KR101294999B1

KR101294999B1 - 세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법

Info

Publication number: KR101294999B1
Application number: KR1020100117499A
Authority: KR
Inventors: 한재진
Original assignee: 주식회사셀세이프
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2013-08-09
Also published as: KR20120056002A

Abstract

본 발명은 (a) 마이코플라즈마로 오염된 세포에 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 세포 현탁액을 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액으로부터 세포 응집체(cell clumps)를 제거하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액 또는 상기 세포 현탁액으로부터 수확한 세포를, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유한 배지에 가하여 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법을 제공한다.

Description

세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법{Method for eliminating mycoplasma contamination of cells}

본 발명은 세포의 마이코플라즈마 오염의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단일세포-분리용 효소 용액 처리 및 세포 응집체 제거를 조합하여 수행하는 것을 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법에 관한 것이다.

마이코플라즈마(mycoplasma)는 몰리컷드(Mollicutes)에 속하는 세포벽이 없는 박테리아의 일종으로, 크기가 약 0.2-0.8μm로서 0.2μm의 필터를 통과할 수 있다. 마이코플라즈마는 배양 중인 세포에서 많이 오염되는데 특히 세포배양을 자주하는 제약회사 및 병원, 대학연구실에서는 마이코플라즈마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라즈마 퍼멘탄스(Mycoplasma fementans), 마이코플라즈마 오라레(Mycoplasma orale), 마이코플라즈마 알지니니이(Mycoplasma argininii), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 아콜레플라즈마 라이드라위(Acholeplasma laidlawi) 등의 마이코플라즈마가 주로 세포 배양시 세포를 감염시켜 세포 오염을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 마이코플라즈마는 세포주의 원 생명체에 감염된 후 세포주 수립시 오염되며, 혈청 그리고 실험실내에서 부주의에 의하여 세포주간에 오염되어 실험실 전체로 퍼지게 된다.

미국의 경우 약 15%에 이르는 세포주들이 상기 마이코플라즈마의 한종 또는 그 이상의 마이코플라즈마로 오염되어 있는 것으로 보고되고 있다. 이렇게 오염이 증가하는 이유는 마이코플라즈마가 다른 감염원 즉 세포벽이 있는 박테리아나 곰팡이와 같이 배지의 혼탁도가 증가하거나 혹은 바이러스와 같이 세포의 사멸 등과 같은 가시적인 변화가 없으므로 실험자가 그 오염을 인지하지 못하고 오염을 확대시키기 때문이다. 더욱이, 마이코플라즈마는 세포벽이 없기 때문에, 세포배양에 주로 사용하는 페니실린 및 다른 베타-락탐계 항생제가 마이코플라즈마에 영향을 미치지 못하는 것 또한 주요 원인 중 하나로 지적되고 있다.

한편, 세포배양에 있어서 마이코플라즈마의 오염은 가시적 변화는 거의 없으나 세포배양에 많은 영향을 미치는데, 가장 대표적인 현상은 감염된 세포주의 물질대사를 변화시켜 세포주의 비정상적인 사이토카인 발현을 유도하는 것이다. 이러한 이유로, 수 많은 실험들과 연구가 마이코플라즈마의 오염으로 인하여 비정상적인 결과를 초래하고 있다. 또한 마이코플라즈마는 세포의 형태도 변화시킬 수 있으며, 이와 함께 DNA, RNA 합성에 필요한 대사물을 소모하여 핵산 대사에 영향을 미친다. 이러한 영향은 세포막 외부의 수용체나 막 단백질의 조성을 변화시켜, 세포의 면역성이나 신호전달체계를 교란시키게 되며 세포성장속도가 변하여 성장실험이나 세포독성 실험시 실험결과에 영향을 미치게 된다. 또한, 핵산대사 및 물질대사에 영향을 주기 때문에 세포주를 이용한 바이러스 생산이 감소되게 된다. 특히 단일클론항체의 생산시 하이브리도마 세포의 융합 성공률이 떨어질 뿐만 아니라, 항체 생산도 크게 저하되어 실험에 실패하는 경우가 자주 발생하고 있다. 이러한 현상은 백신을 비롯한 생물학적 제제의 생산과정에 매우 치명적인 실패를 가져올 수 있어서, 마이코플라즈의 오염은 경제적으로도 심각한 문제를 야기하고 있다.

상기와 같이, 세포배양시 수반되는 심각한 마이코플라즈마 오염에 따른 문제에도 불구하고, 만족할만한 수준의 마이코플라즈마 오염 제거 방법은 아직까지 보고되지 않고 있다. 종래에는, 주로 테트라사이클린 및 퀴롤론계 항생제를 사용하거나 혹은 펩타이드 및 리포펩타이드 등과 같은 비항생제를 사용하여 마이코플라즈마 오염을 제거하고 있으나, 마이코프라즈마의 오염을 완전히 제거하지는 못할 뿐만 아니라, 완전한 제거를 위해 높은 농도를 사용할 경우는 세포에 독성 및 항생제 내성을 나타내므로 그 사용에는 한계가 있다.

본 발명자는 세포배양시 수반되는 마이코플라즈마 오염을 근본적으로 차단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도 배양하고자 하는 세포(마이코플라즈마로 오염된 세포)가 세포 응집체(cell clumps) 를 포함하고 있을 경우에는, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질이 상기 세포 응집체를 침투하지 못한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 세포의 계대배양에 있어서, 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 배양 플레이트로부터 세포 현탁액 또는 이로부터 세포를 수확한 후, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유하는 배지 중에서 이어지는 계대배양을 수행하더라도, 상기 세포 현탁액 또는 수확한 세포는 여전히 세포 응집체를 소량이라도 포함하고 있기 때문에, 세포 응집체 내부에 존재하는 마이코플라즈마의 오염을 근본적으로 차단할 수 없다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 기초로, 세포의 배양시 단일세포-분리용 효소 용액을 처리한 후, 세포 응집체를 제거하는 단계를 추가로 수행할 경우, 마이코플라즈마 오염을 근본적으로 차단할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명은 단일세포-분리용 효소 용액 처리 및 세포 응집체 제거를 조합하여 수행하는 것을 포함하는 세포의 마이코플라즈마 오염 제거 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 마이코플라즈마로 오염된 세포에 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 세포 현탁액을 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액으로부터 세포 응집체(cell clumps)를 제거하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액 또는 상기 세포 현탁액으로부터 수확한 세포를, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유한 배지에 가하여 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단일세포-분리용 효소 용액은 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 함유하는 용액일 수 있다.

또한, 단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액을 10∼100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터로 여과하여 세포 응집체를 제거함으로써 수행될 수 있다.

또한, 상기 단계(a) 내지 단계(c)는 2∼4회 반복하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질은 시프로플록사신, 독시사이클린, 리팜피신, 크로람페니콜, 프라스모신, 클린다마이신, 아지스로마이신, 클라리슬로마이신, 테트라사이클린, 티아물린, 서팍틴, 아라메티신, 세클로핀 에이, 피원(Cecropin A, P1), 글로보마이신, 그라미시딘 에스, 마게이닌 2(Magainin 2), 멜리틴, 폴리믹신 비, 타일로신(Tylosin), 및 발리노마이신으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 또한, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질은 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물일 수 있다.

본 발명에 의해, 마이코플라즈마로 오염된 세포가 세포 응집체(cell clumps) 를 포함하고 있을 경우에는, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질이 상기 세포 응집체를 침투하지 못한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 계대배양에 있어서, 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 얻어진 세포가 여전히 세포 응집체를 소량이라도 포함하고 있기 때문에, 세포 응집체 내부에 존재하는 마이코플라즈마의 오염을 근본적으로 차단할 수 없다는 것을 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따라, 세포의 배양시 단일세포-분리용 효소 용액을 처리한 후, 세포 응집체를 제거하는 단계를 추가로 수행할 경우, 마이코플라즈마 오염을 근본적으로 차단할 수 있다.

도 1은 마이코플라즈마 진단 키트에 의해 마이코플라즈마 오염이 확인된 3 종의 세포주 NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주의 전기영동 사진이다. 도 1에서 양성대조군은 마이코플라즈마 퍼멘탄스(Mycoplasma fementans) 유래의 DNA (미네르바, Cat. No. 51-0117, 독일)를 가하여 전기영동한 것이고, 음성 대조군은 증류수만을 가하여 전기영동한 것이다.
도 2는 세포 응집체 제거 처리 혹은 비처리 조건하에서 마이코플라스마 오염 제거 처리 후, 제1, 3, 6, 및 10 계대의 세포에 대하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인한 전기영동 사진이다. 도 2에서 양성대조군은 마이코플라즈마 퍼멘탄스(Mycoplasma fementans) 유래의 DNA (미네르바, Cat. No. 51-0117, 독일)를 가하여 전기영동한 것이고, 음성 대조군은 증류수만을 가하여 전기영동한 것이다.

본 발명은, (a) 마이코플라즈마로 오염된 세포에 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 세포 현탁액을 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액으로부터 세포 응집체(cell clumps)를 제거하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액 또는 상기 세포 현탁액으로부터 수확한 세포를, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유한 배지에 가하여 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 마이코플라즈마로 오염된 세포에 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 세포 현탁액을 얻는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다.

상기 마이코플라즈마로 오염된 세포는 마이코플라즈마로 오염된 모든 종류의 세포를 포함하며, 예를 들어 마이코플라즈마로 감염된 NIH3T3 세포주, HepG2 세포주, Raw 264.7 세포주 등을 열거할 수 있으나, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 마이코플라즈마로 오염된 세포는 통상의 배양을 통하여 얻어진 마이코플라스마로 오염된 세포; 계대배양에 착수하거나 혹은 계대배양 중인 마이코플라스마로 오염된 세포; 또는 계대배양을 완료하고 시험에 사용하기 직전의 마이코플라스마로 오염된 세포를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 계대배양에 착수하거나 혹은 계대배양 중인 마이코플라스마로 오염된 세포에 적용될 수 있다. 이어지는 효소 용액 처리 과정을 위하여, 상기 마이코플라즈마로 오염된 세포는 배지를 제거하고 인산완충용액 등으로 1회 또는 2회 이상 세척하여 준비될 수 있다.

상기 단일세포-분리용 효소 용액은 배양 플레이트(배양접시, 배양 플라스크, 혹은 배양기 등을 모두 포함한다)에 고착되어 자란 세포를 단일세포(single cells)로 분리하는데 사용하는 효소 용액이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 단일세포-분리용 효소 용액은 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 용액(통상 "트립신-EDTA 용액(tripsin-EDTA solution)"으로 칭해진다)일 수 있다. 또한, 세포를 배양 플레이트에서 떼어내는 데 사용되는 일반적인 세포분리용액(cell detachment solution)에 사용되는 단백질 분해효소(protease) 및 콜라겐분해효소(collagenase) 등을 포함한다. 바람직하게는, 트립신 및 EDTA를 함유하는 용액을 사용할 수 있으며, 트립신과 EDTA의 중량비는 통상 25 : 1 정도이고, 각각의 농도(예를 들어, 인산완충액 중의 희석액 농도)는 0.025%, 0.001%이나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 트립신-EDTA 용액은 상업적으로 시판되는 시약, 예를 들어, 인비트로젠사의 Trypsin/EDTA Solution (Cat. No. R-001-100)을 사용할 수도 있다. 상기 트립신-EDTA 용액을 포함한 단일세포-분리용 효소 용액은 세포배양 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 사용될 수 있다.

상기 효소 용액 처리는 세포(바람직하게는 인산완충용액으로 세척하여 배지 성분을 제거한 세포)에 단일세포-분리용 효소 용액을 가하고, 약 37℃에서 약 10분간 인큐베이션한 뒤, DMEM 배지 등을 가하여 세포 현탁액을 얻은 다음, 이를 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 수행될 수 있다. 얻어진 세포는 다시 DMEM 배지 등의 세포배양용 배지를 가하여 세포 현탁액을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액으로부터 세포 응집체(cell clumps)를 제거하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.

상기 세포 응집제의 제거방법은 세포 응집체를 제거할 수 있는 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적절한 포어 사이즈를 갖는 필터를 사용한 여과에 의해 세포 응집체를 제거하는 것이, 간단하게 수행될 수 있다는 점에서, 적합하게 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액을 10∼100 ㎛, 더욱 바람직하게는 30∼70 ㎛, 특히 바람직하게는 약 40 ㎛ 의 포어 사이즈를 갖는 필터로 여과하여 세포 응집체를 제거함으로써 수행된다.

본 발명에 따른 방법은 단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액 또는 상기 세포 현탁액으로부터 수확한 세포를, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유한 배지에 가하여 배양하는 단계[즉, 단계(c)]를 포함한다.

단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액은, 배지를 사용하여, 배양에 적합한 세포 농도로 조절될 수 있다. 또한, 단계(b)의 세포 현탁액으로부터 세포의 수확은 원심분리 등의 방법을 포함한 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 단계(c)의 상기 배지는 배양되는 세포에 적합한 것으로 알려져 있는 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지는 FBS 등의 사이토카인 등으로 보충(supplemented)될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 상기 단계(a) 내지 단계(c)를 반복하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 2∼4회 반복하여 수행될 수 있다.

상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질은 마이코플라스마 저해를 위하여 사용되는 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질로는 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드(6-methylpurine deoxyriboside), 6-메틸퓨린 리보사이드(6-methylpurine riboside), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 독시사이클린(Doxycyclin), 리팜피신(Rifampicin), 크로람페니콜(Chloramphenicol), 프라스모신(Plasmocin), 클린다마이신(Clindamycin), 아지스로마이신(Azithromycin), 클라리슬로마이신(Clarithromycin), 테트라사이클린(Tetracyclin), 티아물린(Tiamulin), 서팍틴(Surfactin), 아라메티신(Alamethicin), 세클로핀 에이, 피원(Cecropin A, P1), 글로보마이신(Globomycin), 그라미시딘 에스(Gramicidin S), 마게이닌 2(Magainin 2), 멜리틴(Mellitin), 폴리믹신 비(Polymixin B), 타일로신(Tylosin), 발리노마이신(Valinomycin) 등의 항생제, 펩타이드 혹은 리포펩타이드를 사용할 수 있다. 상기 항생제 또는 리포펩타이드(혹은 펩타이드)의 사용량은 공지의 문헌에 따라 적절히 정할 수 있다. 또한, 상업적으로 시판되는 마이코플라즈마 제거용 시약, 예를 들어 LookOut Mycoplasma Elimination Reagent(시그마알드리치사), BM cyclin(로슈) 등의 시약을 사용할 수도 있다.

바람직하게는, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질은 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물일 수 있다.

상기 "암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주"라 함은 암피디놀(amphidinols, AM)로 알려져 있는 폴리엔-폴리히드록시(polyene-polyhydroxy) 화합물들을 생산할 수 있는 균주를 의미한다. 상기 암피디놀은 현재까지 AM1 내지 AM15의 약 15종이 알려져 있으나, 이들을 모핵으로 하는 다양한 유사체(analogues)도 상기 암피디놀에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 암피디놀을 생산하는 균주로서 현재까지 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 및 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)의 2종만이 알려져 있으나, 이들의 활성(즉, 암피디놀 생성능)을 갖는 모든 재조합 균주 및 변이주가 상기 암피디놀 생성능을 갖는 균주에 포함되는 것으로 이해되어야 하며, 또한 상기 암피디놀의 유사체(analogues)를 생성하는 균주, 그의 재조합균주 및 변이주도 상기 암피디놀 생성능을 갖는 균주에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

상기 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주는 바람직하게는 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 또는 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)일 수 있다. 상기 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii), 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae) 등의 균주는 와편모조류(Dinoflagellates)에 속하는 균주로서, 적조를 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 균주의 배양, 균체의 추출분, 및 분획(fractionizing)은 공지의 방법, 예를 들어 Gopal K. Paul et al., J. Mar. Biotechnology (1997) 5: 124-128; Toshihiro Houdai et al., Tetrahedron 57 (2001) 5551-5555; 또는 Reiko Echigoya et al., Harmful algae 4 (2005) 383-389에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주의 배양은 암피디니움 클렙시(Amphididinium klebsii) 등의 균주를 바다물을 포함하는 배양기 중에서 빛을 공급하면서 배양함으로써 수행할 수 있으며, 글라스 필터로 여과함으로써 균체(biomass)를 수확할 수 있다. 또한 균체의 추출은 얻어진 균체로부터 C₁∼C₄ 알콜(바람직하게는 메탄올) 및 아세톤 / 물 및 에틸 아세테이트 / n-부탄올을 순차적으로 사용하여 추출함으로써 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균체의 추출물은 (a') 상기 균체를 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤으로 추출하는 단계; (b') 단계(a')에서 얻어진 추출물에 물 및 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; (c') 단계(b')에서 얻어진 수층에 n-부탄올을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-부탄올층을 분리하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어질 수 있다. 단계(a')에서, 상기 추출은 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤의 혼합용매를 사용하여 수행하거나, 혹은 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤을 상기 균체에 순차적으로 가하여 추출하여 얻어진 추출물들을 혼합함으로써 수행할 수도 있다. 상기 C₁∼C₄ 알콜, 아세톤의 사용량은 크게 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 균체 중량당 10 내지 300 배 ml/g의 비율로 사용될 수 있다. 단계(b')에서 물과 에틸 아세테이트의 중량비는 1 : 2∼5의 범위일 수 있으며, 그 사용량은 단계(a')에서 얻어진 추출액 중량당 10 내지 50 배 ml/g의 범위일 수 있다. 단계(c')에서 n-부탄올로 추출하여 얻어진 n-부탄올층은 감압건조 등의 통상의 건조방법에 의해 건조함으로써, 분말 형태의 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 분획(fractionizing)도 상기한 바와 같이 Gopal K. Paul et al., J. Mar. Biotechnology (1997) 5: 124-128; Toshihiro Houdai et al., Tetrahedron 57 (2001) 5551-5555; 또는 Reiko Echigoya et al., Harmful algae 4 (2005) 383-389에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 n-부탄올 추출물에 대하여 50% 메탄올을 사용한 HW-40(Toyopearl, Tosoh) 컬럼크로마토그래피, 100% 메탄올을 사용한 세파덱스 LH-20(Pharmacia-LKB) 컬럼크로마토그래피, 및 0-50% 아세토니트릴을 사용한 ODS(YMC, ODS-AQ) 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 수행하고, 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 HPLC을 수행함으로써, 분획물 즉, 암피디놀(amphidinols, AM)로 알려져 있는 폴리엔-폴리히드록시(polyene-polyhydroxy) 화합물들(AM1 내지 AM15)을 얻을 수 있다.

상기 분획물 중, 특히 암피디놀 1(amphidinol 1, AM1), 암피디놀 2(amphidinol 2, AM2), 암피디놀 3(amphidinol 3, AM3), 암피디놀 4(amphidinol 4, AM4), 암피디놀 5(amphidinol 5, AM5), 암피디놀 6(amphidinol 6, AM6), 암피디놀 7(amphidinol 7, AM7), 및 암피디놀 9(amphidinol 9, AM9)의 화합물, 특히 암피디놀 3가 바람직하다. AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6, AM7, 및 AM9의 화학구조는 다음 화학식 1 내지 8과 같다.

배지 중의 상기 추출물 또는 분획물의 농도는 0.1 nM ∼ 100 uM 일 수 있으며, 바람직하게는 1 nM ∼ 1 uM, 더욱 바람직하게는 5 nM ∼ 100 nM일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예: 마이코플라즈마로 오염된 세포주로부터 마이코플라즈마의 제거

(1) 마이코플라즈마로 오염된 세포주의 수득 및 배양

서울에 위치한 여러 대학교의 실험실로부터 실험실내에서 구축된 다양한 세포주를 얻었다. 얻어진 세포주를 DMEM(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지 중에서 3일간 배양한 후, 세포를 회수하여 마이코플라즈마 진단 키트(Promokine 사 독일, 셀세이프사 한국)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 PCR 을 수행하였으며, PCR 반응 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였다. 상기와 같이 확인 결과, 3 종의 세포주 즉, NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주가 마이코플라즈마에 감염된 것으로 확인되었다 (도 1 참조).

마이코플라즈마로 오염된 것으로 확인된 NIH3T3, HepG2, Raw 264.7 세포주 각각을 T-75 배양 플라스크(NUNC, Cat. No. 156367)에 1X10⁶ 개의 농도로 접종한 뒤, 10% 이하의 혈청(GIBCO BRL, Cat. No. 10082-147)을 포함하는 DMEM(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 배지를 첨가하고, 3일간 배양하였다.

(2) 필터 통과 처리 후 계대배양시 마이코플라즈마의 제거능 평가

상기 (1)에서 T-75 배양 플라스크에서 배양된 마이코플라즈마 감염이 확인된 세포(80∼90% confluent) 배양물로부터 배지를 제거하고, 인산완충용액 10 ml을 사용하여 세포를 2회 세척한 다음, 트립신-EDTA 2 ml을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 세포를 떼어내었다. 여기에 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)를 가하여 10 ml의 세포 현탁액을 얻고, 이를 15ml 코니컬 튜브로 옮긴 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 상기 코니컬 튜브에 5% FBS 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 10 ml를 가하여 세포 현탁액을 얻었다. 얻어진 세포 현탁액을 5 ml씩 2군으로 나누어, 제1군은 40 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터를 통과시키고, 제2군은 필터 처리를 하지 않았다. 제1군 및 제2군의 세포 현탁액을 5% FBS 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)로 희석하여 세포의 농도가 각각 약 2.5x10⁵ cells/ml이 되도록 하였다. 얻어진 제1군 및 제2군의 세포 현탁액(각각 약 2.5x10⁵ cells/ml의 세포 함유)으로부터 각각 4 ml씩 취하여 15ml 튜브로 옮기고, 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)를 5.5ml 씩 가한 후, Mycoplasma Elimination Reagent - initial treatment (시그마알드리치사 Cat. no. M4569) 시약을 500 ㎕씩 처리하였다. 얻어진 각각의 혼합액 10 ml을 T-75 배양 플라스크에 옮긴 후 CO₂ 배양기에서 3일 동안 배양하였다 (제1 계대 처리).

3일간 배양된(80~90% confluent) T-75 배양 플라스크의 배양물로부터 배지를 제거하고, 인산완충용액 10 ml을 사용하여 세포를 2회 세척한 다음, 트립신-EDTA 2 ml을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하여 세포를 떼어내었다. 여기에 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)를 가하여 10 ml의 세포 현탁액을 얻고, 이를 15ml 코니컬 튜브로 옮긴 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 상기 코니컬 튜브에 10% FBS 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058) 10 ml를 가하여 세포 현탁액을 얻었다. 제1군의 세포 현탁액은 상기와 마찬가지로 40 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터를 통과시켰으며, 제2군은 필터 처리를 하지 않았다. 제1군 및 제2군의 세포 현탁액에 10% FBS 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)로 희석하여 세포의 농도가 각각 약 2.5x10⁵ cells/ml이 되도록 하였다. 얻어진 제1군 및 제2군의 세포 현탁액(각각 약 2.5x10⁵ cells/ml의 세포 함유)으로부터 각각 4 ml씩 취하여 15ml 튜브로 옮기고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지(GIBCO BRL, Cat. No. 12800-058)를 5.5ml 씩 가한 후, Mycoplasma Elimination Reagent - Final treatment (시그마알드리치사 Cat. no. M4444) 시약을 500 ㎕씩 처리하였다. 얻어진 각각의 혼합액 10 ml을 T-75 배양 플라스크에 옮긴 후 CO₂ 배양기에서 2일 동안 배양하였다 (제2 계대 처리). 상기 제2 계대 처리를 2회 더 수행하여 총 제4 계대 처리를 수행하였다.

상기 4계대 처리가 완료된 세포 각각을 다시 1계대로부터 시작하여 33 계대까지 배양하였으며, 각 계대에 있어서의 배양은 일반적인 세포배양법, 즉 필터 통과 없이 트립신-EDTA 용액 처리 및 마이코플라즈마 제거용 시약이 없는 배지 중에서의 배양을 수행하였다. 상기 초기 4계대 동안의 처리후, 추가의 1, 3, 6, 10, 12, 15, 및 33 계대에서 각각의 세포에 대한 마이코플라스마 오염 여부를 측정하였다. 마이코플라즈마의 제거 여부를 확인하기 위해, 마이코플라즈마 진단 키트(Promokine 사 독일, 셀세이프사 한국)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 PCR 을 수행하였으며, PCR 반응 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 마이코플라즈마 오염여부를 확인하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다. 또한, 제1군 및 제2군의 NIH3T3 세포에 대한 제1, 3, 6, 및 10 계대의 전기영동 사진은 도 2와 같다.

	필터 통과			필터 통과 없음
	NIH3T3	HepG2	Raw 264.7	NIH3T3	HepG2	Raw 264.7
처리 후 1 계대	-	-	-	-	-	-
처리 후 3 계대	-	-	-	+	+	+
처리 후 6 계대	-	-	-	+	+	+
처리 후 10 계대	-	-	-	+	+	+
처리 후 12 계대	-	-	-	+	+	+
처리 후 15 계대	-	-	-	+	+	+
처리 후 33 계대	-	-	-	+	+	+

* -: 오염제거, +: 오염

표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 필터 통과 처리를 한 경우, 모든 세포주에서 마이코플라즈마 오염이 완전히 제거되었다. 그러나, 상기 표 1 및 도 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 응집체를 제거하는 단계를 수행하지 않은 세포는 제3 계대부터 다시 마이코플라즈마 DNA가 나타났다.

(3) 포어 사이즈에 따른 마이코플라즈마의 제거능 평가

40 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터 대신, 11, 20, 30, 60, 80, 90, 및 100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터(Millipore) 및 50, 70 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터(Falcon)를 사용하여 처리한 후, 상기 (2)와 동일한 방법으로 계대배양을 한 다음, 마이코플라즈마 오염를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.

	포어 사이즈 (㎛)
	11	20	30	50	60	70	80	90	100
처리 후 1 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 3 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 6 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 10 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 12 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 15 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 33 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-

* -: 오염제거, +: 오염

표 2의 결과로부터, 10 내지 100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터를 사용할 경우, 마이코플라스마의 오염을 완전히 제거할 수 있음을 알 수 있다.

(4) 암피디놀 유도체를 사용한 마이코플라즈마의 제거능 평가

마이코플라즈마 제거용 시약으로서 화학식 3의 화합물을 2 ㎍/ml 의 농도로 처리하고, 또한 11, 20, 30, 60, 80, 90, 및 100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터(Millipore) 및 40, 50, 70 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터(Falcon)를 사용하여 처리한 것을 제외하고는, 상기 (2)와 동일한 방법으로 계대배양을 한 다음, 마이코플라즈마 오염를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3과 같다.

	포어 사이즈 (㎛)
	11	20	30	40	50	60	70	80	90	100
처리 후 1 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 3 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 6 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 10 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 12 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 15 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
처리 후 33 계대	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

* -: 오염제거, +: 오염

표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 마이코플라즈마 제거용 시약으로서 화학식 3의 화합물 및 10 내지 100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터를 사용할 경우, 마이코플라스마의 오염을 완전히 제거할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

(a) 마이코플라즈마로 오염된 세포에 단일세포-분리용 효소 용액을 처리하여 세포 현탁액을 얻는 단계;
(b) 단계(a)에서 얻어진 세포 현탁액을 10∼100 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터로 여과하여 세포 응집체(cell clumps)를 제거하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 얻어진 세포 현탁액 또는 상기 세포 현탁액으로부터 수확한 세포를, 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질을 함유한 배지에 가하여 배양하는 단계
를 포함하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단일세포-분리용 효소 용액이 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 함유하는 용액인 것을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계(a) 내지 단계(c)를 2∼4회 반복하는 것을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제1항, 제2항, 또는 제4항에 있어서, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질이 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드, 6-메틸퓨린 리보사이드, 시프로플록사신, 독시사이클린, 리팜피신, 크로람페니콜, 프라스모신, 클린다마이신, 아지스로마이신, 클라리슬로마이신, 테트라사이클린, 티아물린, 서팍틴, 아라메티신, 세클로핀 에이, 피원(Cecropin A, P1), 글로보마이신, 그라미시딘 에스, 마게이닌 2(Magainin 2), 멜리틴, 폴리믹신 비, 타일로신(Tylosin), 및 발리노마이신으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것임을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제1항, 제2항, 또는 제4항에 있어서, 상기 마이코플라즈마 저해 활성을 갖는 물질이 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주를 배양하여 얻어진 균체(biomass)의 추출물 또는 상기 추출물로부터 얻어진 분획물인 것을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 암피디놀(amphidinols) 생성능을 갖는 균주가 암피디움 클렙시(Amphidinium klebsii) 또는 암피디움 카르테레(Amphididinium carterae)인 것을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 균체의 추출물이 (a') 상기 균체를 C₁∼C₄ 알콜 및 아세톤으로 추출하는 단계; (b') 단계(a')에서 얻어진 추출물에 물 및 에틸 아세테이트를 가하여 추출하고, 얻어지는 수층을 분리하는 단계; (c') 단계(b')에서 얻어진 수층에 n-부탄올을 가하여 추출하고, 얻어지는 n-부탄올층을 분리하는 단계를 포함하는 추출공정을 수행하여 얻어진 것임을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 분획물이 하기 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는, 세포의 마이코플라즈마 오염을 제거하는 방법.
<화학식 3>
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