KR102560912B1 - 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료, 예방 또는 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

세포 유래 물질로서 안전성이 뛰어나고, 기존 사용되고 있는 항암제의 부작용을 최소화할 수 있는 유효성분으로서 엑소좀을 포함하는, 암 치료, 예방 또는 암 전이 억제를 달성하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료, 예방 또는 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing lung cancer or inhibiting cancer metastasis, comprising exosomes as an active ingredient}
본 발명은 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 본 발명은 세포 유래 물질로서 안전성이 뛰어나고, 기존 사용되고 있는 항암제의 부작용을 최소화할 수 있는 유효성분으로서 엑소좀을 포함하는, 폐암 치료, 예방 또는 폐암 전이 억제를 달성하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
폐암(lung cancer)이란 폐에서 비정상적인 암 세포가 무절제하게 증식하여 종괴(덩어리)를 형성하고 인체에 해를 미치는 질환을 의미하며, 폐 내에 국한되어 발견되기도 하지만 진행되면 반대쪽 폐뿐만 아니라 임파선이나 혈액을 통하여 온몸으로 전이될 수 있다.
미국에서는 남자는 연간 99,000명, 여자는 78,000명 정도가 폐암으로 진단을 받으며, 진단 5년 이내에 86% 정도가 사망에 이른다. 국내 한국인 사인 분류 통계에 의하면 폐암은 지속적으로 증가하고 있고, 사망률 또한 꾸준히 증가하고 있다.
이러한 폐암 중에서도 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC)은 상피성 암(carcinoma)의 일종으로 소세포성 폐암(small-cell lung cancer)이 아닌 모든 상피성 폐암(epithelial lung cancer)을 일컬으며, 폐암 전체의 약 85% 내지 90%를 차지한다. 비소세포성 폐암의 증상은 지속적인 기침, 흉부 통증, 체중감소, 손톱 손상, 관절 통증, 호흡의 단기화(shortness of breath) 등이 있으나, 비소세포성 폐암은 일반적으로 천천히 진행되기 때문에 초기에는 그 증상을 거의 나타내지 않아 조기 발견 및 치료가 어렵고, 뼈, 간, 소장 및 뇌 등 전신에 전이된 후에야 발견될 가능성이 높다.
비소세포성 폐암 중 초기의 비전이성(non-metastatic) 비소세포성 폐암의 경우 시스플라틴과 관련된 보조적인 화학요법과 함께 수술을 하게 된다. 반면에 초기 단계를 지나 전이성 비소세포성 폐암으로 발달한 경우에는 다양한 화학 요법 및 방사선 치료가 이루어진다.
엑소좀은 한 세포로부터 다른 세포로 특정 성분을 운반하는 중요한 매개체로서, 이를 받아들이는 세포의 유전자 발현 변화를 야기할 수 있다고 알려져 있다. 엑소좀은 세포외 운반체(extracellular vesicles)로서 역할을 하며 줄기세포를 비롯한 다양한 세포로부터 분비되어 혈액, 체액(biological fluid), 뇨 및 세포배양액에 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 엑소좀은 세포내 엔도좀 트래피킹 과정을 통해 생성된 후기 엔도좀과 원형질막의 융합을 통해 생성된다.
엑소좀은 해당 세포에서 발현하고 있는 특정 단백질과 mRNA 전사체를 포함하고 있을 뿐만 아니라 중요하게도 RNA 자체로서 유전자의 발현을 조절하는 다양한 small non-coding RNA(microRNA, piRNA 등)들도 함유되어 있다. 따라서 엑소좀은 기원한 해당 세포의 유전적 특성을 반영하고 있다고 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허공보 제10-2019-0097201호
본 발명의 목적은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료, 예방 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)에서 유래한 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는, 암 치료, 예방 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 지방줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여하는 경우, 폐암의 예방, 치료 및/또는 전이 억제 효과를 거둘 수 있다는 놀라운 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
바람직한 구현예에서 상기 폐암은 폐암(lung cancer)이며, 보다 구체적으로 상기 폐암은 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC) 또는 전이성 비소세포성 폐암일 수 있다. 상기 폐암이 전이성 암인 경우, 본 발명의 지방줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것에 의하여 폐암 전이를 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하고 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀은 유전적 인자를 내포하여 한 세포에서 다른 세포로 그 유전적 인자의 정보를 전달하는 역할을 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 지방줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 증식된 지방줄기세포로부터 추출한 것으로서 40~100 nm, 바람직하게는 50~80 nm, 더 바람직하게는 60~70 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 이러한 직경을 갖는 본 발명의 엑소좀은, 증식된 지방줄기세포를 일반 배양배지에서 배양한 후 분자량 컷오프(Molecular Weight Cut-Off)가 200~400 kDa, 바람직하게는 250~350 kDa인 필터를 사용하여 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 지방줄기세포유래 엑소좀은 TGF-β(Transforming growth factor-β), IL-10(Interleukin-10) 및 IL-13(Interleukin-13)과 같은 항염증과 관련된 사이토카인을 포함할 수 있으며, 또한 miR-4440, miR-4775, miR-553, miR-548 및 miR-1277로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양 억제와 연관된 1 이상의 miRNA를 포함할 수 있다.
상기와 같은 엑소좀은 본 발명의 약학적 조성물 중에 1Х108 에서 1Х1011 particles/mL까지의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
지방, 골수, 제대혈 등 다양한 출처로부터 유래한 줄기세포는, 그 출처 조직에 따라 서로 상이한 치료적 잠재력을 갖는 것으로 알려져 있다(Jin et al., Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, Int J Mol Sci. 2013 Sep; 14(9): 17986-18001).
예컨대 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Human adipose-derived stem cells; Stem-EXO), 피부각질세포로부터 추출한 엑소좀(Human epidermal keratinocytes; K-EXO) 및 피부섬유아세포로부터 추출한 엑소좀(Human foreskin fibroblasts; F-EXO)은 내부에 포함되어 있는 생체활성인자가 서로 상이함이 확인되었다(WO2016-072821 A1).
또한 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포 등 줄기세포의 출처에 따라서도 엑소좀이 상이한 특성을 가짐이 확인되었다.
본 발명의 유효성분으로 사용하는 엑소좀은 지방줄기세포로부터 유래한 것으로서, 바람직하게는 증식된 지방줄기세포로부터 유래한 것일 수 있다. 지방줄기세포는 골수 또는 제대혈에서 유래된 줄기세포와 세포형태와 면역 표현형에서 비슷하지만, 상이한 치료적 잠재력을 가진다. 구체적으로 지방조직이 아닌 다른 조직에서 유래한 줄기세포로부터 추출한 엑소좀은 오히려 암을 서포트(support)하는 것으로 확인되었다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 엑소좀은 인체 또는 동물 유래 지방줄기세포로부터 유래한 것이며, 더 바람직하게는 상기 조성물을 투여 받을 환자의 자가 지방줄기세포에서 유래한 것일 수 있다.
지방조직은 자가 지방에서 추출하므로 면역거부 반응 등의 위험이 없으며, 윤리적으로도 문제가 없고, 지방조직 추출 또는 흡입 시술은 지방줄기세포를 추출할 때 개체에게 줄 수 있는 통증 및 부담감이 골수 또는 제대혈 등의 조직에서 줄기세포를 얻는 경우와 비교할 때 크게 적다는 장점이 있다.
또한 환자로부터 얻을 수 있는 골수 및 혈액의 양은 크게 제한되어 있는 반면, 지방줄기세포는 풍부한 지방조직으로부터 얻어지므로, 엑소좀 추출을 위한 원재료로서 용이하게 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 전술한 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th edition, 1995)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여용일 수 있다. 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 치료 부위에 이식을 필요로 하는 기존의 침습적 투여 방법과는 달리, 정맥을 통해 전신 투여(systemic administration)하는 경우에도, 탁월한 암 치료, 예방 및 암 전이 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은, 암 특히 폐암 예방 및 치료 효과를 가지며, 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것에 의하여 폐암 전이를 억제하는 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 실시예 1-2에 따라 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 상기 엑소좀의 구조와 모양을 나타내고, (b)는 나노입자분석기(dynamic light scattering)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기를 나타낸 것이다. 스케일 바(Sacle bar)는 100 nm를 나타낸다. (c)는 유세포분석기(Flow cytometry)을 통해 엑소좀의 표면마커(CD9, CD63, CD81), 골지체 단백질(Golgi matrix protein, GM130) 및 소포체 막단백질(Endoplasmic reticulum membrane protein, Calnexin)을 확인한 결과를 나타낸 것이고, (d)는 나노입자 전위차 분석기(Zetasizer)를 이용하여 엑소좀 표면 전위차(Zeta potential)를 나타낸 결과이다.
도 2는 실시예 3-4에 따른 인간지방줄기세포 엑소좀의 싸이토카인 및 microRNA를 프로파일한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 5에 따른 인간지방줄기세포 엑소좀의 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 증식 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 실시예 6에 따른 인간지방줄기세포 엑소좀의 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 세포 이동 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 실시예 7에 따른 인간지방줄기세포 엑소좀의 폐암 이식 쥐에서의 암 증식 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 폐암 이식 쥐에 인간지방줄기세포 고농도의 엑소좀을 투여한 후 체중, 간, 췌장, 신장의 무게를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 인간지방줄기세포로부터 엑소좀 ( HADSC - Exo ) 추출
증식된 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위하여, 인간지방 줄기세포(passage 5)를 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM contating 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양한 후 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하여 얻은 세포 배양 상층액을 회수하였다. 이로부터, 인간지방 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 μm 가공 크기를 갖는 filter를 이용하여 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 300 kD molecular weight cut off(MWCO)를 갖는 filter를 이용하여 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다. 엑소좀은 사용 전까지 -70 ℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 2: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 확인
실시예 1의 인간지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM), 나노입자분석기(Nanoparticle tracking analysis, NTA), 유세포분석기(Flow cytometry) 그리고 전위차 분석기(Zetasizer)를 이용하여 엑소좀의 크기, 형태, 농도와 순도 및 CD 표면마커를 확인하였다(도 1).
추출된 엑소좀의 모양을 투과전자현미경으로 확인하기 위해 2.5% paraformaldehyde 용액에 10분 동안 고정시킨 후 Grid 위에 올리고 2% Uranyl acetate 용액에 염색을 실시하였다. 그 결과, 구형의 나노입자형태가 관찰되었다(도 1a).
엑소좀의 농도를 평가하기 위해서 엑소좀은 하나의 프레임 당 화면으로 확인되는 나노입자수가 30 내지 40 개의 범위 안에 들어올 수 있도록 샘플희석(희석용액; 1X phosphate buffer saline(PBS) solution)을 실시하여 측정하였다(도 1b). 추출한 엑소좀 농도는 평균적으로 1.0 × 1010 particle/mL이고, 평균 크기는 64.6 nm 내외, 엑소좀 표면 전위차는 - 16 mV 내외임을 확인하였다(도 1d).
또한, 엑소좀 막 표면 마커들로 알려진 CD9, CD63, CD81을 유속분석기를 통해 발현정도를 확인하였다. CD63 항체가 결합되어 있는 마그네틱 비드와 엑소좀을 결합시킨 후, 엑소좀 표면마커(CD9/63/81), 골지체 마커(GM130) 및 소포체 막단백질 마커(Calnexin) 항체와 각각 반응시켰다. 이때 음성대조군으로 mouse IgG1 항체를 사용하였다. 형광표지인자를 엑소좀 표면에 부착한 후 유속분석기로 엑소좀 표면 마커의 발현을 확인하였다(도 1c).
실시예 3: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀 싸이토카인 분석
상기 실시예 1로부터 추출한 엑소좀 내 싸이토카인을 분석하기 위하여, microarray를 실시하였다. Microarray는 항원-항체반응을 통해 이루어지며, 레이저 스캐너(GenePix 4000B)를 통해 측정된 형광(Streptavidin-Cy3) 발현 정도를 heatmap으로 표현하였다(도 2a). 총 80 종류의 cytokine 중 항염증과 관련된 Transforming growth factor-β(TGF-β), Interleukin 10(IL 10), Interleukin 13(IL 13)이 엑소좀 내에 많이 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀 microRNA 분석
상기 실시예 1로부터 추출한 엑소좀 내 microRNA를 프로파일링하기 위하여, miRNA microarray를 실시하였다. 구체적으로, RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 엑소좀의 miRNA를 분리하고 정제하였다. 엑소좀 miRNA는 Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix)를 이용하여 miRNA microarray 영상을 스캔하였으며, Affymetrix Expression Console software를 이용하여 엑소좀에 발현되는 microarray 결과를 분석하였다(도 2b). 그 결과 종양 억제와 연관된 miRNA(miR-4440, miR-4775, miR-553, miR-548 family, miR-1277)가 엑소좀 내에 과발현되는 것을 확인하였다.
실시예 5: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 증식 억제 효과
상기 실시예 1로부터 추출한 엑소좀의 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 증식 억제 효능을 평가하기 위해, in vitro 세포 증식 평가를 실시하였다.
구체적으로, 폐섬유아세포(MRC5)와 폐암세포(비소세포성, A549)를 96-웰 플레이트(well plate)에 각각 3,000 개씩 분주하고, FBS가 포함되지 않은 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS)가 포함된 RPMI1640(Gibco) 배지에서 24시간동안 세포 부착을 유도하였다. 부착 후, FBS가 포함되지 않은 RPMI1640에 1Х109 particles/mL의 엑소좀이 혼합된 배지로 배양액을 교체하였다. 이때 대조군으로는 FBS와 엑소좀 모두 혼합되지 않은 RPMI1640 배지에 엑소좀과 동일한 부피의 phosphate buffered saline(PBS)를 혼합하여 사용하였다. 48시간과 72시간 배양 후, 각각의 well에 WST-1(Roche) 10 μL을 처리하여 반응시키고 420 ~ 480 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 증식률을 평가하였다.
엑소좀이 함유된 배지에서 정상 폐섬유아세포와 폐암세포를 배양한 결과, 정상 폐섬유아세포의 경우 엑소좀을 처리함에 따라 통계적으로 유의하게 세포 증식이 유도되었다(P<0.001)(도 3a). 반면, 폐암세포의 경우 엑소좀을 처리함에 따라 유의하게 세포 증식이 억제되었는데, 특히 1Х109 particles/mL의 엑소좀이 함유된 배지에서는 48시간부터 세포 증식이 확실하게 억제되는 것을 확인하였다(P<0.001) (도 3b).
실시예 6: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 세포 이동 억제 효과
상기 실시예 1로부터 추출한 엑소좀을 정상 폐섬유아세포와 폐암세포에 대한 세포의 이동 억제 효능을 평가하기 위해, transwell migration array를 실시하였다.
구체적으로, 폐섬유아세포(MRC5)와 폐암세포(비소세포성, A549)를 24-transwell(Costar)의 upper well에 각각 50,000 개씩 분주하였다. FBS가 포함되지 않은 RPMI1640 배지에 1Х109 particles/mL의 엑소좀을 혼합하여 transwell의 upper well에 채우고, 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지는 lower well에 채웠다. 이때 대조군으로는 FBS와 엑소좀 모두 혼합되지 않은 RPMI1640 배지에 엑소좀과 동일한 부피의 phosphate buffered saline(PBS)를 혼합하여 사용하였다. 암세포와 정상세포와 세포 증식률을 고려하여 각각 48시간과 72시간 후에 transwell의 membrane을 통과한 세포를 확인하기 위해 membrane lower part로 이동하여 부착한 세포를 70% 에탄올로 고정시킨 후, crystal violet 염색을 하여 염색된 세포의 수를 측정하였다.
정상 폐섬유아세포의 경우 엑소좀이 포함된 배지에 72시간 노출시켰을 때 통계적으로 유의하게 lower well로의 세포 이동을 촉진시켰다 (P<0.001) (도 4a). 반면, 폐암세포의 경우 엑소좀이 포함된 배지에 48시간 노출시켰을 때 통계적으로 유의하게 lower well로의 세포 이동이 억제되었다(P<0.001) (도 4b).
실시예 7: 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐암 이식 쥐에서의 암 증식 억제 효과
상기 실시예 1로부터 추출한 엑소좀을 폐암 이식 쥐에 처리하여 암 증식 억제 효능 평가를 실시하였다.
구체적으로, 비소세포성 폐암 세포주인 A549 세포를 1Х107 cells/0.2 mL/head로 준비하여 BALB/c 누드 면역결핍 마우스의 왼쪽 겨드랑이 부위에 이식하였다. 10일 이상 종양 세포가 자라도록 유지한 다음 종양의 평균 크기가 100 mm3 이상, 질병이나 상처 등의 임상증상이 없고 적절한 체중을 나타내는 동물을 선택하여 군간 통계적 유의성이 없도록 무작위 배치를 하였다. 동물실험 군 구성 및 엑소좀 투여 용량은 하기 표 1과 같았다.
Group No.of Animals Volume
(μL/head)
Dose
(particles/head)
Frequency Injection site
Vehicle control(CTL) 4 200 PBS 5 times /10 days IV
MSC-Exosome 4 200 6.67Х108 5 times /10 days IV
엑소좀은 6.67Х108 particles의 개수를 2일 간격으로 10일간 총 5회 정맥 투여하였으며, 하기 상세 관찰 항목에 따라 19일간 종양의 크기 변화를 측정하였다.
<종양 크기 측정 및 상세 관찰 항목>
- 개체 별로 비정상적인 행동과 외형의 이상 유무를 상세히 관찰
- 상세 관찰 항목: 피모, 피부, 눈, 점막, 분비물 및 배설물, 자율신경계(유루, 입모 및 비정상 호흡), 보행 변화, 자세, 반복행동, 이상행동
- 종양 부피 측정: 종양부피(mm3) = 1/2 [단경(mm)]2 Х 장경(mm)
실험결과 도 6에 나타낸 바와 같이, PBS만 투여한 쥐에서는(vehicle control) 시간이 지남에 따라 종양의 성장이 눈에 띄게 나타났다. 반면에 엑소좀(6.67Х108 particles/head)을 투여한 쥐에서는 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제된 것을 확인하였다(도 5a, 5b). 또한, 엑소좀을 투여한 쥐에서 체중, 간, 췌장, 신장의 무게가 PBS 투여군과 차이가 없어 주요 장기 독성은 보이지 않음을 확인하였다(도 6).

Claims (11)

  1. 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)에서 유래한 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는, 암 치료, 예방 또는 전이 억제용 약학적 조성물로서,
    상기 암은 폐암(lung cancer)이고,
    상기 엑소좀은 miR-4440, miR-4775, miR-553, miR-548 및 miR-1277로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 miRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 비소세포성 폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 전이성 비소세포성 폐암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것에 의하여 암 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지방줄기세포는 인체 또는 동물 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 조성물을 투여 받을 환자의 자가 지방줄기세포에서 유래한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 엑소좀을 1Х108 에서 1Х1011 particles/mL까지의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 TGF-β(Transforming growth factor-β), IL-10(Interleukin-10) 및 IL-13(Interleukin-13)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 삭제
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