WO2021054576A1 - 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 - Google Patents

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WO2021054576A1
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extracellular vesicles
ascorbic acid
cells
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PCT/KR2020/007798
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조병성
하대현
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주식회사 엑소코바이오
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    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles.
  • the present invention relates to a medium for promoting the production of exosomes and / or extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles are sometimes called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, etc., and in some cases, they are used separately from exosomes.
  • Exosomes are vesicles having a size of tens to hundreds of nanometers consisting of a double phospholipid membrane that has the same structure as a cell membrane, and contains proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomes cargo (cargo).
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be specific to the cell type and are regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cellular behavior including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Is known.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors depending on the nature and state of the derived cell. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, cell behaviors such as cell migration, proliferation and differentiation are regulated, and the characteristics of stem cells related to tissue regeneration are reflected (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • exosomes which are called cell avatars, contain bioactive factors such as growth factors, similar to cells, and serve as a carrier that carries bioactive factors between cells and cells, that is, the communication between cells and cells.
  • Exosomes are known not only to be released from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts, and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae. .
  • Another object of the present invention is to provide a medium for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles.
  • the inventors of the present invention have been intensively researching the production method of exosomes and/or extracellular vesicles that can improve the productivity of exosomes and/or extracellular vesicles, in a medium containing ascorbic acid and its analogs or derivatives. When culturing cells, it was confirmed that the productivity of exosomes secreted or released per cell (or cell culture medium) and/or extracellular vesicles was improved, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a method for promoting production of exosomes and/or extracellular vesicles or a method for improving productivity, comprising culturing animal-derived cells in a medium containing ascorbic acid, analogs or derivatives thereof.
  • extracellular vesicles generally encompasses membrane-derived vesicles (membrane vesicles), ectosomes, shedding vesicles, microparticles, or equivalents thereof It is used in the sense of saying. Depending on the separation environment, conditions, and methods, extracellular vesicles may have the same meaning as exosomes, and may have the same or similar size as exosomes, but may have a meaning including nanovesicles that do not have the composition of exosomes. Meanwhile, the term exosomes used in relation to production promotion or productivity in the present specification is used in the sense of encompassing the extracellular vesicles.
  • exosomes refers to vesicles having a size of tens to hundreds of nanometers (preferably about 30 to 200 nm) composed of a double phospholipid membrane identical to the structure of the cell membrane (however, the separation target is The particle size of the exosomes may vary depending on the cell type, separation method, and measurement method. (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins and nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be specific to the cell type and are regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cellular behavior including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Is known.
  • exosome has a nano-sized vesicle structure secreted from animal-derived cells and released into the extracellular space, and has a composition similar to that of exosomes (eg, exosomes -It means to include all similar vegetables).
  • the type of animal-derived cells from which exosomes and/or extracellular vesicles are derived is not limited, but as an example that does not limit the present invention, it may be a stem cell or an immune cell.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSC), adult stem cells, mesenchymal stem cells derived from embryonic stem cells, or mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells.
  • the immune cells may be T cells, B cells, NK cells, cytotoxic T cells, dendritic cells or macrophages.
  • the adult stem cells are at least one adult selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, and multipotent stem cells. It can be a stem cell.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, Wharton jelly, and placenta.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, for example, stem cells derived from fat, bone marrow, umbilical cord or umbilical cord blood, and more preferably stem cells derived from fat.
  • the type of the stem cell or the immune cell is not limited as long as there is no risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human stem cell or a human immune cell.
  • the fat stem cells used in the examples described below should be understood as an example of animal cells that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • the term "ascorbic acid, an analog or derivative thereof” is, for example, ascorbic acid, ascorbic acid-2-glucoside (AA-2G), ascorbic acid-2 -Sulfate (Ascorbic acid-2-sulfate; AA-2S), Ascorbic acid-2-phosphate (AA-2P), Magnesium ascorbyl phosphate, Ascorbyl palmitate (Ascorbyl palmitate), Retinyl Ascorbate, Tetrahexyldecyl Ascorbate, Sodium ascorbate, Calcium ascorbate, Polyethoxylated ascorbic acid (Polyethoxylated ascorbic acid) acid), Ethyl Ascorbic Acid, Aminopropyl Ascorbyl Phosphate, and/or 3-Ascorbyl Carbonyl Dipeptide-17.
  • the above-described ascorbic acid, an analog or derivative thereof should be understood as an example of ascorbic acid, an analog or derivative thereof
  • pretreatment refers to culturing animal-derived cells in a medium containing ascorbic acid, analogs or derivatives thereof
  • pretreatment exosomes and/or extracellular vesicles refers to ascorbic acid, analogs or derivatives thereof. It means exosomes and/or extracellular vesicles obtained by culturing animal-derived cells in a medium containing.
  • No treatment refers to culturing animal-derived cells in a medium that does not contain ascorbic acid, analogs or derivatives thereof
  • untreated exosomes and/or extracellular vesicles or untreated control refers to the cell culture step and exo It refers to exosomes and/or extracellular vesicles obtained without treatment of ascorbic acid, analogs or derivatives thereof in any of the stages of separation.
  • the present invention provides a method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles, comprising culturing animal-derived cells in a medium containing ascorbic acid, an analog or derivative thereof.
  • the method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles is to further cultivate the animal-derived cells in a medium containing ascorbic acid, an analog or derivative thereof, and fetal bovine serum (FBS). It may include the step of.
  • the fetal bovine serum may be obtained from FBS-derived exosomes and extracellular vesicles removed.
  • the method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles of one embodiment of the present invention may comprise the step of further culturing the animal-derived cells in a serum-free medium containing ascorbic acid, an analog or derivative thereof. have.
  • the concentration of the ascorbic acid, an analog or derivative thereof is preferably about 1 ⁇ g/mL to 300 ⁇ g/mL, more preferably It may be about 10 ⁇ g/mL to 100 ⁇ g/mL.
  • the amount of exosomes and/or extracellular vesicles produced is the amount of exosomes and/or extracellular vesicles per cell (or cell culture solution) (tetra It can be defined as the amount of spanin, for example CD63 content), or the number of exosomes and/or extracellular endoplasmic reticulum particles per cell (or cell culture).
  • the present invention provides a medium for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles derived from animal cells, including ascorbic acid, an analog or derivative thereof.
  • the concentration of the ascorbic acid, its analog or derivative is preferably about 1 ⁇ g/mL to 300 ⁇ g/mL , More preferably about 10 ⁇ g/mL to 100 ⁇ g/m.
  • the method for promoting the production of exosomes and/or extracellular vesicles of the present invention can economically and efficiently produce exosomes and/or extracellular vesicles that can be useful commercially and/or clinically with high yield, and , In particular, there is an advantage of being able to mass-produce exosomes and/or extracellular vesicles compared to conventional methods.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Figure 2 is a case of pretreatment and culture of stem cells in a medium containing ascorbic acid, an analog or derivative thereof according to an embodiment of the present invention, the number of exosome particles per unit mL (ie, exosome productivity) is ascorbic acid, its It is a comparative graph showing a marked increase compared to the untreated control group not treated with analogs or derivatives.
  • FIG. 3 shows that when stem cells are pretreated and cultured in a medium containing ascorbic acid, an analog or derivative thereof according to an embodiment of the present invention, the exosome content (CD63 content) per unit mL is ascorbic acid, an analog or derivative thereof. It is a comparative graph showing a marked increase compared to the untreated control group.
  • Human adipose-derived stem cells were suspended in ⁇ -MEM culture medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin, and then 6- The well plate was inoculated at a density of 6,000 cells/cm 2 and cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2. 24 hours after inoculation, in the case of the ascorbic acid-treated group, 10 ⁇ g/mL, 30 ⁇ g/mL, or 100 ⁇ g/mL of ascorbic acid was added to the culture medium, respectively.
  • FBS Fetal bovine serum
  • penicillin 100 units/mL
  • streptomycin 100 ⁇ g/mL streptomycin
  • the culture medium is ⁇ -MEM medium containing 100 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (hereinafter, "Serum-free media” or “SFM”), or ⁇ -MEM medium containing FBS-derived exosomes and extracellular vesicles removed 2% FBS, 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin (hereinafter, "Extracellular vesicles-depleted media" or "EDM”), and in the case of the ascorbic acid-treated group, 10 ⁇ g/mL, 30 ⁇ g/mL, or 100 ⁇ g/mL of ascorbic acid was added to the medium, respectively.
  • SFM serum-free media
  • EDM Extracellular vesicles-depleted media
  • Ultracentrifugation was used to separate exosomes from the culture medium recovered in Example 1.
  • the recovered culture was sequentially centrifuged at 4° C. as follows to separate exosomes. First, in order to remove cells from the recovered culture solution, centrifugation was performed at 300 ⁇ g for 10 minutes, and then the supernatant was taken. And, in order to remove cell debris from the supernatant, the supernatant was taken after centrifugation at 2,000 ⁇ g for 20 minutes. In addition, in order to remove microvesicles from the supernatant, the supernatant was taken after centrifugation at 16,500 ⁇ g for 10 minutes.
  • the finally obtained supernatant was centrifuged at 120,000 ⁇ g for 120 minutes, then the supernatant was removed and the pellet was taken, and the pellet was washed with phosphate-buffered saline, and again 120,000 ⁇ g. After removing the supernatant by centrifugation at for 120 minutes, the pellet was suspended in a phosphate buffer solution to separate exosomes.
  • a method for separating exosomes from animal-derived cell culture media including stem cells in addition to the above-described separation method, various methods known in the art may be used. For example, for the separation of exosomes, ultrafiltration, density gradient centrifugation, tangential flow filtration (TFF), size exclusion chromatography, ion Ion exchange chromatography, immunoaffinity capture, microfluidics-based isolation, exosome precipitation, total exosome isolation kit, or polymer Known separation methods, such as polymer based precipitation, can be used. However, the method of separating exosomes is not limited to the methods as described above, and of course, various separation methods that are used in the art or may be used in the future can be adopted.
  • the separated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis ( NTA; purchased from Malvern).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • FIG. 1 the exosomes obtained after pretreatment and cultivation of stem cells in a medium containing ascorbic acid according to an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as "Experimental Group 1") do not contain ascorbic acid. It was found that the particle size distribution was uniform compared to the exosomes obtained after pretreatment and cultivation of stem cells in a medium that was not used (hereinafter, referred to as "Experimental Group 2").
  • exosomes of experimental groups 1 and 2 and exosome-human CD63 flow detection reagent (Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent) (InvitrogenTM) were mixed overnight. After reaction with PE mouse anti-Human CD63 (BD PEGTM), PE mean fluorescence intensity (MFI) was measured using flow cytometry.
  • Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent
  • MFI mean fluorescence intensity
  • CD63 is a representative positive marker of exosomes
  • the content of CD63 and the content of exosomes have linearity with each other, and an increase in CD63 content means a proportional increase in the content of exosomes.
  • human CD63 protein by concentration was prepared by serial dilution of human CD63 protein of known concentration, and human CD63 protein by concentration and exosome-human CD63 flow detection reagent (Exosome-Human CD63 Flow Detection) were prepared. Reagent) (InvitrogenTM) was mixed overnight and then reacted with PE mouse anti-human CD63 (BD PROgenTM), and PE mean fluorescence intensity (mean) using flow cytometry. fluorescence intensity; MFI) was measured.
  • the present invention can improve the productivity of exosomes secreted or released per cell (or cell culture fluid) and/or extracellular vesicles, and can be usefully used commercially and/or clinically, and/or It is possible to economically and efficiently produce extracellular vesicles with a high yield, and in particular, there is an advantage of being able to produce exosomes and/or extracellular vesicles in large quantities compared to conventional methods.

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Abstract

본 발명은 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법을 제공한다. 본 발명은 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시킬 수 있어, 상업적 및/또는 임상적으로 유용하게 활용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 종래의 방법과 비교하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법
본 발명은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
그러나, 전술한 바와 같이 다양한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리방법이 제안되고 있음에도 불구하고 다른 기술분야와 마찬가지로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산과 관련한 기술분야에서도 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다. 예를 들어, 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시킬 수 있는 새로운 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산기술의 제공이 필요하다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지를 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시킬 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산방법에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 세포를 배양할 경우 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성이 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 내지는 생산성 향상 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 생산 촉진 또는 생산성과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 동물 유래 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 유래하는 동물 유래 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 또는 상기 면역세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포 또는 인간 유래 면역세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, HEK 293 세포나 HEK 293T 세포의 사용도 가능하다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 지방줄기세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체"는, 예를 들어, 아스코르브산(Ascorbic Acid), 아스코르브산-2-글루코사이드(Ascorbic acid-2-glucoside; AA-2G), 아스코르브산-2-설페이트(Ascorbic acid-2-sulfate; AA-2S), 아스코르브산-2-포스페이트(Ascorbic acid-2-phosphate; AA-2P), 마그네슘 아스코르빌 포스페이트(Magnesium ascorbyl phosphate), 아스코르빌 팔미테이트 (Ascorbyl palmitate), 레티닐 아스코르브산염 (Retinyl Ascorbate), 테트라헥실데실 아스코르브산염(Tetrahexyldecyl Ascorbate), 아스코르브산 나트륨(Sodium ascorbate), 아스코르브산 칼슘(Calcium ascorbate), 폴리에톡실레이티드 아스코르브산(Polyethoxylated ascorbic acid), 에틸 아스코르브산(Ethyl Ascorbic Acid), 아미노프로필 아스코르빌 포스페이트(Aminopropyl Ascorbyl Phosphate), 및/또는 3-아스코르빌 카르보닐 디펩티드-17(3-Ascorbyl Carbonyl Dipeptide-17)일 수 있다. 그러나 전술한 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체는 본 발명에서 사용될 수 있는 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "전처리"는 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하는 것을 의미하고 "전처리 엑소좀 및/또는 세포외 소포체"는 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하여 얻은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 의미한다. "무처리"란 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하지 않는 배지에서 동물 유래 세포를 배양하는 것을 의미하고, "무처리 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 무처리 대조군"은 세포배양 단계 및 엑소좀 분리 단계 중 어떠한 단계에서도 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체가 처리되지 않고 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 의미한다.
본 발명은 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법은 상기 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체와 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 포함하는 배지에서 추가로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 우태아혈청은 FBS 유래의 엑소좀 및 세포외 소포체가 제거된 것일 수 있다. 대안으로, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법은 상기 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 무혈청 배지에서 추가로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법에 있어서, 상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 바람직하게는 약 1 μg/mL 내지 300 μg/mL, 더욱 바람직하게는 약 10 μg/mL 내지 100 μg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법에 있어서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성량은 세포(또는 세포배양액) 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함량(테트라스파닌 함량, 예를 들어 CD63 함량), 또는 세포(또는 세포배양액) 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 입자수로 정의될 수 있다.
본 발명은 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는, 동물세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지를 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 동물세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지에 있어서, 상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 바람직하게는 약 1 μg/mL 내지 300 μg/mL, 더욱 바람직하게는 약 10 μg/mL 내지 100 μg/m일 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법은 상업적 및/또는 임상적으로 유용하게 활용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 종래의 방법과 비교하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하지 않는 배지("0 μg/mL"로 표시됨), 또는 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지("30 μg/mL" 또는 "100 μg/mL"로 표시됨)에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 엑소좀 각각에 대해 NTA (nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 경우 단위 mL 당 엑소좀 입자수(즉, 엑소좀 생산성)가 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 처리하지 않은 무처리 대조군에 비해 현저하게 증가한 것을 나타내는 비교 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 경우 단위 mL 당 엑소좀 함량(CD63 함량)이 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 처리하지 않은 무처리 대조군에 비해 현저하게 증가한 것을 나타내는 비교 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인간 지방 유래 줄기세포를 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS), 100 유닛(Units)/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배양 배지에 현탁시킨 후, 6-웰 플레이트에 6,000 세포/cm2 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 접종 24시간 후, 아스코르브산 처리군의 경우 배양 배지에 각각 10μg/mL, 30μg/mL 또는 100 μg/mL의 아스코르브산을 첨가하였다.
아스코르브산 처리군 및 무처리군 모두 80% 이상의 세포 밀집도(confluency)에 도달하면, 배양배지를 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지 (이하, "Serum-free media" 또는 "SFM"이라 함), 또는 FBS 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 2% FBS, 100 유닛/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지(이하, "Extracellular vesicles-depleted media" 또는 "EDM"이라 함)로 교체해 주었고, 아스코르브산 처리군의 경우 해당 배지에 각각 10μg/mL, 30μg/mL 또는 100 μg/mL의 아스코르브산을 첨가하였다.
그리고 나서, SFM 또는 EDM 배지로 교체하여 24시간 배양한 후 배지를 수거하였고, 배지수거가 완료된 세포는 세포 계수기를 이용해 세포수를 측정하였다.
실시예 2: 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 회수한 배양액으로부터 엑소좀의 분리를 위해 초원심분리법(ultracentrifugation)을 사용하였다. 회수한 배양액은 4℃에서 다음과 같이 순차적으로 원심분리하여 엑소좀을 분리하였다. 우선, 회수한 배양액으로부터 세포를 제거하기 위하여 300×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 상층액을 취하였다. 그리고, 상기 상층액으로부터 세포 잔해물(debris)을 제거하기 위해 2,000×g에서 20분 동안 원심분리를 후 상층액을 취하였다. 또한, 상기 상층액으로부터 마이크로베지클(Microvesicles)을 제거하기 위해 16,500×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 상층액을 취하였다. 최종적으로 수득한 상층액에 대해 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 수행한 후 상층액을 제거하고 펠렛을 취한 다음, 펠렛을 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 세척하였고, 다시 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 하여 상층액을 제거한 후 펠렛을 인산염 완충용액에 부유시켜 엑소좀을 분리하였다.
한편, 줄기세포를 포함한 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법으로는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 분리를 위해, 초미세여과법(ultrafiltration), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 그러나 엑소좀의 분리방법은 전술한 바와 같은 방법들에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법이 채택가능한 것임은 물론이다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석 및 생산성 평가
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA 분석 결과는 도 1에 도시하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 일 구체예에 따라 아스코르브산을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 엑소좀(이하, "실험군 1"이라 함)이 아스코르브산을 포함하지 않는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 엑소좀(이하, "실험군 2"라 함)에 비해 입자 크기 분포가 균일한 것을 알 수 있었다.
도 2에 도시된 바와 같은 NTA 비교 분석 결과, 아스코르브산을 포함하는 배지에서 전처리 및 배양한 줄기세포 유래의 엑소좀(실험군 1)의 생산성(즉, 단위 mL 당 엑소좀 입자수)이 아스코르브산 무처리 대조군(실험군 2)에 비해 대략 4배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.
추가로, 정확한 엑소좀의 생산성 비교 분석을 위해, 실험군 1 및 2 각각의 엑소좀과 엑소좀-휴먼 CD63 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™)을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 PE 마우스 항-인간 CD63(Mouse anti-Human CD63)(BD Parmigen™)과 반응시키고 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하였다.
한편, CD63은 엑소좀의 대표적인 포지티브 마커이므로 CD63의 함량과 엑소좀의 함량은 서로 선형성을 갖고 CD63 함량의 증가는 엑소좀 함량의 비례적인 증가를 의미한다. 이러한 원리에 따라, 농도를 알고 있는 인간 CD63 단백질을 연속 희석(serial dilution)하여 농도별 인간 CD63 단백질을 준비하고, 농도별 인간 CD63 단백질과 엑소좀-휴먼 CD63 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD63 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™)을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 PE 마우스 항-인간 CD63(Mouse anti-Human CD63)(BD Parmigen™)과 반응시키고 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하였다. 그리고 인간 CD63 단백질 농도값 및 이에 대응하는 MFI 측정값에 대해 선형 회귀 분석을 하여 선형성 0.99 이상을 만족하는 표준 정량분석 그래프를 생성한 후, 생성된 표준 정량분석 그래프를 이용하여 실험군 1 및 2 각각의 CD63 함량을 결정하였다.
그 결과, 아스코르브산을 포함하는 배지에서 전처리 및 배양한 줄기세포 유래의 엑소좀 함량(CD63 함량)이 무처리 대조군에 비해 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 이러한 결과로부터 본 발명은 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시킬 수 있어, 상업적 및/또는 임상적으로 유용하게 활용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 특히 종래의 방법과 비교하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (9)

  1. 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체와 우태아혈청(FBS)을 포함하는 배지에서 추가로 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 우태아혈청은 FBS 유래의 엑소좀 및 세포외 소포체가 제거된 것을 특징으로 하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 동물 유래 세포를 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 무혈청 배지에서 추가로 배양하는 단계를 포함하는, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL인, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 10 μg/mL 내지 100 μg/m인, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법.
  7. 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는, 동물세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 1 μg/mL 내지 300 μg/mL인, 동물세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아스코르브산, 이의 유사체 또는 유도체의 농도는 10 μg/mL 내지 100 μg/m인, 동물세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023064924A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Codiak Biosciences, Inc. Modified producer cells for extracellular vesicle production

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102284517B1 (ko) 2021-01-15 2021-08-02 주식회사 다산씨엔텍 인간 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 및 생성 촉진용 배지의 제조 방법
KR102368442B1 (ko) * 2021-02-19 2022-02-28 주식회사 엑소코바이오 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용
KR20240022018A (ko) 2022-08-10 2024-02-20 한스바이오메드 주식회사 생산성이 향상된 세포 유래 세포외 소포체 제조방법 및 그에 의해 제조된 세포외 소포체
CN116004724A (zh) * 2022-12-30 2023-04-25 暨南大学 过表达cd63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170114871A (ko) * 2016-04-06 2017-10-16 주식회사 제이제이메이딘 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법
KR20180035700A (ko) * 2016-09-29 2018-04-06 한양대학교 에리카산학협력단 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물
KR20180082980A (ko) * 2017-01-11 2018-07-19 주식회사 스템랩 나노그를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포로부터 획득한 엑소좀 내 포함된 육모 촉진용 조성물의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101877793B1 (ko) 2016-07-15 2018-07-13 주식회사 엔바이오텍 줄기세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 배양 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170114871A (ko) * 2016-04-06 2017-10-16 주식회사 제이제이메이딘 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법
KR20180035700A (ko) * 2016-09-29 2018-04-06 한양대학교 에리카산학협력단 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물
KR20180082980A (ko) * 2017-01-11 2018-07-19 주식회사 스템랩 나노그를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포로부터 획득한 엑소좀 내 포함된 육모 촉진용 조성물의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BODEGA, G. ET AL.: "Microvesicle : ROS scavengers and ROS producers", JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES, vol. 8, no. 1626654, 17 June 2019 (2019-06-17), pages 1 - 10, XP055808072 *
CHOI, E. S. ET AL.: "Evaluation of the enhanced antioxidant activity of curcumin within exosomes by fluorescence monitoring", BIOTECHNOLOGY AND BIOPROCESS ENGINEERING, vol. 23, 2018, pages 150 - 157, XP036502499, DOI: 10.1007/s12257-018-0058-2 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023064924A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Codiak Biosciences, Inc. Modified producer cells for extracellular vesicle production

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