KR100988017B1

KR100988017B1 - 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법 및 세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법

Info

Publication number: KR100988017B1
Application number: KR1020090121103A
Authority: KR
Inventors: 한재진
Original assignee: 주식회사셀세이프
Priority date: 2009-12-08
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2010-10-18
Also published as: WO2011071259A3; WO2011071259A2; US8809034B2; US20120244614A1; JP2013512686A; JP5819845B2; US20140093955A1; US8815565B2

Abstract

본 발명은 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주, 바람직하게는 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물을 사용하여 세포를 배양함으로써 마이코플라즈마 오염 가능성을 방지할 수 있는 세포의 배양방법; 및 상기 암피디놀 유도체를 사용하여 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양함으로써 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법을 제공한다.

마이코플라즈마 오염, 세포배양, 암피디놀

Description

마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법 및 세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법{Method for culturing mycoplasma contamination free cells and method for eliminating mycoplasma contamination of cells}

본 발명은 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법 및 세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물을 사용하여 세포를 배양함으로써 마이코플라즈마 오염 가능성을 방지할 수 있는 세포의 배양방법; 및 상기 추출물 또는 분획물을 사용하여 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양함으로써 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법에 관한 것이다.

마이코플라즈마(mycoplasma)는 몰리컷드(Mollicutes)에 속하는 세포벽이 없는 박테리아의 일종으로, 크기가 약 0.2-0.8μm로서 0.2μm의 필터를 통과할 수 있다. 현재까지 마이코플라즈마는 6개속의 120 여종이 알려져 있으며, 사람, 가축의 동물은 물론 대추나무, 밤나무, 복숭아나무 등 나무류와 딸기, 배추, 무등 채소류 에도 감염하여 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 마이코플라즈마가 인체의 폐세포내 BMP2 라는 중요한 성장인자 합성을 야기하여 정상 폐 세포에 종양이 발병하게 하는 세포로 전환시킬 수 있음이 보고된 바 있다. 또한 돼지에 폐렴을 일으키며 소와 양에도 감염을 일으킨다. 식물에서는 배추, 무, 딸기에 짖무름병을 야기하며 대추나무, 밤나무, 복숭아나무등에 빗자루병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

마이코플라즈마는 배양 중인 세포에서 많이 오염되는데 특히 세포배양을 자주하는 제약회사 및 병원, 대학연구실에서는 마이코플라즈마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라즈마 퍼멘탄스(Mycoplasma fementans), 마이코플라즈마 오라레(Mycoplasma orale), 마이코플라즈마 알지니니이(Mycoplasma argininii), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 아콜레플라즈마 라이드라위(Acholeplasma laidlawi) 등의 마이코플라즈마가 주로 세포 배양시 세포를 감염시켜 세포 오염을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 마이코플라즈마는 세포주의 원 생명체에 감염된 후 세포주 수립시 오염되며, 혈청 그리고 실험실내에서 부주의에 의하여 세포주간에 오염되어 실험실 전체로 퍼지게 된다.

미국의 경우 약 15%에 이르는 세포주들이 상기 마이코플라즈마의 한종 또는 그 이상의 마이코플라즈마로 오염되어 있는 것으로 보고되고 있다. 이렇게 오염이 증가하는 이유는 마이코플라즈마가 다른 감염원 즉 세포벽이 있는 박테리아나 곰팡이와 같이 배지의 혼탁도가 증가하거나 혹은 바이러스와 같이 세포의 사멸 등과 같은 가시적인 변화가 없으므로 실험자가 그 오염을 인지하지 못하고 오염을 확대시 키기 때문이다. 더욱이, 마이코플라즈마는 세포벽이 없기 때문에, 세포배양에 주로 사용하는 페니실린 및 다른 베타-락탐계 항생제가 마이코플라즈마에 영향을 미치지 못하는 것 또한 주요 원인 중 하나로 지적되고 있다.

한편, 세포배양에 있어서 마이코플라즈마의 오염은 가시적 변화는 거의 없으나 세포배양에 많은 영향을 미치는데, 가장 대표적인 현상은 감염된 세포주의 물질대사를 변화시켜 세포주의 비정상적인 사이토카인 발현을 유도하는 것이다. 이러한 이유로, 수 많은 실험들과 연구가 마이코플라즈마의 오염으로 인하여 비정상적인 결과를 초래하고 있다. 또한 마이코플라즈마는 세포의 형태도 변화시킬 수 있으며, 이와 함께 DNA, RNA 합성에 필요한 대사물을 소모하여 핵산 대사에 영향을 미친다. 이러한 영향은 세포막 외부의 수용체나 막 단백질의 조성을 변화시켜, 세포의 면역성이나 신호전달체계를 교란시키게 되며 세포성장속도가 변하여 성장실험이나 세포독성 실험시 실험결과에 영향을 미치게 된다. 또한, 핵산대사 및 물질대사에 영향을 주기 때문에 세포주를 이용한 바이러스 생산이 감소되게 된다. 특히 단일클론항체의 생산시 하이브리도마 세포의 융합 성공률이 떨어질 뿐만 아니라, 항체 생산도 크게 저하되어 실험에 실패하는 경우가 자주 발생하고 있다. 이러한 현상은 백신을 비롯한 생물학적 제제의 생산과정에 매우 치명적인 실패를 가져올 수 있어서, 마이코플라즈의 오염은 경제적으로도 심각한 문제를 야기하고 있다.

상기와 같이, 세포배양시 수반되는 심각한 마이코플라즈마 오염에 따른 문제에도 불구하고, 만족할만한 수준의 마이코플라즈마 오염 제거 방법은 아직까지 보고되지 않고 있다. 종래에는, 주로 테트라사이클린과 퀴롤론계 항생제를 사용하여 마이코플라즈마 오염을 제거하려고 시도하고 있으나, 이러한 항생제의 처리는 마이코플라즈마의 오염을 100% 제거할 수 없으며, 처리를 위한 시간이 장기간을 요하므로 그 효율성이 떨어지고, 또한 내성을 유발하는 문제가 있다. 또한, 테트라사이클린과 퀴롤론계 항생제 사용 이외에 리포펩타이드류(lipo-peptides)를 사용하는 방법이 보고된 바 있으나, 사용되는 농도에서 마이코프라즈마의 오염을 완전히 제거하지는 못할 뿐만 아니라, 완전한 제거를 위해 높은 농도를 사용할 경우는 세포에 독성을 나타내므로 그 사용에는 한계가 있다.

본 발명자는 세포배양시 수반되는 마이코플라즈마 오염을 근본적으로 차단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도 적조를 유발하는 조류로 알려져 있는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물이 마이코플라즈마에 선택적으로 작용함으로써 사멸을 유도한다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자는 상기 추출물 또는 분획물이 세포배양시 마이코플라스마 감염(즉, 세포의 마이코플라스마 오염)을 차단할 뿐만 아니라, 마이코플라스마로 오염된 세포에서 마이코플라스마의 오염을 제거함으로써 정상적인 세포를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 추출물 또는 분획물을 사용하여 세포를 배양함으로써 마이코플라즈마 오염 가능성을 방지할 수 있는 세포의 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물 또는 분획물을 사용하여 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양함으로써 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주, 바람직하게는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 또는 암피디움 카르테 레(Amphididinium carterae)를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물을 포함하는 배지 중에서 세포를 배양하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주, 바람직하게는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 또는 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물을 포함하는 배지 중에서 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법이 제공된다.

본 발명에 의해, 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물이 마이코플라즈마에 선택적으로 작용함으로써 사멸을 유도한다는 것을 밝혀졌다. 특히, 상기 추출물 또는 분획물은 세포배양시 세포의 마이코플라스마 오염을 차단할 뿐만 아니라, 마이코플라스마로 오염된 세포에서 마이코플라스마의 오염을 제거함으로써 정상적인 세포를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 배양방법은 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포를 안정적으로 배양할 수 있도록 하며, 또한 본 발명에 따른 오염 제거방법은 마이코플라스마로 오염된 세포로부터 정상적인 세포를 얻는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주"라 함은 암피디놀(amphidinols, AM)로 알려져 있는 폴리엔-폴리히드록시(polyene-polyhydroxy) 화합물들을 생산할 수 있는 균주를 의미한다. 상기 암피디놀은 현재까지 AM1 내지 AM15의 약 15종이 알려져 있으나, 이들을 모핵으로 하는 다양한 유사체(analogues)도 상기 암피디놀에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 암피디놀을 생산하는 균주로서 현재까지 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 및 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)의 2종만이 알려져 있으나, 이들의 활성(즉, 암피디놀 생성능)을 갖는 모든 재조합 균주 및 변이주가 상기 암피디놀 생성능을 갖는 균주에 포함되는 것으로 이해되어야 하며, 또한 상기 암피디놀의 유사체(analogues)를 생성하는 균주, 그의 재조합균주 및 변이주도 상기 암피디놀 생성능을 갖는 균주에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주, 바람직하게는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 또는 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물을 포함하는 배지 중에서 세포를 배양하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법을 제공한다.

상기 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주는 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 균주로서, 적조를 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 균주의 배양, 균체의 추출 분, 및 분획(fractionizing)은 공지의 방법, 예를 들어 Gopal K. Paul et al., J. Mar. Biotechnology (1997) 5: 124-128; Toshihiro Houdai et al., Tetrahedron 57 (2001) 5551-5555; 또는 Reiko Echigoya et al., Harmful algae 4 (2005) 383-389에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.

예를 들어, 상기 균주의 배양은 암피디니움 클렙시(Amphididinium klebsii) 등의 균주를 바다물을 포함하는 배양기 중에서 빛을 공급하면서 배양함으로써 수행할 수 있으며, 글라스 필터로 여과함으로써 균체(biomass)를 수확할 수 있다.

또한 균체의 추출은 얻어진 균체로부터 C₁∼C₄ 알콜(바람직하게는 메탄올) 및 아세톤 / 물 및 에틸 아세테이트 / n-부탄올을 순차적으로 사용하여 추출함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로는, 상기 추출물은 (a) 상기 균체를 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤으로 추출하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 추출물에 물 및 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 수층에 n-부탄올을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-부탄올층을 분리하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 단계(a)에서, 상기 추출은 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤의 혼합용매를 사용하여 수행하거나, 혹은 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤을 상기 균체에 순차적으로 가하여 추출하여 얻어진 추출물들을 혼합함으로써 수행할 수도 있다. 상기 C₁∼C₄ 알콜, 아세톤의 사용량은 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 균체 중량당 10 내지 300 배 ml/g의 비율로 사용될 수 있다. 단계(b)에서 물과 에 틸 아세테이트의 중량비는 1 : 2∼5의 범위일 수 있으며, 그 사용량은 단계(a)에서 얻어진 추출액 중량당 10 내지 50 배 ml/g의 범위일 수 있다. 단계(c)에서 n-부탄올로 추출하여 얻어진 n-부탄올층은 감압건조 등의 통상의 건조방법에 의해 건조함으로써, 분말 형태의 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 분획(fractionizing)도 상기한 바와 같이 Gopal K. Paul et al., J. Mar. Biotechnology (1997) 5: 124-128; Toshihiro Houdai et al., Tetrahedron 57 (2001) 5551-5555; 또는 Reiko Echigoya et al., Harmful algae 4 (2005) 383-389에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 n-부탄올 추출물에 대하여 50% 메탄올을 사용한 HW-40(Toyopearl, Tosoh) 컬럼크로마토그래피, 100% 메탄올을 사용한 세파덱스 LH-20(Pharmacia-LKB) 컬럼크로마토그래피, 및 0-50% 아세토니트릴을 사용한 ODS(YMC, ODS-AQ) 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 수행하고, 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 HPLC을 수행함으로써, 분획물 즉, 다음과 같은 암피디놀(amphidinols, AM)로 알려져 있는 폴리엔-폴리히드록시(polyene-polyhydroxy) 화합물들(AM1 내지 AM15)을 얻을 수 있다.

상기 분획물 중, 특히 암피디놀 1(amphidinol 1, AM1), 암피디놀 2(amphidinol 2, AM2), 암피디놀 3(amphidinol 3, AM3), 암피디놀 4(amphidinol 4, AM4), 암피디놀 5(amphidinol 5, AM5), 암피디놀 6(amphidinol 6, AM6), 암피디놀 7(amphidinol 7, AM7), 및 암피디놀 9(amphidinol 9, AM9)의 화합물, 특히 암피디놀 3가 마이코플라즈마에 선택적으로 작용함으로써 사멸을 유도하는 활성이 우수하다는 것이 밝혀졌다. AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6, AM7, 및 AM9의 화학구조는 다음 화학식 1 내지 8과 같다.

본 발명의 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법에 있어서, 상기 세포는 마이코플라즈마 오염 가능성이 있는 것으로 알려진 모든 세포를 포함하며, 예를 들어 NIH3T3 세포주, HepG2 세포주, Raw 264.7 세포주 등을 열거할 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다. 상기 배지 또한 배양되는 세포에 적합한 것으로 알려져 있는 배지를 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법에 있어서, 배지 중의 상기 추출물 또는 분획물의 농도는 0.1 nM ∼ 100 uM 일 수 있으며, 바람직하게는 1 nM ∼ 1 uM, 더욱 바람직하게는 5 nM ∼ 100 nM일 수 있다.

또한, 상기 배지는 상기 추출물 또는 분획물에 추가하여, 마이코플라즈마 억제 활성이 있는 것으로 알려져 있는 항생제 혹은 리포펩타이드를 포함할 수 있으며, 예를 들어 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 독시사이클린(Doxycyclin), 리팜피신(Rifampicin), 크로람페니콜(Chloramphenicol), 프라스모신(Plasmocin), 클린다마이신(Clindamycin), 아지스로마이신(Azithromycin), 클라리슬로마이신(Clarithromycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 티아물린(Tiamulin) 등의 항생제, 서팍틴(Surfactin), 아라메티신(Alamethicin), 세클로핀 에이, 피원(Cecropin A, P1), 글로보마이신(Globomycin), 그라미시딘 에스(Gramicidin S), 마게이닌 투(Magainin 2), 멜리틴(Mellitin), 폴리믹신 비(Polymixin B), 발리노마이신(Valinomycin) 등의 리포펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 배지는 배지 중에 서팍틴(surfactin) 1 ∼ 40 uM, 시프로플록사신(ciprofloxacin) 0.1 ∼ 100 ug/ml, 또는 리팜피신(rifamficin) 0.1 ∼ 100 ug/ml을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 추출물 또는 분획물을 포함하는 배지 중에서 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법에 있어서, 상기 마이코플라즈마로 오염된 세포는 마이코플라즈마로 오염된 모든 종류의 세포를 포함하며, 예를 들어 마이코플라즈마로 감염된 NIH3T3 세포주, HepG2 세포주, Raw 264.7 세포주 등을 열거할 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다. 상기 배지 또한 배양되는 오염 세포(즉, 마이코플라즈마로 감염된 세포)에 적합한 것으로 알려져 있는 배지를 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법에 있어서, 배지 중의 상기 추출물 또는 분획물의 농도는 0.1 nM ∼ 100 uM 일 수 있으며, 바람직하게는 1 nM ∼ 1 uM, 더욱 바람직하게는 5 nM ∼ 100 nM일 수 있다.

또한, 상기 배지는 화학식 1의 화합물에 추가하여, 마이코플라즈마 억제 활성이 있는 것으로 알려져 있는 항생제 혹은 리포프로틴을 포함할 수 있으며, 예를 들어 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 독시사이클린(Doxycyclin), 리팜피신(Rifampicin), 크로람페니콜(Chloramphenicol), 프라스모신(Plasmocin), 클린다마이신(Clindamycin), 아지스로마이신(Azithromycin), 클라리슬로마이신(Clarithromycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 티아물린(Tiamulin) 등의 항생제, 서팍틴(Surfactin), 아라메티신(Alamethicin), 세클로핀 에이, 피원(Cecropin A, P1), 글로보마이신(Globomycin), 그라미시딘 에스(Gramicidin S), 마게이닌 투(Magainin 2), 멜리틴(Mellitin), 폴리믹신 비(Polymixin B), 발리노마이신(Valinomycin) 등의 리포펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 배지는 배지 중에 서팍틴(surfactin) 1 ∼ 40 uM, 시프로플록사신(ciprofloxacin) 0.1 ∼ 100 ug/ml, 또는 리팜피신(rifamficin) 0.1 ∼ 100 ug/ml을 추가로 포함할 수 있다.

상기 마이코플라즈마로 오염된 세포의 배양 즉, 상기 마이코플라즈마로 오염된 세포에 대한 상기 추출물 또는 분획물의 처리는, 예를 들어 통상의 세포배양 시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있으며, 필요할 경우 상기 추출물 또는 분획물을 함유한 배지 중에서의 계대배양을 통하여 수행할 수 있다. 이렇게 배양된 세포는 더 이상 마이코플라즈마가 검출되지 않고 효과적으로 제거되게 되므로, 마이코플라즈마 감염이 없는 정상적인 세포를 얻는 것이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 암피디놀 유도체의 분리

Gopal K. Paul 등의 보고(Gopal K. Paul et al., J. Mar. Biotechnology (1997) 5: 124-128)에 따라, 암피디니움 클렙시(Amphididinium klebsii)로부터 암피디놀 유도체를 분리하였다. 구체적으로는, 암피디니움 클렙시(Amphididinium klebsii)를 바다물 2 리터를 포함하는 5리터-배양기 3대에서 24℃에서 16 룩스의 밝기로 빛을 공급하면서 4주 동안 배양한 후, 글라스 필터로 여과하여 조류 바이오매스(biomass)를 수확하였다. 상기 조류 바이오매스 25g에 메탄올 1 리터를 사용하여 각각 3회 추출하였다. 그후 아세톤 300 ml를 사용하여 추가로 3회 더 추출하였다. 이들 추출물을 혼합한 후, 증발기(rotary vacuum evaporator, Buchi R-205, Flawil, Switzerland)을 사용하여 휘발성 용액을 제거하고, 남은 비휘발성층에 물:에틸 아세테이트(1:4, v/v) 400 ml을 가한 다음, 수층을 분리하여 n-부탄올(n-butanol)로 추출하여 n-부탄올층을 분리하였다. 상기 n-부탄올층의 일부를 감압 건조하여 분말(이하, "부탄올 추출물"이라 칭함)을 얻었으며, 나머지는 하기 단계의 분획에 사용하였다.

상기 나머지의 n-부탄올층을 50% 메탄올을 사용하여 HW-40(Toyopearl, Tosoh) 컬럼과 100% 메탄올을 용매로 세파덱스 LH-20(Pharmacia-LKB) 컬럼, 및 0-50% 아세토니트릴(Acetonitrile)을 용매로 ODS(YMC, ODS-AQ) 컬럼을 사용하여 순차적으로 컬럼크로마토그라피를 수행하였다. 마지막으로 33% 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 HPLC을 수행하여 암피디놀 유도체(즉, AM1-AM15)를 분리하였다. Leo A. Paquette 방법(Org. Lett., 2005, 7 (14), pp 3111-3114)에 따라, DMSO-d₆를 용매로 하여 500MHz에서 ¹H-NMR 및 ¹H-¹H COSY를 측정하여, 얻어진 암피디놀 유도체의 분석하였다. 도 1 및 도 2는 암피디놀 3(즉, AM3)의 ¹H-NMR 차트 및 DQF-COSY 스펙트럼을 나타낸다.

실시예 2. 마이코플라즈마에 대한 암피디놀 유도체의 영향 평가

마이코플라즈마에 대한 실시예 1에서 얻어진 추출물 및 암피디놀 유도체의 영향을 평가하기 위하여, 마이코플라즈마 균주(Mycoplasma hyorhinis, ATCC17981)를 Hayflick의 방법(Hayflick, 1965, Tex. Rep. Bio. Med. 23, 285-303)에 따라 우태아혈청(fetal calf serum)과 효모추출물(yeast extract)로 보충된 PPLO(pleuropneumonia-like organism basal medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) 배지를 사용하여 배양하였다. 즉, 상기 배지 100 ul을 96 웰 플레이트에 넣고 시료(즉, 실시예 1에서 얻어진 추출물 및 암피디놀 유도체)를 1 mg/ml을 시작으로 하여 2배 희석으로 12 웰까지 희석하였다. 우태아혈청(fetal calf serum)과 효모추출물(yeast extract)가 보충된 PPLO(pleuropneumonia-like organism basal medium, Difco Laboratories,Detroit, USA) 배지 중에서, 37℃에서 48시간 성장한 마이코플라즈마 배양액과 배지를 1:10으로 희석하여 얻어진 100ul을 상기에서 준비한 96 웰 플레이트에 추가하여 200ul가 되게 하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후 40ul의 0.2mg/ml INT(p-iodonitrotetrazolium)을 첨가하고 4시간 더 배양하였다. 배양 후, 배지가 분홍색으로 변화하게 되면 마이코플라즈마의 대사가 활발하게 일어남을 의미하며, 시료에 의해 마이코플라즈마가 억제되면 분홍색으로 변환되는 것이 줄어들게 된다. 따라서 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 색깔변화가 없는 마지막 농도를 측정함으로써 얻었다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

시험물질	IC₅₀
DMSO	-
AM1	+++
AM2	+++
AM3	++++
AM4	+++
AM5	+++
AM6	+++
AM7	+++
AM9	+++
AM10	++
AM11	++
AM12	++
AM13	++
AM14	++
AM15	++
부탄올 추출물	+++

-: 저해활성 없음

++: 10∼100 ug/ml

+++: 1∼20 ug/ml

++++: 0.25 ug/ml ∼ 10 ug/ml

상기 표 1의 결과로부터, 암피디놀 유도체가 마이코플라즈마를 억제하는 활성이 있음을 알 수 있으며, 특히 AM3(화학식 1의 화합물)은 약 0.25 ug/ml의 낮는 농도에서 마이코플라즈마를 억제함을 알 수 있다.

실시예 3. 마이코플라즈마로 오염된 세포주로부터 마이코플라즈마의 제거

(1) 마이코플라즈마로 오염된 세포주의 수득

서울에 위치한 여러 대학교의 실험실로부터 실험실내에서 구축된 다양한 세포주를 얻었다. 얻어진 세포주를 DMEM(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지 중에서 3일간 배양한 후, 세포를 회수하여 마이코플라즈마 진단 키트(Promokine 사 독일, 셀세이프사 한국)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 PCR 을 수행하였으며, PCR 반응 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였다. 상기와 같이 확인 결과, 3 종의 세포주 즉, NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주가 마이코플라즈마에 감염된 것으로 확인되었다 (도 3 참조).

(2) 마이코플라즈마가 오염된 세포주로부터 마이코플라즈마의 제거

마이코플라즈마로 오염된 것으로 확인된 NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주 각각을 T-25 culture flask (NUNC, Cat. No. 156367)에 1X10⁵ 개의 농도로 접종한 뒤, 10% 이하의 혈청(GIBCO BRL, Cat. No. 10082-147)을 포함하는 DMEM(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지를 첨가하고, 20 ug/ml 암피디놀 3(AM3)를 첨가한 뒤, 3일간 배양한 후, 트립신-EDTA(Trysine-EDTA)로 처리하여 세포용액을 얻었다. 상기의 암피디놀 3(AM3)로 처리된 1X10⁵ 개의 세포를 다시 접종한 뒤 10% 이하의 혈청 (GIBCO BRL, Cat. No. 10082-147)을 포함하는 DMEM (GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지를 첨가하고 20u g/ml 암피디놀 3(AM3)를 첨가한 후 추가로 3일간 더 배양하였다. 마이코플라즈마 진단 키트(Promokine 사 독일, 셀세이프사 한국)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 PCR 을 수행하였으며, PCR 반응 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였다. 그 결과는 도 4와 같다. 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 암피디놀 3(AM3)를 처리한 경우, 모든 세포주에서 마이코플라즈마 오염이 완전히 제거되었다.

(3) 암피디놀 3(AM3)와 사이클릭 리포펩타이드/항생제와의 병용 처리

마이코플라즈마로 오염된 세포주로서 HepG2를 사용하고; 암피디놀 3(AM3)를 처리하는 것 대신 암피디놀 3(AM3) 5 ug/ml 및 10 ug/ml과 함께 서팍틴(surfactin)[10uM 또는 20uM], 시프로플록사신(ciprofloxacin)[1ug/ml 또는 5ug/ml], 혹은 리팜피신(rifamficin)[0.5ug/ml 또는 1ug/ml]을 처리한 것을 제외하고는 상기 (2)와 동일한 방법으로 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 서팍틴, 시프로플록사신, 리팜피신을 단독으로 처리한 경우에는 모두 마이코플라즈마 오염이 그대로 존재하고 있으나, 암피디놀 3(AM3)와 병용 처리한 경우에는 마이코플라즈마 오염이 완전히 제거되었다.

실시예 4. 세포배양시 마이코플라즈마 오염 예방 활성 평가

마이코플라즈마로 오염되지 않은 세포주 HepG2 세포주를 10% 이하의 혈청 (GIBCO BRL, Cat. No. 10082-147)을 함유하는 DMEM (GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지 중에 1X10⁵의 농도로 접종한 후, 암피디놀 3(AM3) 20 ug/ml 및 서팍틴 20 uM을 처리한 후, 마이코플라즈마 균주(Mycoplasma hyorhinis, ATCC 17981) 1X10³ cfu(colony formin unit)_를 접종하였다. 상기 배양액을 배양기에서 37℃, 5% CO₂ 의 조건에서 3일 동안 배양하였으며, 일주일에 두 번 계대배양 후 각 일주마다 세포배양액을 회수하여 마이코플라즈마 진단 키트(Promokine 사 독일, 셀세이프사 한국)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 PCR 을 수행하였으며, PCR 반응 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였다. 그 결과는 도 6과 같다. 도 6의 결과로부터 인위적으로 마이코플라즈마를 감염시켰음에도 불구하고, 얻어진 세포는 마이코플라즈마의 오염 없이 안정적으로 배양되었다.

도 1은 암피디놀 3(AM3)의 ¹H-NMR 차트이다.

도 2는 암피디놀 3(AM3)의 DQF-COSY 스펙트럼이다.

도 3은 마이코플라즈마 진단 키트에 의해 마이코플라즈마 오염이 확인된 3 종의 세포주 NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주의 전기영동 사진이다.

도 4는 마이코플라즈마로 오염된 세포주에서 암피디놀 3(AM3)의 마이코플라즈마 오염의 제거활성을 측정한 결과이다.

도 5는 마이코플라즈마로 오염된 세포주에 서팍틴, 시프로플록사신, 혹은 리팜피신을 각각 혹은 암피디놀 3(AM3)와 병용 처리하였을 때, 마이코플라즈마 오염의 제거활성을 측정한 결과이다.

도 6은 세포배양시 마이코플라즈마 오염 예방 활성을 평가한 결과이다.

Claims

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하기 화학식 1 내지 8의 화합물로부터 선택된 암피디놀 유도체를 포함하는 배지 중에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>
제4항에 있어서, 상기 암피디놀 유도체가 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 배지 중에 서팍틴(surfactin) 1 ∼ 40 uM, 시프로플록사신(ciprofloxacin) 0.1 ∼ 100 ug/ml, 또는 리팜피신(rifamficin) 0.1 ∼ 100 ug/ml을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 오염이 방지된 세포의 배양방법.
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하기 화학식 1 내지 8의 화합물로부터 선택된 암피디놀 유도체를 포함하는 배지 중에서 마이코플라즈마로 오염된 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>
제10항에 있어서, 상기 암피디놀 유도체가 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 배지 중에 서팍틴(surfactin) 1 ∼ 40 uM, 시프로플록사신(ciprofloxacin) 0.1 ∼ 100 ug/ml, 또는 리팜피신(rifamficin) 0.1 ∼ 100 ug/ml을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.