CN113862216B - 一种提纯试剂、以及提纯细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提纯试剂、以及提纯细胞的方法，所述所述提纯试剂包括甲基纤维素、胰蛋白酶和DMEM培养基，其中，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为0.8～1.2％和0.01～0.03％。本发明提供了一种提纯试剂，使用该提纯试剂对受污染的细胞进行提纯时，通过简单的清洗、提纯和筛选手段即可完成细胞提纯，并且在整个提纯过程中，无需添加额外的抗生素，也无需繁琐的离心清洗，过程简单，工作量小，可以有效地保证细胞的生理生化状态不会受到各种抗生素的影响，提高了提纯的除菌效率，可以短时间内有效地根除细胞污染，挽救所要的种子细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种提纯试剂、以及提纯细胞的方法。
背景技术
细胞是构成高等生物体的基本单位。细胞培养是生命发育研究，生物医药开发和医学组织工程的最重要基础技术。细胞污染是细胞培养中常见的问题，污染的种类包括细菌污染、真菌污染、霉菌污染、支原体污染、病毒污染和异种细胞的交叉污染。细胞培养过程最常见的是发生细菌、真菌和霉菌污染，发生污染后，污染菌快速大量增殖，竞争消耗养分并产生代谢废物使培养基变浑浊，同时，污染菌还会释放对细胞有害的竞争性毒素，使细胞代谢紊乱，逐渐萎缩脱壁，最终完全死亡。
细胞培养中解决污染问题的关键是预防，即强调无菌操作和保证所有用于细胞培养的试剂耗材均是无菌状态。但是细胞在保存和运输的过程中以及操作人员的日常操作和细胞复苏过程中，是无法绝对保证杜绝污染的发生。因此，发生污染后，细胞的状态会变差，在有细胞备份的情况下，通常会将所污染的细胞添加消毒剂(如84)密封抛弃处理，同时判断污染源并将操作空间消毒后重新启用冻存的相同细胞株，这样会使研究过程加长，减慢研究进程。在更通常情况下，有时所获得的细胞株极其珍贵，所费颇高，甚至是远渡重洋而来的细胞株，常常只有一支而无备份，所以一旦在复苏或者初期培养扩增时发生污染后将是十分严重的经济问题。
因此，通常在不能抛弃处理时，会采用连续的清洗离心，利用细胞与污染物的密度差异通过反复清洗结合蔗糖梯度离心来提纯拯救细胞，然后在之后的培养过程中添加大剂量的抗生素如青/链霉素混合物、两性菌霉素、放线菌素D来抑制污染菌的生长。但是，这些方法非常耗费时间、人力和物力成本，最后并无法根除污染，只是一时的减少污染菌并依赖抗生素抑制其生长。重要的是，长期使用抗生素，不仅对培养细胞有毒性，降低细胞的分化和分泌功能，而且更容易导致耐药菌的出现并导致支原体污染，最终导致细胞污染难以收拾，浪费了很多的精力与物力，造成不可挽回的损失。另外，在细胞的原代培养中，受环境条件和样本来源所限，例如在野外环境，养殖场和珍贵野生动物栖息地等，原代细胞取材难度大，所取得的原代细胞样本不可避免的会被一些细菌如大肠杆菌，或是支原体等污染，所以找到一种去除污染菌，保留目的细胞/种子细胞，发展不依赖抗生素来减少对细胞损害的提纯细胞方法是迫切亟需解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种提纯试剂、以及提纯细胞的方法，旨在解决现有细胞提纯时添加有抗生素、操作步骤复杂且提纯效率低的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种提纯试剂，所述提纯试剂包括甲基纤维素、胰蛋白酶和DMEM培养基，其中，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为0.8～1.2％和0.01～0.03％。
可选地，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为1％和0.02％。
进一步地，本发明还提出一种如上所述的提纯试剂在提纯受污染细胞、简化细胞原代培养和/或单细胞克隆中的应用。
更进一步地，本发明还提出一种提纯细胞的方法，包括以下步骤：
步骤S10、对受污染物污染的细胞培养物进行清洗，得清洗后的细胞培养物；
步骤S20、使用提纯试剂对所述清洗后的细胞培养物中的细胞进行提纯，得目的细胞；
步骤S30、对所述目的细胞进行培养筛选，得提纯细胞；
其中，步骤S20中的所述提纯试剂为如上所述的提纯试剂。
可选地，步骤S10中：
所述细胞培养物中的细胞为贴壁培养的动物细胞。
可选地，步骤S10中：
所述污染物包括细菌、真菌、霉菌、衣原体、病毒和异种细胞中的任意一种。
可选地，步骤S10包括：
每间隔3h使用1×PBS对受污染物污染的细胞培养物进行清洗，每次清洗进行3轮，每轮摇晃培养皿3～5s，清洗至所述细胞培养物中漂浮的污染菌被去除，然后更换新鲜培养基进行培养，培养至细胞融合度为40～60％时，得清洗后的细胞培养物。
可选地，步骤S20包括：
通过镜检标记出所述清洗后的细胞培养物中状态良好的细胞作为待提纯的目的细胞，然后将将培养基替换成为提纯试剂，并在37℃、5％CO2、90％湿度的环境下静置至贴壁细胞在所述提纯试剂中收缩成为球形，再将标记的所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中分离出来，得目的细胞。
可选地，将标记的所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中分离出来的步骤，包括：
使用体式显微镜和移液枪将所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中吸出，转移至新的孔板中；
其中，所述移液枪的量程为1～2μL。
可选地，步骤S30包括：
将所述目的细胞置于37℃、5％CO2、90％湿度的环境下培养7～14天，得提纯细胞；其中，培养过程中每隔2天进行镜检，每隔2天更换新鲜培养基。
本发明提供了一种提纯试剂，所述提纯试剂包括甲基纤维素Methylcellulose、胰蛋白酶Trypsin和DMEM培养基，为粘稠半固体，具有高粘性，流动性差，在37℃条件下呈半固体状态，使用该提纯试剂对受污染的细胞进行提纯时，通过简单的清洗、提纯和筛选手段即可完成细胞提纯，并且在整个提纯过程中，无需添加额外的抗生素，也无需繁琐的离心清洗，过程简单，工作量小，可以有效地保证细胞的生理生化状态不会受到各种抗生素的影响，提高了提纯的除菌效率，可以短时间内有效地根除细胞污染，挽救所要的种子细胞，尤其适合于拯救受污染的珍贵细胞系，另外还可以应用于简化稀缺来源的动植物细胞的原代培养及单细胞克隆过程，具有极大的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的提纯细胞的方法的一实施例的流程示意图；
图2为实施例1中冻存的人胃腺癌细胞BGC-823的细胞形态图；
图3为实施例1中人胃腺癌细胞BGC-823受污染的形态图；
图4为实施例1中人胃腺癌细胞BGC-823大量死亡的形态图；
图5为实施例1中人胃腺癌细胞BGC-823筛选培养3天后的细胞形态图；
图6为实施例1中人胃腺癌细胞BGC-823筛选培养7天后的细胞形态图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通常而言，受污染的细胞在不能抛弃处理时，会采用连续的清洗离心，利用细胞与污染物的密度差异通过反复清中添加大剂量的抗生素洗结合蔗糖梯度离心来提纯拯救细胞，然后在之后的培养过程如青/链霉素混合物、两性菌霉素、放线菌素D来抑制污染菌的生长。但是，这些方法非常耗费时间、人力和物力成本，最后并无法根除污染，只是一时的减少污染菌并依赖抗生素抑制其生长。重要的是，长期使用抗生素，不仅对培养细胞有毒性，降低细胞的分化和分泌功能，而且更容易导致耐药菌的出现并导致支原体污染，最终导致细胞污染难以收拾，浪费了很多的精力与物力，造成不可挽回的损失。另外，在细胞的原代培养中，受环境条件和样本来源所限，例如在野外环境，养殖场和珍贵野生动物栖息地等，原代细胞取材难度大，所取得的原代细胞样本不可避免的会被一些细菌如大肠杆菌，或是支原体等污染，所以找到一种去除污染菌，保留目的细胞/种子细胞，发展不依赖抗生素来减少对细胞损害的提纯细胞方法是迫切亟需解决的问题。
为解决现有细胞提纯时添加有抗生素、操作步骤复杂的问题，本发明经过长期实践检验，创新的提出一种全新的提纯试剂，通过降低培养基流动性来避免提取细胞时的交叉污染，从而提高提纯的除菌效率，降低工作量。具体地，在本发明提供的提纯试剂的实施例中，所述提纯试剂包括甲基纤维素(Methylcellulose)、胰蛋白酶(Trypsin)和DMEM培养基，其中，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为0.8～1.2％和0.01～0.03％。
本发明提供的提纯试剂包括甲基纤维素、胰蛋白酶和DMEM培养基，所述提纯试剂为粘稠半固体，具有高粘性，流动性差，在37℃条件下呈半固体状态，使用该提纯试剂对受污染的细胞进行提纯时，通过简单的清洗、提纯和筛选手段即可完成细胞提纯，并且在整个提纯过程中，无需添加额外的抗生素，也无需繁琐的离心清洗，过程简单，工作量小，可以有效地保证细胞的生理生化状态不会受到各种抗生素的影响，提高了提纯的除菌效率，可以短时间内有效地根除细胞污染，挽救所要的种子细胞，尤其适合于拯救受污染的珍贵细胞系，另外还可以应用于简化稀缺来源的动植物细胞的原代培养及单细胞克隆过程，具有极大的应用价值。
作为本发明提供的提纯试剂的一优选实施例，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为1％和0.02％。
进一步地，基于本发明上述提供的提纯试剂，本发明还提出一种如上所述的提纯试剂在提纯受污染细胞、简化细胞原代培养和/或单细胞克隆中的应用。本发明提供的提纯试剂可以短时间内有效根除细胞污染，进行细胞提纯，且整个提纯过程无需添加抗生素，可有效保证细胞的生理生化状态不会受到抗生素的影响，特别适用于提取受污染细胞，尤其是适合拯救受污染的珍贵细胞系，而且还可以应用于简化稀缺来源的动植物细胞的原代培养及后续的单细胞克隆过程，具有极大的应用价值和推广意义。
更进一步地，基于本发明上述提供的提纯试剂，本发明还提出一种提纯细胞的方法，图1所示为本发明提供的提纯细胞的方法的一实施例。参阅图1所示，在本实施例中，所述提纯细胞的方法包括以下步骤：
步骤S10、对受污染物污染的细胞培养物进行清洗，得清洗后的细胞培养物；
在本发明提供的一些实施例中，所述提纯细胞的方法可以适用于对贴壁培养的动物细胞进行提纯，也即，所述细胞培养物中的细胞为贴壁培养的动物细胞。另外，本发明提供的提纯细胞的方法克适用于受细菌、真菌、霉菌、衣原体或一种细胞污染的动物细胞的提纯，也即，所述污染物包括细菌、真菌、霉菌、衣原体、病毒和异种细胞中的任意一种。进一步地，本发明提供的提纯细胞的方法尤其适用于受细菌、真菌或霉菌污染的动物细胞的提纯，也即，所述污染物更优选为细菌、真菌或霉菌，可以在段时间内根除污染，有效地提纯目的细胞并且保证细胞的生理活性。
步骤S10中的清洗具体是指在细胞培养中发现有污染后，污染菌的增殖速度要远大于所培养细胞，此时需要保证细胞的生长而抑制污染菌的生长，本发明根据大多数污染菌悬浮生长而目的细胞贴壁生长的特点，采用间隔性清洗的方式来抑制污染菌的繁殖，并同时维持受污染细胞的增殖。具体地，在本发明提供的实施例中，步骤S10包括：每间隔3h使用1×PBS(即1×PBS缓冲液)对受污染物污染的细胞培养物进行清洗，每次清洗进行3轮，每轮摇晃培养皿3～5s，清洗至所述细胞培养物中漂浮的污染菌被去除，然后更换新鲜培养基进行培养，培养至细胞融合度为40～60％时，得清洗后的细胞培养物，用于后续的提纯步骤。在此过程中，冻存或舍弃大部分细胞，仅保留最小量的受污染细胞用于提纯。另外，步骤S10中所使用的1×PBS和新鲜培养基在使用前均提前进行预热或平衡处理，以达到适合于培养细胞的最佳条件。
步骤S20、使用本发明上述提供的提纯试剂对所述清洗后的细胞培养物中的细胞进行提纯，得目的细胞；
步骤S20主要是在受污染细胞经过步骤S10处理至40～60％的细胞融合度时，利用本发明上述提供的特制的提纯试剂对其中的目的细胞进行提取，从而有效地提纯目的细胞，除去污染。具体地，在本发明的实施例中，步骤S20包括：通过镜检标记出所述清洗后的细胞培养物中状态良好的细胞作为待提纯的目的细胞，然后将将培养基替换成为提纯试剂，并在37℃、5％CO2、90％湿度的环境下静置至贴壁细胞在所述提纯试剂中收缩成为球形，再将标记的所述待提纯的目的细胞通过手工挑选的方式，从所述提纯试剂中分离出来，得目的细胞。
在获得40～60％细胞融合度的细胞培养物后，首先使用1×PBS将所述清洗后的细胞培养物清洗5次，再加入正常培养基一半用量的新鲜培养基，进行镜检，标记出状态良好的细胞(呈现白色球状，折光性高)作为待提纯的目的细胞，所标记的细胞需要在10倍镜下周边无漂浮的污染菌；然后，将培养基替换成为提纯试剂，并在37℃、5％CO2、90％湿度的环境下静置，在此过程中，由于所述提纯试剂为粘稠半固体，具有高粘滞性，流动性差，在37℃下呈现半固体状态，通常的移动细胞培养皿时并不会使脱壁，而使用本发明提供的所述提纯试剂由于其中添加了胰蛋白酶，使得细胞收缩趋向脱壁，可以使用移液枪移取等简单的方式分离出来，极大地提高了提纯效率，降低了工程量，同时还可以避免提纯细胞的交叉污染。
当静置3min至贴壁细胞在所述提纯试剂中收缩成为球形，然后在洁净环境中利用体式显微镜和移液枪将所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中吸出，转移至新的孔板(具体为24孔板)中。在吸取细胞的过程中，在体式显微镜条件下，当标记好的待提纯目的细胞位于视野中央时，视野中不能出现任何明显残留的污染菌。进一步地，所述移液枪的量程优选为1～2μL，如此，可以保证吸入所挑选的目的细胞而不会吸取镜检视野以外过多的提纯试剂。通常挑取8个左右的种子细胞作为克隆，每个克隆中大概含有1～8个细胞，将所挑选的细胞移入24孔板中，每孔中含有1mL的新鲜培养基，然后置于37℃、5％CO2、90％湿度的环境中培养。
步骤S30、对所述目的细胞进行培养筛选，得提纯细胞；
在分离出所述目的细胞后，通过进一步的培养筛选，杜绝污染的复发并扩增目的细胞，使其恢复至无菌状态。具体地，在本发明的实施例中，步骤S30包括：将所述目的细胞置于37℃、5％CO2、90％湿度的环境下培养7～14天，在培养过程中每隔2天进行镜检，每隔2天更换新鲜培养基，观察是否有污染菌残留或复发，在此过程中，每2个克隆为一组，分别置于24孔板的孔中，每孔添加300μL培养基，使其不易发生交叉污染，若有残留的污染菌，将其液体吸走，加入500μL的1N的NaOH溶液封闭，物残留污染菌的即为提纯细胞。待所述提纯细胞长成大克隆，可以将数个孔中的细胞集合传代至6孔板中扩增，镜检观察3～5天，若无污染复发，可以进一步培养至更大面积的培养瓶或培养皿中扩增后冻存。
本发明提供的提纯细胞的方法的特点在于，通过间隔清洗抑制污染菌增殖，同时保证目的细胞的生长，待细胞生长到40～60％融合度，通过清洗后加入提取试剂使细胞脱壁，利用提纯试剂的高粘性半流体半固体性质降低提取细胞时的交叉污染，通过手工挑取细胞克隆，在体式显微镜下利用移液枪吸取少量的种子细胞移植到新的培养皿中用于筛选，特别是利用1～2μL的小量程移液枪，保证只吸取种子细胞而不会吸取视野外的可能含有污染菌的培养基和提纯试剂。通过1-2周的培养筛选过程，保证根除污染菌而确保不会复发污染，使目的细胞得以有效的被拯救和持续扩增，在此过程中，无须添加任何抗生素，不会对受污染的细胞造成二次化学伤害，所使用的设备均是实验室常备的消耗品，整个过程简单有效，无需离心清洗，可以有效地根除各种细胞污染，拯救重要和珍贵的细胞系，并可以间接的简化稀缺动植物来源的细胞原代培养及单细胞克隆过程，具有重大的应用价值和推广意义。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1提纯受细菌污染的人胃腺癌细胞(BGC-823)
在接到冻存细胞(如图1所示)后的培养初期发生细菌污染，表现为在复苏培养时，培养基中出现不明团块(如图3中白色箭头所示)，DAPI染色显阳性，第二天导致细胞大量死亡(如图4所示)，因此，利用本发明提供的提纯细胞的方法，对仅有的两只冻存细胞进行提纯挽救，方法如下：
(1)将BGC-823细胞按常规解冻方法复苏培养在6孔板中，每孔2mL培养基，培养基中添加1×双抗；复苏培养3h后，缓慢移除2mL培养基，加入2mL新鲜培养基和2mL 1×PBS，摇晃培养皿3～5s；继续培养3h后，缓慢移除培养基和PBS，加入2mL新鲜培养基和2mL 1×PBS，摇晃培养皿3～5s；继续培养3h后，缓慢移除培养基和PBS，加入2mL新鲜培养基和2mL 1×PBS，摇晃培养皿3～5s；3轮PBS清洗为一次清洗过程，清洗至培养基中所漂浮的大部分污染菌被去除，然后更换新鲜的培养基继续培养至40～60％细胞融合度。
(2)使用1×PBS清洗步骤(1)获得的细胞培养物5次，然后添加正常培养基量一半的新鲜培养基，进行镜检并标记状态良好的细胞(呈现白色球状，折光性高)，在10倍镜下所标记的细胞周边没有漂浮粘连的细菌；然后将培养基更换为提纯试剂(添加2mL，提纯试剂包括Methylcellulose、Trypsin和DMEM培养基，且Methylcellulose、Trypsin的质量百分比分别为1％和0.02％)，置于37℃、5％CO2、90％环境湿度的条件下静置3min，待贴壁细胞在提纯试剂中收缩成为球形，然后在10倍镜下，用量程为1～2μL的移液枪将所标记的单个细胞吸走，重复操作24次，并将每次吸走的细胞逐次置于24孔板的每个培养孔中，每个培养孔内含1mL新鲜培养基。
(3)将装有标记细胞的24孔板置于37℃、5％CO2、90％环境湿度的条件下进行筛选培养，24h后进行镜检，使用1N的NaOH溶液封闭含有细菌污染的培养孔，其余不含有细菌污染的培养孔中的细胞继续培养，继续培养的过程中，每2天进行一次镜检，观察污染是否复发(如污染复发，则使用1N的NaOH溶液封闭含有细菌污染的培养孔，其余不含有细菌污染的培养孔中的细胞继续培养)，每2天更换一次培养基，连续培养7～14天。
提纯后2天(也即筛选培养3天后)形成的人胃腺癌细胞BGC-823呈现小克隆形态，如图5所示；继续生长4天后(也即筛选培养7天后)，被挽救的人胃腺癌细胞BGC-823扩增到70％融合度，并恢复至正常的细胞形态，如图6所示。说明采用本发明提供的提纯试剂和提纯方法对受细菌污染的人胃腺癌细胞BGC-823进行提纯，可以有效实现细胞的提纯，且提纯后的细胞经过培养可恢复至正常细胞形态。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种提纯细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、每间隔3h使用1×PBS对受污染物污染的细胞培养物进行清洗，每次清洗进行3轮，每轮摇晃培养皿3~5s，清洗至所述细胞培养物中漂浮的污染菌被去除，然后更换新鲜培养基进行培养，培养至细胞融合度为40~60%时，得清洗后的细胞培养物；
步骤S20、通过镜检标记出所述清洗后的细胞培养物中状态良好的细胞作为待提纯的目的细胞，然后将培养基替换成为提纯试剂，并在37℃、5%CO2、90%湿度的环境下静置至贴壁细胞在所述提纯试剂中收缩成为球形，再将标记的所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中分离出来，得目的细胞；
步骤S30、对所述目的细胞进行培养筛选，得提纯细胞；
其中：
步骤S20中，所述提纯试剂包括甲基纤维素、胰蛋白酶和DMEM培养基，其中，所述甲基纤维素、胰蛋白酶在所述提纯试剂中的质量百分比为1%和0.02%；
步骤S10中，所述细胞培养物中的细胞为贴壁培养的动物细胞，所述污染物包括细菌、真菌、霉菌、衣原体、病毒和异种细胞中的任意一种。
2.如权利要求1所述的提纯细胞的方法，其特征在于，将标记的所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中分离出来的步骤，包括：
使用体式显微镜和移液枪将所述待提纯的目的细胞从所述提纯试剂中吸出，转移至新的孔板中；
其中，所述移液枪的量程为1~2μL。
3.如权利要求1所述的提纯细胞的方法，其特征在于，步骤S30包括：
将所述目的细胞置于37℃、5%CO2、90%湿度的环境下培养7~14天，得提纯细胞；其中，培养过程中每隔2天进行镜检，每隔2天更换新鲜培养基。
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