에서 세포 배양을 개시하고 상기 제1의 배양 용기에서의 배양이 끝난 다음 상기 제1의 배양 용기에 접속된 제2의 양 용기에 상기 제1의 배양 용기에서 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 이어서 상기 제1의 배양 용기에 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 상기 제2의 배양 용기에 상기 제1의 배양 용기에서 배지를 공급하고, 상기 제2의 배양 용기에서 세포 배양을 하여 상기 제2의 배양 용기에서의 배양이 끝난 후, 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 다음의 배양 용기가 있는 경우, 상기 다음 배양 용기에 대한 세포 현탁액의 이송, 상기 배양이 종료된 배양 용기에의 배지의 공급, 상기 다음 배양 용기에의 상기 배양이 종료된 배양 용기로부터의 배지의 공급 및 상기 다음의 배양 용기에서의 세포의 배양을 상기 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 상기 다음의 배양 용기가 없어질 때까지 반복하여 실시하는 방법으로 되어 있다.

또한 본 발명에 관한 세포 배양 시스템은 부유계의 세포를 배양하기 위한 복수의 배양 용기를 갖춘 세포 배양 시스템이며, 상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와, 상기 복수의 배양 용기로서 타격을 받은 세포의 기능을 회복시키기 위한 세포 배양에 사용하는 양생 배양 용기와, 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 활성화 배양 용기와, 세포를 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 하나 또는 두개 이상의 증폭 배양 용기를 갖추고, 상기 양생 배양 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기가, 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고, 상기 배지 공급 용기와 상기 양생 배양 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기가 이 순서로 튜브를 사용하여 접속된 구성으로 되어있다.

또한 본 발명에 관한 세포 배양 시스템은 접착계의 세포를 배양하기 위한 복수의 배양 용기를 갖춘 세포 배양 시스템이며, 상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와, 상기 복수의 배양 용기로서, 배양 면적이 다른 배양 용기를 갖추고, 상기 복수의 배양 용기가 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고, 상기 배지 공급 용기에 상기 복수의 배양 용기가 배양 면적이 작은 순서로 튜브를 사용하여 접속된 구성으로 되어있다.

본 발명에 따르면 복수의 배양 용기를 사용하여 세포 배양을 하는 경우에 오염의 리스크를 저감함과 동시에 세포의 이송에 있어서 배양 용기 내에서의 세포의 잔존을 감소시키고, 또한 배지의 가온 기구를 생략할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 시스템의 개략을 도시하는 설명도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에 있어서의 교반 수단의 개략을 도시하는 설명도이다.
도 3은 본 발명의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 방법에 있어서의 1차 배양 공정을 도시하는 사시도이다.
도 4는 본 발명의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 방법에 있어서의 세포 이송 공정을 도시하는 사시도이다.
도 5는 본 발명의 제2 실시형태에 관한 세포 배양 시스템의 개략을 도시하는 설명 도이다.
도 6은 본 발명의 제2 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에서의 양생 용기 및 유지구의 개략을 도시하는 사시도이다.
도 7은 본 발명의 제3 실시형태에 관한 세포 배양 시스템의 개략을 도시하는 설명도이다.
도 8은 본 발명의 제4 실시형태에 관한 세포 배양 시스템의 개략을 도시하는 설명도이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템의 바람직한 실시형태에 대해서, 도면을 참조하여 설명한다.

(제1 실시형태)

먼저 본 발명의 제1 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 대해서, 도 1및 도 2를 참조하여 설명한다.

[세포 배양 시스템]

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 도 1과 같이 배지 공급 용기 (1)(이하, 배지 용기 (1)라고 일컫는 경우가 있다)와, 복수의 배양 용기 (2)(1차 배양 용기 (2a), 2차 배양 용기 (2b), 3차 배양 용기 (2c))와, 이송 튜브 (3)(이하 단순히 튜브(도관)으로 칭하는 경우가 있다)를 갖추고 있다.

복수의 배양 용기 (2)에는 각각 다른 용기와의 내용물의 이송을 하기 위한 포트가 하나 갖춰졌으며, 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)가 튜브를 사용하여 접속되어 있다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에 따르면 이들 복수의 배양 용기 (2)를 사용하여 폐쇄계에서 세포의 계대 배양을 할 수 있으므로 오염의 리스크를 줄이는 것이 가능하게 되어 있다.

또한 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템을 사용해서 어떤 배양 용기 (2)에서의 배양이 끝나고 다음의 배양 용기 (2)에서 배양을 하는데 있어서 해당 다음의 배양 용기 (2)에 배지를 주입하기 전에 이미 배양이 종료된 배양 용기 (2)에 배지를 주입하여 소정 시간 기다린 다음 다음에 배양을 하는 배양 용기 (2)에 배지를 이송함으로써, 배양이 종료된 배양 용기 (2)에 잔존하는 세포를 저감할 수 있고 또한 다음에 배양을 하는 배양 용기 (2)로 이송하는 배지의 온도를 상승시킬 수 있다. 이로 인해 세포의 증식 효율을 보다 향상시킬 수 있게 되어 있다.

이들 효과는 이후 실시형태에서도 역시 얻는 것이 가능하다.

[배지 공급 용기]

배지 용기 (1)는 세포를 배양하기 위한 배지를 배양 용기에 공급하는 용기이며, 복수의 배양 용기 (2)에 공급하는 배지를 격납한다. 이 배지 용기 (1)는 동일한 또는 다른 배지를 공급하기 위해서 복수의 용기를 사용하여 구성해도 된다.

배지 용기 (1)는, 격납되어 있는 배지의 pH가 배양 기간 중에 크게 변화하지 않도록 산소 및 이산화탄소에 대한 가스 차단성을 가진 것이 바람직하다. 이는 배지 중에 포함된 고농도의 탄산 가스가 공기 중으로 빠져나가서 배지 중의 탄산 가스 농도가 저하하고, 결과적으로 pH가 상승하는 것을 회피하기 위해서 배지 용기 (1)의 내부에서 이산화탄소가 외부로 빠져나가는 것을 되도록 줄이는 것이 바람직하기 때문이다. 또한 배지의 산화를 막는 것이 바람직하기 때문이다.

배지 용기 (1)에는 하나의 포트가 갖추어지고, 이 포트에 이송 튜브 (3)가 접속되고, 이 이송 튜브 (3)를 통해서 복수의 배양 용기 (2)에 접속되어 있다. 이 배지 용기 (1)로부터 배지를 배양 세포의 증식 등에 맞추어 펌프를 사용하여 배양 용기 (2)에 공급할 수 있다.

또한 배지 용기 (1)는 배양이 완료되어 비게 된 후에, 폐액 회수 용기(이하, 폐액 용기라고 일컫는 경우가 있다)로서 사용할 수 있다. 그리고 배양 용기 (2)에서 세포 현탁액의 상등액을 폐액 용기로서의 배지 용기 (1)에 송류함으로써 배양 용기 (2)에서의 세포 현탁액을 농축하는 것이 가능하게 되어 있다. 또한, 두개 이상의 배지 용기 (1)를 접속하여 한쪽을 폐액 용기로서 사용하는 동시에 다른 한쪽을 세포 회수 용기로서 사용하고, 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (2)로부터 배지 용기 (1)에 송류하여 세포를 회수하는 것 등도 가능하다.

[배양 용기]

배양 용기 (2)는 세포를 계대 배양 등에 의해서 증식시키기 위한 용기이며 복수의 용기로 이루어진다. 도 1의 예에서는 배양 용기 (2)로서 1차 배양 용기 (2a), 2차 배양 용기 (2b), 3차 배양 용기 (2c)가 구비되어 있고, 이 순서로 세포 배양을 실시하는 것을 상정하고 있다. 또한 배양 용기 (2)의 개수는 3개로 한정되는 것이 아니고 예를 들면 두 개로도 되고, 4개와 5개, 또는 그 이상으로 해도 된다.

배양 용기 (2)의 용량 및 배양 면적은, 계대 배양 등을 효율적으로 할 수 있도록 후에 접속되는 것일수록 크게 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 2차 배양 용기 (2b)로서 1차 배양 용기 (2a)의 용량의 2배 이상의 것을 알맞게 사용할 수 있으며, 1차 배양 용기 (2a)의 배양 면적의 1.5배 이상의 것을 알맞게 사용할 수 있다. 또한 3차 배양 용기 (2c)로서, 2차 배양 용기 (2b)의 용량의 10배 정도의 것을 알맞게 사용할 수 있고, 2차 배양 용기 (2b)의 배양 면적의 6배 이상의 것을 알맞게 사용할 수 있다. 또한 1차 배양 용기 (2a), 2차 배양 용기 (2b), 3차 배양 용기 (2c)의 용량 및 배양 용기의 비율은 이에 한정되지 않는다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에서는 먼저 1차 배양 용기 (2a)에서 세포 배양을 한 다음, 배양된 세포를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)로 이송한다. 이어 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)로 첨가(흐르게 해서 더함.)한다. 그리고 1차 배양 용기 (2a)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다. 이 대기 시간으로서는 배지량과 배양 온도에 의하지만, 예를 들면 5분에서 10분 정도로 할 수 있다. 이어 배지를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)에 이송한다.

또한 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에의 배지의 이송에 있어서 이송 속도를 평소보다 느리게 하는 것이 바람직하다. 예를 들면 이 이송 속도로서는 통상의 이송 속도의 5%~50%정도로 하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 5mL/min~50mL/min으로 하는 것이 바람직하고, 10mL/min~30mL/min로 하는 것이 보다 바람직하다. 이와 같이 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 함으로써 다음의 배양을 하는 배양 용기 (2)(2차 배양 용기 (2b))에 이송하기 전에 배지의 온도를 상승시킬 수 있게 되어 있다.

또한 배지를 1차 배양 용기 (2a)로 이송하고 나서 2차 배양 용기 (2b)로 이송하기 위하여 1차 배양 용기 (2a)에 잔존하고 있던 세포를 배지와 함께 2차 배양 용기 (2b)에 이송할 수 있다. 그래서 배양이 종료된 배양 용기 (2)(1차 배양 용기 (2a))에서의 잔존 세포를 저감할 수 있게 되어 있다.

또한 2차 배양 용기 (2b)로 세포 배양을 한 후에 대해서도 마찬가지로 배양된 세포를 2차 배양 용기 (2b)에서 3차 배양 용기 (2c)에 이송하고, 이어서 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에 첨가한다. 그리고 1차 배양 용기 (2a)에 배지가 수용된 상태에서 그대로 소정 시간이 경과하기를 기다렸다가 배지 온도를 상승시키고 이어 배지를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)에 이송한다. 그리고, 2차 배양 용기 (2b)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다렸다가 배지 온도를 상승시키고 이어 배지를 2차 배양 용기 (2b)에서 3차 배양 용기 (2c)로 이송한다.

이 때, 배지를 1차 배양 용기 (2a)와 2차 배양 용기 (2b)에 이송하고 나서 3차 배양 용기 (2c)에 이송하기 위하여 1차 배양 용기 (2a)와 2차 배양 용기 (2b)에 잔존한 세포를 배지와 함께 3차 배양 용기 (2c)에 이송할 수 있다.

또한 2차 배양 용기 (2b)에서 세포 배양을 한 후에 1차 배양 용기 (2a)에만 배지를 첨가하여 배지 온도를 상승시킨 다음 이 배지를 3차 배양 용기 (2c)에 이송해도 되고, 2차 배양 용기 (2b)에만 배지를 이송시켜서 배지 온도를 상승시킨 다음 이 배지를 3차 배양 용기 (2c)에 이송해도 된다. 또한 1차 배양 용기 (2a) 및 2차 배양 용기 (2b) 양자에 배지를 첨가하여 배지 온도를 상승시킨 다음 이들의 배지를 3차 배양 용기 (2c)에 이송해도 된다.

이와 같이 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에 따르면 배양 용기 내에서의 세포의 잔존을 현저히 감소시킬 수 있는 동시에, 배지의 온도를 상승시키고 나서 배양 용기에 이송할 수 있으며 세포의 증식 효율을 향상시킬 수 있게 되어 있다.

이들의 배양 용기 (2)는 연포재를 재료로 하여 주머니 모양(백형)으로 형성되어 있고, 내용물을 확인할 수 있도록 일부 또는 전부가 투명성을 가지고 있다.

또한 배양 용기 (2)는 세포 배양에 필요한 가스 투과성(산소 및 이산화탄소 투과성)을 가지고 있을 필요가 있으며, 37℃, 5% 이산화탄소 농도의 배양 환경 하에서 사용하는 것이 바람직하다. 또한 배양 용기 (2)는 높은 세포 증식 효율을 실현하기 위해서, 저 세포 독성, 저 용출성 및 방사선 멸균 적성을 갖는 것이 바람직하다.

이와 같은 조건을 충족시키는 배양 용기 (2)의 재료로는 폴리에틸렌 수지가 바람직하다. 이 폴리에틸렌 수지로는 폴리에틸렌, 에틸렌과 α-올레핀의 공중합체, 에틸렌과 초산 비닐의 공중합체, 에틸렌과 아크릴산과 메타 크릴산 공중합체와 금속 이온을 사용한 아이오노머 등을 들 수 있다. 또한 폴리올레핀 스티렌계 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘 수지 등을 사용할 수도 있다.

배양 용기 (2)의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 도 1에 도시한 바와 같이 직사각형 모양으로 할 수 있으며, 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고 있다. 이 내용물의 이송용 포트에는 이송 튜브 (3)가 접속되어 이 이송 튜브 (3)를 통해서 배지 용기 (1)에서 배양 용기 (2)에 대한 배지 주입 및 배양 용기 (2)에서 다음의 배양 용기 (2)에 대한 배지나, 세포 현탁액의 이송을 하는 구성으로 되어있다.

이 이송용 포트는 배양 용기 (2)를 경사지게 함으로써 내용물을 다음의 배양 용기 (2)에 자연 송류할 수 있도록 배양 용기 (2)를 경사지게 했을 때에 아래쪽으로 되는 위치에 배치하는 것이 바람직하다.

또한 마지막으로 배양이 이루어지는 배양 용기 (2)(통상, 마지막에 접속되는 배양 용기 (2), 도 1에서는 3차 배양 용기 (2c))는 샘플링용 포트를 갖추고 있으며 이 포트에 샘플링 튜브 (2c-1)가 접속되어 있다. 샘플링 튜브 (2c-1)는 배양된 세포의 상태를 확인하는 것 등을 목적으로 하여, 배양 용기 (2)에서 배양된 세포의 일부를 꺼내기 위해서 사용된다. 샘플링 튜브 (2c-1)에서의 배양 용기 (2)의 포트와 반대 측의 자유단 선단부에는 2단 씰 처리가 되어있고, 샘플링 튜브 (2c-1)를 훑음으로써 배양 용기 (2)에서 샘플링 튜브 (2c-1)내에 세포 현탁액을 충전시킬 수 있다. 그리고, 샘플링 튜브 (2c-1)를 히트실(열 용착) 한 후에 절단함으로써 세포 배양 시스템의 폐쇄계를 유지한 상태에서 세포를 샘플링할 수 있게 되어 있다.

또한 샘플링용 포트를 중간의 배양 용기 (2)(도 1에서는 2차 배양 용기 (2b))에 갖추고, 이 포트에 샘플링 튜브를 접속하고 세포의 샘플링을 할 수 있도록 하는 것도 바람직하다.

배양 용기 (2)의 4변은 가열 밀봉에 의하여 밀봉되어 있다. 배양 용기 (2)의 수용부의 형상은 직사각형 모양으로 해도 되고, 또한 도 1과 같이 포트에 향해서 점차 좁아지게 구성하는 것도 바람직하다. 또한 배양 용기 (2)는 블로우 성형에 의한 일체 성형 백이라도 된다.

[이송 튜브]

이송 튜브 (3)는 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)를 접속하고 이로써 배지 용기 (1)에서 배양 용기 (2)에 대한 배지의 주입, 및 복수의 배양 용기 (2) 사이에 있어서의 배지나 세포 현탁액의 이송을 하는 것을 가능하게 하고 있다.

이송 튜브 (3)의 유로에는 유로 개폐 수단과 펌프를 적절히 배치하고, 유로 개폐 수단에 의해서 송액 유로를 제어하고 있다. 유로 개폐 수단으로는 예를 들면 핀치 밸브나 2방 활전(二方活栓), 3방 활전 등을 사용할 수 있으며, 특히 한정되지 않는다. 도 1에서는 3방 활전을 사용하여 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)가 접속되어 펌프에 의해서 배지 용기 (1)에서 배양 용기 (2)에 대한 배지의 이송이 이루어진다. 또한 이 도에서는 배양 용기 (2)(1차 배양 용기 (2a), 2차 배양 용기 (2b))와 이송 튜브 (3)의 접속이나 이송 튜브 (3)끼리의 접속을 루어 커넥터를 사용하여 실시하고 있지만 기타의 방법으로 접속해도 된다.

이송 튜브 (3)의 재료는 사용 환경에 맞추어 적절히 선택하면 되지만, 가스 투과성에 뛰어난 것이 바람직하다. 예를 들면 실리콘 고무, 연질 염화 비닐 수지, 폴리부타디엔 수지 에틸렌-초산 비닐 공중 합체, 염소화 폴리에틸렌 수지, 폴리우레탄계 열 가소성 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 스티렌계 엘라스토머 등을 사용할 수 있다. 또한 스티렌계 엘라스토머로는 예를 들면 SBS(스티렌·부타디엔·스틸렌), SIS(스티렌·이소프렌·스틸렌), SEBS(스티렌·에틸렌·부틸렌 렌·스틸렌), SEPS(스티렌·에틸렌·프로필렌·스틸렌) 등을 사용할 수 있다.

도 1에서는 이송 튜브 (3)에서의 펌프를 장착하는 부분에는 실리콘 튜브가 사용되며, 그 밖의 부분에는 연질 염화 비닐 수지 섬유 튜브가 사용되고 있다.

[교반 수단]

배양 용기 (2)를 사용하여 세포 배양을 하는데 있어서 배양 용기 (2)의 내용액 중의 세포의 분포나 배지의 성분 농도를 균일하게 하여 양호한 배양 환경을 유지하여 세포의 증식을 촉진하기 위해서, 배양 개시 및 배지 공급시 등에 배양 용기 (2)의 내용액을 교반하는 교반 수단을 형성하는 것이 바람직하다. 또한 교반 수단은 이후의 실시형태에서도 배양 용기의 내용액을 교반하는 것 등을 목적으로 사용할 수 있다.

이 때, 교반 수단으로 배양 용기 (2)를 초기 위치보다 위쪽으로 이동시키는 상동(上動) 공정과, 배양 용기 (2)를 초기 위치까지 되돌리는 동시에 함께 초기 위치로 돌아온 배양 용기 (2)에 진동을 가하는 하동(下動) 공정을 반복함으로써 배양 용기 (2)의 내용액을 교반할 수 있다.

또한 상동. 공정과 하동 공정을 반복함에 있어서 배양 용기 (2)의 내용액의 교반이 확실하게 이루어지도록 필요에 따라 하동 공정 후에 간격을 두고, 소정의 시간이 경과하고 나서 하동 공정이 반복되게 해도 된다.

이렇게 함으로써 배양 용기 (2)의 상하동에 의한 내용액의 교반에 더하여 하동 공정에서 배양 용기 (2)에 가해지는 진동으로 세포가 내용액중을 날아오르듯 확산한다. 이로써, 배양 용기 (2)의 내용액이 상하 방향으로도 효율적으로 교반 되어, 세포 배양 용기 (2)의 배양면을 굴러 떨어질 때의 전단(剪斷) 응력을 경감하고, 세포에 미치는 대미지를 적게 하면서, 배양 용기 (2)의 내용액 중의 세포의 분포나 배지의 성분 농도를 균일하게 하여 양호한 배양 환경을 유지하는 동시에, 세포가 용기 내벽에 부착하거나 지나치게 응집하는 것을 억제하여, 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 또한 배양하는 세포가 접착계의 세포인 경우에는 하동 공정에서 배양 용기 (2)에 가해지는 진동에 의해서 배양 용기 (2)의 배양 면에서 세포의 박리를 촉구하는 것도 가능하다.

상기와 같이 배양 용기 (2)의 내용액을 교반하기 위해서, 교반 수단으로서, 예를 들면 도 2와 같이 한쪽 끝가장자리에 형성된 회동축 (42)을 기대(基台) (6)에 축지지한 평판형 유지판 (41)을 가진 적재부 (4)와, 유지판 (41)을 팔로어(follower)하는 캠 기구를 갖추고, 배양 용기 (2)가 적재부 (4)에서 유지되어, 캠 기구에 의해서 회동축 (42)을 중심으로 유지판 (41)을 상하로 반복 회동시키는 동시에 유지판 (41)이 하동하여 기대 (6)에 접촉했을 때에 생기는 진동을 배양 용기 (2)에 가함으로써 배양 용기 (2)의 내용액을 교반하는 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 복수의 배양 용기 (2)는 각각 별개의 유지판 (41)에 유지시키도록 해도 되고, 하나의 유지판 (41)에 일괄적으로 유지하도록 해도 된다.

이와 같은 장치에서 상동 공정에서는 적재부 (4)에 유지된 배양 용기 (2)는 캠 기구에 의해서 유지판 (41)이 위쪽으로 회동함에 따라 초기 위치보다 위쪽으로 이동하면서 기울어져가고, 이로써 연포재를 사용하여 형성된 배양 용기 (2)가 휘어져 변형하면서 그 내용액이 회동축 (42)측에 치우치게 유동한다(도 2(a)~(e)참조). 하동 공정에서는, 유지판 (41)은 최대 경사 각도 θ max에 이른 후 아래쪽으로 회동하고 이에 따라 배양 용기 (2)는 초기 위치로 되돌아가지만(도 2(f),(g)참조), 그 때 배양 용기 (2)의 내용액에 되돌아옴이 생기고 이와 함께 유지판 (41)이 기대 (6)에 접촉했을 때의 충격으로 생긴 진동으로 세포가 내용액 중을 날아오르듯 확산하고 이에 따라서 배양 용기 (2)의 내용액이 교반된다.

이와 같이 하여 배양 용기 (2)의 내용액을 교반함에 있어서 세포에 미치는 타격을 보다 적게 하여 배양 용기 (2)의 내용액을 보다 효율적으로 교반하려면, 기대 (6)에 수평으로 지지한 유지판 (41)을 완만하게 위쪽으로 회동시키고, 유지판 (41)이 최대 경사 각도 θ max에 이른 후에, 유지판 (41)을 낙하에 의해서 아래쪽으로 회동시켜서 낙하하는 유지판 (41)을 기대 (6)가 받았을 때에 생기는 충격으로 배양 용기 (2)에 진동이 가해지도록 하는 것이 바람직하다. 특히 도시하지 않았지만, 유지판 (41)이 기대 (6)에 접촉했을 때의 충격으로 생긴 진동을 배양 용기 (2)에 가하는데 있어서는 배양 용기 (2)의 내용액을 보다 효율적으로 교반하여 배양 용기 (2)에 진동을 가하기에 알맞은 위치에 따라서, 유지판 (41)에 접촉하는 볼록 부를 기대 (6)에 형성해둘 수 있다.

또한 유지판 (41)을 낙하에 의해서 아래쪽으로 회동시키려면 예를 들면, 윤곽이 원호 형상인 제1 캠면 (51)과 윤곽이 직선 모양의 제2 캠면 (52)을 가지는 플레이트 캠 (5)에 의해서 캠 기구를 구성하고, 캠면 (51, 52)의 곡률, 플레이트 캠 (5)을 회전시키는 구동축 (53)의 위치 및 회전 속도를 적절히 설정하여, 제1 캠면 (51)에 의해서 유지판 (41)을 위쪽으로 회동시키고 제2 캠면 (52)으로 전환 시에 플레이트 캠 (5)이 유지판 (41)에서 떨어지도록 함으로서(도 2(f)참조), 유지판 (41)을 낙하에 의해서 아래쪽으로 회동시킬 수 있다.

또한 제2 캠면 (52)으로 전환 시 플레이트 캠 (6)이 유지판 (41)에 접한 채로 되게 함과 동시에, 캠면 (51, 52)의 곡률, 구동축 (53)의 위치 및 회전 속도를 적절히 설정함으로써 배양 용기 (2)에 충격을 가하지 않고 배양 용기 (2)를 요동하여, 배양 용기 (2)의 내용액을 완만하게 섞는 것도 가능하다.

또한 상기한 바와 같이 배양 용기 (2)의 형상은 직사각형 모양으로 할 수 있으며 유지판 (41)의 형상도 배양 용기 (2)의 형상에 맞추어 설계하지만, 유지판 (41)을 직사각형으로 한 경우 회동축 (42)을 설치하는 한쪽 끝 가장자리는 단변 측이라도 장변 측이라도 된다.

또한 이러한 배양 용기 (2)의 내용액 교반 수단을 부유계의 세포를 활성화시킨 다음 세포를 배양 면에서 박리하는 경우나, 상기한 바와 같이 접착계의 세포를 배양면에서 박리하는 경우에 세포박리 수단으로 사용하는 것도 가능하다.

또한 도시하지 않았지만 세포 배양 시스템에는 각 배양 용기 (2)내의 세포나 배지의 상태를 관찰하기 위한 관찰 장치를 갖추는 것이 바람직하다. 관찰 장치로는 CCD카메라, 대물 렌즈, 조명 및 정보 처리 장치 등으로 이루어진 것을 사용할 수 있다. 이 경우 관찰 구멍을 가진 적재대에 수평으로 재치(載置)된 배양 용기 (2)위쪽에서 빛을 비추어 관찰 구멍 아래에서 CCD카메라와 대물 렌즈에 의해서 배양 용기 (2)내의 세포 등을 소정의 시기에 자동적으로 촬영할 수 있다. 그리고, 얻은 화상 데이터를 정보 처리 장치에 송신하여 정보 처리 장치에서 화상 데이터를 해석하고, 배양 용기 (2)내의 세포 수나 세포 밀도 등을 산출할 수 있다. 이는 이후의 실시형태에 대해서도 마찬가지이다.

[세포 배양 방법]

다음에 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에 대해서 도 1~도 4를 참조하여 자세히 설명한다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은 복수의 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법이며, 복수의 배양 용기가 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고, 복수의 배양 용기에서의 제1의 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하고, 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와 제1의 배양 용기를 튜브를 사용하여 접속하는 동시에, 제1의 배양 용기에 복수의 배양 용기에서의 그 밖의 배양 용기를 순차적으로 튜브를 사용하여 접속하고, 제1의 배양 용기에서 세포 배양을 시작하고 제1의 배양 용기에서의 배양이 끝난 다음 제1의 배양 용기에 접속된 제2의 배양 용기에 제1의 배양 용기에서 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 이어서 제1의 배양 용기에 배지 공급 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 제2의 배양 용기에 제1의 배양 용기에서 배지를 공급하여, 제2의 배양 용기에서 세포 배양을 하고, 제2의 배양 용기에서의 배양이 끝난 후, 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 다음의 배양 용기가 있는 경우 다음의 배양 용기에 대한 세포 현탁액의 이송, 배양이 종료된 배양 용기에 대한 배지의 공급, 다음의 배양 용기에 대한 배양이 종료된 배양 용기로부터의 배지의 공급 및 다음의 배양 용기에서의 세포 배양을, 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 다음의 배양 용기가 없어질 때까지 반복하여 실시하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로는 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은, (1) 용기 접속 공정과, (2) 1차 배양 공정과, (3) 세포 이송 공정 1과, (4) 배지 첨가공정 1과, (5) 2차 배양 공정과, (6) 세포 이송 공정 2와, (7) 배지 첨가공정 2와, (8) 3차 배양 공정과, (9) 샘플링 공정과, (10) 농축 공정을 가진 것으로 할 수 있다.

또한 세포 배양 시스템에서의 배양 용기 (2)의 개수가 2개인 경우는 (6)~(8)을 생략하는 동시에 2차 배양 용기 (2b)에 샘플링 튜브를 갖추고 (9)~(10)을 할 수 있다. 또한 세포 배양 시스템에서의 배양 용기 (2)의 개수가 4개 이상인 경우는 네 개 이상의 부분에 대해서 (6)~(8)을 반복한다. 또한 (9) 및(10)을 생략할 수도 있다.

(1) 용기 접속 공정

먼저 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에서 사용하는 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)를 도 1과 같이 접속하여 폐쇄계의 세포 배양 시스템을 구성한다.

즉 배지 용기 (1)와 1차 배양 용기 (2a)와 2차 배양 용기 (2b)와 3차 배양 용기 (2c)를 이 순서로 이송 튜브 (3)를 사용하여 접속한다.

이 때 1차 배양 용기 (2a)에는 배양을 할 세포와 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하여 접속한다. 또한 배지 용기 1에는 배양 용기 (2)에 공급하기 위한 배지를 충전해서 접속한다. 2차 배양 용기 (2b)와 3차 배양 용기 (2c)는 빈 채로 접속한다. 배지 용기 (1)와 배양 용기 (2)사이의 이송 튜브 (3)위에는 펌프가 갖추어지고 이 펌프에 의해서 배지의 이송이 이루어진다. 또한 이송 튜브 (3)위에는 적절히 3방 활전이 구비되어 있어, 이것들에 의해서 송액 유로를 제어할 수 있다.

또한 도 3과 같이 복수의 배양 용기 (2)는 배지 용기 (1)에 보다 가까이 접속된 것일수록 상대적으로 높은 위치가 되도록 배치된다. 즉 1차 배양 용기 (2a)가 가장 높은 위치에 배치되고, 2차 배양 용기 (2b)가 다음으로 높은 위치에 배치되어 3차 배양 용기 (2c)가 가장 낮은 위치에 배치된다. 배양 용기 (2)를 이렇게 배치하고, 1차 배양 용기 (2a)를 도 4에 나타내듯이 기울임으로써 1차 배양 용기 (2a)의 내용액을 1차 배양 용기 (2a)의 아래쪽의 포트와 이송 튜브 (3)를 경유하여 2차 배양 용기 (2b)에 자연 송류에 의해서 이송할 수 있게 되어 있다. 또한 도시하지 않았지만 마찬가지로 2차 배양 용기 (2b)를 기울임으로써 2차 배양 용기 (2b)의 내용액을 2차 배양 용기 (2b)의 아래쪽의 포트와 이송 튜브 (3)를 경유하여 3차 배양 용기 (2c)에 자연 송류에 의해서 이송하는 것이 가능하게 되어 있다. 또한 도 3, 도 4에서, 교반 수단은 생략되어 있다.

또한 도시하지 않았지만 배지 용기 (1)는 배양 용기 (2)보다 상대적으로 낮은 위치에 배치하는 것이 바람직하고, 예를 들면 배양 용기를 배치한 적재대 (13)의 아래쪽에 배치할 수 있다. 이로써 배지가 배양계에 의도하지 않고 유입하는 것을 방지할 수 있게 된다.

이러한 복수의 배양 용기 (2)와 배지 용기 (1)의 배치는 다음의 실시형태에서도 같이 취하는 것이 바람직하다.

또한 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에서 배양 용기 (2)를 재치한 기대 (6)의 중량을 계측하기 위한 계측 수단을 갖추는 것도 바람직하다. 이러한 계측 수단을 사용하여 배양 용기 (2)를 재치한 기대 (6)의 중량의 감소를 모니터링함으로써 배양 용기 (2)에서 액 누출이 생긴 경우에 이를 검출할 수 있게 된다.

(2) 1차 배양 공정

이와 같이 세포 배양 시스템을 구성하면 먼저 1차 배양 용기 (2a)에서 세포 배양이 진행된다. 또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어서 배지가 배지 용기 (1)에서 펌프를 사용하여 1차 배양 용기 (2a)에 공급된다. 이때 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다. 이 이송 속도로서는 예를 들면 통상의 이송 속도의 5% ~ 50%정도로 하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 5mL/min ~ 50mL/min으로 하는 것이 바람직하며, 10mL/min ~ 30mL/min로 하는 것이 보다 바람직하다.

또한 이 1차 배양 공정에서 1차 배양 용기 (2a)내에서의 세포를 분산시키기 위해서, 상기 교반 수단을 사용하여 1차 배양 용기 (2a)에 반복적으로 진동을 가하여, 1차 배양 용기 (2a)의 내용액을 교반하는 것이 바람직하다. 이와 같은 내용액의 교반은 기타의 배양 용기 (2)에 대해서도 마찬가지로 실시하는 것이 바람직하다.

(3) 세포 이송 공정 1

1차 배양 용기 (2a)내의 세포 밀도가 소정의 세포 밀도로 되고 1차 배양 공정이 완료되면 다음으로 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)로 배양 세포의 이송이 이루어진다.

이 때 도 4와 같이 1차 배양 용기 (2a)를 2차 배양 용기 (2b)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 하여 1차 배양 용기 (2a)내의 내용액(세포 현탁액)을 2차 배양 용기 (2b)에 송류한다. 이로써 1차 배양 용기 (2a)에서 배양된 세포가, 2차 배양 용기 (2b)로 이송된다. 이와 같이 1차 배양 용기 (2a)에서 배양된 세포는 2차 배양 용기 (2b)에 자연 송류되지만 이 송류가 완료된 시점에서는 통상 1차 배양 용기 (2a)에는 세포가 남아 있다.

(4)배지 첨가공정 1

다음에 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에 첨가한다. 이 때 상기 1차 배양 공정에서 배지를 공급하는 경우와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다.

그리고 1차 배양 용기 (2a)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다. 이 대기 시간으로서는 예를 들면 2분에서 20분 정도로 하는 것이 바람직하고, 5분에서 10분 정도로 하는 것이 보다 바람직하다.

이어 상기 교반 수단에 의해서, 1차 배양 용기 (2a)내의 배지를 교반한다. 그리고 배지를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)에 이송한다.

이로써 예를 들면 배지 용기 (1)에서 15℃ 이하였던 배지의 온도를 20℃ 이상으로 한 다음에 2차 배양 용기 (2b)에 이송할 수 있다.

이 때문에, 저온의 배지가 그대로 2차 배양 용기 (2b)로 이송되지 않고 저온의 배지에 의해서 세포의 증식 효율이 떨어지는 것을 억제할 수 있다. 그 후 배지의 온도는 실온(예를 들면 37℃)까지 자연스럽게 상승한다.

또한 이와 같이 배지를 1차 배양 용기 (2a)로 이송하고 나서 2차 배양 용기 (2b)에 이송함으로써 1차 배양 용기 (2a)에 잔존한 세포를 배지와 함께 2차 배양 용기 (2b)에 이송할 수 있으며 세포 배양에서의 잔존 세포를 저감할 수 있게 되어 있다.

(5) 2차 배양 공정

2차 배양 용기 (2b)에 배양 세포 및 배지가 이송되면 2차 배양 용기 (2b)에서 계속해서 세포 배양이 진행된다. 또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지를 배지 용기 (1)에서 공급할 수 있지만 이때도 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 실시할 수 있다.

(6) 세포 이송 공정 2

2차 배양 용기 (2b)내의 세포 밀도가 소정의 세포 밀도로 되어 2차 배양 공정이 완료되면 다음에 2차 배양 용기 (2b)에서 3차 배양 용기 (2c)에 배양 세포의 이송이 이루어진다.

이 때, 2차 배양 용기 (2b)를 3차 배양 용기 (2c)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 하여 2차 배양 용기 (2b)내의 내용액(세포 현탁액)을 3차 배양 용기 (2c)에 송류한다. 이에 의해서, 2차 배양 용기 (2b)에서 배양된 세포가, 3차 배양 용기 (2c)에 이송된다. 이와 같이 2차 배양 용기 (2b)에서 배양된 세포는 3차 배양 용기 (2c)로 자연 송류되지만 이 송류가 완료된 시점에서는, 통상, 2차 배양 용기 (2b)에는 세포가 남아 있다.

(7) 배지 첨가공정 2

다음에 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에 첨가한다. 이 때, 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송해도 된다. 그리고 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 1차 배양 용기 (2a)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다.

이어, 교반 수단에 의해서 1차 배양 용기 (2a)내의 배지를 교반한 후 배지를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)에 이송한다. 그리고 2차 배양 용기 (2b)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다렸다가 배지 온도를 상승시키고 이어 교반 수단에 의해서 2차 배양 용기 (2b)내의 배지를 교반한 후 배지를 2차 배양 용기 (2b)에서 3차 배양 용기 (2c)에 이송한다.

이 때 배지를 1차 배양 용기 (2a)와 2차 배양 용기 (2b)에 이송하고 나서 3차 배양 용기 (2c)에 이송하기 위하여, 1차 배양 용기 (2a)와 2차 배양 용기 (2b)에 잔존한 세포를 배지와 함께 3차 배양 용기 (2c)에 이송할 수 있으며, 세포 배양에서의 잔존 세포를 현저히 감소할 수도 있다.

(8) 3차 배양 공정

3차 배양 용기 (2c)에 배양 세포 및 배지가 이송되면 3차 배양 용기 (2c)에서 계속 세포 배양이 진행된다. 또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지를 배지 용기 (1)에서 공급할 수 있지만 이때도 배지 첨가공정 2와 같이 실시해도 된다.

또한 3차 배양 용기 (2c)에서의 배지량은 1차 배양 용기 (2a)나 2차 배양 용기 (2b)보다 크고 차가운 배지에 의한 영향이 비교적 작기 때문에 3차 배양 용기 (2c)에 대한 배지의 이송 속도는 통상의 이송 속도로 할 수 있고, 예를 들면 100mL/min정도로 할 수 있다.

배지 용기 (1)에서의 모든 배지가 배양 용기 (2)에 공급되어 배지 용기 (1)가 비면, 빈 배지 용기 (1)는 폐액 용기 또는 세포 회수 용기로서 사용할 수 있다.

(9) 샘플링 공정

3차 배양 용기 (2c)에서의 세포가 소정의 세포 수 또는 세포 밀도가 되면 세포의 샘플링이 이루어진다. 또한 이 샘플링 공정은 증폭 배양 공정의 도중에서 실시해도 된다.

이때 세포의 샘플링은 샘플링 튜브 (2c-1)를 훑음으로써 샘플링 튜브 (2c-1)내에 3차 배양 용기 (2c)에서 내용액을 충전하고, 샘플링 튜브 (2c-1)를 열 용착한 후 절단해서 실시할 수 있다. 이렇게 하면 세포 배양 시스템에서의 폐쇄계를 유지한 채 무균적으로 세포의 샘플링을 할 수 있다.

(10) 농축 공정

다음에, 3차 배양 용기 (2c)에서 내용액의 상등액을 폐액 용기로서의 배지 용기 (1)에 펌프를 사용하여 송류한다. 이에 의해서, 3차 배양 용기 (2c)내의 내용액에서의 세포 밀도를 높일 수 있고, 고농도의 세포 현탁액을 얻는 것이 가능하다. 그리고 이렇게 얻어진 고농도의 세포 현탁액을 수용하는 3차 배양 용기 (2c)에서 세포를 회수할 수 있다.

이와 같이 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에서는 배양 용기에 배지를 공급함에 있어서 이미 배양이 종료된 배양 용기에 배지를 주입하여 소정 시간 경과한 후에, 배양 용기에 배지를 이송하도록 하고 있다. 이 때문에 배양이 종료된 배양 용기에 잔존하는 세포를 저감 할 수 있는 동시에 배지의 온도를 상승시키고 나서 배양 용기에 배지를 이송할 수 있으며 세포의 증식 효율을 보다 향상시킬 수 있게 되어 있다.

(제2 실시형태)

다음에 본 발명의 제2 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 대해서, 도 5를 참조하여 설명한다.

[세포 배양 시스템]

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 주로, 림프구 등의 부유계의 세포를 보다 효율적으로 배양하기 위한 것이며, 도 5와 같이 복수의 배지 용기 (1)와, 기능이 다른 복수의 배양 용기가 이송 튜브 (3)에 의해서 접속된 구성으로 되어 있다. 이들 복수의 배양 용기는 다른 용기와의 내용물의 이송을 위한 포트가 하나 갖춰졌으며, 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)가 튜브를 사용하여 접속되어 있다.

구체적으로는 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 배지 용기 (1)로서, 배지 A 공급 용기 (1a)와 배지 B 공급 용기 (1b)를 구비함과 동시에, 복수의 배양 용기로서, 양생 확대 배양 용기 (20a)(이하, 양생 배양 용기, 또는 양생 용기 (20a)라고 칭하는 경우가 있음), 활성화 배양 용기 (20b)(이하, 활성화 용기 (20b)라고 칭하는 경우가 있음.) 및 증폭 배양 용기 (20c)(이하, 증폭 용기 (20c)라 일컫는 경우가 있음.)를 갖추고 이들의 용기를 이송 튜브 (3)를 사용하여 접속한 구성으로 되어 있다.

또한 복수의 배양 용기는 이들 3개로 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 양생 용기 (20a)를 제외하고 활성화 용기 (20b)와 증폭 용기 (20c)의 2개로 해도 되고, 또한 그 외의 배양 용기 등을 사용하여 4개나 5개, 또는 그 이상으로 해도 된다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에 따르면 양생 용기 (20a)에서의 배양이 종료되고, 활성화 용기 (20b)에서 배양을 하는데 있어서 활성화 용기 (20b)에 배지를 주입하기 전에 먼저 양생 용기 (20a)에 배지를 주입하여 소정 시간 기다린 후 활성화 용기 (20b)에 배지를 이송함으로써 양생 용기 (20a)에 잔존하는 세포를 저감할 수 있고, 또한 활성화 용기 (20b)에 이송할 배지의 온도를 상승시킬 수 있다. 또한 증폭 용기 (20c)에서 배양을 하는데 증폭 용기 (20c)에 배지를 주입하기 전에 양생 용기 (20a) 및/또는 활성화 용기 (20b)에 배지를 주입하여 소정 시간 기다린 후 증폭 용기 (20c)에 배지를 이송함으로써 양생 용기 (20a) 및/또는 활성화 용기 (20b)에 잔존하는 세포를 저감할 수 있고, 또한 증폭 용기 (20c)로 이송하는 배지의 온도를 더욱 상승시킬 수 있다. 따라서 세포의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있게 되어 있다.

[배지 공급 용기]

배지 용기 (1)는 세포를 배양하기 위한 배지를 배양 용기에 공급하는 용기이며, 양생 용기 (20a), 활성화 용기 (20b) 및 증폭 용기 (20c)에 공급하는 배지를 격납한다.

배지 용기 (1)는 도 5에서 양생 용기 (20a)와 활성화 용기 (20b)에 배지 (A)를 공급하기 위한 배지 A 공급 용기 (1a)와, 증폭 용기 (20c)에 배지 (B)를 공급하기 위한 배지 B 공급 용기 (1b)로 구성되어 있는 점에서 제1 실시형태와 다르다. 기타의 점에 대해서는 제1 실시형태의 것과 같은 구성으로 할 수 있다.

[양생 확대 배양 용기]

양생 용기 (20a)는 타격을 받은 세포의 기능을 회복시키기 위한 세포 배양에 사용하는 용기이다. 즉 환자로부터 갓 채취한 세포나, 동결 보존 후에 갓 해동된 세포와 같은 타격을 받아 기능이 쇠약해진 세포는 그 상태로는 활성화시키려고 해도 제대로 할 수 없어 세포의 대량 배양에 사용할 수 없다. 그래서 이러한 세포를 증식시키기 위해 세포 본래의 기능이 회복되도록 세포 배양의 초기 단계에서 해당 세포를 양생하면서 배양하는 배양 공정(양생 배양 공정)이 이뤄진다. 그리고 세포 본래의 기능이 회복하고 세포의 증식이 어느 정도 진행되고부터 재배 면적을 확대하여, 소정의 세포 밀도에 오르기까지 세포 배양을 계속하는 배양 공정(확대 배양 공정)이 이뤄진다.

양생 용기 (20a)는 이러한 양생 배양 공정과 확대 배양 공정에서 사용되는 배양 용기이며 도 6과 같이 양생 용기 (20a)를 유지하는 유지구 (7)와 함께 사용된다.

양생 용기 (20a)는 연포재를 재료로 하여 주머니 모양(백형)으로 형성되어 있다. 연포재란 가요성. 및 유연성을 포장체에 부여하는 포장 재료를 말한다.

또한 양생 용기 (20a)는 세포 배양에 필요한 가스 투과성(산소 및 이산화탄소 투과성)을 가지고 있다. 이로써 세포 배양을 폐쇄계(밀폐계)에서 할 수 있다. 양생 용기 (2)는 37℃, 5% 이산화탄소 농도의 배양 환경 하에서 사용하는 것이 바람직하다. 이는 활성화 용기 (20b) 및 증폭 용기 (20c)에 대해서도 마찬가지이다.

또한 양생 용기 (20a)는 내용물을 확인할 수 있도록 일부 또는 전부가 투명성을 가지고 있다. 또한 양생 용기 (20a)는 저 세포 독성, 저 용출성 및 방사선 멸균 적성을 가지는 것이 바람직하다.

이러한 조건을 충족시키는 양생 용기 (20a)의 재료로는 폴리에틸렌 수지가 바람직하다. 이 폴리에틸렌계 수지로는 폴리에틸렌, 에틸렌과 α-올레핀의 공중합체, 에틸렌과 초산 비닐의 공중합체, 에틸렌과 아크릴산이나 메타 크릴산 공중합체와 금속 이온을 사용한 아이오노머 등을 들 수 있다. 또한 폴리올레핀, 스티렌계 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘 수지 등을 사용할 수도 있다.

이러한 양생 용기 (20a)의 형상은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 직사각형 모양으로 할 수 있으며, 단변 측의 한 변에 하나의 포트가 갖추어지고 이에 이송 튜브 (3)가 접속되어 있다. 그리고 이 이송 튜브 (3)를 통해서 활성화 용기 (20b)에 대한 세포 현탁액의 이송, 배지 A 공급 용기 (1a)로부터 양생 용기 (20a)에 대한 배지의 첨가 및 양생 용기 (20a)에서 활성화 용기 (20b)에 대한 배지의 이송이 이루어진다.

또한 양생 용기 (20a)의 4변은 가열 밀봉에 의해 밀봉되는 동시에 양생 용기 (20a)내의 수용부가 이송 튜브 (3)의 장착 부분을 향하여 점차 좁아지게 하는 것이 바람직하다. 또한 양생 용기 (20a)는 블로우 성형에 의한 일체 성형 백이라도 된다.

양생 용기 (20a)를 유지하는 유지구 (7)에는, 복수의 오목부 (701)가 형성되고, 양생 용기 (20a)의 폭 방향 중앙부를 유지하는 바닥판 (70)과, 바닥판 (70)의 양 끝 가장자리를 따라서 형성되어 양생 용기 (20a)의 폭 방향 측 가장자리를 유지하고 수직 또는 대각선 방향으로 일어선 상태와 바닥판 (70)과 수평으로 쓰러진 상태로 가변이 되도록, 그 하단 쪽을 축으로 회동 가능한 측판 (71)을 가지고 있다. 도 6은 측판 (71)을 바닥판 (70)과 수평으로 쓰러진 상태를 나타내고 있다. 또한 복수의 오목부 (701)를 관통 구멍으로 구성할 수도 있다.

양생 용기 (20a)를 유지구 (7)에 장착하여 유지하기 위해서, 유지구 (7)의 측판 (71)에는 고정 부재가 세워져 설치되어 있다. 이와 함께 양생 용기 (20a)의 네 귀퉁이에는 고정 부재에 고정되는 구멍이 설치되어 있다. 이로써 고정 부재의 각각에 양생 용기 (20a)의 각 구멍을 고정함으로써 양생 용기 (20a)가 유지구 (7)에 장착되어, 도 6과 같이 측판 (71)이 바닥판 (70)과 수평으로 쓰러진 상태의 유지구 (7)의 거의 전체면에서 양생 용기 (20a)가 유지되도록 되어 있다. 그리고 측판 (71)이 일어선 상태에서 바닥판 (70)과 수평으로 쓰러진 상태가 되도록 회동(회전운동)함에 따라, 양생 용기 (20a)의 네 귀퉁이가 당겨져서, 양생 용기 (20a)에 장력이 가해지도록 되어있다.

즉 측판 (71)이 일어선 상태에 있을 때는 바닥판 (70)상에 유지된 양생 용기 (20a)가 내용물의 무게로 오목부 (701)내에 부분적으로 빠지듯 휨으로써 양생 용기 (20a)의 바닥면에 패임 ((20a-1))이 형성되도록 되어 있다. 그리고 측판 (71)이 회동하여 바닥판 (70)과 수평으로 쓰러진 상태가 되면 양생 용기 (20a)의 폭 방향 끝 가장자리부도 측판 (71)과 함께 쓰러지고, 이에 따라 고정 부재에 의해서 양생 용기 (20a)의 네 귀퉁이가 당겨져서 장력이 가해져서 양생 용기 (20a)의 휘어짐이 해소되어 양생 용기 (20a)의 저면에 형성된 패임 ((20a-1))이 소실되어 있다.

이러한 양생 용기 (20a)에 따르면 세포 배양의 개시에 있어서, 양생 용기 (20a)에 세포와 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하면 세포는 양생 용기 (20a)의 저면에 침강하지만, 이 때 측판 (71)을 일어선 상태에 두면 침강한 세포가 양생 용기 (20a)의 저면에 형성된 패임 ((20a-1))에 모여서 세포 밀도를 높일 수 있다.

이 때문에 세포 배양의 개시 시에 세포 밀도를 높인 상태에서 배양을 할 수 있으며, 세포 본래의 기능을 보다 효율적으로 회복시킬 수 있게 되어 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 림프구 등의 부유계 세포를 배양하는 경우에는 양생 용기 (20a)의 저면에 형성된 패임 (20a-1)에 세포가 몰리면서 세포가 생성하는 사이토카인 등의 활성화 물질의 농도가 국소적으로 높아지고, 또한 세포 간의 상호 작용이 생김으로써, 세포 활성을 높인 상태에서 배양할 수 있게 되어 있다.

그리고 양생 용기 (20a)에 장력을 가하여 휘어짐을 해소함으로써 양생 용기 (20a)의 저면에 형성된 패임 (20a-1)을 소실시키면서 양생 용기 (20a)내의 배양 면적을 확대할 수 있다. 이 때문에, 용기를 옮기지 않고, 양생 배양 공정에서 확대 배양 공정으로 이행할 수 있으며 세포에 대한 타격의 저감, 오염의 리스크 저감이 가능하게 되어 있다.

또한 세포의 증식이 어느 정도 진행되고부터 양생 용기 (20a)내의 배양 면적을 확대시킴으로써 동일한 용기 내에서 적정한 세포 밀도를 유지하면서 효율적으로 세포를 배양할 수 있다.

그러므로 본 실시형태에서의 양생 용기 (20a)는 환자로부터 갓 채취한 세포나, 동결 보존 후에 해동된 직후의 세포와 같은 타격을 받아 기능이 쇠약해진 세포를 양생하여, 세포 본래의 기능을 회복하면서 효율적으로 배양하는데 특히 알맞게 사용할 수 있다.

[활성화 배양 용기]

활성화 용기 (20b)는 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 용기이다. 활성화 용기 (20b)내의 바닥면 위에는 항 CD3항체 등의 세포를 활성화시키는 물질이 고체상화(고정화)되어 있고 활성화 용기 (20b)에 수용된 세포는 해당 물질에 결합하여 활성화된다. 항 CD3항체는 림프구를 활성화하기에 알맞게 사용된다.

활성화 용기 (20b)는 양생 용기와 마찬가지로 연포재를 재료로 하여 주머니 모양(백형)으로 형성되어 있어 내용물을 확인할 수 있도록 일부 또는 전부가 투명성을 가지고 있다. 또한 활성화 용기 (20b)는 양생 용기 (20a)와 마찬가지로 세포 배양에 필요한 가스 투과성(산소 및 이산화탄소 투과성)을 가지며, 저 세포 독성, 저 용출성 및 방사선 멸균 적성을 갖는 것이 바람직하다. 활성화 용기 (20b)의 재료로서는, 양생 용기 (20a)와 같은 것을 사용할 수 있다.

활성화 용기 (20b)의 형상은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 직사각형 모양으로 할 수 있으며, 단변 측의 한 변에 하나의 포트가 갖추어지고 이에 이송 튜브 (3)가 접속되어 있다. 그리고 이 이송 튜브 (3)를 통해서 증폭 용기 (20c)에 대한 세포 현탁액의 이송, 배지 A 공급 용기 (1a) 또는 양생 용기 (20a)에서 활성화 용기 (20b)에 대한 배지의 첨가 및 활성화 용기 (20b)에서 증폭 용기 (20c)에 대한 배지의 이송이 이루어진다.

또한 활성화 용기 (20b)의 4변은 가열 밀봉에 의해서 밀봉되는 동시에 활성화 용기 (20b)내의 수용부가 이송 튜브 (3)의 장착 부분을 향하여 점차 좁아지게 하는 것이 바랍직하다. 또한 활성화 용기 (20b)는 블로우 성형에 의한 일체 성형 백이라도 된다.

활성화 용기 (20b)의 용량은 양생 용기 (20a)의 용량보다 크게 하는 것이 바람직하고, 예를 들면 양생 용기 (20a)의 용량의 2배 이상의 것을 알맞게 사용할 수 있다.

[증폭 배양 용기]

증폭 용기 (20c)는 세포를 대량 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 용기이다.

증폭 용기 (20c)의 형상은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 직사각형 모양으로 할 수 있으며 그 한변에 다른 용기와의 내용물의 이송을 하기 위한 포트가 하나 갖추어지고, 이에 이송 튜브 (3)가 접속되어 있다. 그리고 이 이송 튜브 (3)를 통해서, 폐액 용기로서의 배지 용기 (1)에의 상등액의 이송, 회수 용기로서의 배지 용기 (1)에 대한 세포 현탁액의 이송, 배지 B 공급 용기 (1b) 또는 양생 용기 (20a) 또는 활성화 용기 (20b)에서 증폭 용기 (20c)에 대한 배지의 첨가가 이루어진다. 또한 샘플링 튜브 (20c-1)를 접속하기 위한 포트도 갖추어져 있다.

증폭 용기 (20c)는 세포를 대량 생산하기 위해서 사용하기 때문에 용량이 큰 것을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면 활성화 용기 (20b)용량의 10배 정도의 것을 알맞게 사용할 수 있다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에서의 증폭 용기 (20c)에 대한 기타의 점은 제1 실시형태에서의 배양 용기 (2)(3차 배양 용기 (2c))와 같은 구성으로 할 수 있다. 또한 이송 튜브 (3)도 실시형태와 같은 것으로 할 수 있다.

[세포 배양 방법]

다음에 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에 대해서 도 5 및 도 6을 참조하여 자세히 설명한다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은 배양하는 세포가 부유계의 세포인 경우에, 복수의 배양 용기로서 타격을 받은 세포의 기능을 회복시키기 위한 세포 배양에 사용하는 양생 배양 용기, 세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 활성화 배양 용기 및 세포를 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 증폭 배양 용기를 사용하여 양생 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하여, 배지 공급 용기와 양생 배양 용기와 활성화 배양 용기와 증폭 배양 용기를, 이 순서대로 접속하고 양생 배양 용기에서 타격을 받은 세포의 기능을 회복시킨 후, 활성화 배양 용기에 양생 배양 용기에서 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 양생 배양 용기에 배지 공급 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 배지의 온도가 소정의 값 이상으로 오른 후에 활성화 배양 용기에 양생 배양 용기에서 배지를 공급하고, 활성화 배양 용기에서 세포 배양을 하여 활성화 배양 용기에서 세포를 활성화시킨 후, 증폭 배양 용기에 활성화 배양 용기에서 활성화된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 양생 배양 용기 및/또는 활성화 배양 용기에 배지 공급 용기에서 배지를 공급하여, 소정 시간 경과 후, 배지의 온도가 소정의 값 이상으로 오른 후에 증폭 배양 용기에 양생 배양 용기 및/또는 활성화 배양 용기에서 배지를 공급하여, 증폭 배양 용기에서 세포 배양을 하고 세포를 증식시키는 것을 특징으로 한다.

구체적으로는 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은, (1) 용기 접속 공정과, (2) 양생 배양 공정과, (3) 확대 배양 공정과, (4) 세포 이송 공정 1과, (5) 배지 첨가공정 1과, (6) 활성화 배양 공정과, (7) 세포 이송 공정 2와, (8) 배지 첨가공정 2와, (9) 증폭 배양 공정과, (10) 샘플링 공정과, (11) 농축 공정을 갖는 것으로 할 수 있다.

또한 증폭 용기 (20c)를 2개 이상 접속하여 사용하는 경우에는 각 증폭 용기 (20c)마다 (7)~(9)를 반복 실시한다. 또한 (10)과 (11)을 생략할 수도 있다. 본 실시형태에서는 (10)과 (11)을 제1 실시형태와 동일하게 실시할 수 있으므로 이하에서는 이들 설명은 생략한다.

(1) 용기 접속 공정

먼저 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에 사용하는 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2)를 도 5와 같이 접속하여 폐쇄계의 세포 배양 시스템을 구성한다.

즉 배지 용기 (1)와 양생 용기 (20a)와 활성화 용기 (20b)와 증폭 용기 (20c)를 이 순서로 이송 튜브 (3)를 사용하여 접속한다.

이때 양생 용기 (20a)에는 배양을 할 세포와 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하여 접속한다. 또한 배지 용기 (1) 중 배지 A 공급 용기 (1a)에는 양생 용기 (20a) 및 활성화 용기 (20b)에 공급하기 위한 배지 (A)를, 배지 B 공급 용기 (1b)에는 증폭 용기 (20c)에 공급하기 위한 배지 (B)를 충전해서 접속한다. 활성화 용기 (20b)와 증폭 용기 (20c)는 빈채로 접속한다. 배지 용기 (1)와 양생 용기 (20a)사이의 이송 튜브 (3)위에는 펌프가 갖추어지고, 이 펌프에 의해서 배지를 이송한다. 또한 이송 튜브 (3)위에는 적절히 3방 활전이 구비되어 있어, 이들에 의해서 송액 유로를 제어할 수 있다.

(2) 양생 배양 공정

이와 같이 세포 배양 시스템을 구성하면 먼저 양생 용기 (20a)에서 세포 배양이 진행되며 타격을 받은 세포의 기능 회복이 이뤄진다.

이때 양생 용기 (20a)를 유지하는 유지구 (7)는 측판을 세운 상태로 사용된다. 양생 용기 (20a)내의 저면은 내용물의 무게로 부분적으로 휘고 패임이 형성되어 있다. 그리고 이 패임에 세포가 모아지고, 세포 배양의 개시 시에 알맞은 세포 밀도로 배양이 이루어진다.

또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지 (A)가 배지 A 공급 용기 (1a)에서 펌프를 사용하여 양생 용기 (20a)에 공급된다. 이때 제1 실시형태와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다.

양생 배양 공정에서 양생 용기 (20a)내에서의 세포를 분산시키기 위해서 제1 실시형태에서 상기 교반 수단을 사용하여 양생 용기 (20a)의 내용액을 교반하는 것이 바람직하다. 또한 이와 같은 배양 용기의 내용액의 교반을, 후술 하는 활성화 배양 공정에서 활성화 용기 (20b)에 대해서 실시해도 되고, 증폭 배양 공정에서 증폭 용기 (20c)에 대해서 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 후술 하는 활성화 배양 공정과 증폭 배양 공정의 설명에서 이와 같은 배양 용기의 내용액의 교반의 설명은 생략한다.

(3) 확대 배양 공정

타격을 받은 세포의 기능이 회복되어 세포의 증식이 어느 정도 진행되고 양생 배양 공정이 완료되면 다음에 확대 배양 공정이 진행된다.

이 공정에서 도 6과 같이 유지구 (7)의 측판을 수평으로 쓰러진 상태로 전개하여, 양생 용기 (20a)에서의 재배 면적을 확대해서 배양을 한다.

이 때 유지구 (7)에 유지된 양생 용기 (20a)는 그 네 귀퉁이가 당겨져서, 장력이 가해져서 휘어짐이 해소되고 양생 용기 (20a)내의 저면에 형성되어 있던 패임은 없어진다. 그래서 양생 용기 (20a)에서 세포를 바닥면 전체에 분산시켜서 소정의 세포 밀도가 되도록 배양할 수 있게 된다.

이 공정에서도, 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지 (A)가 배지 A 공급 용기 (1a)에서 펌프를 사용하여 양생 용기 (20a)에 공급된다. 또한 이때에도 제1 실시형태와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다.

(4) 세포 이송 공정 1

양생 용기 (20a)내의 세포 밀도가 소정의 세포 밀도가 되어 양생 배양 공정이 완료되면 다음으로 양생 용기 (20a)에서 활성화 용기 (20b)에 배양 세포의 이송이 이루어진다.

이때 양생 용기 (20a)를 활성화 용기 (20b)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 하여, 양생 용기 (20a)내의 내용액을 활성화 용기 (20b)에 송류한다. 이로써, 양생 용기 (20a)에서 배양된 세포가 활성화 용기 (20b)에 이송된다. 이와 같이 양생 용기 (20a)에서 배양된 세포는 활성화 용기 (20b)에 자연 송류되지만, 이 송류가 완료된 시점에서는 보통 양생 용기 (20a)에는 세포가 남아 있다.

(5)배지 첨가공정 1

다음에 배지를 배지 A 공급 용기 (1a)로부터 양생 용기 (20a)에 첨가한다. 이 때 제1 실시형태와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다.

그리고 양생 용기 (20a)에 배지가 수용된 상태에서 제1 실시형태와 마찬가지로 그대로 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다.

이어 상기 교반 수단에 의해서, 양생 용기 (20a)의 내용물을 교반한다. 그리고 배지를 양생 용기 (20a)에서 활성화 용기 (20b)에 이송한다.

이와 같이 배지를 양생 용기 (20a)로 이송하고 나서 활성화 용기 (20b)에 이송함으로써 양생 용기 (20a)에 잔존한 세포를 배지와 함께 활성화 용기 (20b)에 이송할 수 있으며 세포 배양에서의 잔존 세포를 저감할 수 있게 되어 있다.

(6) 활성화 배양 공정

활성화 용기 (20b)에의 세포의 배양과 배지의 이송이 완료되면 활성화 용기 (20b)에서 세포의 활성화가 이루어진다. 림프구를 배양하는 경우에는 활성화 용기 (20b)내의 저면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있으며, 림프구는 이 항 CD3항체에 결합함으로써 활성화된다.

활성화 배양 공정에서도, 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지를 활성화 용기 (20b)에 공급할 수 있다. 이때에도 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 배지의 첨가를 실시하는 것이 바람직하다.

(7) 세포 이송 공정 2

활성화 용기 (20b)에 있어서 세포가 충분히 활성화되어 활성화 배양 공정이 완료되면 다음에 활성화 용기 (20b)에서 증폭 용기 (20c)로 배양 세포의 이송이 이루어진다.

이 때 상기 교반 수단을 세포 박리 수단으로서 사용하고, 활성화 용기 (20b)에 비교적 강한 진동을 주어 배양면에 고체상화된 항체에 결합한 세포를 배양면에서 박리할 수 있다.

그리고 활성화 용기 (20b)를 증폭 용기 (20c)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 하여 활성화 용기 (20b)내의 내용액을 증폭 용기 (20c)에 송류한다. 이와 같이 활성화 용기 (20b)에서 배양된 세포가 증폭 용기 (20c)로 이송된다. 이와 같이 활성화 용기 (20b)에서 활성화된 세포는 증폭 용기 (20c)에 자연 송류되지만 이 송류가 완료된 시점에서는, 통상, 활성화 용기 (20b)에는 세포가 남아 있다.

(8) 배지 유가공정 2

다음에 배지를 배지 B 공급 용기 (1b)로부터 양생 용기 (20a)에 첨가한다. 이 때도 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송할 수 있다. 그리고 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 양생 용기 (20a)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다.

이어, 교반 수단에 의해서 양생 용기 (20a)의 내용액을 교반한 후 배지를 양생 용기 (20a)에서 활성화 용기 (20b)에 이송한다. 그리고 활성화 용기 (20b)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다렸다가 배지 온도를 상승시키고, 이어 교반 수단에 의해서 활성화 용기 (20b)의 내용액을 교반한 후 배지를 활성화 용기 (20b)에서 증폭 용기 (20c)로 이송한다. 이 때 배지를 양생 용기 (20a)와 활성화 용기 (20b)에 이송하고 나서 증폭 용기 (20c)로 이송하기 위해 양생 용기 (20a)와 활성화 용기 (20b)에 잔존한 세포를 배지와 함께 증폭 용기 (20c)로 이송할 수 있으며, 세포 배양에서의 잔존 세포를 현저하게 감소할 수도 있다.

(9) 증폭 배양 공정

증폭 용기 (20c)에 대한 배양세포와 배지의 이송이 완료되면 증폭 용기 (20c)에서 세포의 대량 증식이 이루어진다. 세포의 증식은 증폭 용기 (20c)에서의 세포 수 또는 세포 밀도가 소정의 크기가 될 때까지 이루어진다.

배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지 (B)가 배지 B 공급 용기 (1b)에서 펌프를 사용하여 증폭 용기 (20c)에 공급된다. 이때도 배지 첨가공정 2와 마찬가지로 배지의 첨가를 해도 된다.

배지 B 공급 용기 (1b)에서의 모든 배지가 증폭 용기 (20c)에 공급되고 배지 B 공급 용기 (1b)가 비면, 빈 배지 B공급 용기 (1b)는 폐액 용기 또는 세포 회수 용기로서 사용할 수 있다.

이와 같이 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 따르면 부유계의 세포를 배양할 경우에는 배양이 종료된 배양 용기에 잔존하는 세포를 저감 할 수 있는 동시에, 배지의 온도를 상승시키고 나서 배양 용기에 배지를 이송할 수 있다. 그래서 세포의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있게 되어 있다.

(제3 실시형태)

다음에 본 발명의 제3 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 대해서 도 7을 참조하여 설명한다.

본 실시형태는 제2 실시형태의 변형의 예이며, 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 도 7과 같이 배지 용기 (1)와 활성화 용기 (20b)와 증폭 용기 (20c)와 회수 용기 (8)가 이송 튜브 (3)로 연결된 구성으로 되어있다.

즉, 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 제2 실시형태의 세포 배양 시스템으로부터 양생 용기 (20a)와 배지 A 공급 용기 (1a)가 생략되고, 회수 용기 (8)가 추가된 구성으로 되어 있다. 본 실시형태에서 회수 용기 (8)를 복수 갖출 수도 있다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에서는 양생 배양 공정은 이뤄지지 않고, 세포 배양은 활성화 배양 공정부터 시작된다. 그리고 회수 용기 (8)에 의해서 증폭 용기 (20c)의 상등액을 회수하거나 증폭 용기 (20c)에서 세포 현탁액을 회수할 수도 있다.

기타의 점에 대해서는 제2 실시형태와 같은 것으로 할 수 있다.

이와 같이 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 따르면, 양생 배양을 실시할 필요가 없는 부유계의 세포를 배양하는 경우 등에서 배양이 종료된 배양 용기에 잔존하는 세포를 저감 할 수 있는 동시에 배지의 온도를 상승시키고 나서 배양 용기에 배지를 이송할 수 있다. 그래서 세포의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있게 되어 있다.

(제4 실시형태)

다음에 본 발명의 제4 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 대해서, 도 8을 참조하여 설명한다.

[세포 배양 시스템]

본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템은 주로 섬유 아세포 등의 접착계의 세포를 보다 효율적으로 배양하기 위한 것이며, 도 8과 같이 폐액 회수 용기 (12)(이하, 폐액 용기 (12)라고 칭하는 경우가 있음.)와, 배지 용기 (1)와, 세정액 공급 용기 (9)(이하, 세정액 용기 (9)라고 일컫는 경우가 있음)와, 효소 용액 공급 용기 (10)(이하, 효소 용기 (10)로 일컫는 경우가 있음)와, 저해제 용액 공급 용기 (11)(이하, 저해제 용기 (11)라고 일컫는 경우가 있음)와, 배양 면적이 다른 복수의 배양 용기 (2)(1차 배양 용기 (2a), 2차 배양 용기 (2b), 3차 배양 용기 (2c))가 이송 튜브 (3)를 사용하여 접속된 구성이다. 이하, 제1 실시형태와 같은 구성에 대해서는 설명을 생략한다.

[세정액 공급 용기]

세정액 용기 (9)는, 세정액을 배양 용기 (2)에 공급하는 용기이며, 도 8과 같이 배지 용기 (1)와 1차 배양 용기 (2a)사이에 튜브를 사용하여 접속된다.

세정액은 배양 용기 (2)내에 효소 용액을 공급하기에 앞서서 배양 용기 (2)내에 잔존하는 배지를 씻어내기 위해서 사용된다.

이 세정액으로는 생리 식염수나 PBS(인산 완충 생리 식염수)등 일반적으로 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다.

[효소 용액 공급 용기]

효소 용기 (10)는 배양된 세포를 배양 용기 (2)내의 바닥면에서 박리하기 위한 효소 용액을 배양 용기 (2)에 공급하는 용기이다.

효소 용액은 배양 용기 (2)의 배양 면 전체에 세포가 증식하고 해당 배양 용기 (2)에서의 세포 배양이 완료되면, 배양된 세포를 다음의 배양 용기 (2)로 이송하기에 앞서서 세포를 배양 용기 (2)내의 바닥면에서 박리하기 위해서 사용된다. 이 효소 용액으로서는 접착계의 세포를 용기 내의 바닥면에서 박리할 때 통상 사용 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들면 트립신 등의 프로테아제를 사용할 수 있다.

[저해제 용액 공급 용기]

저해제 용기 (11)는 상기 효소 용액에서의 효소 활성을 저해하기 위한 저해제 용액을 배양 용기 (2)에 공급하는 용기이다.

저해제 용액은 세포를 배양 용기 (2)내의 바닥면에서 박리하기 위해서 사용된 효소의 활성을 저해시키기 위해서 사용된다. 이 억제제 용액으로서는 상기 효소를 활성 저해시킬 때에 통상 사용 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들면 트립신 억제제 등의 프로테아제 억제제를 사용할 수 있다. 한편, 효소를 배지에 의해서 활성 저해시킬 수 있는 경우에는 본 실시형태에 관한 세포 배양 시스템에서 억제제 용기 (11)를 생략해도 된다.

[폐액 회수 용기]

폐액 용기 (12)는 배양 용기 (2)에서 세정액, 효소 용액, 저해제 용액 및 배지 등의 폐액을 회수하는 용기이며, 이들을 펌프에 의해서 이송 튜브 (3)를 통해서 회수할 수 있다.

[세포 배양 방법]

다음에 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법을 도 8을 참조하여 자세히 설명한다.

본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은 배양하는 세포가 접착계의 세포인 경우에 복수의 배양 용기로서, 배양 면적이 다른 배양 용기를 사용하여 복수의 배양 용기에서의 배양 면적이 가장 작은 제1의 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하고, 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기에 복수의 배양 용기를 배양 면적이 작은 순서로 접속하여 제1의 배양 용기에서 세포 배양을 개시하고, 제1의 배양 용기에서의 배양이 끝난 후 제1의 배양 용기에 접속된 제2의 배양 용기에 제1의 배양 용기에서 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 제1의 배양 용기에 배지 공급 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 제2의 배양 용기에 제1의 배양 용기에서 배지를 공급하고, 제2의 배양 용기에서 세포 배양을 하고, 제2의 배양 용기에서의 배양이 끝난 후, 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 다음의 배양 용기가 있는 경우 다음의 배양 용기에 대한 세포 현탁액의 이송, 배양이 종료된 배양 용기에의 배지의 공급, 다음의 배양 용기에의 배양이 종료된 배양 용기의 배지의 공급 및 다음의 배양 용기의 세포 배양을 배양이 종료된 배양 용기에 접속된 다음의 배양 용기가 없어질 때까지 반복 실시하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로는 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법은, (1) 용기 접속 공정과, (2) 1차 배양 공정과, (3) 배지 배출 공정 1과, (4) 세정 공정 1과, (5) 세포 박리 공정 1과, (6) 효소 활성 저해 공정 1과, (7) 세포 이송 공정 1과, (8) 배지 첨가공정 1과, (9) 효소 등 배출 공정 1과, (10) 배지 첨가공정 2와, (11) 2차 배양 공정과, (12) 배지 배출 공정 2와, (13) 세정 공정 2와, (14) 세포 박리 공정 2와, (15) 효소 활성 저해 공정 2와, (16) 세포 이송 공정 2와, (17) 배지 첨가공정 3과, (18) 효소 등 배출 공정 2와, (19) 배지 첨가공정 4와, (20) 3차 배양 공정을 보유하는 것으로 할 수 있다. 또한 배양 용기 (2)를 4개 이상 접속하여 사용하는 경우에는 4차 배양 이후의 공정으로서 각 배양 용기 (2)에 대해서 (12)~(20) 공정을 다시 반복한다.

(1) 용기 접속 공정

먼저 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법에서 사용하는 배지 용기 (1)와 복수의 배양 용기 (2) 등을 도 8과 같이 접속하여 폐쇄계의 세포 배양 시스템을 구성한다.

구체적으로는 폐액 용기 (12)와, 배지 용기 (1)와, 세정액 용기 (9)와, 효소 용기 (10)와, 저해제 용기 (11)와, 1차 배양 용기 (2a)와, 2차 배양 용기 (2b)와, 3차 배양 용기 (2c)를 이송 튜브 (3)를 사용하여 접속한다. 또한 배지 용기 (1)에는 배양 용기 (2)에 공급하기 위한 배지를, 세정액 용기 (9)에는 세정액을, 효소 용기 (10)에는 효소 용액을, 저해제 용기 (11)에는 저해제 용액을 각각 충전해서 접속한다. 2차 배양 용기 (2b), 3차 배양 용기 (2c), 및 폐액 용기 (12)는 빈채로 접속한다. 배지 용기 (1)와 배양 용기 (2) 사이의 이송 튜브 (3)위에는 펌프가 갖추어지고, 이 펌프에 의해서 배지의 이송 등이 이루어진다. 또한 이송 튜브 (3)위에는 적절히 3방 활전이 구비되어 있어, 이것들에 의해서 송액 유로를 제어할 수 있다.

(2) 1차 배양 공정

이와 같이 세포 배양 시스템을 구성하면 먼저 배양 면적이 가장 작은 1차 배양 용기 (2a)에서 세포 배양을 시작한다. 1차 배양 용기 (2a)에서는, 세포의 1차 배양이 진행된다. 또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지가 배지 용기 (1)에서 펌프를 사용하여 1차 배양 용기 (2a)에 공급된다. 이때 제1 실시형태와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다.

(3) 배지 배출 공정 1

1차 배양 용기 (2a)의 배양 면 전체에 세포가 증식하면 1차 배양은 완료한다. 그리고, 배양에 사용된 배지를 펌프를 사용하여 1차 배양 용기 (2a)에서 폐액 용기 (12)로 이송해서 배출한다.

(4) 세정 공정 1

다음에 세정액 용기 (9)에서 세정액을 1차 배양 용기 (2a)에 송류하고, 상기 교반 수단을 사용하여 1차 배양 용기 (2a)내의 세정액을 교반하여 배출한다.

이로써 1차 배양 용기 (2a)에 잔존하는 배지를 제거할 수 있고 다음의 세포 박리 공정 1에서 1차 배양 용기 (2a)에 효소 용액을 송류함에 있어서, 효소 활성이 배지에 의해서 저해되는 것을 방지할 수 있다.

(5) 세포 박리 공정 1

다음에, 효소 용기 10에서 효소 용액을 1차 배양 용기 (2a)에 송류하여 1차 배양 용기 (2a)내의 바닥면에 접착한 세포를 박리하다.

이때 세포의 박리를 상기 교반 수단을 사용하여 1차 배양 용기 (2a)의 내용액을 교반함으로써 촉진하는 것이 바람직하다. 이와 같은 교반 수단을 사용한 세포의 박리 촉진은 2차 배양 용기 (2b)및 이후에 접속하는 기타의 배양 용기에 대해서도 똑같이 적용할 수 있다.

(6) 효소 활성 저해 공정 1

다음에 저해제 용기 (11)에서 저해제 용액을 1차 배양 용기 (2a)에 송류하여 1차 배양 용기 (2a)내의 효소를 활성 저해시킨다.

(7) 세포 이송 공정 1

다음에 박리된 세포를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)로 이송한다.

이 때 1차 배양 용기 (2a)를 2차 배양 용기 (2b)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 함으로써 박리된 세포를 포함한 내용액을 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)에 자연 송류할 수 있다.

또한 박리된 세포를 2차 배양 용기 (2b)에서 3차 배양 용기 (2c)로 이송할 경우도 마찬가지로, 2차 배양 용기 (2b)를 3차 배양 용기 (2c)에 접속하기 위한 포트가 아래쪽이 되도록 경사지게 하여 실시할 수 있다.

(8) 배지 첨가공정 1

다음에 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에 첨가한다. 이 때 제1 실시형태와 마찬가지로 배지의 이송 속도를 평소보다 느리게 해서 배지의 온도를 상승시키면서 이송하는 것이 바람직하다. 그리고 1차 배양 용기 (2a)에 배지가 수용된 상태에서 소정 시간이 경과하기를 기다림으로써 배지 온도를 상승시킨다.

이어, 교반 수단에 의해서 1차 배양 용기 (2a)의 내용액을 교반한 후 배지를 1차 배양 용기 (2a)에서 2차 배양 용기 (2b)로 이송한다.

이와 같이 배지를 1차 배양 용기 (2a)로 이송하고 나서 2차 배양 용기 (2b)에 이송함으로써 배지의 온도를 상승시키고 나서 2차 배양 용기 (2b)에 공급할 수 있고, 또한 1차 배양 용기 (2a)에서의 잔존 세포를 저감할 수도 있어서 세포 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있게 되어 있다.

(9) 효소 등 배출 공정 1

2차 배양 용기 (2b)내에서 세포가 바닥면에 접착하면 2차 배양 용기 (2b)에서 효소 용액, 저해제 용액 및 배지를 펌프를 사용하여 폐액 용기 (12)에 배출한다.

(10) 배지 첨가공정 2

다음에 2차 배양 용기 (2b)에 다시 배지를 공급하지만 이때도 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 배지를 배지 용기 (1)에서 1차 배양 용기 (2a)에 첨가하여, 배지의 온도를 상승시키고 2차 배양 용기 (2b)에 이송하는 것이 바람직하다.

이로써 배지의 온도를 상승시키고 2차 배양 용기 (2b)에 공급할 수 있는 동시에 1차 배양 용기 (2a)에서의 잔존 세포를 더욱 저감할 수 있으며, 세포의 증식 효율을 보다 향상시킬 수 있게 되어 있다.

(11) 2차 배양 공정

이상의 공정에 의해서 배양 면적이 더 큰 2차 배양 용기 (2b)에서 세포 배양이 진행된다. 또한 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지가 배지 용기 (1)에서 펌프를 사용하여 2차 배양 용기 (2b)에 공급된다. 이때도 배지 첨가공정 1과 마찬가지로 배지의 첨가를 실시하는 것이 바람직하다.

그리고 (12) 배지 배출 공정 2~(19) 배지 첨가공정 4의 공정으로서, 상기 (3) 배지 배출 공정 1 ~ (10) 배지 첨가공정 2와 같은 공정이 실시된다. 이때 배지의 첨가는 제1 실시형태에서의 배지 첨가공정 2와 마찬가지로 실시하는 것이 바람직하다.

다음에, (20) 3차 배양 공정에서 배양 면적이 보다 큰 3차 배양 용기 (2c)에서 세포 배양이 진행되며, 배양 세포의 증식 등에 맞추어 배지가 배지 용기 (1)에서 펌프를 사용하여 3차 배양 용기 (2c)에 공급된다. 이때도 제1 실시형태에서의 배지 첨가공정 2와 마찬가지로 배지의 첨가를 해도 된다.

그리고 3차 배양 용기 (2c)의 배양 면 전체에 세포가 증식하면 3차 배양이 완료하고, 3차 배양 용기 (2c)에서 대량으로 증식한 배양 세포를 회수할 수 있다.

이와 같이 본 실시형태에 관한 세포 배양 방법 및 세포 배양 시스템에 따르면 접착계의 세포를 배양할 경우에는 배양이 종료된 배양 용기에 잔존하는 세포를 저감 할 수 있는 동시에, 배지의 온도를 상승시키고 나서 배양 용기에 배지를 이송할 수 있다. 그래서 세포의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있게 되어 있다.

이상 본 발명에 대해서 바람직한 실시형태를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되는 것은 아니고 본 발명의 범위에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것을 말할 필요도 없다.

예를 들면 상기 제2 실시형태에서는 양생 용기 (20a), 활성화 용기 (20b)및 증폭 용기 (20c)를 사용 예에 대해서 설명하였지만, 기능이 다른 기타 복수의 용기를 사용하여 본 발명의 실시형태에 관한 세포 배양 시스템을 구성하거나 또는 상기 각 실시형태의 구성을 조합하거나 하는 등 적절히 변경할 수 있다.

1 배지 공급 용기 (배지 용기)
1a 배지 A 공급 용기
1b 배지 B 공급 용기
2 배양 용기
2a 1차 배양 용기
20a 양생 확대 배양 용기 (양생 배양 용기, 양생 용기)
20a-1 패임
2b 2차 배양 용기
20b 활성화 배양 용기 (활성화 용기)
2c 3차 배양 용기
2c-1 샘플링 튜브
20c 증폭 배양 용기 (증폭 용기)
20c-1 샘플링 튜브
3 이송 튜브
4 적재부
41 유지판
42 회동축
5 플레이트 캠
51 제1 캠면
52 제2 캠면
53 구동축
6 기대
7 유지구
70 바닥판
701 오목부
71 측판
8 회수 용기
9 세정액 공급 용기 (세정액 용기)
10 효소 용액 공급 용기 (효소 용기)
11 저해제 용액 공급 용기 (저해제 용기)
12 폐액 회수 용기 (폐액 용기)
13 적재대

Claims (13)

1. 복수의 배양 용기를 사용하여 세포를 배양하는 세포 배양 방법이며,
   상기 복수의 배양 용기가 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고,
   상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기에 상기 복수의 배양 용기를 순차적으로 튜브를 사용하여 접속하고,
   세포 및 배지를 포함하는 세포 현탁액이 수용되고, 상기 배지 공급 용기에 보다 가까이 접속된 배양 용기에서 세포 배양을 시작하고
   먼저 접속된 배양 용기에서의 배양이 끝난 후, 배양된 세포를 포함하는 세포 현탁액을, 다음 접속된 배양 용기에 이송하고, 상기 복수의 배양용기의 각각에 접속된 순서로 세포의 배양을 수행함에 있어서,
   이미 배양이 끝난 배양 용기에, 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 이미 배양이 끝난 배양 용기에서 다음으로 배양할 배양 용기에 배지를 공급하여, 계속 세포 배양을 행하는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
2. 제1항에 있어서, 배양하는 세포가 부유계의 세포인 경우에, 상기 복수의 배양 용기로서,
   타격을 받은 세포의 기능을 회복시키기 위한 세포 배양에 사용하는 양생 배양 용기,
   세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 활성화 배양 용기, 및
   세포를 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 증폭 배양 용기를 사용하고,
   상기 양생 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하여, 상기 배지 공급 용기와 상기 양생 배양 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기를, 이 순서대로 접속하고,
   상기 양생 배양 용기에서 타격을 받은 세포의 기능을 회복시킨 후, 상기 활성화 배양 용기에 상기 양생 배양 용기에서 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 상기 양생 배양 용기에 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하여, 소정 시간 경과 후, 배지의 온도가 소정의 값 이상으로 오른 후에 상기 활성화 배양 용기에 상기 양생 배양 용기에서 배지를 공급하여, 상기 활성화 배양 용기에서 세포의 배양을 하고,
   상기 활성화 배양 용기에서 세포를 활성화시킨 후, 상기 증폭 배양 용기에 상기 활성화 배양 용기에서 활성화된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 상기 양생 배양 용기 및/또는 상기 활성화 배양 용기에 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하여, 소정 시간 경과 후, 배지의 온도가 소정의 값 이상으로 오른 후, 상기 증폭 배양 용기에 상기 양생 배양 용기 및/또는 상기 활성화 배양 용기에서 배지를 공급하여, 상기 증폭 배양 용기에서 세포 배양을 하고 세포를 증식시키는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 활성화 배양 용기에서 세포를 활성화시킨 후, 상기 증폭 배양 용기에 상기 활성화 배양 용기에서 활성화된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 상기 양생 배양 용기에 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하여, 소정 시간 경과 후, 상기 활성화 배양 용기에 상기 양생 배양 용기에서 배지를 공급하고, 소정 시간 경과 후, 상기 증폭 배양 용기에 상기 활성화 배양 용기에서 배지를 공급하고, 상기 증폭 배양 용기에서 세포 배양을 하여 세포를 증식시키는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
4. 제1항에 있어서, 배양하는 세포가 부유계의 세포인 경우에, 상기 복수의 배양 용기로서,
   세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 활성화 배양 용기, 및
   세포를 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 증폭 배양 용기를 사용하여,
   상기 활성화 배양 용기에 세포 및 배지를 포함한 세포 현탁액을 수용하여, 상기 배지 공급 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기를, 이 순서대로 접속하여,
   상기 활성화 배양 용기에서 세포를 활성화시킨 후 상기 증폭 배양 용기에 상기 활성화 배양 용기에서 활성화된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하고, 상기 활성화 배양 용기에 상기 배지 공급 용기에서 배지를 공급하여, 소정 시간 경과 후, 배지의 온도가 소정의 값 이상으로 오른 후에 상기 증폭 배양 용기에 상기 활성화 배양 용기에서 배지를 공급하여, 상기 증폭 배양 용기에서 세포 배양을 하고 세포를 증식시키는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
5. 제1항에 있어서, 배양하는 세포가 접착계의 세포인 경우에, 상기 복수의 배양 용기로서, 배양 면적이 다른 배양 용기를 사용하여
   상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기에 상기 복수의 배양 용기를 배양 면적이 작은 순서로 접속하고,
   세포 및 배지를 포함하는 세포 현탁액이 수용되고, 상기 배지 공급 용기에 보다 가까이 접속된 배양 면적이 가장 작은 배양 용기에서 세포의 배양을 개시하는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
6. 제5항에 있어서, 배양된 세포를 상기 배양 용기 내의 바닥면에서 박리하기 위한 효소 용액을 상기 배양 용기에 공급하는 효소 용액 공급 용기를, 상기 배지 공급 용기와 상기 배지 공급 용기에 보다 가까이 접속된 배양 용기 사이에 튜브를 사용하여 접속하고,
   상기 효소 용액 공급 용기에서 상기 배양 용기에 효소 용액을 송류하여, 배양된 세포를 상기 배양 용기 내의 바닥면에서 박리하여 배양된 세포를 포함한 세포 현탁액을 이송하는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 배양 용기를, 상기 배지 공급 용기에 보다 가까이 접속된 것일수록 상대적으로 높은 위치에 배치하고,
   각각의 상기 배양 용기를 기울임으로써 상기 배양 용기에서 다음에 접속된 배양 용기에 세포 현탁액을 이송하는
   것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 한쪽 끝가장자리에 설치된 회동축을 기대에 축지지한 평판형의 하나 또는 두개 이상의 유지판을 가진 적재부에 상기 복수의 배양 용기를 별개로 또는 일괄적으로 유지하고,
   상기 회동축을 중심으로 상기 유지판을 위쪽으로 회동시킴으로써 상기 복수의 배양 용기를 별개로 또는 동시에 기울이면서 초기 위치보다 위쪽으로 이동시키고,
   이어 상기 회동축을 중심으로 상기 유지판을 아래쪽으로 회동시켜서, 상기 복수의 배양 용기가 별개로 또는 동시에 초기 위치로 되돌아갈 때에 상기 유지판을 상기 기대에 접촉시킴으로써, 상기 복수의 배양 용기에 가해지는 진동을 발생시키는 세포 배양 방법.
9. 부유계의 세포를 배양하기 위한 복수의 배양 용기를 갖춘 세포 배양 시스템이며,
   상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와,
   상기 복수의 배양 용기로서,
   타격을 받은 세포의 기능을 회복시키기 위한 세포 배양에 사용하는 양생 배양 용기와,
   세포를 활성화시키기 위한 세포 배양에 사용하는 활성화 배양 용기와,
   세포를 증식시키기 위한 세포 배양에 사용하는 하나 또는 두개 이상의 증폭 배양 용기를 갖추고,
   상기 양생 배양 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기가, 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고,
   상기 배지 공급 용기와 상기 양생 배양 용기와 상기 활성화 배양 용기와 상기 증폭 배양 용기가, 이 순서로 튜브를 사용하여 접속되고,
   먼저 접속된 배양 용기에서 배양이 끝난 후, 배양된 세포를 포함하는 세포 현탁액을 이어서 접속된 배양 용기에 이송하고, 상기 복수의 배양용기의 각각에 접속된 순서로 세포 배양을 수행함에 있어서,
   이미 배양이 끝난 배양 용기에, 상기 배지 공급용기에서 배지를 공급하고, 그러한 후에, 이미 배양이 끝난 배양용기에서 다음으로 배양할 배양용기에 배지를 공급하는 것을 가능하게 한
   것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템.
10. 접착계의 세포를 배양하기 위한 복수의 배양 용기를 갖춘 세포 배양 시스템이며,
    상기 복수의 배양 용기에 배지를 공급하는 배지 공급 용기와,
    상기 복수의 배양 용기로서, 배양 면적이 다른 배양 용기를 갖추고,
    상기 복수의 배양 용기가 각각 다른 용기와의 내용물의 이송용 포트를 하나 갖추고,
    상기 배지 공급 용기에 상기 복수의 배양 용기가 배양 면적이 작은 순서로 튜브를 사용하여 접속되고,
    먼저 접속된 배양 용기에서 배양이 끝난 후, 배양된 세포를 포함하는 세포 현탁액을 이어서 접속된 배양 용기에 이송하고, 상기 복수의 배양용기의 각각에 접속된 순서로 세포의 배양을 수행함에 있어서,
    이미 배양이 끝난 배양 용기에, 상기 배지 공급용기에서 배지를 공급하고, 그러한 후에, 이미 배양이 끝난 배양 용기에서 다음으로 배양할 배양 용기에 배지를 공급하는 것을 가능하게 한
    것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 한쪽 끝가장자리에 설치된 회동축을 기대에 축지지한 평판형의 하나 또는 두개 이상 유지판을 가진 적재부와,
    상기 유지판을 팔로어(follower)하는 캠 기구를 갖추고,
    상기 복수의 배양 용기가 별개로 또는 일괄적으로 상기 적재부에 유지되고,
    상기 캠 기구에 의해서 상기 회동축을 중심으로 상기 유지판을 상하로 반복 회동시키는 동시에, 상기 유지판이 하동하여 상기 기대에 접촉하였을 때에 생기는 진동을 상기 복수의 배양 용기에 별개로 또는 동시에 가해짐으로써 상기 복수의 배양 용기의 내용액을 교반하는
    것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 배양 용기의 적어도 어느 하나가, 배양된 세포의 일부를 꺼내기 위해 샘플링용 포트를 갖추고, 상기 샘플링용 포트에 샘플링용 튜브가 접속되고, 상기 샘플링용 튜브는 상기 샘플링용 포트와 반대쪽 말단이 밀봉되어
    상기 샘플링용 튜브를 훑어서, 상기 샘플링용 튜브가 접속된 배양 용기에서 상기 샘플링용 튜브 내에 세포 현탁액을 충전시키고,
    상기 샘플링용 튜브를 열 용착한 후에 절단하는
    것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 복수의 배양 용기의 적어도 하나가 배양된 세포의 일부를 꺼내기 위한 샘플링용 포트를 갖추고, 상기 샘플링용 포트에 샘플링 튜브가 접속되고, 상기 샘플링 튜브는 상기 샘플링용 포트와 반대쪽 말단이 밀봉된
    것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템.
    

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