KR20180035700A - 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 분화하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 분화에 영향을 주는 생체활성인자 발현율이 우수하고, 암 줄기세포의 리프로그래밍을 촉진, 약물 저항성이 약화된 암세포로 분화시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 세포 유래 물질로서 생체 적합성이 뛰어나며, 기존 화학 치료제의 부작용을 최소화할 수 있고, 엑소좀 자체가 캐리어 역할을 할 수 있어 담지한 성분을 인체에 쉽게 적용할 수 있으므로, 약물 저항성 암 치료제로 적용시 유리한 이점이 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 분화하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 하여, 약물 저항성 암 치료용 제재 또는 암 치료 전처리 조성물로 적용할 수 있다.

Description

분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating drug resistance cancer comprising exosomes extracted from stem cells which differentiate}
본 발명은 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
줄기세포를 무혈청 배지에 배양하고 그 배지로부터 얻은 세포 분비물(secretome) 또는 엑소좀(exosome)을 추출하는 기술이 개발되었고, 추출된 물질의 성분은 프로테오믹스(proteomics) 및 지노믹스(genomics) 기법을 통해 분석되었다. 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
종래에는 암 치료 방법으로 화학요법, 방사선 요법 등을 사용하였다. 화학요법은 주로 플라틴, 탁솔, 빈카 유래 알칼로이드 화합물이나 5-플루오우라실, 독소루비신 등 화학 치료제를 단일 혹은 복합적으로 투여하여 암세포의 세포증식 억제 및 사멸을 유도하는 방법이다. 그러나 대부분의 항암제는 오심과 구토, 탈모, 피부 및 손톱의 변색, 신경계 부작용 등 심각한 부작용을 일으키므로, 투여량 및 투여 기간에 한계가 있다. 방사선 요법은 고에너지의 방사선을 암 조직에 조사시켜 암세포의 사멸을 유도하는 방법이다. 암의 완치를 위해서는 화학요법 및 방사선 요법을 동시에 시행하는 경우가 일반적이다.
약물 저항성 암을 치료하기 위한 종래 기술로는, PDGFRα 및 PDGFRβ, bFGF 및/또는 VEGF-RTK의 기능을 억제하는 방법(국제특허 PCT/US2006/017922), 카제인 키나제 2(CK2) 펩티드 저해제를 이용하여 세포증식억제 약물에 대한 민감성을 높이는 방법(국제특허 PCT/CU2007/000010), 또는 암 줄기세포(Cancer stem cells)를 표적하여 치료하는 방법(국제특허 PCT/EP2014/001142) 등이 개시되었다.
구체적으로, 약물 저항성 암 치료 기술에는 화학 치료제, 카제인 키나제 2(CK2) 펩티드 저해제를 사용하거나, 암 줄기세포(cancer stem cells)를 표적화한 기술이 있다.
화학 치료제에 관한 국제특허 PCT/US2006/017922는 수용체 타이로신 키나제의 길항제로서, 특히 PDGFRα 및 PDGFRβ, bFGF 및/또는 VEGF-RTK 기능의 억제제로서 작용하는 화합물을 이용하여, VEGF-RTK의 억제제에 대한 필요가 있는 환자를 치료하는데 효과가 있는 것을 확인하였다.
카제인 키나제 2(CK2) 펩티드 저해제에 관한 국제특허 PCT/CU2007/000010는 CK2의 활성 증가가 세포의 저항성 증가 요인임에 따라, CK2 인산화 저해제(P15 펩티드) 및 약학적으로 허용가능한 세포증식억제 약물을 조합하여 제공한다.
암 줄기세포(Cancer stem cells)의 표적화에 관한 국제특허 PCT/EP2014/001142는 암 줄기세포 암의 바이오마커로서 O-아세틸화된-GD2 강글리오사이드를 인식하는 항체에 관련된 기술이다. 이러한 항체는 세포소멸(apoptosis) 및 다른 세포사멸 경로를 통한 암 줄기세포에 대한 직접적인 세포 독성을 포함하는, 종양(tumor) 세포들에 대한 내재적 포텐(potent)의 세포독성 활동을 보여줌이 확인되었다.
첫 번째 종래기술은 수용체 타이로신 키나제의 길항제의 역할을 하는 화합물을 이용하는 것으로, 특히 VEGF-RTK의 억제제에 대한 필요가 있는 환자에 대하여 효율적이나, 다양한 약물저항성 암 치료에 적용되는 데에 한계가 있다. 또한, 화합물로써 투여량 및 투여 기간에 한계가 있을 수 있다.
두 번째 종래기술은 카제인 키나제 2(CK2) 펩티드 저해제(P15 펩티드)를 약물저항성 암 치료용 조성물로 이용하는 것으로, CK2 활성을 보이는 암 줄기세포에만 적용 가능한 단점이 있어, 다양한 약물저항성 암 치료에 적용되는 데에 한계가 있다.
세 번째 종래기술은 암줄기세포의 바이오마커로써 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 인식하는 항체를 이용하는 것으로, 세포 표면에 O-아세틸화된-GD2 갱글리오사이드를 발현하는 암 줄기세포에만 적용 가능한 단점이 있어, 다양한 약물저항성 암 치료에 적용되는 데에 한계가 있다.
암의 재발은 암 조직 내에 존재하는 암 줄기세포(Cancer stem cells)에 의해 일어난다고 보고되고 있다. 암 줄기세포는 줄기세포와 유사한 능력을 갖는 것으로 여겨지는데, 암세포와 구분되는 특이적인 표면 마커를 가지며, 자가 재생 및 분화능력을 갖고 있다. 또한, 암 줄기세포가 특정 세포로 분화하는 경우 암 줄기세포의 약물 저항성이 낮아진다는 보고가 있다. 한편, 암 줄기세포는 약물 저항성을 일으키는 약물 트랜스포터(drug transporter)의 과발현을 특징으로 한다. 약물 트랜스포터의 과발현은 암세포 밖으로 약물을 배출함으로써, 약물에 의한 세포 사멸을 회피하여 암의 재발 및 2차 암 발생으로 연결된다. 따라서, 근본적으로 암 치료 효율을 향상시키고 암의 재발과 전이를 줄이기 위해서는 암 줄기세포를 약물 저항성이 약화된 암세포로 리프로그래밍 시키거나 표적하여 사멸시키는 치료제의 개발이 필요하다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 약물 저항성 암 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 암 줄기세포의 리프로그래밍을 촉진, 즉, 약물 저항성이 낮은 암세포로 분화시켜 암 치료 효율을 극대화할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
국제특허 PCT/US2006/017922 국제특허 PCT/CU2007/000010 국제특허 PCT/EP2014/001142
본 발명의 목적은 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 투여하여 방사선 또는 약물 저항성 암을 치료하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 투여하여 방사선 또는 약물 저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력뿐만 아니라, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우, 다중분화능(multi potency)의 특성에 의해 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 특성이 있으며, 지방, 골수, 제대혈 및 태반 등에 포함되어 있으며, 심근경색, 뇌경색, 퇴행성 관절염 및 골절 등의 다양한 세포손상질환을 치료하는데 활용될 수 있는 세포이다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.
본 발명에서 용어 "분화되고 있는 줄기세포"란, 도 1과 같이 줄기세포로부터 골세포(osteocyte) 또는 지방세포(adipocyte)로 분화하는 중에 있는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 골세포 또는 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.
구체적으로, 줄기세포가 골세포 또는 지방세포로 분화할 때 세포의 모양 및 특성이 변하는데, 이때 엑소좀을 추출하는 것이다. 따라서 일반 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 것과 다르다고 볼 수 있다.
상기 "분화하는 중에 있는 줄기세포"는 이에 제한되지는 않으나, 골세포 또는 지방세포로 분화 가능한 줄기세포일 수 있으며, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화 가능한 줄기세포일 수 있다.
상기 "분화 가능한 줄기세포"는 이에 제한되지는 않으나, 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 "골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포"는 이에 제한되지는 않으나, 인체 또는 동물 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 40~120nm 크기의 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 엑소좀은, 이에 제한되지는 않으나, 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포로부터 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화 중에 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이다.
상기 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포 등 각각의 다양한 종류의 세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있으며, 줄기세포의 특성에 따라 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있어, 항종양 면역 반응 유도에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다.
또한, 상기 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포 등 각각의 다양한 종류의 세포로 분화시 각 세포에 따른 중요한 성장인자, 여러 생체활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 인간 지방 유래 줄기세포에서 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 CD133+ 골암 줄기세포(CD133+ MG63)에서 골세포로 분화 유도시 ALPL(Alkaline phosphatase), BGLAP(Osteocalcin), RUNX2(Runt-related transcription factor 2), COL1A1(Collagen, type I, alpha 1) 등과 같은 골세포 분화 관련 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였다(도 4 및 도 5).
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 하기의 단계를 포함하는 추출 방법에 의하여 수득할 수 있다:
1) 줄기세포를 일반 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대 배양하는 단계;
2) 상기 계대 배양하여 증식시킨 줄기세포를 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화시키는 단계; 및
3) 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출 및 정제하는 단계.
구체적으로, 상기 단계 1)의 줄기세포는, 이에 제한되지는 않으나, 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있고, 예를 들어 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 지방 유래 줄기세포는 인체 또는 동물 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 단계 1)에서 일반 배양 배지는, 당업계에 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지, MEM(minimal essential medium) 배지, 또는 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institute 1640) 배지일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G(penicilli G), 스트렙토마이신 설페이트(sterptomycin sulfate) 및 젠타마이신(gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B(amphotericin B) 및 니스타틴(nystatin) 등의 항진균제(antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
구체적으로, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지일 수 있다. 또한, 이에 제한되지는 않으나, 혈청(serum), 항생제(antibiotics) 및 페놀레드(phenol red)가 첨가되지 않은 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(passage 7 또는 8)를 배양하고, 상기 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다(비교예 1).
상기 단계 2)에서 "줄기세포를 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화"는 줄기세포(stem cell)가 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화(differentiation)되도록 유도하는 배지 조성물을 이용하여 이루어질 수 있다.
상기 분화 유도용 배지 조성물은 줄기세포를 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포와 같은 목적으로 하는 세포로 분화시키기 위하여 덱사메타손(dexamethasone), 인슐린(insulin), 아스코르브산(ascorbate), 연골형성 성장인자 IGF(Insulin-like Growth Factor) 및 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 골세포 분화 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 아스코르빈산(ascorbic acid), 0.01 M 베타-글리세로인산(β-glycerophosphate)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco Modified Eagle Medium))를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3 내지 7)를 배양하고, 상기 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다(실시예 1).
본 발명의 일실시예에 있어서, 지방세포 분화 배지(5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 1 ㎍/㎖ 인슐린(insulin), 100 μM 인도메타신(indomethacin), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose))를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3 내지 7)를 배양하고, 상기 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다(실시예 1).
상기 단계 3)에서 "분화되고 있는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출 및 정제"는 이에 제한되지는 않으나, 상기 분화되고 있는 줄기세포의 배양 상층액을 원심분리 및 여과를 통해 최종적으로 분리 및 정제될 수 있다.
상기 원심분리는, 이에 제한되지는 않으나, 250 내지 500 xg에서 5 내지 10분간 수행하는 것일 수 있으며, 또는 8,000 내지 12,000 xg에서 25 내지 45분간 수행하는 것일 수 있으며, 80,000 내지 120,000 xg에서 60 내지 80분간 수행하는 것일 수 있다.
상기 여과는 다양한 포어 크기의 필터를 이용하여 단계적으로 여과할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 4 ㎛ 포어 크기를 갖는 셀 스트레이너(cell strainer), 0.22 ㎛ 포어 크기를 갖는 필터(filter), 및 500 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터를 이용하여 단계적으로 여과할 수 있다.
본 발명에서 용어 "저항성 암"은 "내성 암"과 동일한 의미로 사용되는 것으로, 본 발명에서는 혼용하여 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 "내성 암"이란 항암제 치료 또는 방사선 치료 등에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어 상기 치료법에 의하여 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성 암은 특정한 항암제 또는 방사선 치료에 대하여 처음부터 내성을 가질 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암세포 내의 유전자가 변이되어 동일한 치료제에 대하여 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내성 암은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 방사선 치료 또는 항암제 치료에 대하여 내성을 나타내는 모든 암이 될 수 있다.
상기 방사선 치료 또는 항암제 치료에 대하여 내성을 나타내는 모든 암은 이에 제한되지는 않으나, 폐암, 유방암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 피부암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 신장암, 섬유육종, 흑색종 또는 혈액암일 수 있다.
본 발명에 있어서, "약물 저항성 암"은 암종별로 특정한 약물, 즉 항암제에 대하여 저항성, 즉 내성을 갖고 있거나, 또는 장기적으로 특정 항암제를 투여할 때, 암세포가 약물 내성을 획득하여 항암 효과를 제대로 볼 수 없게 되는 경우에 발생될 수 있는 것으로, 지금까지 알려진 암세포가 내성을 나타내는 항암제로는 주로 친수성의 양쪽 친매성 약물, 예를 들어, 탁산(taxane), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid) 계열 약물(vinorelbine, vincristine, vinblastine), 안스라사이클린(anthracycline) 계열약물(doxorubicin, daunorubicin, epirubicin), 에피도필로톡신(epidophyllotoxin: etoposide, teniposide), 대사길항제(antimetabolites: methorexate, fluorouracil, cytosar, 5-azacytosine, 6-mercaptopurine, gemcitabine), 토포테칸(topotecan), 닥티노마이신(dactinomycin), 미토마이신(mitomycin) 등의 항암 약물을 사용하였을 경우 나타날 수 있다.
본 발명에서 "항암제"는 이에 제한되지는 않으나, 대사길항제, 알킬화제, 항종양 항생제, 식물알칼로이드, 유사분열억제제, 호르몬제 또는 백금함유 화합물일 수 있다.
상기 항암제는 엽산 유도체(methotrexate), 퓨린 유도체(6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘 유도체(5-fluorouracil, cytarabine) 등의 대사길항제(antimetabolites); 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물(busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물(dacarbazine) 등의 알킬화제(alkylating agent); 악티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항종양 항생제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등의 유사분열억제제(antimitotic drugs); 또는 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제; 시스플라틴 같은 백금함유 화합물 등인 것일 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 효과적인 내성 암 치료를 위한 효능 물질로서, 분화하는 줄기세포로부터 추출, 정제된 엑소좀을 사용한다는 점에서 종래 기술들과 차별성이 있다.
상기 분화하는 줄기세포로부터 추출, 정제된 엑소좀은 줄기세포 또는 암 줄기세포 분화에 영향을 주는 생체활성인자 발현율이 우수하며, 암 줄기세포 또는 암세포를 효율적으로 분화시켜 약물 저항성을 낮추는 효과가 있다.
즉, 줄기세포가 분화되는 기간 동안 추출, 정제된 줄기세포 유래 엑소좀은 암 줄기세포의 리프로그래밍을 촉진, 약물 저항성이 낮은 암세포로 분화시킬 수 있으며, 세포 유래 물질이기 때문에 생체 적합성이 뛰어나며, 흡수율 또한 우수하다.
따라서, 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물에 의해 암 줄기세포의 리프로그래밍을 촉진, 약물 저항성이 낮은 암세포로 분화시킴으로써, 내성 암 치료 효율을 극대화 시킬 수 있어 내성 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 인간 지방 유래 줄기세포에서 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 CD133+ 골암 줄기세포(CD133+ MG63)에 처리한 경우, 골세포 분화 관련 유전자의 발현량이 증가, 즉 골세포로의 효율적 분화 유도와 더불어, 약물 저항성 유전자의 발현율은 억제됨을 확인하였으며, 약물 저항성을 일으키는 약물 트랜스포터 유전자(drug transporter gene)의 발현량 또한 현저히 낮아짐을 확인하였다(도 5 내지 도 7).
본 발명에 있어서, 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 본 발명에 따른 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은, 이에 제한되지는 않으나, 1 내지 200 ㎍/㎖의 농도로, 또는 5 내지 150 ㎍/㎖의 농도로, 또는 10 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 약학 조성물에 포함되어 암세포, 암 줄기세포, 또는 내성 암 세포에 처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 상황에 따라 방사선 또는 항암제와 동시, 분리 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 방사선 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 방사선 치료 또는 항암 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있으며, 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 세포 분화와 관련된 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 포함하며, 이로 인하여 상기 엑소좀은 줄기세포를 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포와 같은 특정 세포로 분화시킬 수 있으며, 특히 암 줄기세포를 약물 저항성이 현저히 낮은 암세포로 분화시킬 수 있다.
이에 따라, 화학 항암요법 내성 극복 또는 방사선 치료 내성 극복을 위해 효과적으로 사용될 수 있는 바, 항암 약물 치료 내성 환자 또는 방사선 치료 내성 환자 치료에 효과적이다.
본 발명에 있어서, 상기 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물 저항성 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명에 따른 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 약학적으로 유효한 양은 약물 저항성 암의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 폐포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton-Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo)사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 모든 방식에 의해 투여될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
구체적으로, 투여 방법은 이에 제한되지는 않으나, 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 정맥 내로 투여(정맥주사; Intravenous injection)하거나, 대상체의 폐 또는 기관 내로 투여(국소 투여; Topical administration)하거나, 흡입(inhalation)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 네블라이져(nebulizer)을 사용하여 투여될 수 있으며, 기관 내 튜브를 사용하여 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 방사선 또는 약물 내성 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 내성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 약학 조성물을 개체에 단독으로 투여할 수도 있고, 방사선 조사를 수행하면서 상기 약학조성물을 투여할 수도 있으며, 본 발명의 약학 조성물과 다른 항암치료용 조성물(예를 들어, 독소루비신, 빈블라스틴 등)을 병용하여 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내성 암은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란 상기 내성 암이 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 내성 암을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써, 방사선 또는 약물내성 암이 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 저항성 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 분화하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 분화에 영향을 주는 생체활성인자 발현율이 우수하고, 암 줄기세포의 리프로그래밍을 촉진, 약물 저항성이 약화된 암세포로 분화시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 세포 유래 물질로서 생체 적합성이 뛰어나며, 기존 화학 치료제의 부작용을 최소화할 수 있고, 엑소좀 자체가 캐리어 역할을 할 수 있어 담지한 성분을 인체에 쉽게 적용할 수 있으므로, 약물 저항성 암 치료제로 적용시 유리한 이점이 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물은 분화하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 하여, 약물 저항성 암 치료용 제재 또는 암 치료 전처리 조성물로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포 또는 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 도로, (A) 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 상기 엑소좀의 구조와 모양, 및 (B) 나노입자분석기(dynamic light scattering)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기를 나타낸 도이다. 여기에서, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-Exo)을 대조군으로 사용하였으며, 스케일 바(Sacle bar)는 50 nm를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 21일 동안 농도별(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)로 처리하여 인간 지방 유래 줄기세포를 골세포로 분화 유도한 결과를 나타낸 도로, (A)는 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red s staining) 결과, 및 (B) 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red s staining)된 줄기세포를 10% 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 이용하여 탈 염색하여 562 nm에서 흡광도를 측정한 Calcium detection assay 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, DM은 골세포 분화 배지(differentiation medium)이고, P-Exo는 증식하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이며, GM은 세포 배양 배지(growth medium)이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 CD133+ 골암 줄기세포(CD133+ MG63)에 14일 동안 농도별(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 30 ㎍/㎖)로 처리하여 골암 줄기세포를 골세포로 분화 유도한 결과를 나타낸 도로, (A) 14일 동안 농도별(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 30 ㎍/㎖)로 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 후의 골암 줄기세포의 현미경 관찰 사진 및 (B) 14일 동안 농도별(5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 30 ㎍/㎖)로 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 후, 골세포 분화 유전자인 ALPL(Alkaline phosphatase), BGLAP(Osteocalcin), RUNX2(Runt-related transcription factor 2) 및 COL1A1(Collagen, type I, alpha 1)의 상대적 변화를 나타낸 그래프이다. 여기에서, GM은 세포 배양 배지(growth medium)이고, D-Exo는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 Human Osteogenesis PCR array 분석을 수행하여 골세포 분화 유전자의 발현율을 나타낸 도로, (A) 골암 줄기세포에 14일 동안 세포 배양 배지(GM, 음성대조군)를 처리한 그룹 및 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹의 상대적 유전자 발현율을 나타낸 그래프 및 (B) 세포 배양 배지(GM, growth medium)를 처리한 음성대조군 대비 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹에서 과발현된 골세포 분화 관련 유전자를 나타낸 표이다. 여기에서, GM은 세포 배양 배지(growth medium)이고, D-Exo는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 PCR 어레이를 이용하여 약물 저항성 유전자의 발현율을 나타낸 도로, (A) 골암 줄기세포에 14일 동안 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹과 상기 엑소좀(D-Exo)을 처리하지 않은 그룹의 상대적 유전자 발현율을 나타낸 어레이 결과 및 (B) 상대적 유전자 발현율을 수치화한 표를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 약물 트랜스포터(drug transporter)의 상대적 유전자 발현율을 나타낸 도이다. 여기에서, CSC는 골암 줄기세포에 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 무처리한 그룹이고, CSC + D-Exo는 골암 줄기세포에 14일 동안 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 골세포 또는 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 엑소좀의 추출
골세포 또는 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 각각의 엑소좀을 추출하기 위하여, 패시지(passage) 3 내지 7까지 계대 배양(sub-culture)한 인간 지방 유래 줄기세포를 골세포 분화 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 아스코르빈산(ascorbic acid), 0.01 M 베타-글리세로인산(β-glycerophosphate)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco Modified Eagle Medium)), 또는 지방세포 분화 배지(5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 1 ㎍/㎖ 인슐린(insulin), 100 μM 인도메타신(indomethacin), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose))에서 각각 배양하면서 3일에 한 번씩 24시간 동안 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 분화하고 있는 줄기세포의 배양 상층액을 회수하여 엑소좀(D-Exo)을 추출하였다.
상기 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 10,000 xg에서 30분간 원심분리하여 세포 분비물을 제거하였다. 이후, 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 xg에서 70분간 원심분리하여 엑소좀 침전물을 얻었다. 이후, 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)를 넣어 100,000 xg에서 70분간 총 2회 세척하였다. 세척한 엑소좀 침전물은 인산완충식염수에 재현탁하였다.
비교예 1: 증식하는 줄기세포로부터 엑소좀(P-Exo)의 추출
골세포 또는 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출한 엑소좀의 효능을 비교하기 위해, 패시지(passage) 3 내지 7까지 계대 배양(sub-culture)한 인간 지방 유래 줄기세포를 일반 배양 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium))에서 배양한 후 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하여 얻은 상층액으로부터, 증식하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀(P-Exo)을 추출하여 비교 대조군으로 사용하였다.
상기 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 10,000 xg에서 30분간 원심분리하여 세포 분비물을 제거하였다. 이후, 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 100,000 xg에서 70분간 원심분리하여 엑소좀 침전물을 얻었다. 이후, 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)를 넣어 100,000 xg에서 70분간 총 2회 세척하였다. 세척한 엑소좀 침전물은 인산완충식염수에 재현탁하였다.
실시예 2: 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 특성 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1로부터 추출한 엑소좀을 투과전자현미경(transmission electron microscope)과 나노입자분석기(dynamic light scattering)를 사용하여 크기 및 모양을 확인하였다.
그 결과, 각각 추출된 엑소좀의 모양을 투과전자현미경으로 확인할 수 있었으며(도 2의 A), 엑소좀의 크기는 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 크기는 평균적으로 약 78.52 nm, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-Exo)의 크기는 평균적으로 약 87.17 nm 인 것을 확인하였다(도 2의 B).
실시예 3: 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 이용한 인간 지방 유래 줄기세포의 골세포 분화 유도
인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 분화 유도 능력을 확인하기 위하여, 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 이때, 비교 대조군으로서 증식하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-Exo)을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo) 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖ 농도를 일반 배양 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium))에 추가하여 사용하였다. 상기 배지 조성물을 배양된 인간 지방 유래 줄기세포(hASCs, human adipose-derived stem cells)에 각각 처리한 후, 상기 배지 조성물을 3일에 한 번씩 14일간 교체하였다. 이때, 음성대조군(Growth medium, GM)은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지에서 배양된 줄기세포를 사용하였으며, 양성대조군(Differentiation medium, DM)은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 아스코르빈산(ascorbic acid), 0.01 M 베타-글리세로인산(β-glycerophosphate) 이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지에서 배양된 줄기세포를 사용하였다.
이후, 14일 동안 골세포로의 분화가 유도된 줄기세포에 대하여, 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red s staining)을 이용하여 세포의 분화 여부를 분석하였다. 또한, 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin red s staining)된 줄기세포를 10% 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 이용하여 탈 염색하여 562 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분화 정도를 정량화 하였다.
그 결과, 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 10 ㎍/㎖ 이상의 농도로 14일 동안 처리시, 양성대조군과 유사한 수준으로 골세포 분화가 유도되는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 반해 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-Exo)을 처리한 줄기세포의 경우, 골세포로 분화되지 않고 증식만 이루어지는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 4: 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 이용한 골암 줄기세포의 골암 세포 분화 유도 및 PCR 어레이를 이용한 골세포 분화 유전자의 발현율 분석
인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 분화 유도 능력을 확인하기 위하여, 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo) 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 30 ㎍/㎖ 농도를 일반 배양 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium))에 추가하여 사용하였다. 상기 배지 조성물을 배양된 CD133+ 골암 줄기세포(CD133+ MG63)에 각각 처리한 후, 상기 배지 조성물을 3일에 한 번씩 14일간 교체하였다. 이때, 음성대조군(Growth medium, GM)으로서 3% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지에서 배양된 줄기세포를 사용하였다.
이후, 14일 동안 골세포로의 분화가 유도된 골암 줄기세포에 대하여, PCR 분석 기법을 이용하여 세포의 분화 여부를 분석하였다.
그 결과, 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 30 ㎍/㎖ 이상의 농도로 14일 동안 처리시, 음성대조군과 비교하여 ALPL(Alkaline phosphatase), BGLAP(Osteocalcin), RUNX2(Runt-related transcription factor 2) 등 골세포 분화 유전자가 2 내지 45배 이상 높게 발현됨을 확인하였다(도 4).
또한, Human Osteogenesis PCR array 분석을 통한 mRNA 발현량을 정량한 결과, 총 73종류의 골세포 분화 관련 유전자 중 27개의 유전자가 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹에서 2배 이상 더 많이 발현되었음을 확인하였다(도 5).
실시예 5: PCR 어레이를 이용한 약물 저항성 유전자의 발현율 분석 및 약물 트랜스포터(drug transporter)의 상대적 유전자 발현율 분석
인간 지방 유래 줄기세포로부터 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)의 골암 줄기세포 약물 저항성 억제 능력을 확인하기 위하여, 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo) 30 ㎍/㎖ 농도를 일반 배양 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium))에 추가하여 사용하였다. 상기 배지 조성물을 배양된 CD133+ 골암 줄기세포(CD133+ MG63)에 처리한 후, 상기 배지 조성물을 3일에 한 번씩 14일간 교체하였다. 이때, 음성대조군(Growth medium, GM)으로서 3% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지에서 배양된 줄기세포를 사용하였다.
이후, 14일 동안 골세포로의 분화가 유도된 골암 줄기세포에 대하여, PCR 분석 기법을 이용하여 골암세포의 약물 저항성과 관련된 유전자에 대해 정량 분석하였다.
그 결과, 총 84종류의 약물 저항성 관련 유전자 중 64개의 유전자가 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-Exo)을 처리한 그룹에서 억제된 것을 확인하였다(도 6의 A). 특히, APC, BLMH, BRCA1, BRCA2, DHFR, MSH2, NAT2, RARB, 및 XPC 유전자는 10 내지 415배 억제된 것을 확인하였다(도 6의 B).
또한, 약물 저항성에 직접적인 영향을 미치는 약물 트랜스포터 유전자(drug transporter gene) 중 ABCC1, ABCC5, ABCG2, 및 MVP 유전자의 발현이 현저히 낮아짐을 확인하였다(도 7).

Claims (8)

  1. 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분화되고 있는 줄기세포는 골세포, 지방세포, 연골세포, 근세포, 섬유아세포, 성상세포 또는 신경세포로 분화 가능한 줄기세포인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분화 가능한 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포는 인체 또는 동물 유래 줄기세포인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀이 1 내지 200 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 방사선 또는 항암제와 동시, 분리 또는 순차적으로 사용되는 것인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항암제는 대사길항제, 알킬화제, 항종양 항생제, 식물알칼로이드, 유사분열억제제, 호르몬제 또는 백금함유 화합물인 것인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 약물 저항성 암은 폐암, 유방암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 피부암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 신장암, 섬유육종, 흑색종 또는 혈액암인 약물 저항성 암 치료용 약학 조성물.
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