JP2007312668A

JP2007312668A - 自動培養装置

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Publication number: JP2007312668A
Application number: JP2006145161A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Ieshima; 大輔家島; Tsutomu Suzuki; 力鈴木; Yoshihiro Komori; 義広小森; Hiroshi Tachikui; 宏立久井; Izumi Asahina; 泉朝比奈; Minoru Ueda; 実上田
Original assignee: University of Tokyo NUC; Hitachi Medical Corp
Current assignee: Hitachi Healthcare Manufacturing Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2006-05-25
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2026-05-25
Also published as: JP4928831B2

Abstract

【課題】コンタミネーションのリスクを軽減でき、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現する。
【解決手段】インキュベータ３６内に気密に形成された細胞の培養器２を設置し、培養器に気密に接続された送液管４を介して培地容器１４と洗浄液容器１０と骨髄液容器１２の液を選択的に培養器に注入する送液手段３４と、培養器内の液を排液管８を介して排出する排液手段４２とを備え、培地を培養器に注入した後に骨髄液を注入して設定時間静置させた後、培養器内を洗浄して培養器に接着する幹細胞を選択的に分離した後、培地を培養器に注入して幹細胞を培養し、十分な細胞数に増殖させた後、分化培地１５を培養器に注入して目的の組織細胞に分化させて、分化させた組織細胞を培養器から抜き出して回収容器４８に回収する。
【選択図】図１

Description

本発明は、自動培養装置に係り、具体的には、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現する自動培養装置に関する。

再生医療は、例えば、欠損した組織の修復法として注目されている。このような再生医療は、細胞を用いた治療であり、培養器での培養及びＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性などの試験を含むインビトロ（ＩｎＶｉｔｒｏ）の細胞培養作業を必要とする。例えば、骨又は軟骨を欠損した被験者の治療においては、間葉系幹細胞（以下、適宜、ＭＳＣ（ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌ）と略す。）を培養し、骨又は軟骨に分化させ、被験者に移植する方法が提案されている。このＭＳＣは腸骨などの骨髄液に含まれることが知られているが、骨髄液に含まれるＭＳＣを分離、培養して、骨や軟骨へ分化させるには煩雑な培養作業が必要である。また、培養の途中でＭＳＣが汚染される、いわゆるコンタミネーションなどのリスクが伴うことがある。一般に、ＭＳＣの培養作業は、例えば、次の手順により行われている。
（１）腸骨等に穿刺し、ヘパリンナトリウムなどの血液凝固防止剤を含んだシリンジで骨髄液を採取する。
（２）骨髄液に含まれる赤血球など血球系細胞を排除し、ＭＳＣを分離するために、遠沈管に骨髄液を入れ、遠心分離を行って密度勾配法により目的の細胞であるＭＳＣ層の液をピペツターで吸出し、培地等で希釈した後にシャーレなどの培養器へ注入して培養（インキュベート）する。

また、所定の培養条件下の培地により培養する過程で、ＭＳＣはシャーレに接着することから、適当な期間をあけて培地交換することにより、シャーレに接着しない血球系細胞を排除してＭＳＣを分離することができる。
（３）その後、所定の培養条件下において継続して培養する。ここで、所定の培養条件は、温度３７℃前後、ＣＯ_２濃度５％が一般的である。凡そ３日おきにピペツターなどを使用しながら培地交換して培養を継続する。
（４）細胞が増殖し、局所に細胞密度の高いコロニーが形成されるか、あるいは培養面積の６０〜９０％程度まで細胞が増殖したら、複数の新しいシャーレに再播種する継代を行う。この継代は、培養中のシャーレにタンパク分解酵素を入れて細胞を浮遊させ、数分後にタンパク分解酵素失活剤を注入して、複数の新しいシャーレに再播種することにより行う。このように細胞増殖に伴い継代を複数回行うことにより、シャーレの数が鼠算的に増加する。例えば、培養器の面積が約７５ｃｍ^２の場合、約１〜１．５×１０^６個の細胞を回収できる。
（５）適当な日数が経過し、細胞が充分量増殖した後に、骨又は軟骨などの用途に応じて適当な成分を含有する培地に切り替え、目的の組織の細胞に分化誘導する。
（６）目的の組織の培養細胞の回収は、シャーレにタンパク分解酵素を入れて細胞を浮遊させ、数分後にタンパク分解酵素の失活剤を注入して回収する。回収した培養細胞は、被験者への移植などに利用する。例えば、最終的には１×１０^７個以上の細胞を必要とする場合が多く、例えば約７５ｃｍ^２のシャーレの場合は、１０枚以上必要となる。

上述したように、再生医療に用いる細胞の培養作業は、煩雑な作業を伴うことから、培養プロトコールに従って自動的に培養操作を行うようにした自動培養装置が特許文献１等に提案されている。これによれば、煩雑な培養作業を自動化することができ、かつ、気密でクリーンな環境で培養操作をすることができるから、培養細胞が汚染されるコンタミネーションを回避でき、安全性を向上させることができる。

特開２００４−１６１９４号公報

しかしながら、特許文献１に記載の自動培養装置は、基本的に手作業による個々の培養操作を自動化したものであり、例えば、シャーレ内の培地交換はインキュベータ内のシャーレの蓋を開けてピペットにより交換するようにしている。したがって、インキュベータ内又はインキュベータを収納する筐体内をクリーン環境に保持しても、コンタミネーションのリスクを軽減することに改善の余地がある。また、シャーレの数が鼠算的に増加するため、非常に煩雑な作業となり、作業ミスの発生も否定できない。特に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養に適用する場合、骨髄液からＭＳＣを分離する操作を自動化することについては配慮されていない。

本発明は、コンタミネーションのリスクを軽減し、培養細胞の安全性を一層向上させることができ、かつ、骨髄液からの幹細胞の分離操作を自動化することを第1の課題とする。

また、本発明は、第1の課題に加えて、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現することを第2の課題とする。

上記第１の課題を解決するため、本発明の自動培養装置は、インキュベータ内に設置され気密に形成された細胞の培養器と、培地が貯留された培地容器と、洗浄液が貯留された洗浄液容器と、骨髄液が貯留された骨髄液容器と、前記培養器に気密に接続された送液管を介して前記培地容器と前記洗浄液容器と前記骨髄液容器の液を選択的に前記培養器に注入する送液手段と、前記培養器内の液を排液管を介して排出する排液手段と、前記送液手段と前記排液手段を予め定められた培養プロトコールに従って制御する制御手段とを備えてなり、前記制御手段は、前記送液手段を制御して前記培地を前記培養器に注入した後に前記骨髄液を前記培養器に注入して設定時間静置させる初期操作と、該初期操作の後に前記排液手段と前記送液手段を制御して、前記培養器内を前記培地又は前記洗浄液によって洗浄して前記培養器に接着する幹細胞を選択的に分離する分離操作と、該分離操作後に前記培養器に前記培地を注入して前記幹細胞を培養する培養操作を含んで構成する。

このような構成を有する本発明によれば、培養器が気密に形成され、かつ、培地、洗浄液、骨髄液等の液が気密に接続された送液管を介して培養器に送液されることから、ピペットなど培養器具を介して、あるいは周囲の空気から培養器内に汚染物質が侵入するのを防ぐことができる。その結果、コンタミネーションのリスクを軽減し、自動培養細胞の安全性を一層向上させることができる。特に、培養器内の液の排出及び洗浄液の注入を、好ましくは繰返し行って、培養器に接着する幹細胞を選択的に分離するようにしているから、幹細胞の分離操作を自動化することができる。

また、第２の課題を解決するため、本発明の他の発明の自動培養装置は、インキュベータ内に設置され気密に形成された細胞の培養器と、タンパク質分解酵素を失活させる成分が含まれた第１の培地が貯留された第１の培地容器と、該第1の培地とは異なる第２の培地が貯留された第２の培地容器と、タンパク質分解酵素が貯留されたタンパク質分解酵素容器と、洗浄液が貯留された洗浄液容器と、骨髄液が貯留された骨髄液容器と、前記培養器に気密に接続された送液管を介して前記第１の培地容器と前記第２の培地容器と前記タンパク質分解酵素容器と前記洗浄液容器と前記骨髄液容器の液を選択的に前記培養器に注入する送液手段と、前記培養器内の液を排液管を介して排液タンク又は細胞回収タンクに選択的に排出する排液手段と、前記送液手段と前記排液手段を予め定められた培養プロトコールに従って制御する制御手段とを備えてなり、前記制御手段は、前記送液手段を制御して前記第１の培地を前記培養器に注入した後に前記骨髄液を前記培養器に注入して設定時間静置させる初期操作と、該初期操作の後に前記排液手段と前記送液手段を制御して、前記培養器内を前記培地又は前記洗浄液によって洗浄して前記培養器に接着する幹細胞を選択的に分離する分離操作と、該分離操作後に前記送液手段を制御して前記第１の培地を前記培養器に注入して前記幹細胞を培養する培養操作と、該培養操作により前記幹細胞が十分に増殖したことを確認した後、前記送液手段を制御して前記第２の培地を前記培養器に注入して前記幹細胞を組織細胞に分化させる分化操作と、該分化操作後に、前記送液手段を制御して前記タンパク質分解酵素を前記培養器に注入して前記幹細胞を浮遊させ、前記第１の培地を前記培養器に注入して浮遊した前記幹細胞を前記細胞回収タンクに排出する細胞回収操作を含んで構成する。

これによれば、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現することができる。

本発明において、さらに、前記培養器を揺らす揺動手段を備え、前記制御手段は、前記分離操作時に前記揺動手段を制御して前記培養器を揺らすように構成することにより、幹細胞の分離効率を向上させることができる。

本発明によれば、コンタミネーションのリスクを軽減し、培養細胞の安全性を一層向上させることができ、かつ、骨髄液からの幹細胞の分離操作を自動化することができる。

また、本発明の他の発明によれば、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。図１は、本発明の自動培養装置の一実施形態のブロック構成図である。図２〜図６は、骨髄液から間葉系幹細胞を培養するのに好適な本発明の一実施形態の培養プロトコールの操作手順を示すフローチャートである。

図１に示すように、本実施形態の培養器２は円形シャーレを用いて密閉状態に形成されている。この培養器２には、送液側のチューブ４、排出側のチューブ８、空気交換用のチューブ６が気密に接続されている。培養器２は、細胞無毒性の材質であればよく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。また、培養器２の形状は、本実施形態のように円形シャーレを用いることが好ましいが、特に限定されるものではない。

洗浄液を入れたバッグ１０、タンパク分解酵素を入れたバッグ１２、第１の培地を入れたバッグ１４，第１の培地とは異なる成分の第２の培地を入れたバッグ１５が備えられている。バッグ１４の第１の培地にはタンパク分解酵素を失活する血清が含有されている。また、バッグ１５の第２の培地には、目的とする組織細胞に分化させるのに適した組成の薬剤が用いられる。これらのバッグは、図示していないが、保冷（約４℃）された庫内に収納されている。各バッグ１０，１２，１４，１５は、それぞれ培養器２の送液側のチューブ４に接続されている。また、各バッグ１０，１２，１４，１５に接続された分岐チューブには、ピンチ弁１６，１８，２０，２１が設けられている。チューブ４には、各バッグ１０，１２，１４，１５から培養器２に注入する液を余熱するヒータ２６が設けられている。ヒータ２６と培養器２の間のチューブ４に、ピンチ弁２２とポンプ３４が設けられている。ポンプ３４は外気が侵入しないタイプが良く、ローラポンプが好ましい。ローラポンプは、例えば３本のローラを一体に回転させるように構成され、その３本のローラの外周にチューブ４を巻き付けて用いる。

ポンプ３４とピンチ弁２２の間のチューブ４には、チューブ２５を介して液溜め３２が接続されている。液溜め３２の開口部はフィルム３０により覆われている。液溜め３２には、シリンジ２８をフィルム３０に穿刺してシリンジ２８内に採取した骨髄液が注入される。

培養器２の排出側のチューブ８には、培養後の細胞液を入れる細胞回収容器である細胞回収用のバッグ４８と、培養器２内の廃液を排出するためのバッグ５０が接続されている。また、チューブ８には、ローラポンプなどのポンプ４２が設けられ、各バッグ４８，５０に接続された分岐チューブには、それぞれピンチ弁４４，４６が設けられている。ここで、バッグ１０，１２，１４，１５、４８及びチューブ４，６、８、２５等は、細胞無毒性の材質であればよく、例えば、塩化ビニル、シリコン製が好ましい。

培養器２に接続された空気交換用のチューブ６の先端は、インキュベータ３６内に空気フィルター３８を介して開口されている。これにより、外気が直接培養器２内部に侵入するのを防いで、コンタミネーションのリスクを低減している。また、インキュベータ３０内に空気フィルター４０が設けられ、この空気フィルター４０はチューブ２７を介して各バッグ１０，１２，１４，１５とヒータ２６との間のチューブ４に接続されている。インキュベータ３６には、図示していないが、内部の温度及び二酸化炭素濃度を調整する手段が設けられている。例えば、温度は３０℃から４０℃、ＣＯ_２濃度は５％に制御されている。培養器２には、培養細胞を観察するＣＣＤカメラ付き顕微鏡などの画像取得手段５２が設けられている。また、培養器２を揺らす揺動手段５４が設けられている。

各ピンチ弁１６，１８，２０，２１、２２、２３、２４，４４，４６、ポンプ３４，４２、画像取得手段５２、及び揺動手段５４は、図示していない制御装置により駆動制御されるようになっている。

このように構成される本実施形態の自動培養装置を、予め定めた培養プロトコールに従って制御する制御装置の動作手順を、図２〜図6を参照して説明する。図2は、図1の自動培養装置により骨髄液から間葉系幹細胞を培養する培養プロトコールの概要フローチャートである。

〔ステップＳ１：初期・分離操作〕
オペレータが細胞培養の開始指令を制御装置に入力することにより、培養プロトコールに従って一連のシーケンス動作が開始する。まず、培養器２にバッグ１４の第１の培地を注入し、続いて培養器２に液溜め３２から骨髄液を注入し、しばらく（例えば、３０分以上）静止した後、培養器２内の培地をバッグ５０に排液する。これにより、培養器２に接着する間葉系幹細胞以外の細胞を排出させて間葉系幹細胞を分離することができる。この場合、必要に応じて、バッグ１０の洗浄液又はバッグ１４の第１の培地を培養器２に注入して、再び排出する処理を繰返し行うことにより、間葉系幹細胞の分離精度を向上することができる。

〔ステップＳ２：培養操作〕
ステップＳ２では、培養器２に残された間葉系幹細胞を第１の培地により培養する。このステップでは、必要に応じて、培地交換及び培地内に空気を送る操作を行う。この培養は、培養器２内の細胞数が所定の十分な数になるまで行う。

〔ステップＳ３：継代操作〕
継代操作は、通常、培養操作に含まれる処理である。つまり、ステップＳ２の培養操作において、細胞数が十分に増えていない場合であっても、培養器２内に局所的に細胞密度が高いコロニーが形成されると、その領域における増殖速度が抑制されることから、培養器２内の細胞を播き直す継代を行う。この継代は、培養中の培養器２にバッグ１２のタンパク分解酵素を注入して細胞を浮遊させた後、タンパク分解酵素の失活剤が含有された第１の培地を注入することにより行う。このように、細胞増殖に伴い継代を複数回行うことにより、培養器２内の細胞密度が均等化され、増殖を促すことができる。

〔ステップＳ４：分化操作〕
適当な日数が経過し、培養操作によって細胞数が十分な数に達したことを、例えば、画像取得手段５２の画像により確認したときは、培養操作を停止して、培養された間葉系幹細胞を目的とする組織細胞に分化誘導する操作を行う。この分化操作は、骨又は軟骨などの用途に応じて適当な成分を含有する第２の培地に切り替えて培養し、目的の組織の細胞に誘導する。この培養は、ステップＳ２の培養操作と同様の操作になる。

〔ステップＳ５：細胞回収操作〕
ステップＳ４の操作で、目的の組織の細胞への分化が完了したら、培養器２内の細胞を回収する。この回収は、培養器２にバッグ１２のタンパク分解酵素を入れて細胞を浮遊させ、数分後にタンパク分解酵素の失活剤を含有する第１の培地を注入して、バッグ４８に回収する。回収した培養細胞は、被験者への移植などに利用する。

ここで、各ステップＳ１〜Ｓ５の詳細な処理手順を、図３〜図６を用いて説明する。

図３は、初期・分離操作の詳細なフローチャートである。まず、細胞培養の開始指令が入力されると、ステップＳ１１において、ピンチ弁２０，２２を開き、ポンプ３４を動作させて、培養器２にバッグ１４から第１の培地を注入する。この際、培養器２内部の空気は、空気フィルター３８から排気されるので、円滑に培地を注入できる。

次に、ステップＳ１２において、液溜め３２から培養器２に骨髄液を注入する。液溜め３２内には、予め培地などと混合された骨髄液が入ったシリンジ２８を、フィルム３０に穿刺して骨髄液が注入されている。培養器２に骨髄液を注入するには、ピンチ弁２４を開いてポンプ３４を動作させることにより行う。この際、培養器２内部の空気は、空気フィルター３８から排気されるので、骨髄液がチューブに詰まることなく円滑に注入できる。

次いで、ステップＳ１３において、培養器２に骨髄液を注入した状態で、少なくとも３０分以上静置する。これにより、培養器２に間葉系幹細胞を接着させる。

次に、ステップＳ１４において、間葉系幹細胞のみを残して、血球系細胞などの他の細胞を除去するために、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させ、培養器２の培地をバッグ５０に排出する。この場合、空気フィルター３８から外気が培養器２内に吸入されるので、培養器２内が負圧になることなく培地を円滑に排出できる。その後、ピンチ弁２０，２２を開き、ポンプ３４を動作させて第１の培地を注入する。

この洗浄は、ピンチ弁２０に代えて、ピンチ弁１６を開き、バッグ１０の洗浄液を用いてもよい。また、この洗浄の回数は複数回行うと効果的である。さらに培地（もしくは洗浄液）を入れた後に、揺動手段５４を駆動して培養器２を揺すると、より高い洗浄の効果が得られる。このようにして、培養器２内に、間葉系幹細胞のみが分離される。

図４は、図２における培養操作と継代処理の詳細なフローチャートである。図示のように、培養操作はステップＳ２１〜２４からなり、継代処理はステップＳ３１〜３４からなる。なお、本実施形態では、図３のステップＳ１４の洗浄処理の最後において、培養器２には第１の培地が注入されているものとするが、洗浄処理の最後においても洗浄液を用いる場合は、ステップＳ２１において第1の培地を注入する。培養は、培養器２を所定期間（例えば、３日程度）インキュベータ３６内に静置して行う。この間、培養器２は密閉状態にあるため、適宜、培養器２内を換気する。この換気は、ステップＳ２２において、ピンチ弁２２，２３を開き、ポンプ３４を動作させて、空気フィルター４０からインキュベータ３６内の空気を吸引して培養器２に注入する。この換気において、培養器２内の空気は空気フィルター３８を介して排気される。この換気は、後述する培地交換、細胞回収以外の時間帯は、何回行ってもよく、また、常時連続して実施してもよい。

培養を継続していくうちに、培地中に溶出する細胞の不要な代謝物質を除去するため、及び培地の栄養分補給のために、定期的に行う培地を交換する必要がある。そこで、ステップＳ２３において、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の培地をバッグ５０に排出する。この際、培養器２内部には、空気フィルター３８を介して外気が吸入されるので、円滑に培地を排出できる。次いで、ピンチ弁２０，２２を開き、ポンプ３４を動作させて、第１の培地を注入する。培養器２内部の空気は、空気フィルター３８から排気されるので、円滑に培地を注入できる。このステップＳ２３の培地交換は、通常、３日程度おきに実施するが、この時間は予め、もしくは細胞の増殖状況に応じて任意に設定できる。なお、回数には限定しない。

このようにして培養した後、ステップＳ２４において画像取得手段５２により培養器２内の画像を取得し、取得した画像に基づいて細胞の増殖状況を確認する。所期の細胞数に対して十分な細胞数に達していなければ、ステップＳ３の継代操作に移行する。

継代操作は、図４のステップＳ３１〜Ｓ３４の手順で行う。まず、図示していないが、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の培地をバッグ５０に排出する。続いて、ピンチ弁１６、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、培養器２内にバッグ１０の洗浄液を注入する。さらに、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の洗浄液を排出する。次に、ピンチ弁１８、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、培養器２にバッグ１２のタンパク質分解酵素を注入する。これにより、培養器２に接着している細胞が剥離して浮遊する。

ステップＳ３２では、タンパク分解酵素を失活させるために、ピンチ弁２０、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、培養器２にバッグ１４の第１の培地を注入する。次のステップＳ３３において、揺動手段５４を動作させて培養器２を揺らし、培地内に細胞を懸濁させて均一に分散させる。そして、ステップＳ３４において一定時間（例えば、３０分）静置して細胞を培養器2に接着させた後、ステップ２１の培養に戻る。

このような培養操作と継代操作を繰り返し、ステップＳ２４において、十分な細胞数が確認できた場合は培養操作を終了し、ステップＳ４の図５の分化操作に移行する。なお、培養器２から排液時及び培養器２に液を注入する際、培養器２の内部は空気フィルター３８を介して吸排気される。

図５に示す分化操作は、培養された間葉系幹細胞を目的とする組織細胞に分化誘導する操作であり、骨又は軟骨などの用途に応じて適当な成分を含有する第２の培地に切り替えて培養し、目的の組織の細胞に誘導する。図示のように、ステップＳ４１において、培養に用いていた第１の培地を、第２の培地に交換する。この交換は、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の第１の培地をバッグ５０に排出する。続いて、ピンチ弁２１、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、第２の培地を注入することにより行う。次いで、ステップＳ４２において第２の培地により培養することにより、目的とする細胞に分化させる。この培養の過程で、必要に応じて培養器２内に空気を送るため、ピンチ弁２２，２３を開き、ポンプ３４を動作させる。

分化操作が終了したら、図６のステップＳ５１〜Ｓ５３の細胞回収操作に移行する。まず、図示していないが、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器内部の第２の培地を排出する。続いて、ピンチ弁１６、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、洗浄液を注入する。さらに、ピンチ弁４６を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の洗浄液を排出する。

そして、ステップＳ５１において、ピンチ弁１８、２２を開き、ポンプ３４を動作させて、培養器２にタンパク質分解酵素注入を注入し、細胞を培養器２内に浮遊させる。次に、ステップＳ５２において、培養器２に培地（第１又は第２？）を注入する。そして、ステップＳ５３において、ピンチ弁４４を開き、ポンプ４２を動作させて、培養器２内の細胞を回収バッグ４８に排出する。排出後、回収バッグ４８に接続されたチューブを熱シールなどにより切断及びシールする。回収バッグ４８は培養細胞を利用する部署に運ばれる。

このようにして、細胞回収操作が終了すると、制御装置の表示装置などにシーケンス制御の終了が表示される。

以上説明した動作フローチャートにおいて、ステップ１１、１５で用いる培地は、図２における培地１５を用いてもよい。その場合の動作は、前述の培地１２を用いるときに動作させたピンチ弁２０を２１とすればよい。

（実施例）
以下、上記実施形態の自動培養装置を用いて、ヒト骨髄液から間葉形幹細胞を培養した結果について、具体的かつ詳細に述べる。
（１）実験条件
図１の自動培養装置の制御装置に、図２〜図６の培養プロトコールを実行するシーケンス制御ソフトを搭載した。また、培養に用いた薬剤は表１のとおりである。

外科的に採取した２９歳男性の骨髄液10ｍ1を、ＤＭＥＭ（10％ＦＢＳ，1％ＰＳ）で3倍希釈し（総量30ｍｌ）、液溜め３２に投入して、図２の培養プロトコールーチンによる培養を開始した。なお、培養器２には、直径２５ｃｍの円形シャーレを用いた。

（２）培養プロトコールによる培養
液溜め３２に投入された骨髄は、日詰まりをおこすこともなく、培養器２へ到達し、第１の培地１５０ｍｌと培容器２内で混和した。投入直後の骨髄液には、多量の血球成分が含まれており、光の透過率の関係で顕微鏡画像には何も写らないが、図３ステップＳ１３，Ｓ１４の静置及び洗浄を経ることで、図７に示すように、浮遊系細胞は除去された。本実施例では、７回の洗浄を行った。

培養開始後１０日目に、培養器２内を観察したところ、細胞数が少ない部分がある一方(図８（Ａ）)、細胞が密になったコロニーを確認した（図８（Ｂ））。この段階で、細胞の密度分布を培養器内で均一にするため、継代操作（図４ステップＳ３１〜Ｓ３４）を実行した結果、培養器２内で細胞は剥離され、再度均一に播種された(図８（Ｃ）)。さらに、継代後に、図４のステップＳ２１〜Ｓ２３の培養操作で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養した結果、培養器２内でＭＳＣはコンフルエントに達した(図８（Ｄ）)。

培養器２内でコンフルエントに達したＭＳＣに対して、図５のステップＳ４１〜Ｓ４３の手順で、分化培地を投入して約１週間培養（培養開始から２１日）した。そして、図６のステップＳ５１〜Ｓ５３の手順で、細胞回収を行った結果、３×１０^７個のＭＳＣが回収バッグ４８に得られた。

（３）実験結果の考察
骨髄液からのＭＳＣの分離精製・増殖・分化・回収の工程を完全閉鎖系環境の中で、自動で行うことが可能となった。また、コンタミネーションを生じることはなく、またその恐れも感じることもなかった。さらに、細胞数は通常利用される７５ｃｍ^２の培養器の約６．５倍の面積を有する培養器を用いたため、その期待値はせいぜい約１×１０^７個であったが、３×１０^７個と非常に多い細胞を得ることができた。

（４）培養細胞の生化学的評価
１）評価方法
本実施例の方法で培養した細胞の分化能を確認するため、回収した細胞の総数を測定した上で、その一部を採取し、ＰＮＰＰ法を用いてアルカリフォスフォターゼ活性（ＡＬＰ活性）を測定した。また、コントロールとして、用手法で培養した４０歳女性、本発明の自動培養装置で培養した４０歳男性のＭＳＣも比較として用いた。なお、ＡＬＰ活性測定用試薬は、ｐ-Nitrophenyl phosphate tablets sets （Sigma製）を用いた。

２）評価結果
測定の結果、本発明の方法で分化誘導処理を行った２９歳男性由来のＭＳＣと、用手法で行った４０歳女性由来のＭＳＣで高いＡＬＰ活性を示しており、本実施例で分化誘導処理を行ったＭＳＣは分化能を有していることが示された（図９）。本発明で行った４０歳男性のＭＳＣのＡＬＰ活性が低いが、これは本発明の影響よりも、被験者の年齢や状態が影響しているものと考えられる。

３）結果の解釈
本実施例により骨髄液からのＭＳＣの分離精製・増殖・分化を自動で実現できることが明確になった。さらに骨髄液からのMSCは、骨への分化能を有することが示された。

（５）培養細胞を用いた骨誘導移植実験
１）方法
本実施例の方法で培養した骨髄細胞を用いた骨分化によるインビボ（Ｉｎｖｉｖｏ）評価をヌードマウスヘの細胞移植により行った。具体的な方法は、回収した細胞は１×１０^６個をＴＣＰ（Ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）頼粒５０ｍｇに混ぜ、ヌードマウスの皮下に移植し、４週後に取り出し、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオジン染色）を行い顕微鏡で観察した。

２)結果
移植実験の結果、ＴＣＰ頼粒中に混ぜられた細胞の中に、骨に分化した部分が存在しており、得られた細胞には骨分化能が存在することが判明した（図１０）。

３）結果の解釈
本実施例の方法により分離精製・増殖・分化させたＭＳＣは、骨形成能を有することが示された。

以上説明したように、本実施形態によれば、培養器２が気密に形成され、かつ、培地、洗浄液、骨髄液等の液が気密に接続されたチューブ４を介して培養器２に送液されることから、ピペットなど培養器具を介して、あるいは周囲の空気から培養器２内に汚染物質が侵入するのを防ぐことができる。また、培養器２内の培養細胞は、気密に接続されたチューブ８を介してバッグ４８に回収できる。その結果、コンタミネーションのリスクを軽減し、培養細胞の安全性を一層向上させることができる。

特に、培養器２内の培地等の液の排出及び洗浄液の注入による洗浄処理を、好ましくは繰返し行うことにより、培養器２に接着する間葉系幹細胞を選択的に分離するようにしているから、間葉系幹細胞の分離操作を自動化することができる。また、分離操作時に揺動手段５４を動作させて培養器２を揺らすように構成しているから、間葉系幹細胞の分離効率を向上させることができる。

また、本実施形態によれば、骨髄液から幹細胞を分離し、増殖、分化誘導の培養プロトコールを安全かつ自動的に実現することができる。

本発明の一実施形態の自動培養装置のブロック図である。本発明の一実施形態の培養プロトコールの概要手順を示すフローチャートである。初期・分離操作の詳細手順を示すフローチャートである。培養操作及び継代操作の詳細手順を示すフローチャートである。分化操作の詳細手順を示すフローチャートである。細胞回収操作の詳細手順を示すフローチャートである。初期・分離操作における細胞画像の一例である。培養中の細胞画像の一例である。培養細胞のＡＬＰ活性値を比較して示す図である。培養細胞をマウスに移植後の組織標本画像である。

符号の説明

２培養器
４、８チューブ
１０，１２，１４，１５バッグ
１６，１８，２０，２１，２２，２４，２３，４４，４６ピンチ弁
２６ヒータ
３２液溜め
３４，４２ポンプ
３６インキュベータ
４８、５０バッグ
５２画像取得手段
５４揺動手段

Claims

インキュベータ内に設置され気密に形成された細胞の培養器と、培地が貯留された培地容器と、洗浄液が貯留された洗浄液容器と、骨髄液が貯留された骨髄液容器と、前記培養器に気密に接続された送液管を介して前記培地容器と前記洗浄液容器と前記骨髄液容器の液を選択的に前記培養器に注入する送液手段と、前記培養器内の液を排液管を介して排出する排液手段と、前記送液手段と前記排液手段を予め定められた培養プロトコールに従って制御する制御手段とを備えてなり、
前記制御手段は、前記送液手段を制御して前記培地を前記培養器に注入した後に前記骨髄液を前記培養器に注入して設定時間静置させる初期操作と、
該初期操作の後に前記排液手段と前記送液手段を制御して、前記培養器内を前記培地又は前記洗浄液によって洗浄して前記培養器に接着する幹細胞を選択的に分離する分離操作と、
該分離操作後に前記培養器に前記培地を注入して前記幹細胞を培養する培養操作を含んでなる自動培養装置。
インキュベータ内に設置され気密に形成された細胞の培養器と、タンパク質分解酵素を失活させる成分が含まれた第１の培地が貯留された第１の培地容器と、該第1の培地とは異なる第２の培地が貯留された第２の培地容器と、タンパク質分解酵素が貯留されたタンパク質分解酵素容器と、洗浄液が貯留された洗浄液容器と、骨髄液が貯留された骨髄液容器と、前記培養器に気密に接続された送液管を介して前記第１の培地容器と前記第２の培地容器と前記タンパク質分解酵素容器と前記洗浄液容器と前記骨髄液容器の液を選択的に前記培養器に注入する送液手段と、前記培養器内の液を排液管を介して排液タンク又は細胞回収タンクに選択的に排出する排液手段と、前記送液手段と前記排液手段を予め定められた培養プロトコールに従って制御する制御手段とを備えてなり、
前記制御手段は、前記送液手段を制御して前記第１の培地を前記培養器に注入した後に前記骨髄液を前記培養器に注入して設定時間静置させる初期操作と、
該初期操作の後に前記排液手段と前記送液手段を制御して、前記培養器内を前記培地又は前記洗浄液によって洗浄して前記培養器に接着する幹細胞を選択的に分離する分離操作と、
該分離操作後に前記送液手段を制御して前記第１の培地を前記培養器に注入して前記幹細胞を培養する培養操作と、
該培養操作により前記幹細胞が十分に増殖したことを確認した後、前記送液手段を制御して前記第２の培地を前記培養器に注入して前記幹細胞を組織細胞に分化させる分化操作と、
該分化操作後に、前記送液手段を制御して前記タンパク質分解酵素を前記培養器に注入して前記幹細胞を浮遊させ、前記第１の培地を前記培養器に注入して浮遊した前記幹細胞を前記細胞回収タンクに排出する細胞回収操作を含んでなる自動培養装置。
請求項１又は２に記載の自動培養装置において、
前記制御手段は、前記培養操作において前記幹細胞の増殖が不十分であるとき、前記送液手段を制御して前記タンパク質分解酵素を前記培養器に注入して前記幹細胞を浮遊させて前記培養器内部を懸濁させる操作を含んでなることを特徴とする自動培養装置。
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の自動培養装置において、
さらに、前記培養器を揺らす揺動手段を備え、前記制御手段は、前記分離操作時に前記揺動手段を制御して前記培養器を揺らすことを特徴とする自動培養装置。