JP2005278564A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養におけるコンタミネーションの発生を抑制できる細胞培養装置を提供する。
【解決手段】 異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する細胞分離室１、細胞分離室１で分離した目的の細胞を増殖させる培養を行なう細胞増殖室３、細胞分離室１で分離した目的の細胞を細胞増殖室３に移動させるための移動流路５、細胞分離室１に連結されて細胞分離室１内へ液体を注入する第１注入流路７及び細胞分離室１内の液体を導出する第１導出流路９、細胞増殖室３に連結されて細胞増殖室１内へ液体を注入する第２注入流路１１及び細胞増殖室３内の液体を導出する第２導出流路１３を備え、細胞分離室１は、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部１５を有し、移動流路５は、移動流路５を開閉する移動流路開閉手段５ａを有している構成とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞培養装置に係り、特に、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養装置に関する。

細胞培養により細胞を増殖させる際、異なる複数種の細胞を含む状態で培養を行い、その後、これら異なる種類の細胞を分離し、目的の細胞のみを増殖させるための培養を行なう必要が生じる場合がある。

例えば、主に哺乳類などの動物の骨髄液から付着性細胞である間葉系幹細胞（以下ＭＳＣと略称する）を分離して細胞株として得る場合、取り出した骨髄細胞を細胞培養液に希釈して培養後、目的の細胞となるＭＳＣを分離してさらに培養を行なう。このため、目的の細胞となるＭＳＣを他の細胞から分離する必要がある。また、胚性幹細胞などの細胞（以下ＥＳ細胞と略称する）の培養では、フィーダー細胞と共培養を行った後、分離したＥＳ細胞を受精卵や未受精卵へ移植したり、分化及び成長因子などを加えて細胞を分化させた後に他に移植したり、また、成長因子を加えてＥＳ細胞のまま単独で増殖させたりする場合がある。したがって、このような培養を行なう場合、フィーダー細胞と共培養を行った後、ＥＳ細胞単独で培養を行うため、ＥＳ細胞とフィーダー細胞とを分離する必要がある。

このように、異なる種類の細胞を分離し、目的の細胞のみを増殖させるための培養を行なう必要がある場合、例えばＭＳＣなどでは、その付着性を利用し、付着性細胞以外の細胞を培養液または洗浄液などで洗い流して取り除く分離操作を行った後、培養液中で細胞を増殖させるために細胞を培地に植える操作などを行なっている。そして、これらの細胞の分離操作や、細胞を培地に植える操作などは、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっている。別の方法として、細胞の大きさや表面抗原などを尺度にセルソーターなどの機器により、目的の細胞を分離して増殖させる培養を行なうこともできる。このようにセルソーターを用いて分離を行なう場合でも、分離操作はセルソーターで行なうことができるが、分離した細胞を培地に植える操作などは作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっている。

また、フィーダー細胞と共培養を行う必要があるＥＳ細胞などでは、ＥＳ細胞とフィーダー細胞の間には付着性に違いがあり、フィーダー細胞の付着性の方が強い。このことから、ＥＳ細胞とフィーダー細胞を分離してフィーダー細胞を除去する場合、ＥＳ細胞をフィーダー細胞と共培養した後、培養床に付着していないＥＳ細胞のみを取り出して培養を行なっているが、このような細胞の分離や培養の操作も、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっている。

このように従来の異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養では、異なる複数種の細胞からの目的の細胞の分離操作や、分離した目的の細胞を増殖させるため培地に植える操作などは、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっている。このため、コンタミネーションの発生が問題となっている。また、セルソーターなどの機器により、目的の細胞の分離操作が機器によって行なえたとしても、分離した目的の細胞を増殖させるため培地に植える操作などは、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっており、また、その機器が多検体を処理する際は検体間のクロスコンタミネーションが生じる可能性があるため、やはり、コンタミネーションの発生が問題となる。

これに対して、継代培養の操作における外部からのコンタミネーションを防ぐ目的で、作業者がピペットなどを用いて手作業で操作を行なわなくても、培地や培養細胞の供給、回収、排出などができる細胞培養装置として、継代培養を一体化された２つの培養床出行う装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開平２００１−２７５６５９号公報（第４−９頁、第１図）

ところが、特許文献１のような細胞培養装置は、継代培養の操作における外部からのコンタミネーションを防ぐ目的のものであり、異なる複数種の細胞からの目的の細胞の分離操作が必要な場合は、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なう必要がある。また、特許文献１のような細胞培養装置では、異なる複数種の細胞からの目的の細胞の分離操作を装置内で行なうことは難しい。したがって、特許文献１のような細胞培養装置では、なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させる際のコンタミネーションの発生を抑制することは難しい。このため、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させる際のコンタミネーションの発生を抑制できる細胞培養装置が必要とされている。

本発明の課題は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養におけるコンタミネーションの発生を抑制することにある。

本発明の細胞培養装置は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、この細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する細胞分離室と、この細胞分離室で分離した目的の細胞を増殖させる培養を行なう細胞増殖室と、細胞分離室で分離した目的の細胞を細胞増殖室に移動させるための移動流路と、細胞分離室に連結されてこの細胞分離室内へ液体を注入する第１注入流路及びこの細胞分離室内の液体を導出する第１導出流路と、細胞増殖室に連結されてこの細胞増殖室内へ液体を注入する第２注入流路及びこの細胞増殖室内の液体を導出する第２導出流路とを備え、細胞分離室は、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、移動流路は、この移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している構成とすることにより上記課題を解決する。

このような構成とすることにより、細胞分離室内の付着部に、細胞含有液に含まれる細胞のうち付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させることにより、付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とを分離することができる。さらに、細胞分離室に連結された第１注入流路及び第１導出流路、細胞分離室と細胞増殖室を連通させる移動流路、細胞増殖室に連結された第２注入流路及び第２導出流路により、細胞分離室内への異なる複数種の細胞を含む細胞含有液や緩衝液などの注入、細胞分離室内からの不要な細胞や液体などの導出、細胞分離室で分離した細胞の細胞増殖室への移動、細胞増殖室内への培養液や緩衝液などの注入や、細胞増殖室内からの細胞の回収などを行なうことができる。このため、目的の細胞の分離操作や、分離した目的の細胞の培地への植付け操作などの操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。

また、前記第１注入流路には、該第１注入流路を開閉する第１注入流路開閉手段が、前記第１導出流路には、該第１導出流路を開閉する第１導出流路開閉手段が各々設けられ、前記第２注入流路には、該第２注入流路を開閉する第２注入流路開閉手段が、前記第２導出流路には、該第２導出流路を開閉する第２導出流路開閉手段が各々設けられている構成とする。

このような構成とすれば、細胞分離室や細胞増殖室に液体を出し入れする流路が全て各流路開閉手段で閉塞でき、また、必要な流路のみを開いて液体の出し入れができるため、細胞分離室や細胞増殖室などの空間の滅菌状態を維持し易くなり、コンタミネーションの発生をより確実に抑制できる。

ところで、付着性の細胞を培養した場合、培養後に細胞を培養容器の内壁面などから剥離するため、トリプシンなどの蛋白質分解酵素を加えている。ところが、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素は、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力を低下させてしまう場合がある。このため、細胞分離室の付着部に付着した細胞が目的の細胞であるとき、目的の細胞を付着部から剥離する必要があるが、この目的の細胞の剥離にトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いると、細胞が有している能力が低下することにより、その後の細胞増殖室での培養で要求される品質の細胞が得られなくなる場合がある。

これに対して、細胞分離室内の付着部は、温度変化に応じて細胞への接着性が変化し、細胞周囲の環境温度の変化によって細胞の付着及び剥離が制御できる細胞接着性材料で形成されている構成とする。また、細胞分離室内の付着部は、植物細胞特有の成分で、酵素分解可能な成分を含む細胞接着性材料で形成されている構成とする。これらの構成とすることにより、細胞分離室内の付着部からの細胞の剥離に、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いる必要がなくなり、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養において、細胞が有している能力の低下を抑制しながら、コンタミネーションの発生を抑制できる。

また、細胞分離室の付着部に付着していない細胞が目的の細胞であるとき、細胞分離室内の付着部は、該細胞分離室の内壁面の少なくとも一部に、細胞の付着を促進するための表面処理を施すことで形成されている構成とすれば、目的の細胞以外の細胞の付着部への付着が促進され、細胞分離室における目的の細胞の分離能力を向上できる。

本発明によれば、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。

以下、本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態について図１乃至図１０を参照して説明する。なお、以下の説明において、ＥＳ細胞という表現には、胚性幹細胞のみならず、クローン胚や受精卵クローンから樹立された細胞なども含むものとする。

図１は、本発明を適用してなる細胞培養装置の概略構成を模式的に示す図であり、（ａ）は全体の構成を、（ｂ）は細胞分離室、移動管路及び細胞増殖室を構成する袋やチューブを取り出して分解した状態で示す斜視図である。図２は、本発明を適用してなる細胞培養装置の細胞分離室での細胞の分離の原理を模式的に説明する図である。図３は、本発明を適用してなる細胞培養装置において、目的の細胞が付着性の細胞である場合の動作を模式的に示す図である。図４は、本発明を適用してなる細胞培養装置において、目的の細胞が付着性の細胞である場合の動作を示すフロー図である。図５は、本発明を適用してなる細胞培養装置において、目的の細胞が付着部に付着していない細胞である場合の動作を模式的に示す図である。図６は、本発明を適用してなる細胞培養装置において、目的の細胞が付着部に付着していない細胞の動作を示すフロー図である。図７乃至９は、本発明を適用してなる細胞培養装置の別の概略構成を模式的に示す図である。図１０は、本発明を適用してなる細胞培養装置における培養操作を自動化した場合の概略構成を模式的に示す斜視図である。

本実施形態の細胞培養装置は、図１（ａ）に示すように、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的の細胞を分離するための細胞分離室１、細胞分離室１で分離した目的の細胞を増殖させる培養を行なう細胞増殖室３を備えている。また、細胞分離室１と細胞増殖室３とは、細胞分離室１で分離した目的の細胞を細胞分離室１から細胞増殖室３へ移動させるための移動管路５によって連結されており、移動管路５によって細胞分離室１と細胞増殖室３とは連通した状態となっている。なお、移動管路５には、移動管路５内の流路を開閉する移動流路開閉手段となるコック５ａが設けられている。

細胞分離室１には、細胞分離室１内へ液体を注入する柔軟な樹脂製のチューブで形成された第１注入管路７、そして、細胞分離室１内の液体を導出する柔軟な樹脂製のチューブで形成された第１導出管路９が連結されている。第１注入管路７には、第１注入管路７内の流路を開閉する第１注入流路開閉手段となるコック７ａが、第１導出管路９には、第１導出管路９を開閉する第１導出流路開閉手段となるコック９ａが設けられている。同様に、細胞増殖室３には、細胞増殖室３内へ液体を注入する柔軟な樹脂製のチューブで形成された第２注入管路１１、そして、細胞増殖室３内の液体を導出する柔軟な樹脂製のチューブで形成された第２導出管路１３が連結されている。第２注入管路１１には、第２注入管路１１内の流路を開閉する第２注入流路開閉手段となるコック１１ａが、第２導出管路１３には、第２導出管路１３を開閉する第２導出流路開閉手段となるコック１３ａが設けられている。

なお、各流路開閉手段となるコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａとしては、各流路内の液体の流量や通流及び遮断を制御できるものであればよく、外側からチューブを挟み込むピンチコックやローラ式コック、活栓などを適宜用いることができる。さらに、各流路開閉手段は、手動で操作するコックなどの他、動作を制御する制御手段と組み合わせることにより自動で流路を開閉できる電磁弁などを用いることもできる。

図１に示すような細胞培養装置では、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、細胞分離室１は、透明な硬い樹脂製の箱１ａの中に密封された透明な柔軟な樹脂製の袋１ｂを入れて形成している。同様に、細胞増殖室３は、透明な硬い樹脂製の箱３ａの中に密封された透明な柔軟な樹脂製の袋３ｂを入れて形成している。移動管路５も、透明な硬い樹脂製の筒５ｂの中に密封された透明な柔軟な樹脂製のチューブ５ｃを入れて形成している。細胞分離室１の箱１ａ及び細胞増殖室３の箱３ａは、適宜１面が着脱可能になっており、袋１ｂや袋３ｂを出し入れ可能になっている。移動管路５の筒５ｂは、両端が開放されているため、チューブ５ｃを出し入れ可能になっており、また、両端部は、細胞分離室１の箱１ａ及び細胞増殖室３の箱３ａの対応する位置に着脱可能になっている。なお、図１（ｂ）の移動管路５を形成するチューブ５ｃでは、コック５ａは省略している。

細胞分離室１を形成する袋１ｂには、移動管路５を形成するチューブ５ｃ、第１注入管路７及び第１導出管路９を連結するための連結部１ｃ、１ｄ、１ｅが設けられている。同様に、細胞増殖室３を形成する袋３ｂにも、移動管路５を形成するチューブ５ｃ、第２注入管路１１及び第２導出管路１３を連結するための連結部３ｃ、３ｄ、３ｅが設けられている。また、移動管路５を形成するチューブ５ｃの両端部にも連結部５ｄ、５ｅが設けられている。各連結部１ｃ、１ｄ、１ｅ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、５ｄ、５ｅは、細胞分離室１を形成する袋１ｂ、細胞増殖室３を形成する袋３ｂ、そして、移動管路５を形成するチューブ５ｃが図１（ｂ）に示すような状態に分解されているときに各々の密封状態を維持できるものであり、例えば、連結したときにのみ流路が開くコネクタや注射針のような連結用の中空の針などを刺すことができる樹脂製の栓などで形成されている。

このため、細胞分離室１を形成する袋１ｂに連結される第１注入管路７及び第１導出管路９、そして、細胞増殖室３を形成する袋３ｂに連結される第２注入管路１１及び第２導出管路１３も、各々の端部が各連結部１ｃ、１ｄ、１ｅ、３ｃ、３ｄ、３ｅに対応する構造の連結部になっている。

したがって、図１に示すような細胞培養装置では、例えば、細胞分離室１を形成する袋１ｂ、細胞増殖室３を形成する袋３ｂ、そして、移動管路５を形成するチューブ５ｃを分解した状態でオートクレーブ滅菌やγ線滅菌などによって滅菌し、滅菌後、細胞分離室１を形成する袋１ｂを箱１ａに、細胞増殖室３を形成する袋３ｂを箱３ａに、そして、移動管路５を形成するチューブ５ｃを筒５ｂに入れる。そして、連結部１ｃ、３ｃ、５ｄ、５ｅの構造に応じてコネクタや中空の針を用いて連結する。

さらに、細胞分離室１を形成する袋１ｂに第１注入管路７及び第１導出管路９を、そして、細胞増殖室３を形成する袋３ｂに第２注入管路１１及び第２導出管路１３を、連結部１ｄ、１ｅ、３ｄ、３ｅの構造に応じてコネクタや中空の針を用いて連結する。このとき、第１注入管路７及び第１導出管路９、そして、第２注入管路１１及び第２導出管路１３は、細胞分離室１を形成する袋１ｂまたは細胞増殖室３を形成する袋３ｂに連結された側と反対側の端部が、各々、図１では図示していない滅菌された細胞含有液供給タンク、培養液タンク、緩衝液タンク、廃液タンクなどに適宜連結されている。

ここで、細胞分離室１には、細胞分離室１内に収容される細胞含有液に含まれる細胞を付着させるための付着部１５が設けられている。付着部１５は、細胞分離室１を形成する袋１ｂ内の底面に設けられており、分離する細胞の付着性に応じて、細胞接着性を有すると共に細胞の剥離が可能な細胞接着性材料を袋１ｂ内の底面に設けるか、または、付着性を有する細胞の付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などにより表面処理を行なうことによって形成されている。細胞接着性を有すると共に剥離可能な材料を袋１ｂ内の底面に設けることで付着部１５を形成した場合などでは、培養を行なう都度、細胞分離室１を形成する袋１ｂ内に細胞付着性材料を設置することで装置の再利用が可能である。

このような構成の細胞培養装置の細胞分離室１における細胞の分離の基本原理について説明する。前述のように、細胞分離室１を形成している袋１ｂの内面には、図２に示すように、付着部１５が設けられている。図２（ａ）に示すように、細胞分離室１内に付着性が異なる複数種の細胞を含む細胞含有溶液が入れられ、所定の時間が経過すると、図２（ｂ）に示すように、図２中に黒丸で示した付着性細胞１７は付着部１５に付着し、図２中に白丸で示した他の細胞つまり付着性細胞よりも付着性が弱いか、付着性を有していない細胞１９は付着部１５に付着しておらず、液中に浮遊した状態のままになっている。この状態で、細胞分離室１内に細胞を含まない培養液や緩衝液などを通流させると、液中に浮遊した細胞１９が液と共に細胞分離室１から取り出され、図２（ｃ）に示すように、付着部１５に付着した付着性細胞１７のみが細胞分離室１内に残される。

このように、細胞分離室１では付着部１５を設けることにより、細胞が有する付着性の違いを利用して細胞の分離を行なうことができる。そして、細胞増殖室３で増殖させる細胞つまり目的の細胞が付着部１５に付着した付着性細胞１７である場合、図２中に白丸で示した液中に浮遊した細胞１９を細胞分離室１から取り出し除去した後、図２（ｄ）に示すように、付着部１５を形成した材料が有する特性に応じて細胞の剥離を行い、細胞分離室１内に細胞を含まない培養液を注入することで、剥離した細胞１７を培養液と共に細胞増殖室３に移動させる。

一方、細胞増殖室３で増殖させる細胞つまり目的の細胞が着部１５に付着していない浮遊している細胞１９である場合、付着性細胞１７の剥離を行なわず、細胞分離室１内に細胞を含まない培養液を注入することで、液中に浮遊した細胞１９を培養液と共に細胞増殖室３に移動させる。

なお、細胞増殖室３において、細胞増殖室３を形成する袋３ｂ内面への目的の細胞の付着を促進する必要がある場合、一般的に用いられる培養容器などの場合と同様に、細胞増殖室３を形成する袋３ｂの内面への細胞の付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などの表面処理が行なわれたものを適宜用いる。また、必要に応じ、細胞分離室１の付着部１５の形成に用いた細胞接着性材料などを細胞増殖室３に設けることもできる。

ここで、目的とする細胞が付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い場合の本実施形態の細胞培養装置の操作について、主に哺乳類などの動物の骨髄液から付着性細胞である間葉系幹細胞つまりＭＳＣが目的とする細胞である場合を一例として説明する。この場合、細胞分離室１内には、図３に示すように、底面を温度感受性細胞培養シートで被覆することによって付着部１５が形成されている。

付着部１５を形成している温度感受性細胞培養シートは、細胞分離室１内の温度つまり温度感受性細胞培養シート周囲の環境温度が比較的高い温度、例えば３７℃程度では、疎水性を示すためにＭＳＣが付着した状態となり、比較的低い温度、例えば３０℃程度では、親水性となるため、ＭＳＣが剥離可能な状態となる既知の高分子性の細胞接着性材料である。このような細胞接着性材料としては、温度応答性高分子ポリマーである、例えばＮ−ＰＡＭの略称で知られているＮ−イソプロピルアクリルアミドなどがある。

このような温度感受性細胞培養シートで細胞分離室１内の付着部１５を形成することにより、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力を低下させてしまう可能性があるトリプシンなどの蛋白質分解酵素を用いることなく付着部１５に付着した細胞を剥離できる。すなわち、温度感受性細胞培養シートで付着部１５を形成することで、細胞が有している増殖能や分化能などの能力の低下を抑制し、これにより、その後の細胞増殖室での培養でえられる細胞の品質の低下を抑制しながらＭＳＣを剥離できる。

このような細胞分離室１内に、図３（ａ）−（ｂ）及び図４に示すように、動物から採取した骨髄液が、直接または適切な培養液で薄めた状態で、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液として、コック７ａを開けることで、第１注入管路７より注入される（ステップ１０１）。このとき、図１における第１導出管路９のコック９ａ及び移動管路５のコック５ａは閉じており、細胞含有液は、細胞分離室１内のみに注入される。

なお、図３において、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３は、各々の管路に設けられたコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを閉じている場合には、黒で示し、コック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを閉じている場合には、白で示している。また、図３において、目的の細胞であるＭＳＣ２１は黒丸で、他の細胞２３は白丸で示している。

その後、図３（ｂ）に示すように、第１注入管路７のコック７ａを閉じ、ＭＳＣ２１を増殖させる際の培養条件と同じ条件下つまり約３７℃の温度に細胞分離室１内の温度つまり細胞周囲の環境温度を維持して培養する。一般的な付着性細胞の場合、数時間から約２４時間後に細胞分離室１内の付着部１５に付着するが、付着性細胞以外の細胞は付着しない。したがって、図４に示すように、時間経過または培養状態を撮影して画像解析することなどにより、ＭＳＣ２１が細胞分離室１内の付着部１５に付着したか否かを判断する（ステップ１０２）。

ステップ１０２で、細胞分離室１内の付着部１５にＭＳＣ２１が付着したと判断されると、図３（ｃ）及び図４に示すように、第１注入管路７のコック７ａ及び第１導出管路９のコック９ａを開き、培養液または緩衝液を第１注入管路７から注入し第１導出管路９から排出させ潅流させる細胞分離室１内の洗浄を行なう（ステップ１０３）。これにより、細胞分離室１内の付着部１５に付着しなかった浮遊していた細胞を細胞分離室１内から排出でき、細胞分離室１内の付着部１５に付着している目的の細胞であるＭＳＣ２１と、その他の細胞２３とを分離できる。

ステップ１０３において細胞分離室１内を洗浄した後、第１注入管路７のコック７ａ及び第１導出管路９のコック９ａを閉じる。この状態で、ＭＳＣ２１を増殖される際の培養条件での温度よりも低い温度、例えば約３０℃に細胞周囲の環境温度を下げる（ステップ１０４）。このとき、例えば、細胞分離室１が細胞増殖室３と共にインキュベータ内に入れられている場合、インキュベータの温度を調整することで細胞周囲の環境温度を下げることで細胞周囲の環境温度を下げることができ、また、細胞分離室１内に第１注入管路７から約３０℃の培養液または緩衝液を注入することなどでも細胞周囲の環境温度を下げることができる。これにより、付着部１５を形成している温度感受性細胞培養シートの相転移により、温度感受性細胞培養シートが親水性となり、ＭＳＣ２１は付着部１５から剥離する。

ステップ１０４で細胞周囲の環境温度を下げた後、ＭＳＣ２１が付着部１５から剥離しているのを確認した後（ステップ１０５）、図３（ｄ）、（ｅ）及び図４に示すように、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを閉じた状態で、移動管路５のコック５ａ及び第１注入管路７のコック７ａを開き、第１注入管路７から細胞分離室１内に培養液を注入することにより、培養液を細胞分離室１から細胞増殖室３に向けて潅流することで細胞増殖室３に目的の細胞であるＭＳＣ２１を移動させる。そして、移動管路５のコック５ａを閉じ、細胞増殖室３内の温度を細胞培養条件、例えば約３７℃にすることで、ＭＳＣ２１を増殖させる（ステップ１０６）。このとき、必要に応じ第２注入管路１１のコック１１ａを一時的に開き、第２注入管路１１から細胞増殖室３内に培養液を加え、適切な条件にして細胞培養する。

また、ステップ１０６でＭＳＣ２１を増殖させる培養を行なっているとき、ＭＳＣ２１が細胞増殖室３の培養床に付着後、必要に応じ、図３（ｅ）に示すように、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを開き、培養液を第２導出管路１３から排出した後、第２導出管路１３のコック１３ａを閉め、第２注入管路１１から培養液を注入してコック１１ａを閉じることで培地交換を行う。

ステップ１０６でＭＳＣ２１が増殖した後、図４に示すように、細胞増殖室３から増殖したＭＳＣ２１の回収を行なう（ステップ１０７）。ステップ１０７では、図３（ｅ）に示した操作と同様に、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを開き、緩衝液を第２注入管路１１から入れ第２導出管路１３から排出することで細胞増殖室３内のＭＳＣ２１を洗浄する。洗浄後、緩衝液を細胞増殖室３から除去し、図３（ｆ）に示すように、第２導出管路１３のコック１３ａを閉じ、第２注入管路１１から、例えばトリプシンなどの蛋白質分解酵素を含む細胞剥離剤を注入する。

その後、図３（ｇ）に示すように、第２注入管路１１のコック１１ａを閉じ、細胞剥離反応を行う。細胞剥離反応後、図３（ｆ）に示した操作と同様に、第２注入管路１１のコック１１ａを開けて中和剤を入れた後、再び第２注入管路１１のコック１１ａを閉じ、撹拌により細胞剥離反応を停止する。細胞剥離反応の停止後、図３（ｈ）に示すように、第２導出管路１３のコック１３ａのコックを開けＭＳＣ２１を回収する。

ところで、上記の説明では、細胞分離室１内に設けた温度感受性細胞培養シートで付着部１５を形成した場合を示した。しかし、トリプシンなどの蛋白質分解酵素を含む細胞剥離剤を用いずに細胞を剥離できる付着部１５としては、温度感受性細胞培養シートの他に、動物細胞が有していない物質、すなわち、植物細胞由来の物質を用いて付着部１５を形成することもできる。

例えば、植物細胞由来の物質であるセルロースと細胞接着性を有する蛋白質やペプチドとで付着部１５を形成することができる。このように細胞分離室１内にセルロースと細胞接着性を有する蛋白質やペプチドとで形成した付着部１５を設けた場合、前述の図４に示すステップ１０４の細胞分離室１内を細胞剥離条件に変える操作の代わりに、第１注入管路７のコック７ａを一時的に開き、第１注入管路７からセルロースを分解するため、セルラーゼを含む細胞剥離用薬剤を注入し、付着部１５を形成しているセルロースを分解させる操作を行なう。この操作により、付着部１５が分解され、目的の細胞を剥離することができる。

セルラーゼは、動物細胞に影響を与え難いため、細胞増殖室での培養で得られた細胞の品質の低下を抑制しながら、細胞分離室１の付着部１５から目的の細胞を剥離することができる。また、付着部１５を形成する植物細胞由来の物質としては、セルロースの他、アルギン酸など、植物細胞特有の様々な物質を用いることができる。

一方、目的とする細胞が付着性を有していないか、または、付着性が他の細胞よりも弱い場合の本実施形態の細胞培養装置の操作について、フィーダー細胞と共培養後の胚性幹細胞などの細胞つまりＥＳ細胞からフィーダー細胞を分離し、ＥＳ細胞のみを増殖させる場合を一例として説明する。この場合、細胞分離室１を形成する袋１ｂの内側底面の付着部１５は、細胞の付着を促進するため、一般的に用いられる培養容器などの場合と同様に、袋１ｂの内側底面への細胞の付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などの表面処理を行なうことで形成したものである。また、細胞増殖室３を形成する袋３ｂの内面にも、細胞の付着を促進するため、一般的に用いられる培養容器などの場合と同様に、袋３ｂの内面への細胞の付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などの表面処理が行なわれたものを適宜用いる。

このような細胞分離室１内に、図５（ａ）−（ｂ）及び図６に示すように、共培養後のＥＳ細胞２５とフィーダー細胞２７とを含む培養液が、直接または適切な培養液で薄めた状態で、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液として、コック７ａを開けることで、第１注入管路７より注入される（ステップ２０１）。このとき、図１における第１導出管路９のコック９ａ及び移動管路５のコック５ａは閉じており、細胞含有液は、細胞分離室１内のみに注入される。

なお、図５において、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３は、図３の場合と同様に、各々の管路に設けられたコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを閉じている場合には、黒で示し、コック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを閉じている場合には、白で示している。また、図５において、目的の細胞であるＥＳ細胞２５は白丸で、フィーダー細胞２７は黒丸で示しており、細胞分離室１内の付着部１５は省略している。

その後、図５（ｂ）に示すように、第１注入管路７のコック７ａを閉じ、ＥＳ細胞２５を増殖させる際の培養条件と同じ条件に維持して培養する。一般的なフィーダー細胞２７の場合、数時間後には細胞分離室１内の付着部１５に付着するが、フィーダー細胞よりも付着性が弱いＥＳ細胞は付着しない。したがって、図４に示すように、時間経過または培養状態を撮影して画像解析することなどにより、フィーダー細胞２７のみが細胞分離室１内の付着部１５に付着したか否かを判断する（ステップ２０２）。

ステップ２０２で、細胞分離室１内の付着部１５にフィーダー細胞２７が付着したと判断されると、図５（ｃ）及び図６に示すように、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを閉じた状態で、移動管路５のコック５ａ及び第１注入管路７のコック７ａを開き、第１注入管路７から細胞分離室１内に培養液を注入することにより、培養液を細胞分離室１から細胞増殖室３に向けて潅流することで細胞増殖室３に目的の細胞であるＥＳ細胞２５を移動させる。ＥＳ細胞２５の移動後、移動管路５のコック５ａを閉じ、細胞増殖室３内の温度を、ＥＳ細胞を増殖させるための培養温度にし、ＥＳ細胞２５を増殖させるための培養を行なう（ステップ２０３）。このとき、必要に応じて第２注入管路１１のコック１１ａを一時的に開き、第２注入管路１１から細胞増殖室３内に培養液を加え、適切な条件にする。

このように、ステップ２０３で第１注入管路７から細胞分離室１内に培養液を注入することにより、培養液を細胞分離室１から細胞増殖室３に向けて潅流することで細胞増殖室３に目的の細胞であるＥＳ細胞２５を移動させることにより、細胞分離室１内の付着部１５に付着せずに浮遊していた目的の細胞であるＥＳ細胞２５と、細胞分離室１内の付着部１５に付着しているフィーダー細胞２７とを分離できる。

また、ステップ２０３でＥＳ細胞２５を増殖させる培養を行なっているとき、ＥＳ細胞２５が細胞増殖室３の培養床に付着後、必要に応じ、図５（ｄ）に示すように、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを開き、培養液を第２導出管路１３から排出した後、第２導出管路１３のコック１３ａを閉め、第２注入管路１１から培養液を注入してコック１１ａを閉じることで培地交換を行う。

ステップ２０３でＥＳ細胞２５が増殖した後、図６に示すように、細胞増殖室３から増殖したＥＳ細胞２５の回収を行なう（ステップ２０４）。ステップ２０４では、図５（ｅ）に示したように、第２注入管路１１及び第２導出管路１３のコック１１ａ、１３ａを開き、緩衝液を第２注入管路１１から入れ第２導出管路１３から排出することで細胞増殖室３内のＥＳ細胞２５を洗浄する。洗浄後、緩衝液を細胞増殖室３から除去し、図５（ｆ）に示すように、第２導出管路１３のコック１３ａを閉じ、第２注入管路１１から、例えばトリプシンなどの蛋白質分解酵素を含む細胞剥離剤を注入する。

その後、図５（ｇ）に示すように、第２注入管路１１のコック１１ａを閉じ、細胞剥離反応を行う。細胞剥離反応後、図５（ｆ）に示した操作と同様に、第２注入管路１１のコック１１ａを開けて中和剤を入れた後、再び第２注入管路１１のコック１１ａを閉じ、撹拌により細胞剥離反応を停止する。細胞剥離反応の停止後、図５（ｈ）に示すように、第２導出管路１３のコック１３ａのコックを開けＥＳ細胞２５を回収する。

本例では、フィーダー細胞を分離したＥＳ細胞を増殖させて回収する場合を例示したが、細胞増殖室３での培養において、何らかの分化及び成長因子を加え、ＥＳ細胞を他の細胞に分化させて細胞増殖室３から細胞を回収する場合もある。この場合、ステップ２０２までの操作は同じであるが、ステップ２０３において、培養液に適切な分化及び成長因子を加えて培養後、分化した細胞の種類や性質などに応じ、インキュベータなどから細胞増殖室３または細胞培養装置全体を取り出して細胞増殖室３から手作業で細胞を回収するか、または、ステップ２０４と同様の操作で細胞を回収する。

次に、このような本実施形態の細胞培養装置の構成の変形例について説明する。図１に示したような構成の細胞培養装置では、繰り返し用いることを前提としているが、繰り返しの使用におけるクロスコンタミネーションの低減のための洗浄や滅菌作業をなくす上では、細胞分離室１、細胞増殖室３及び各々に連結された移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３などを使い捨て可能な構成とすることが望ましい場合もある。この場合、例えば、細胞分離室１及び細胞増殖室３は、図７に示すように、各々平たい方形の血液バックと同様の透明な樹脂製の容器で形成する。したがって、細胞分離室１及び細胞増殖室３は、２枚の樹脂シートを枠状に溶着することによって形成したものである。このとき、少なくとも細胞分離室１となる容器の内面の少なくとも底面側となる部分の１部に、適宜の付着部１５を設ける処理を行なっておく。

細胞分離室１の一方の側面には、連結部１ｃ、１ｄ、１ｅが並べて設けられている。同様に、細胞増殖室３の一方の側面にも、連結部３ｃ、３ｄ、３ｅが並べて設けられている。そして、細胞分離室１の連結部１ｃ、１ｄ、１ｅ、細胞増殖室３の連結部３ｃ、３ｄ、３ｅに、各々、シリコンチューブなどの樹脂製のチューブを、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１または第２導出管路１３として連結する。これらの移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３には、樹脂製の活栓などからなるコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａが各々設けられている。また、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３の、細胞分離室１または細胞増殖室３に連結された側と反対側の端部は、各々、例えば注射筒の先端部を挿入して連結可能な樹脂製で筒状の接続部７ｂ、９ｂ、１１ｂ、１３ｂとなっている。

図７に示したような細胞分離室１及び細胞増殖室３は、血液バッグと同様の材料及び製造方法により本実施形態の構成の細胞培養装置の細胞分離室１及び細胞増殖室３用として専用に形成したものであるが、細胞分離室１及び細胞増殖室３は、図８に示すように、血液バッグそのものを利用して形成することもできる。この場合、例えば、２つの血液バッグを、各々、細胞分離室１及び細胞増殖室３として用いる。このとき、少なくとも細胞分離室１を形成する血液バッグの内面の少なくとも底面側となる部分の１部に、適宜の付着部１５を設ける処理を行なっておく。

また、図８に示す構成では、血液バッグによって細胞分離室１及び細胞増殖室３を形成する場合、培養中に血液バッグを寝かせた状態に支持するため、また、取扱を容易にするため、細胞分離室１及び細胞増殖室３となる血液バッグを支持可能なフレーム２９を用いている。フレーム２９は、細胞分離室１を形成する血液バッグと細胞増殖室３を形成する血液バッグを各々支持するための支持枠部２９ａ、２９ｂを有している。支持枠部２９ａ、２９ｂには、細胞分離室１及び細胞増殖室３となる血液バッグの各々の周縁に形成されたリム部１ｆ、３ｆの各々３箇所を挟み込んで細胞分離室１及び細胞増殖室３となる血液バッグをフレーム２９に取り付けるための挟持部材２９ｃが設けられている。

なお、図８では、細胞分離室１となる血液バッグと一体に形成された管路を第１導出管路９とし、細胞分離室１となる血液バッグに形成された２つの連結部１ｃ、１ｄに各々移動管路５及び第１注入管路７を連結している。同様に、細胞増殖室３となる血液バッグと一体に形成された管路を第２導出管路１３とし、細胞増殖室３となる血液バッグに形成された２つの連結部３ｃ、３ｄに各々移動管路５及び第２注入管路１１を連結している。また、図８では、第１注入管路７及び第２注入管路１１には、各々、２つのコック７ａ、１１ａが設けられている場合を示し、第２導出管路１３の設けられたコック１３ａは省略されている。

また、図１、図７及び図８では、別個に形成された細胞分離室１及び細胞増殖室３を用いた場合を示しているが、図９に示すように、細胞分離室１及び細胞増殖室３を１つの分離培養ユニット３１として形成することもできる。この場合、例えば、図９に示すように、１つの透明な樹脂製の容器３１ａ内に、細胞分離室１及び細胞増殖室３を形成し、さらに、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３を設けた構成とする。また、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３には、コック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを設ける。

このとき、少なくとも細胞分離室１の内面の少なくとも底面側となる部分の１部に、適宜の付着部１５を設ける処理を行なっておく。また、分離培養ユニット３１では、第１注入管路７と第２注入管路１１は、容器３１ａの側壁に形成された１つの注入口３１ｂに連結されており、第１導出管路９と第２導出管路１３は、容器３１ａの側壁に形成された１つの導出口３１ｃに連結されている。分離培養ユニット３１は、金型を用いた樹脂成形などにより、細胞分離室１、細胞増殖室３、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３などを一体的に形成することが可能である。

このような分離培養ユニット３１を用い、また、分離培養ユニット３１に設けたコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａを機械的または電気的に動作を制御できるものとすれば、図３乃至図６に示したような分離培養操作の自動化が容易になる。分離培養ユニット３１を用いて分離培養操作の自動化を行なう場合、細胞培養装置は、図１０に示すように、分離培養ユニット３１に加え、分離培養ユニット３１を内部に収容して細胞の培養環境を制御可能なインキュベータ３３、分離培養ユニット３１に設けられたコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａなどの動作を制御する制御部３５、インキュベータ３３の動作の制御や制御部３５への指令及び各種設定値の入力などを行うためのコンピュータ３７、培養液や緩衝液そして細胞剥離剤などを各々収容した複数の試薬ボトル３９、分離培養ユニット３１からの廃液を収容する廃液タンク４１などを備えている。

複数の試薬ボトル３９には、各々供給管路４３が接続されており、各試薬ボトル３９に接続された供給管路４３は途中で１本の管路に合流し、分離培養ユニット３１の注入口３１ｂに接続されている。供給管路４３の分岐した部分には、各々、各試薬ボトル３９内の液の分離培養ユニット３１への供給及び停止を制御するための電磁弁４５が設けられている。電磁弁４５は、制御部３５と配線４７を介して電気的に接続されており、制御部３５によって動作が制御される。また、図示していないが制御部３５は、配線を介して分離培養ユニット３１に設けられたコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａなどの駆動機構と電気的に接続されている。コンピュータ３７は、配線４７を介して制御部３５及びインキュベータ３３と電気的に接続されている。廃液タンク４１は、廃液管路４９を介して分離培養ユニット３１の導出口３１ｃに連結されている。

このような図１０に示したような構成の細胞培養装置とすることにより、図３乃至図６に示したような分離培養操作にしたがって、コンピュータ３７や制御部３５がコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａ、インキュベータ３３、電磁弁４５などの動作を制御することにより、異なる複数種の細胞から目的の細胞を分離して増殖させる培養を自動的に行なうことができる。

このように、本実施形態の細胞培養装置では、細胞分離室１で、細胞含有液に含まれる細胞のうち付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着部１５に付着させることにより、付着部１５に付着した細胞と付着部１５に付着していない細胞とを分離することができる。さらに、第１注入管路７及び第１導出管路９、第２注入管路１１及び第２導出管路１３、そして、移動管路５により、細胞分離室１内への異なる複数種の細胞を含む細胞含有液や緩衝液などの注入、細胞分離室１内からの不要な細胞や液体などの導出、細胞分離室１で分離した細胞の細胞増殖室３への移動、細胞増殖室１内への培養液や緩衝液などの注入や、細胞増殖室１内からの細胞の回収などを行なうことができる。したがって、目的の細胞の分離操作、分離した目的の細胞の増殖のための培地への植付け操作などを、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。このため、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して増殖させるための細胞培養におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。

さらに、目的の細胞の分離にセルソーターなどの高価な機器を用いる必要がないため、目的の細胞を分離して増殖できる細胞培養装置のコストを低減できる。

さらに、本実施形態の細胞培養装置では、第１注入管路７には、第１注入流路開閉手段となるコック７ａが、第１導出管路９には、第１導出流路開閉手段となるコック９ａが、第２注入管路１１には、第２注入流路開閉手段となるコック１１ａが、第２導出管路１３には、第２導出流路開閉手段となるコック１３ａが設けられている。このため、細胞分離室１や細胞増殖室３に液体を出し入れする流路が全て各コック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａで閉塞でき、また、必要な管路のみを開いて液体の出し入れができるため、細胞分離室１や細胞増殖室３などの滅菌状態を維持し易くなり、コンタミネーションの発生をより確実に抑制できる。加えて、細胞分離室１や細胞増殖室３などへの液体や細胞の出し入れや、細胞分離室１から細胞増殖室３への細胞の移動などの制御が容易になる。

さらに、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１１、第２導出管路１３にコック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａが設けられていることにより、コック５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａなどの各流路開閉手段を機械的または電気的に動作を制御できるものとすることで、目的の細胞の分離操作や分離した細胞の培地への植付け操作、増殖した細胞の回収操作などの目的の細胞を分離して増殖させるための一連の培養操作を容易に自動化できる。

さらに、本実施形態では、細胞分離室１内に設けられた付着部１５は、細胞接着性材料、または、植物細胞特有の成分で、酵素分解可能な成分と、細胞に対する接着性を有する成分とで形成されている。このため、付着部１５に付着した細胞が目的の細胞である場合、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がなく、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力の低下を抑制できる。したがって、細胞増殖室３で要求される品質の細胞を得易くなる。

加えて、本実施形態では、細胞分離室１の付着部１５に付着していない細胞が目的の細胞である場合、細胞分離室１内の付着部１５は、細胞の付着を促進するための表面処理を施すことで形成している。このため、目的の細胞以外の細胞の付着部１５への付着が促進され、細胞分離室１における目的の細胞の分離能力を向上できる。

また、本発明は、本実施形態の構成の細胞培養装置に限らず、付着部を有する細胞分離室、移動流路を介して細胞培養室に連通する細胞増殖室などを備えていれば様々な構成にできる。

本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態の概略構成を模式的に示す図であり、（ａ）は全体の構成を、（ｂ）は細胞分離室、移動管路及び細胞増殖室を構成する袋やチューブを取り出して分解した状態で示す斜視図である。 発明を適用してなる細胞培養装置の細胞分離室での細胞の分離の原理を模式的に説明する図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態において、目的の細胞が付着性の細胞である場合の動作を（ａ）から（ｈ）の順で模式的に示す図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態において、目的の細胞が付着性の細胞である場合の動作を示すフロー図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態において、目的の細胞が付着部に付着していない細胞である場合の動作を（ａ）から（ｈ）の順で模式的に示す図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態において、目的の細胞が付着部に付着していない細胞である場合の動作を示すフロー図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態の別の概略構成を模式的に示す図であり、（ａ）は全体の平面図、（ｂ）は細胞分離室の側面図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態のさらに別の概略構成を模式的に示す図であり、（ａ）は全体の平面図、（ｂ）はフレームのみの平面図、（ｃ）はフレームのみの側面図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置の一実施形態のさらに別の概略構成を模式的に示す平面図である。 本発明を適用してなる細胞培養装置における培養操作を自動化した場合の一実施形態の概略構成を模式的に示す斜視図である。

符号の説明

１ 細胞分離室
３ 細胞増殖室
５ 移動管路
７ 第１注入管路
９ 第１導出管路
１１ 第２注入管路
１３ 第２導出管路
１５ 付着部
５ａ、７ａ、９ａ、１１ａ、１３ａ コック

Claims (3)

1. 異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、該細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する細胞分離室と、該細胞分離室で分離した目的の細胞を増殖させる培養を行なう細胞増殖室と、前記細胞分離室で分離した目的の細胞を前記細胞増殖室に移動させるための移動流路と、前記細胞分離室に連結されて該細胞分離室内へ液体を注入する第１注入流路及び該細胞分離室内の液体を導出する第１導出流路と、前記細胞増殖室に連結されて該細胞増殖室内へ液体を注入する第２注入流路及び該細胞増殖室内の液体を導出する第２導出流路とを備え、前記細胞分離室は、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、前記移動流路は、該移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している細胞培養装置。
2. 前記第１注入流路には、該第１注入流路を開閉する第１注入流路開閉手段が、前記第１導出流路には、該第１導出流路を開閉する第１導出流路開閉手段が各々設けられ、前記第２注入流路には、該第２注入流路を開閉する第２注入流路開閉手段が、前記第２導出流路には、該第２導出流路を開閉する第２導出流路開閉手段が各々設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記細胞分離室内の付着部は、温度変化に応じて細胞への接着性が変化し、細胞周囲の環境温度の変化によって細胞の付着及び剥離が制御できる温度感受性の細胞接着性材料で形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養装置。
   

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