KR20140096105A - 중간엽 줄기 세포 및/또는 ｔｓｇ-6 단백질에 의한 이식 거부의 예방 및 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효량의 중간엽 줄기 세포 및/또는 하나 이상의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 동물에 투여함으로써 동물에서 이식된 세포, 조직 또는 기관의 거부를 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기 세포 및/또는 ＴＳＧ-6 단백질에 의한 이식 거부의 예방 및 치료 {PREVENTION AND TREATMENT OF TRANSPLANT REJECTION WITH MESENCHYMAL STEM CELLS AND/OR TSG-6 PROTEIN}

본 출원은 2011년 11월 4일에 출원된 미국가출원번호 제61/555,717호를 기초로 하여 우선권을 청구하며, 이러한 문헌의 내용들은 그 전문이 참고로 포함된다.

장기의 이식은 다양한 위험한 질환에 대한 중요한 치료법을 제공한다. 그러나, 이러한 치료법들은 면역 체계에 의한 이식 거부에 의해 제한된다. 또한, 이러한 거부반응을 막기 위한 면역억제제들의 장기 투여는 신장 또는 간 독성을 초래하고, 악성 종양들 또는 감염증들에 대한 민감성(susceptibility)을 증가시킬 수 있다. 세포 및 장기의 이식을 개선시키기 위한 최근의 한 전략은 중간엽 줄기/선조 세포(MSC)의 투여이다. MSC의 전신 주입(systemic infusion)이 동물 모델에서 이식편 거부(graft rejection)를 감소시키는 것으로 보고되었고, 그 결과로 환자들의 여러 임상 시도를 촉발시켰다^{1 -4}. 이전 연구들에서는 MSC의 면역조절 효과에 대한 이식의 개선된 생존을 주로 나타내었다^{3 -6}. 그러나, 대부분의 데이타는 생체내에서 MSC의 작용을 거부할 수 있거나 거부하지 않을 수 있는 시험관내 실험을 기초로 한 것이다.

MSC가 장기 이식의 생착(engraftment)을 어떻게 개선시킬 수 있는 지를 규정하기 위하여, 본 발명자들은 동종 각막 이식의 마우스 모델을 채택하였는데, 이러한 모델에서, 동종항원의 도입으로부터 면역 거부에 이르는 사건의 시간 순서가 명백하고 잘 확립된 것이다^{7 -9}. 본 발명자들은 이식 시에 인간 MSC(hMSC)의 정맥내(IV) 투여가 수술 후 조기 기간에 수술-유발 염증을 주로 억제함으로써 면역 거부를 감소시키고 각막 동종이식편의 생존을 연장시켰음을 입증하였다. 염증의 억제는 이후에, 동종 면역 반응의 어페런트 루프(afferent loop)를 억제하였다. 특별히 고려되는 것으로, 각막에서 세포가 각막에서 생착되지 않으면서 MSC의 유익한 효과가 관찰되었지만, 이러한 것들은 항염증 단백질 TSG-6에 대한 유전자를 발현시키기 위해 활성화되는, IV 주입 후 폐에서 포획된 MSC에 의존적이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 동물에서 각막 이식의 거부를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 동물에 중간엽 줄기 세포, 또는 MSC를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 중간엽 줄기 세포는 동물에서 각막 이식의 거부를 예방하거나 치료하는데 효과적인 양으로 조성물에 존재한다.

비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 이전에 동물에 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식과 동시에 동물에 투여된다. 또다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 이후에 동물에 투여된다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 이전 및 이와 동시에 동물에 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 이전 및 이후에 동물에 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식과 동시에 및 이후에 동물에 투여된다. 또 다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 이전, 이와 동시에, 및 이후에 동물에 투여된다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식 1일 전에 및 각막 이식 직후에 투여된다.

중간엽 줄기 세포는 각막을 지닌 안구를 갖는 임의의 동물에 투여될 수 있다. 이러한 동물은 인간 및 인간외 영장류를 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 어류를 포함한다.

MSC는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. MSC는 수용체에 대하여 자가 조직적일 수 있거나(동일한 숙주로부터 얻어짐), 수용체에 대하여 동종일 수 있다. 또한, MSC는 수용체에 대해 이종일 수 있으며(다른 종들의 동물로부터 얻어짐), 예를 들어, 래트 (rat) MSC는 인간에서 각막 이식 거부를 포함하는 이식 거부를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.

추가의 비-제한적인 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 MSC는 인간, 마우스, 래트, 유인원, 긴팔원숭이(gibbon), 소(bovine)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의 종의 포유동물의 골수로부터 단리될 수 있다. 비-제한적인 구체예에서, MSC는 인간, 마우스, 또는 래트로부터 단리된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, MSC는 인간으로부터 단리된다.

MSC를 배양하기 위해 시험관 내에서 MSC를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다. MSC의 성장을 지지할 수 있는 배지 포뮬레이션은 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)), 알파 개질 최소 필수 배지(αMEM), 및 로즈웰 파크 메모리알 인스티튜트 메디아 1640(Roswell Park Memorial Institute Media 1640(RPMI Media 1640)), 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 통상적으로, 0 내지 20% 소태아혈청(FBS) 또는 1 내지 20% 말 혈청이 MSC의 성장을 지지하기 위해 상기 배지에 첨가된다. 그러나, 규정된 배지는 또한, MSC를 배양하기 위해 필수적인 성장인자, 사이토카인 및 호르몬이 배지에 적절한 농도로 제공되는 경우에, 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 유용한 배지는 MSC의 배양을 위해 유용한 항생제, 분열촉진 또는 분화 화합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 고려되는 하나 이상의 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 세포들은 하나의 비-제한적인 구체예에서, 27℃ 내지 40℃의 온도에서, 다른 비-제한적인 구체예에서, 31℃ 내지 37℃의 온도에서, 및 다른 비-제한적인 구체예에서, 습도조절된 인큐베이터에서 성장될 수 있다. 이산화탄소 함량은 2% 내지 10%로 유지될 수 있으며, 산소 함량은 1% 내지 22%로 유지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 어떠한 방식으로도 MSC를 단리시키고 배양하는 임의의 한 방법으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 그 보다는, MSC를 단리시키고 배양하는 임의의 방법이 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

배지에 첨가될 수 있는 항생제는 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 배양 배지에서의 페니실린의 농도는 ml 당 약 10 내지 약 200 유닛(unit)이다. 배양 배지에서의 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ㎍/ml이다.

중간엽 줄기 세포가 상술된 바와 같은 공급원으로부터 얻어지고 배양되어 충분한 수의 중간엽 줄기 세포를 제공한 직후에, 중간엽 줄기 세포는 각막 이식의 거부를 치료하기 위해 동물에 투여된다.

중간엽 줄기 세포는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 허용 가능한 투여 수단에 의해 투여된다. 이러한 방법은 정맥내, 복막내, 근육내, 피부내, 피하 또는 국소 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 범위가 임의의 이론적 추론으로 한정되도록 의도하는 것은 아니지만, 본 출원인은, 중간엽 줄기 세포가 각막 이식의 거부를 예방하거나 치료하기 위해 동물에 투여될 때, 중간엽 줄기 세포가 생체 내에서 활성화되어 각막 이식의 결과로서 유발된 염증을 감소시키는 종양 괴사 인자 자극화 유전자 6 단백질, 또는 TSG-6 단백질로서 공지된 항-염증 단백질의 발현을 크게 증가시킨다는 것을 발견하였다. 또한, 각막 이식의 결과로서 유발된 염증을 감소시킴으로써, 이식된 각막의 접목이 촉진되고 개선되는 것으로 여겨진다. 이에 따라, 다른 비-제한적인 구체예에서, 중간엽 줄기 세포는 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체와 함께 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질은 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체이다.

상기에서 주지된 바와 같이, TSG-6 단백질이 각막 이식에 의해 유발된 염증을 감소시키고, 이에 의해 이식된 각막의 생착을 개선시키는 것으로 여겨진다. 또한, 항-염증 단백질, 예를 들어 TSG-6이 생착을 개선시키고/거나 다른 세포들, 조직들, 또는 장기들의 거부를 치료하거나 예방할 뿐만 아니라 인공기관의 임플란트의 생존을 돕거나 수술에 의해 유발된 염증을 경감시킬 수 있는 것으로 여겨진다.

이에 따라, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 동물에서 이식된 세포, 조직 또는 장기의 거부를 예방하고/거나 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 동물에 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 동물에서 이식된 세포, 조직 또는 장기의 거부를 예방하고/거나 치료하는데 효과적인 양으로 투여된다.

비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질은 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체이다. 이러한 TSG-6 단백질의 생물학적 활성 단편, 유도체, 및 유사체는 TSG-6 링크 모듈(즉, "천연(native)" 인간 TSG-6 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 133), 및 이의 C-말단에 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 갖는 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 비-제한적인 구체예에서, TSG-6 단백질 또는 이의 단편, 유도체, 또는 유사체는 이의 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기의 "His-tag"를 갖는다.

천연 인간 TSG-6 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는다:

MIILIYLFLL LWEDTQGWGF KDGIFHNSIW LERAAGVYHR EARSGKYKLT

YAEAKAVCEF EGGHLATYKQ LEAARKIGFH VCAAGWMAKG RVGYPIVKPG

PNCGFGKTGI IDYGIRLNRS ERWDAYCYNP HAKECGGVFT DPKQIFKSPG

FPNEYEDNQI CYWHIRLKYG QRIHLSFLDF DLEDDPGCLA DYVEIYDSYD

DVHGFVGRYC GDELPDDIIS TGNVMTLKFL SDASVTAGGF QIKYVAMDPV

SKSSQGKNTS TTSTGNKNFL AGRFSHL

TSG-6 링크 모듈은 상기 서열의 아미노산 잔기 1 내지 133으로 이루어진다.

비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직 또는 장기의 이식 이전에 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 이식된 세포, 조직 또는 장기의 이식과 동시에 투여된다. 또다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직, 또는 장기의 이식 이후에 투여된다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직, 또는 장기의 이식 이전 및 이식과 동시에 투여된다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직, 또는 장기의 이식 이전 및 이식 후에 투여된다. 또다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직 또는 장기의 이식 이전, 이식과 동시에, 및 이식 후에 투여된다.

적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직, 또는 장기의 이식체의 수용체인 임의의 동물에 투여될 수 있다. 이러한 동물은 인간 및 비-인간 영장류를 포함하는 포유동물을 포함하는, 상술된 동물을 포함한다.

적어도 하나의 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 임의의 세포, 조직, 또는 장기의 거부를 예방하고/거나 치료하기 위해 투여된다. 이러한 세포, 조직, 또는 장기는 골수 세포, 랑게르한스 세포(Langerhans cell)를 포함하는 섬 세포, 췌장 베타 세포, 각막, 피부, 심장, 폐, 간, 신장 및 췌장을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 이식된 세포, 조직, 또는 장기의 거부를 예방하고/거나 치료하기 위해 중간엽 줄기 세포와 함께 투여된다.

적어도 하나의 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 당업자에게 공지된 임의의 허용 가능한 수단, 예를 들어 정맥내, 복막내, 근육내, 피부내, 피하, 또는 국소 투여에 의해 투여된다.

중간엽 줄기 세포 및/또는 적어도 하나의 항-염증 단백질, 예를 들어 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 세포, 조직, 또는 장기의 이식 결과로서 일어날 수 있는 감염증을 치료하고/거나 예방하기 위해 다양한 항감염제, 예를 들어, 항박테리아제, 항바이러스제, 또는 항진균제와 함께 동물에 투여될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 적어도 하나의 항감염제는 감염증의 타입, 예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 진균, 감염증과 관련된 박테리아, 바이러스, 또는 진균의 타입 또는 종, 및 감염증의 정도 및 중증도, 및 환자의 연령, 체중 및 성별에 의존적이다.

비-제한적인 구체예에서, 감염증이 하나 이상의 박테리아와 관련될 때, 본 발명의 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 적어도 하나의 항감염제는 적어도 하나의 항박테리아제이다. 투여될 수 있는 항박테리아제는 퀴놀론 항생제, 예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신(Cravit), 목시폴록사신(Vigamox), 가티플록사신(Zy-mar), 세팔로스포린, 아미노글리코사이드 항생제(예를 들어, 겐타마이신), 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 감염증이 하나 이상의 바이러스와 관련될 때, 본 발명의 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 항감염제는 적어도 하나의 항바이러스제이다. 이용될 수 있는 항바이러스제는 당업자에게 공지된 항바이러스제를 포함한다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 감염증이 하나 이상의 진균과 관련될 때, 본 발명의 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여되는 항감염제는 적어도 하나의 항진균제이다. 이용될 수 있는 항진균제는 나타마아신, 암포테리신 B, 및 플루코나졸 및 이타코나졸을 포함하는 아졸을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

또 다른 비-제한적인 구체예에서, 감염증이 박테리아, 바이러스, 및 진균 중 하나 초과와 관련될 때, 항박테리아제, 항바이러스제, 및 항진균제 중 하나 초과가 본 발명의 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 중간엽 줄기 세포와 함께 투여된다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체, 예를 들어 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체 및/또는 중간엽 줄기 세포는 이식 거부를 치료하고/거나 예방하기 위해 사용되는 하나 이상의 공지된 약제학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 활성제는 비-스테로이드 항염증 약물(NSAID)을 포함하는 항염증제, 스테로이드, 면역조절제, 및 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린, 및 항-T-세포 항체, 및 이식 거부의 효과를 악화시키는 제제의 발현을 방해하는 소 간섭 RNA(siRNA)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

중간엽 줄기 세포 및/또는 적어도 하나의 항-염증 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체, 예를 들어 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체는 허용 가능한 약제학적 담체와 함께 투여된다.

주사액을 위한 적합한 부형제는 MSC 및/또는 항-염증 단백질, 및 수용체, 예를 들어 완충된 염수 용액 또는 다른 적합한 부형제와 생물학적으로 그리고 생리학적으로 혼화 가능한 부형제이다. 투여를 위한 조성물은 적절한 멸균성 및 안정성을 준수하는 표준 방법에 따라 제형화되고, 생성되고, 저장될 수 있다.

MSC 및/또는 항-염증 단백질의 용량은 광범위한 한계 내에서 변하고, 각 특정 경우에서 개별 요건들에 따라 조정될 수 있다. 세포의 수 및/또는 사용되는 항-염증 단백질의 양은 수용체의 중량 및 상태, 투여 횟수 및/또는 빈도, 및 환자의 나이 및 성병, 예방되거나 치료될 이식 거부의 타입, 및 이의 정도 및 중증도를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 알려진 다른 변수들에 따른다.

하나의 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 동물에 정제된 종양 괴사 인자-알파 자극화 유전자 6(TSG-6) 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 제공하여, 이식된 세포, 조직 또는 장기의 거부와 관련된 하나 이상의 염증 증상을 예방하거나 감소시키는 것을 포함하는, 세포, 조직 또는 장기의 이식의 거부를 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다.

적어도 하나의 항-염증 단백질은 임의의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 비-제한적인 구체예에서, 단백질은 (a) 단백질을 엔코딩하는 이종 누클레오티드 서열을 포함하고 (b) 단백질을 발현시키는, 유전자변형 세포로부터 정제될 수 있다.

이종 누클레오티드 서열을 발현시키기 위해 변형될 수 있는 임의의 세포는 예를 들어, TSG-6 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 유사체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 세포는 인간 및 인간외 진핵 동물 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 인간외 진핵 동물 세포이다.

다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 하나의 항-염증 단백질은 당업자에게 공지된 수단에 의해 자동 단백질 또는 펩티드 합성기에 의해 합성될 수 있다.

또한, 천연의 대응물과 서열에 있어 상이하지만 생물학적 활성을 유지하는 상술된 단백질의 단편 또는 변이체 또는 유사체가 또한 사용될 수 있는 것으로 인식될 것이다.

본 발명의 특정의 비-제한적인 구체예에서, 천연 항-염증 단백질의 단편 또는 변이체 또는 유사체는 천연 대응물의 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 100%를 구성하는 아미노산 부분과 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하다. 예를 들어, 서열의 관련 부분에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 보다 큰 서열 동일성을 나타내는 변이체가 사용될 수 있으며, 여기서 % 동일성은 상술된 바와 같이 결정된다. 아미노산 부분은, 비-제한적인 구체예에서, 적어도 20개 길이의 아미노산, 및 다른 비-제한적인 구체예에서, 적어도 50개 길이의 아미노산이다. 대안적으로, 단편 또는 변이체는 천연 대응물에 대해 상당한, 또는 바람직하게 실질적인 상동성을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 천연 항-염증 단백질의 단편 또는 변이체는 천연 대응물을 인지하는 항체(예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체)에 의해 인지되는 이의 천연 대응물에 대한 충분한 구조적 유사성을 지닌다.

비-제한적인 구체예에서, 하나 이상의 항-염증 단백질 예컨대, TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체는 각막 이식의 거부를 치료하거나 예방하기 위해 예컨대, 예를 들어, 점안액 형태로 눈에 국소적으로 투여될 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜 사슬이 부가된 것 (페길화)과 같은 하나 이상의 항-염증 단백질의 다양한 변형 또는 유도체가 제조되어 이들의 약동학적 및/또는 약력학적 특성에 영향을 끼칠 수 있다.

비경구 투여 이외의 경로로 하나 이상의 항-염증 단백질을 투여하기 위해, 단백질은 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅되거나 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 불완전 애주번트중에서 투여될 수 있거나, 효소 억제제와 공동-투여될 수 있거나, 리포좀중에서 투여될 수 있다. 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디소프로필플루오로포스페이트 (DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포좀은 수중유중수, CGF 에멀션 및 통상적인 리포좀을 포함한다 (Strejan, et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

본 발명의 조성물이 단순 용액으로 투여될 수 있지만, 이들은 더욱 전형적으로 다른 물질 예컨대, 담체, 바람직하게는, 약제학적 담체와 조합되어 사용된다. 유용한 약제학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에 전달하기에 적합한 임의의 양립가능한 비독성 물질일 수 있다. 멸균수, 알코올, 지방, 왁스 및 불활성 고형물이 담체에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 애주번트 (버퍼링제, 분산제)는 또한, 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 이러한 약물의 비경구 투여에 유용한 조성물은 널리 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)]. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 이식가능한 약물 전달 시스템에 의해 환자의 몸체에 도입될 수 있다 [Urquhart et al., Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol. 24:199 (1984).

치료학적 제형은 많은 통상적인 투여 제형으로 투여될 수 있다. 제형은 전형적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 하나 이상의 활성 성분을 포함한다.

제형은 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 약학 기술 분야에서 널리 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Easton, Pa.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, N.Y.; Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y.; and Lieberman et al. (eds.) (1990), Phamiaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y.]를 참조하길 바란다.

또 다른 비-제한적인 구체예에서, 이식된 세포, 조직 또는 기관의 거부를 치료하거나 예방하는데 사용된 중간엽 줄기 세포 또는 치료학적 단백질은 나노입자에 함유될 수 있다. 이러한 나노입자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 형성될 수 있으며, 상기 기술된 바와 같은 방법에 의해 투여될 수 있다.

이제 본 발명은 도면과 관련하여 기술될 것이다. 그러나, 본 발명의 범위를 이에 의해 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다.
도 1. IV hMSC는 생존을 연장시키고 , BALB /c 마우스에서 B6 각막 이식의 면역 거부를 예방하였다. (a) 이식후 14일에 각막의 대표적인 사진 및 각막 이식편의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 이식편 생존은 IV hMSC에 의해 현저하게 연장되었다. BALB/c 마우스에서 12개 B6 각막 이식편 (동종이식편)중 7개가 28일 이내에 거부되었다 (평균 생존 시간 23.1 일). 이에 반해, 수술 1일 전 (D-1) 및 수술 직후 (D0) 둘 모두에서 hMSC가 IV투여된 마우스에서는 12개 동종이식편중 11개가 생존하였으며, D0에서 hMSC의 단일 주입으로 투여된 마우스에서는 12개 동종이식편중 9개가 생존하였다 (D-1 및 0에서의 MSC vs. HBSS, p=0.006; D0에서의 MSC vs. HBSS, p=0.047; 일반화된 윌코슨 시험(Generalized Wilcoxon test)). 각 그룹에서 n=12이다. (b) 28일째에서 각막 이식편의 헤마톡실린-에오신 염색은 대조군 동물의 거부된 동종이식편에서 염증 세포의 심각한 침윤을 나타내었으며, hMSC가 투여된 동종이식편에서는 훨씬 덜한 염증 세포 침윤을 나타내었다. (c) 면역조직화학 염색은, 많은 CD3⁺ T 세포가 대조군 동물의 동종이식편을 침윤한 반면, hMSC가 투여된 이식편에서는 T 세포가 거의 없었음을 보여주었다.
도 2. 이식 수술 후 각막에서 유전자 발현 수준의 시간적 경과. 실시간 RT-PCR은 염증전 사이토카인 (IL-6, IL-1β 및 IL-12a)의 수준이 이식 후 3일 및 7일째에 자가이식편 (a) 및 동종이식편 (b)에서 유사한 수준으로 상향 조절되었음을 보여주었으며, 이는 수술-유도된 염증의 조기 페이스(early phase)를 규정한다. T-세포 유래된 사이토카인 (IFN-γ)의 수준은 동종이식편에서 28일까지 증가하였으나, 자가이식편에서는 증가하지 않았으며, 이는 동종 면역 거부의 후기 페이스 (late phase)를 나타낸다. hMSC가 IV 투여된 동종이식편 (c)에서, hMSC가 투여되지 않은 자가이식편 또는 동종이식편과 비교하여, IL-6, IL-1β 및 IL-12a의 수준은 3일 및 7일째에 현저하게 감소되었으며, IFN-γ의 수준은 28일째에 현저하게 감소되었다. 모든 실험 군의 각 시점에서 n=5이다.
도 3. IV hMSC 는 각막 동종이식편에서 조기 염증 반응을 감소시켰다. 호중구 침윤의 척도로서의 마이엘로퍼옥시다아제의 양은 이식 후 7일째에 hMSC에 의해 현저하게 감소되었다 (a). 또한, 염증전 사이토카인 즉, IL-6, IL-1β 및 IL-12의 수준은 7일째에 IV hMSC에 의해 현저하게 감소되었다 (b-f). 결과는 이식 수술 후 조기 수술후 기간에서 염증 반응이 IV hMSC에 의해 억제되었음을 나타낸다. Auto: 자가이식편, Allo: 동종이식편, Allo MSCx1: 이식 직후 hMSC가 1회 투여된 동종이식편, Allo MSCx2: 이식 1일 전 및 이식 직후 hMSC가 투여된 동종이식편. 각 군에서 n=5이다. * p < 0.05; ** p < 0.01.
도 4. IV hMSC 는 각막 동종이식편에서 후기 T 세포- 매개된 면역 반응을 억제하였다. 활성화된 CD4 T-세포 사이토카인 (IL-2 및 IFN-γ)의 전사 수준 (a, b) 및 IFN-γ의 단백질 수준 (c)이 IV hMSC 부재의 이식편과 비교하여, 수술 후 28일째에 hMSC가 IV 투여된 동종이식편에서 현저하게 감소되었다. 또한, CD8 T-세포 이펙터 분자 (그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린)의 전사 수준을 IV hMSC에 의해 현저하게 감소시켰다 (d-f). Auto: 자가이식편, Allo: 동종이식편, Allo MSCx1: 이식 직후 hMSC가 1회 투여된 자가이식편, Allo MSCx2: 이식 1일 전 및 이식 직후 hMSC가 투여된 동종이식편. 각 군에서 n=5이다. * p < 0.05; ** p < 0.01.
도 5. IV hMSC 는 이식 후 4주에 동축 경부림프절에서 활성화된 T 세포의 수를 감소시켰다. 유세포 분석기는 활성화된 T 세포에 대한 마커로서 배수 림프절에서 CD4+CD44+CD69+ 세포의 비율이 hMSC로 처리된 마우스에서 현저하게 감소되었음을 보여주었다.
도 6. IV hMSC 는 이식 후 1주에서 각막에서 MHC 클래스 II ⁺ 세포의 수를 감소시켰다. 뮤린(murine) Ia^{d +}에 대한 면역염색(a) 및 전체 마운팅된 각막의 상피 시이트에서 MHC 클래스 II⁺ 세포의 열거(b)는, 랑게르한스 세포를 나타내는 MHC 클래스 II⁺ 세포의 수가 이식 수술에 대하여 자가이식편 및 동종이식편 둘 모두에서 현저하게 증가되었음을 보여주었다; 그러나, MHC 클래스 II⁺ 세포의 수는 IV hMSC에 의한 동종이식편에서 현저하게 감소하였다. 각각의 군에서 n=3이다. Auto: 자가이식편, Allo: 동종이식편, Allo MSCx1: 이식 직후 hMSC가 1회 투여된 자가이식편, Allo MSCx2: 이식 1일 전 및 이식 직후 hMSC가 투여된 동종이식편.
도 7. IV hMSC 가 이식 후 1주에 동축 경부림프절에서 활성화된 항원 제시 세포의 수를 감소시켰다. (a) 유세포 분석기는, 수지상 세포 (DC) 즉, MHC II⁺ CD11b⁺ CD11c⁺ 세포 (b) 및 MHC II⁺ CD11b^- CD11c⁺ 세포 (c) 둘 모두의 비율이 hMSC로 처리된 마우스에서 현저하게 감소되었음을 보여주었다. 또한, MHC II⁺ CD11b^- CD11c⁺ 세포를 제시하는 대식세포의 비율이 IV hMSC에 의해 현저하게 감소되었다 (d). 각 군에서 n=4이다. Auto: 자가이식편, Allo: 동종이식편, Allo MSCx1: 이식 직후 hMSC가 1회 투여된 자가이식편, Allo MSCx2: 이식 1일 전 및 이식 직후 hMSC가 투여된 동종이식편.
도 8. hMSC 의 IV 투여 후 각막에서 GAPDH 에 대한 인간 mRNA 의 정량적 검정. 마우스 각막에서 인간-특이적 GAPDH (hGAPDH)의 발현 수준의 표준 곡선을 단일 마우스 각막에 공지된 수의 hMSC을 부가함으로써 구성하였다. hGAPDH의 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 평가하여 표준 곡선을 확립하고 검출 한계를 규정하였다. 검정은 1마리 마우스 각막당 10개 hMSC를 검출하는 민감도를 갖는다. hGAPDH의 수준은 각막 동종 이식 수술 1일 전 및 수술 직후에 1 x 10⁶ hMSC를 마우스에 2회 IV 주입한 후 10시간째, 1, 3, 7 및 28일째에 각막에서 검정하였다. hGAPDH 수준은 10개 미만의 인간 세포 또는 투여된 세포 (1 x 10⁶ 세포) 중 <0.001 %가 각막에 도달함을 나타내는 표준 곡선의 검출 한계 미만이다.
도 9. hMSC 의 IV 투여 후 폐에서 GAPDH 에 대한 인간 mRNA 의 정량적 검정.
마우스 각막에서 인간-특이적 GAPDH (hGAPDH)의 발현 수준의 표준 곡선을 단일 마우스로부터의 폐에 공지된 수의 hMSC를 부가함으로써 구성하였다. hGAPDH의 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 평가하여 표준 곡선을 확립하였다. hGAPDH의 수준을 각막 동종이식 수술 1일 전 및 수술 직후에 1 x 10⁶ hMSC를 마우스에 2회 IV 주입한 후 10시간째에 폐에서 검정하였다. 별표는 hMSC로 처리된 마우스로부터의 폐에서 검출된 hGAPDH의 평균 수준을 나타내며, 이는 약 100,000 인간 세포 (주입된 세포중 10%)가 존재하였음을 입증한다.
도 10. 항-염증 및 면역조절 분자의 인간-특이적 전사물에 대한 실시간 RT - PCR 분석. hMSC 주입 및 각막 이식 수술 후 10 시간째에 마우스의 폐로부터 RNA를 추출하고, 그 후, 항-염증 및 면역조절 분자 즉, COX2, NOS2, IDO, CCL2, TGF-β, TSG-6, STC-1, 및 PTX3의 인간-특이적 전사물에 대한 실시간 RT-PCR을 사용하여 검정하였다. 데이타는, 폐에 포획된 hMSC가 활성화되어 항-염증 분자 TSG-6의 발현을 113.8-배까지 상향 조절한 반면, 연구된 다른 분자들은 현저한 상향-조절을 보이지 않았음을 나타내었다.
도 11. TSG -6 siRNA 넉다운된 IV hMSC 는 수술-유도된 조기 염증을 억제하지 않으며, 각막 동종이식편의 생존을 연장하지 않았다. (a) BALB/c 마우스에서 B6 각막 이식편의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 6개 동종이식편중 3개는 TSG-6가 넉다운된 hMSC (TSG-6 siRNA MSC)가 2회 주입으로 투여된 마우스에서 거부된 반면, siRNA가 스크램블된 hMSC(SCR MSC)가 2회 주입으로 투여된 마우스에서는 모든 동종이식편이 생존하였다. (b) 호중구 침윤의 척도로서 마이엘로퍼옥시다아제 (MPO) 양은 이식 후 7일째에 TSG-6 넉다운된 hMSC에 의해서는 현저하게 감소되지 않았다. 각 군에서 n=3이다. 활성화된 T 세포-유래된 사이토카인 (c-e) 및 이펙터 효소 (f-h)의 수준은 TSG-6 넉다운 hMSC로 처리된 마우스의 각막 이식편에서는 감소되지 않는 반면, siRNA가 스크램블된 hMSC는 각막 이식편에서 T-세포 사이토카인 및 효소의 수준을 현저하게 감소시켰다. 각 군에서 n=3이다. Auto: 자가이식편, Allo: 동종이식편, Allo MSCx1: 이식 직후 hMSC가 1회 투여된 자가이식편, Allo MSCx2: 이식 1일 전 및 이식 직후 hMSC가 투여된 동종이식편. 각 군에서 n=6이다. * p < 0.05; ** p < 0.01.
도 12. 재조합체 TSG -6의 IV 주입은 각막 동종이식편의 수술-유도된 조기 염증 및 후기 면역 거부를 억제하였다. (a) BALB/c 마우스에서 B6 각막 이식편의 Kaplan-Meier 생존 곡선. rhTSG-6가 단일 주입으로 투여된 마우스에서 9개 동종이식편중 6개가 생존한 반면, PBS가 투여된 마우스에서는 9개 동종이식편중 2개가 생존하였다. (b-f) 염증 전 사이토카인에 대한 전사물 수준 및 마이엘로퍼옥시다아제 (MPO)의 양은 수술 직후 재조합체 TSG-6 (35㎍)의 IV 주입에 의해 7일째에 각막 동종이식편에서 현저하게 감소되었다. 각 군에서 n=3이다. (g-j) T 세포-관련된 사이토카인에 대한 전사물의 수준이 또한 28일째에 IV 재조합체 TSG-6에 의해 감소되었다. 각 군에서 n=6이다.
도 13. TSG-6-siRNA MSC가 마우스에 주입되는 시점과 동일한 시점에서 TSG-6-siRNA 또는 스크램블된 siRNA로 트랜스펙션시킨 후 10시간째에서 hMSC에서의 TSG-6의 넉다운 효율은 실시간 RT-PCR로 확인한 결과 약 82%이었다.
도 14. 각막 동종이식편상의 hMSC 의 효과에 대한 그래프 요약. 정맥내 hMSC는 이식 후 조기에 각막에서 염증을 현저하게 억제하였으며, 수지상 세포 (DC)의 활성화 및 이동을 감소시켰다. 그 결과, 면역 거부가 예방되고, 각막 동종이식편의 수용이 달성되었다.

이제 본 발명은 하기 실시예와 관련하여 기술될 것이다; 그러나, 본 발명의 범위를 이로 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

재료 및 방법

세포 준비

NIH/NCRR 보조금 (P40 RR 17447-06)의 후원하에 300여 실험실에 조기 간세포가 풍부한 MSC의 표준화된 제조물을 공급하는 성인 줄기 세포 제조 및 배급 센터 (the Center for the Preparation and Distribution of Adult Stem Cells) (http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html)로부터 냉동된 하나의 패시지(passage) hMSC의 유리병을 수득하였다. 모든 실험은 한 명의 도너로부터의 hMSC로 수행하였다. 배양시 3개의 계통으로 지속적으로 분화된 세포는 조혈 마커 (CD34, CD36, CD117 및 CD45)에 있어서는 네거티브이며, 중간엽 마커 CD29 (95%), CD44 (>93%), CD49c (99%), CD49f (>70%), CD59 (>99%), CD90 (>99%), CD105 (>99%) 및 CD166 (>99%)에 있어서는 파지티브였다. 24시간 동안 고밀로도 배양하여 생존 세포를 회수한 후, hMSC를 저밀도 (100 세포/cm²)로 플레이팅시키고, 16 % FBS를 함유하는 완전 배양 배지 (CCM)중에서 약 70% 컨플루언스에 도달할 때까지 8일 동안 인큐베이션하고, 37℃에서 2분 동안 0.25% 트립신/1 mM EDTA로 채취하였다. 그 후, CCM을 세포에 첨가함으로써 트립신을 불활성화시키고, 세포를 1,200rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 PBS로 세척하였다. 세포를 30% FBS 및 5% DMSO를 함유하는 α-MEM중에서 1 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 냉동시켰다. 모든 실험에 2개의 패시지 세포를 사용하였다. 주입 전에 세포를 리프팅한 후, Hank'S Balanced Salt Solution (HBSS; BioWhittaker, Walkersville, MD)을 사용하여 최종 세척을 수행하였다. 원심분리에 의해 세척한 후, 세포를 주입을 위해 10,000 세포/μL 농도로 HBSS중에 현탁시켰다.

siRNA 실험에 있어서, 통상의 키트 (Lipofectamine RNAiMAX reagent; Invitrogen)를 사용하여 hMSC를 TSG-6에 대한 siRNA (sc-39819; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 스크램블 siRNA (StealthTM RNAi Negative Control; Invitrogen, Carlsbad, CA)로 트랜스펙션시켰다. TSG-6 발현의 성공적인 넉-다운을 확인하기 위해, 세포 분취물로부터 RNA를 추출하고 (RNeasy Mini kit; Qiagen, Valencia, CA), 실시간 RT-PCR에 의해 TSG-6에 대해 검정하였다. hMSC에서 TSG-6의 넉다운 효율은 트랜스펙션 시작 후 10시간으로부터 24시간까지 82 내지 85%였다 (도 14). 넉다운 효율을 검정하는데 사용된 동일한 세포를 실험을 위해 마우스에 주입하였다. TSG-6-siRNA 또는 스크램블 siRNA로 트랜스펙션시킨 후 10시간째에 주입을 위한 세포가 준비되었다.

각막 이식의 동물 모델

본 실험 프로토콜은 텍사스 A&M 헬스 사이언스 센터의 동물관리 위원회 (the Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M Health Science Center) 및 서울대학 병원 바이오메디칼 리서치 협회 (Seoul National University Hospital Biomedical Research Institute)에 의해 승인을 받았다. 각막 도너로서 8주령 암컷 B6 마우스 (C57BL/6J, H-2b, Charles River Laboratories International, Inc. Wilmington, MA)를 사용하고, BALB/c 마우스 (BALB/cAnNCrl, H-2d, Charles River Laboratories International, Inc.)를 각막 이식 수용체로서 사용하였다.

중앙 2-mm 직경 각막 이식편을 B6 마우스의 도너 각막으로부터 2.0 mm 관상톱 (Katena Products, Inc., Denville, NJ)을 사용하여 절개하였다. BALB/c 숙주 마우스의 수용체 각막에서 중앙 1.5-mm 직경 버튼을 1.5 mm 관상톱 (Katena Products, Inc.)으로 제거하여 수용체 각막 이식편 베드를 준비하였다. 준비된 도너 각막 이식편을 수용체 베드에 위치시키고, 8 단속 11-0 나일론 봉합선 (eight interrupt 11-0 nylon suture)으로 고정시켰다. 동질유전자 자가이식편 (BALB/c-대-BALB/c)은 실헌 대조군으로서 사용하며, 동일한 방식으로 수행하였다. 8-0 나일론 눈꺼풀봉합술(tarsorrhaphy)로 눈꺼풀을 봉합하고, 이를 (임상 평가할 때는 제외하고는) 이식 거부가 발생할 때 까지 유지시켰다. 모든 이식편을 6주 동안 매주 3회 평가하였다. 이식 거부는 이식 투명성의 완전한 손실 (즉, 동공 마진 및 홍채 구조가 이식을 통해 보이지 않음)로서 규정하였다 . 수용체 마우스에 100 μL HBSS중의 1 x 10⁶ hMSC를 꼬리 정맥으로 1회 (수술 직후) 또는 2회 (수술 1일전 및 수술 직후) 투여하였다. HBSS를 대조군에서 IV 주입하였다. IV TSG-6 실험에 있어서, 각 마우스에 100μL PBS 또는 PBS 100μL중의 35㎍의 재조합 인간 (rh)TSG-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.

조직병리학

조직 추출에 있어서, 마우스를 희생시킨 후, 각막을 절개하고, 10% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 각막을 4 ㎛ 섹션으로 자르고, H&E로 염색하거나, 면역조직화학으로 처리하였다. 포르말린-고정된 각막 섹션을 에탄올로 탈파라핀화시키고, 항원을 에피토프 회수 용액 (IHC WORLD, Woodstock, MD)에서 스티머(steamer)를 사용하여 회수하였다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: CD3에 대한 토끼 폴리클로날 항체 (ab5690, Abcam, Cambridge, MA), F4/80에 대한 래트 모노클로날 항체 (ab6640, Abcam), iNOS에 대한 토끼 폴리클로날 항체 (ab15323, Abcam), MRC에 대한 마우스 모노클로날 항체 (ab8918, Abcam), 및 MHC 클래스 II I Ad에 대한 마우스 모노클로날 항체 (ab64531, Abcam). DAPI 용액 (VECTASHIELD Mounting Medium; Burlingame, CA)을 대비염색을 위해 사용하였다.

각막 및 폐의 실시간 RT-PCR 검정

RNA 추출에 있어서, 각막 또는 폐를 작은 조각으로 썰고, RNA 분리 시약 (RNA Bee, Tel-Test Inc., Friendswood, TX)중에 용해시키고, 모토-구동 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 그 후, 총 RNA를 RNeasy Mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하고, 역전사 (SuperScript III, Invitrogen)에 의해 이중-가닥 cDNA를 합성하는데 사용하였다. 실시간 증폭을 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 사용하여 수행하였다. 18s rRNA 프로브 (TaqMan Gene Expression Assays ID, Hs03003631_g1)를 유전자 발현의 표준화를 위해 사용하였다. 모든 PCR 프로브 세트에 있어서, TaqMan Gene Expression Assay 키트를 Applied Biosystems으로부터 구입하였다. 검정을 각 생물학적 샘플에 대해 3회 기술적 반복에 의해 수행하였다.

hGAPDH에 대한 실시간 RT-PCR 표준 곡선

종래 기술된 바와 같이 hMSC의 연속 희석물을 마우스 조직에 첨가함으로써 표준 곡선을 유도하였다 (Roddy, 2011; Lee, 2009). 간단하게는, 10-100,000 hMSC를 마우스 각막에 첨가하였다. RNA 추출 후 (RNeasy Mini 키트; Qiagen), cDNA를 1㎍의 총 RNA를 사용하여 역전사 (SuperScript III; Invitrogen)에 의해 생성시켰다. 인간-특이적 GAPDH (hGAPDH) 프라이머 및 프로브 세트 (TaqMan Gene Expression Assays ID, GAPDH HS99999905_05)를 사용하였다. 값을 총 진핵세포 18s rRNA로 표준화하였다. 하나의 마우스 각막에 부가된 공지된 수의 hMSC로부터의 hGAPDH 발현을 기반으로 하여 표준 곡선을 만들었다.

ELISA

단백질 추출에 있어서, 각막을 작은 조각으로 자르고, 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Indianapolis, IN)을 함유하는 조직 수술 시약 (Invitrogen)중에 용해시켰다. 샘플을 얼음상에서 초음파처리하였다 (Ultrasonic Processor, Cole Parmer Instruments, Vernon Hills IL). 4℃에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리한 후, 상청액을 수집하고, IL-1β, IFN-γ 및 IL-12p70 (Mouse Duoset 키트; R&D Systems, Minneapolis, MN), CCR7 (USCN Life Science, Inc., Missouri City, TX), 및 MPO (HyCult biotech, Plymouth Meeting, PA)에 대해 ELISA로 검정하였다.

유세포 분석기

DLN을 수술 후 7일 및 28일째에 이식된 동물로부터 채취하였다. 개별 동물로부터 각 샘플을 준비하고, 별도로 분석하였다. 동물 사이의 림프절 세포의 풀링은 수행하지 않았다. 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지중에서 2개의 유리 슬라이드의 반투명 말단부 사이에 DLN을 위치시키고 잘랐다. 세포 현탁액을 수집하고, 플루오레세인-컨쥬게이팅된 항-마우스 항체와 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 1차 항체는 하기와 같다: I-A^d-PE, CD11b-FITC, CD11c-알로파이코시아닌, CD3-FITC, CD4-PE, 및 CD8-알로피코시아닌 (eBioscience, San Diego, CA). 유세포 분석기에 대해 FACSCan (BD BioSciences, Mountain View, CA)을 사용하여 3가지 칼라 표현형 분석을 수행하였다. 각 샘플로부터 총 20,000의 경우를 수집하였다. 게이트를 I-A^d+ 또는 CD3⁺ 세포 군집에 대해 설정하고, 표면 마커의 추가적 분석을 이러한 게이트내에서 수행하였다. Flowjo 프로그램 (Tree Star, Inc., Ashland, OR)을 사용하여 데이타를 분석하였다.

통계학적 분석

SPSS 소프트웨어 (SPSS 12.0, Chicago, IL)를 사용하여 생존 분석을 수행하였다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 이식편 생존의 전반적인 누적 확률을 평가하고, 생명-표 방법을 이용하여 이식편 거부에 대한 중간 시간 (median time)을 추정하였다. 군 간의 이식편 생존을 Breslow (일반화된 윌코슨) 테스트를 사용하여 비교하였다. SPSS 소프트웨어를 사용한 원-웨이 ANOVA를 사용하여 군간의 이식편 생존 이외의 변수 비교를 수행하였다. 편차는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.

결과

IV hMSC는 각막 동종이식편의 생존을 연장시켰다.

IV hMSC가 각막 동종이식편의 생존을 연장시키는지의 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 도너로서 C57BL/6 마우스 (H-2^b)를 사용하고, 수용체로서 BALB/c (H-2^d)를 사용하여 직교 각막 이종이식을 수행하였다. 수용체 마우스에 수술 직후 (0 일) 1회, 또는 수술 1일 전 (-1 일) 및 다시 수술 직후 (0 일)에 2회 1 x 10⁶ hMSC를 IV를 투여하였다. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)을 비히클 대조군으로서 IV 주입하였다. 네거티브 대조군으로서 사용하기 위해 동질유전자 각막 자가이식 (BALB/c-대-BALB/c)을 수행하였다. 42일의 기간이 지난 후, BALB/c 마우스 (동종이식편)에서 12개 B6 각막 이식편중 7개는 21.3일의 평균 생존 시간으로 28일 이내에 거부되었으며, BALB/c 마우스 (자가이식편, n=12)중 BALB/c 각막 이식편 모두는 생존하였다 (도 1a). IV hMSC는 각막 동종이식편의 생존을 현저하게 연장시켰다. 12개 동종이식편중 11개가 hMSC를 2회 IV주입으로 투여한 마우스에서 거부 반응 없이 유지되었으며 (p=0.006, vs. HBSS 군중 동종이식편), hMSC가 단일 주입으로 투여된 마우스에서는 12개 동종이식편중 9개가 생존하였다 (p=0.047, vs. HBSS 군중 동종이식편).

본 발명자들은 28일째에 이식편에 대한 조직학적 연구를 수행하였다. HBSS-주입된 동물의 거부된 동종이식편에서, 섹션의 헤마토실린-에오신 (H&E) 염색은 염증 세포의 광대한 침윤을 나타내었다 (도 1b). 그에 반해, hMSC로 처리된 마우스로부터의 동종이식편에서는 염증 침윤이 현저하게 감소되었다. 유사한 결과가 CD3⁺ T 세포의 섹션의 면역염색에 의해 관찰되었다 (도 1c). 비히클 대조군 동물로부터의 거부된 이식편에는 CD3⁺ T 세포의 광대한 침윤이 있었으며, hMSC가 투여된 마우스로부터의 동종이식편에서 CD3⁺ T 세포의 최소 침윤이 있었다.

따라서, 이러한 데이타는, IV hMSC의 이식-주변부 주입이 각막 동종이식편의 생존을 연장시켰으며, 거부를 예방함을 입증하였다. 단일 주입 보다는 2회 주입 (-1 일 및 0 일)이 더욱 효과적이었다.

IV hMSC 는 각막 동종이식편의 조기 염증 및 후기 거부를 억제하였다.

hMSC의 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 염증- 및 면역-관련 분자의 시간 경과에 따른 발현에 대해 각막 이식편을 분석하였다. 각막 동종이식편의 거부가 28일까지 발생하고, 생존 이식편이 28일 후에 거부 없이 유지되었기 때문에 (도 1a), 본 발명자들은 면역 거부에 대해서는 28일째에 각막 이식편을 분석하였으며, 수술-유도된 조기 염증에 대해서는 3일 및 7일째에 이식편을 분석하였다. 본 발명자들은 자가이식편 및 동종이식편 둘 모두가 염증 사이토카인 IL-6, IL-1β 및 IL-12 및 호중구 침윤의 반-정량적 척도로서 마이엘로퍼옥시다아제의 동일한 조기 증가를 3일째 및 7일째에 나타냄을 발견하였다 (도 2a, 2b 및 도 3). (Oh, et al., Proc . Nat. Acad . Sci ., Vol. 107, pgs. 16875-16880 (2010). 이러한 발견은 염증이 수술에 의해 유도되었으며, 자가이식편과 동종이식편 간의 수술에 의해 조직에 유사한 양의 손상이 가해졌음을 나타낸다. 그에 반해, 후기 면역 반응에서는 자가이식편과 동종이식편간에 현저한 차이가 존재하였다. 자가이식편이 아닌 동종이식편에서는, 동종이식편 거부에 수반되는 이펙터 분자 (그랜자임 A, 그랜자임 B, 및 퍼포린) 및 T 세포-유래된 사이토카인 (IL-2 및 IFN-γ)의 전사 수준을 28일 까지 점차적으로 증가시켰다 (도 2a, 2b 및 도 4). (Choy, et al., Cell Death Differ ., Vol. 17, pgs. 567-576 (2010)). hMSC의 IV 주입은 조기 염증 페이스 및 후기 면역 반응 둘 모두를 감소시켰다 (도 2c). 3일 및 7일째에, 염증 사이토카인의 수준은 hMSC를 투여한 마우스로부터의 동종이식편에서 현저하게 감소하였다. IL-6 및 IL-1β에 대한 전사물 수준은 약 반까지 감소하였으며, IL-12a에 대한 전사물은 기본선 수준까지 감소시켰다. IL-1β 및 IL-12에 대한 ELISA 및 마이엘로퍼옥시다아제 수준에서 유사한 감소가 7일째에 관찰되었다 (도 3). hMSC에 의해 유도된 염증 페이스의 감소는 면역 반응의 감소에 의해 달성되었다. 28일째에, hMSC가 투여된 마우스로부터의 동종이식편에서 IL-2, IFN-γ, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 및 퍼포린에 대한 전사물 수준 및 IFN-γ의 단백질 수준이 현저하게 감소하였다 (도 2c 및 도 4). 또한, 유세포 분석기는, 활성화된 CD4 T 세포에 대한 마커로서 CD44⁺ CD69⁺ 세포의 수가 hMSC 처리된 마우스의 DLN에서 감소되었음을 입증하였다 (도 5).

따라서, 결과는, hMSC가 조기 수술후 기간에서 수술-유도된 염증을 억제하였으며, 결과적으로, 명백하게는 각막 동종이식편의 후속 면역 거부를 감소시켰음을 나타내었다.

IV hMSC 는 항원 제시 세포의 활성화를 감소시켰다.

이전 연구는 각막의 주요 항원-제시 세포 (APC) 즉, 랑게르한스 세포 (LC)가 각막의 윤부 영역의 기저 상피에 상주함을 입증하였다. (Forrester, et al., Immunol. Rev ., Vol. 234, pgs. 282-304 (2010)). 또한, 수지상 형태를 지닌 CD11b⁺ CD11c⁺ 세포는 전방 기질에 존재하며, 대식세포 형태를 지닌 CD11b⁺ CD11c^- 세포 군집은 후방 기질에 존재한다. (Hamrah, et al., J. Leukocyte Biol ., Vol. 74, pgs. 172-178 (2003)). 이식 수술을 포함하는 염증성 손상에 대한 반응에서, APC는 주조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 II를 과다발현함으로써 성숙하게 된다. (Dana, Invest . Ophthalmol . Vis . Sci ., Vol. 45, pgs. 722-727 (2004); Dana, Trans . Am . Ophthalmol . Soc ., Vol. 105, pgs. 330-343 (2007)). 대부분 숙주 기원인 활성화된 APC는 각막에서 이식편-유래된 항원을 취하고, DLN으로 이동시키고, 여기서 이들은 항원을 숙주 T 세포에 제시하여 T 세포-매개된 면역 거부를 초래한다. (Forrester, 2007; Kuffova, et al., J. Immunol ., Vol. 180, pgs. 1353-1361 (2008)). 따라서, 본 발명자들은 이어서, IV hMSC에 의한 염증 감소가 각막 및 DLN에서 APC의 활성화 감소를 유도할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 먼저, 본 발명자들은 이식 후 1 주째에 숙주-유래된 MHC 클래스 II (뮤린 Ia^d)에 대한 각막의 전체 마운팅된 상피 시트를 시험하였다. 본 발명자들은 1주 시점을 선택하였는데, 왜냐하면 이는 동종감작화 (allosensitization)는 발생하나 동종거부는 아직 시작되지 않는 시점이기 때문이다. (Forrester, 2007). 따라서, 이는 본 발명자들에게 동종멱역의 어페런트 감작화 아암 (afferent sensitization arm)을 시험할 수 있게 해준다. 면역염색은 각막의 MHC 클래스 II⁺ 세포 수가 hMSC 비처리된 자가이식편 또는 동종이식편과 비교하여, hMSC 처리된 마우스로부터의 동종이식편에서 현저하게 감소되었음을 보여주었다 (도 6). 그 후, 본 발명자들은 DLN에서 MHC 클래스 II⁺ 세포 군집의 서브셋을 분석하였다 (이식된 눈에 대해 경부 LN 동측). 유세포 분석기는 DC 즉, MHC II⁺ CD11b⁺ CD11c⁺ 세포 및 MHC II⁺ CD11b^- CD11c⁺ 세포 모두의 비율이 hMSC로 처리된 마우스에서 현저하게 감소하였음을 보여주었다 (도 7). hMSC의 2회 주입 (-1 일 및 0 일)이 단일 주입 (0일) 보다 더욱 효과적이었다. DC 이외에, MHC II⁺ CD11b^- CD11c⁺ 세포 제시 대식세포의 비율은 IV hMSC로 처리된 군에서 현저하게 감소되었다. 자가이식편과 동종이식편간의 각막 및 DLN에서 APC의 유사한 증가의 발견은, 이식 과정 및 수술-유도된 염증이 APC의 활성화에 기여함을 나타내며, 이는 이전에 보고된 데이타와 일관된다. (Dana, 2007). IV hMSC로의 처리는 이식편에서 감소된 염증 및 각막 및 DLN에서 APC의 감소된 활성화를 달성하였다. 따라서, 데이타는 자가면역 반응의 어페런트 림 (afferent limb)이 hMSC에 의해 억제되었음을 나타내었다.

IV 투여된 hMSC 는 각막 동종이식편에 생착하지 않았다.

이전 보고서는 마우스에서 IV 주입된 hMSC의 거의 대부분이 폐에 포획되고, 각막 또는 심장과 같은 손상된 조직으로의 장기간 생착 없이 약 24시간의 반감기로 사라지는 것으로 보고하였다. (Roddy, et al., Stem Cells, Vol. 29, pgs. 1572-1579 (2011); Lee, et al., Cell Stem Cell, Vol. 5, pgs. 54-63 (2009)). hMSC가 IV 주입 후 이식된 각막에서 생착되는지의 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 각막 이식 -1 일 및 0일에서 1 x 10⁶ hMSC의 2회 IV 주입으로 투여한 마우스로부터의 각막에서 인간-특이적 GAPDH에 대한 정량적 RT-PCR검정을 수행하였다 (도 8 및 표 1). 도 8 및 표 1에 도시된 결과는, 10개 미만의 hMSC가 이식 후 10시간 내지 28일까지 각막에 존재하였음을 입증하였다. 따라서, 유리한 효과가 각막에서의 IV 투여된 세포 생착에 의해 설명되지 않았다.

표 1

총 진핵세포 18s rRNA와 비교하여 인간-특이적 GAPDH (hGAPDH)의 발현을 기반으로 하여 한 마리의 마우스 각막에서 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 수에 대한 표준 곡선. hMSC (동물당 1 x 10⁶ 세포)의 정맥내 (IV) 주입 후 1일째 및 3일째에 래트 각막에서 hGAPDH의 발현 수준.

폐에 포획된 IV hMSC 를 활성화시켜 항-염증 유전자/단백질 TSG -6을 발현시켰다.

대부분의 IV hMSC가 폐에 포획되고 (Lee, 2009), 각막에 생착되지 않기 때문에 (도 8 및 표 1), 본 발명자들은 각막 이식편에 대한 hMSC의 효과가 폐에 포획된 세포로부터 생성된 영양 요소에 의해 매개되었다는 가설을 시험하였다. 본 발명자들은 인간-특이적 정량적 RT-PCR 검정을 사용하여, hMSC를 -1 일 및 0 일에 IV hMSC 2회 투여한 마우스에서 각막 동종이식 후 10시간째에 폐를 스크리닝하였다. 데이타는, 주입된 세포의 약 10%가 폐에 존재하였음을 나타냈다 (도 9). 본 발명자들은 MSC에 의해 분비되는 것으로 종래 확인되었던 면역조절 및 항-염증 분자의 발현에 대해 검정하였다: COX2, NOS2, IDO, CCL2, TGF-β, TSG-6, STC-1, 및 PTX3. (English, et al., Cell Stem Cell, Vol. 7, pgs. 431-442 (2010); Lee, et al., J. Cell . Biochem ., Vol. 112, pgs. 3073-3078 (2011)). 본 발명자들은 가장 높게 상향 조절된 인간 전사물이 항-염증 단백질 TSG-6에 대한 것임을 발견하였다 (113.8-배) (도 10).

TSG -6 siRNA 가 넉다운된 IV hMSC 는 조기 염증을 감소시키거나 동종이식체 생존을 연장시키기 않았다.

이식 거부를 예방하는데 있어서 TSG-6의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 siRNA로의 일시적 트랜스펙션에 의해 hMSC에서의 TSG-6의 발현을 넉 다운시키고, 상기 세포를 수술 -1 일 및 0일에 각막 동종이식편을 갖는 마우스에 주입하였다. 6개 동종이식편중 3개는 TSG-6 넉다운된 hMSC의 2회 주입으로 투여된 마우스에서 거부된 반면, 스크램블 siRNA 대조군을 갖는 hMSC로 2회 주입으로 투여된 마우스에서는 모든 동종이식편 (6/6)이 28일에 거부 없이 유지되었다 (p=0.047; 일반화된 윌코슨 테스트) (도 11a). 추가적으로, TSG-6 넉다운된 hMSC는 7일째에 각막 염증을 억제하는데 효과적이지 않았다 (도 11b). 또한, 각막 이식편에서 활성화된 T-세포 유래된 사이토카인 및 이펙터 효소에 대한 전사물의 수준은 TSG-6 넉다운된 hMSC에 의해 억제되지 않는 반면, 스크램블 siRNA를 지닌 hMSC는 T-세포 사이토카인 및 효소에 대한 전사물 수준을 현저하게 감소시켰다 (도 11c-h).

재조합체 TSG -6의 IV 주입은 동종이식편의 조기 염증 및 각막 동종이식편의 후기 거부를 감소시켰다.

다음에, 본 발명자들은 전신-투여된 rhTSG-6가 각막 동종이식편에서 수술-유도된 염증을 감소시킴으로써 IV hMSC의 효과를 재현할 수 있다는 가설을 시험하였다. 본 발명자들은 각막 동종이식 직후 100 μL PBS중의 35㎍ rhTSG-6를 꼬리 정맥 주입에 의해 투여하였다. 각막 동종이식편의 생존이 PBS-주입된 대조군과 비교하여, rhTSG-6로 처리된 마우스에서 현저하게 연장되었다 (평균 생존 시간: TSG-6 처리된 이식편에서는 25.6±1.5 일 및 PBS-처리된 이식편에서는 18.6±3.1 일; p=0.042; 일반화된 윌코슨 시험) (도 12). 7일째에 각막에서 MPO 및 염증전 사이토카인 (IL-6, IL-1β, IL-12a, 및 IL-12b)의 발현은 rhTSG-6 주입 후 현저하게 감소하였다 (도 12b-f). 또한, T 세포-관련된 사이토카인, IL-2, IFN-γ, 그랜자임 B, 및 퍼포린에 대한 전사물의 수준은 28일째에 TSG-6로 처리된 마우스로부터의 동종이식편에서 현저하게 감소하였다 (도 12g-j).

논의

도 13에 요약된 바와 같이, 결과는 IV hMSC가 이식 수술 후 각막에서 APC의 활성화를 감소시키고 조기 염증 반응을 저지함으로써 장기간 생착 없이 동종이식편의 생존을 증가시켰음을 입증하였다.

본 발명자의 데이타는 hMSC가 손상된 조직으로의 생착 없이, 그리고 주로 과도한 염증 및 면역 반응을 조절하는 유전자를 상향-조절함으로써 치료학적 이점을 유도할 수 있다는 현 패러다임에 일치한다. (Prockop, et al., J. Cell. Mol . Med., Vol. 14, pgs. 2190-2199 (2010); Uccelli, et al., Curr . Opin . Immunol ., Vol. 22, pgs. 768-774 (2010)). 본 실험에서, 다중-작용성 항-염증 단백질 TSG-6 (Milner, et al., Biochem . Soc . Trans ., Vol. 34, pgs. 446-450 (2006); Wisniewski, et al., Cytokine Growth Factor , Rev ., Vol. 15, pgs. 129-146 (2004))는 IV 주입된 hMSC의 유리한 효과를 설명하였다. IL-1을 포함하는 염증전 사이토카인은 APC 예컨대, LC의 모집, 활성화 및 이동에 중요한 역할을 수행하기 때문에 (Dana, 2004; Dana, 2007), hMSC에 의한 이식 후 조기 염증의 억제는 면역 반응의 어페런트 루프의 억제를 통한 각막 동종이식편의 연장된 생존에 기여할 수 있다.

염증 억제 이외에, MSC는 또한 면역계에 다른 영향을 끼칠 수 있다. 많은 수의 시험관내 및 생체내 데이타는, MSC가 광범위한 면역 세포와의 이들의 상호작용 (T 및 B 세포, 조절 T 세포, NK 세포, DC, 대식세포, 및 호중구)을 통해 그리고, 많은 분자 예컨대, IDO, PGE₂, 산화질소, CCL2, TGF-β, TSG-6, IL-10, 또는 HLA-G를 분비함으로써 면역억제될 수 있음을 입증한다 (Uccelli, 2010; Siegel, et al., Transplantation, Vol. 87, pgs. 545-549 (2009); Ren, et al., Cell Stem Cell, Vol. 2, pgs. 141-150 (2008); Rafei, et al., J. Immunol ., Vol. 182, pgs. 5994-6002 (2009); Crop, et al., Transpl . Int ., Vol. 22, pgs. 365-376 (2009)). MSC의 면역-조절 메카니즘에 대한 실험 결과에서 이러한 상당한 다양성 및 차이는 아마도 손상된 조직의 미세환경에 대한 이들의 현저한 반응 능력을 반영한다. 본 실험에서, 본 발명자들은 이식 1일 전 및 이식 시에 hMSC를 IV 주입하였다. 세포가 주입 후 계 (system)로부터 신속하게 제거되지만 (Lee, 2009), MSC는 항-염증 분자 TSG-6를 상향-조절함으로써 수술-유도된 조기 염증을 현저하게 감소시켰다. 특히, 본 발명자들의 본 실험 세팅시, MSC에 의해 분비되는 것으로 종래 관찰되었던 면역조절 및 항-염증 분자 (COX2, NOS2, IDO, CCL2, TGF-β, STC-1, 및 PTX3)의 발현은 전사 수준에서 hMSC에서 상향-조절되지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 단백질 수준에서 TSG-6 이외의 분자의 일관된 발현이 현 연구에서 관찰된 hMSC의 작용에 기여할 수 있는 가능성을 배제할 수 없다. IV 재조합체 TSG-6으로 유사한 결과가 수득되었다. 또한, hMSC의 투여는 염증 및 면역 반응에 대한 복합 시스템을 전제 조건으로 할 수 있기 때문에, 효과는 대부분의 hMSC가 더 이상 검출되지 않은 후에 분명해졌다.

여기서 중요한 관찰중 하나는, hMSC가 단지 수술 직후에만 주입되는 경우 보다 수술 1일 전 및 수술 직후 둘 모두에서 IV 주입되는 경우 더욱 효과적이었다는 것이다. 결과는 hMSC가 염증전 사이토카인 예컨대, TNF-α 또는 IFN-γ에 의해 활성화되지 않는다면 배양시 치료학적 단백질 예컨대, TSG-6을 발현하지 않으며, 이들은 IV 주입 후 폐에 포획된 후 약 10시간까지도 TGS-6을 발현하도록 활성화되지 않는다는 점을 반영할 수 있다. (Lee, 2009). 따라서, hMSC의 수술전 투여는 본 연구에서 확인된 바와 같이 수술-유도된 염증을 더욱 효과적으로 감소시킬 수 있다.

본 발명자들은 각막 동종이식이 마우스에서 가장 잘 연구되고, 동종항원의 도입으로부터 면역 거부까지의 사건의 시간적 순서가 본 모델에서 잘 확립되었기 때문에 본 연구에서 마우스 모델을 사용하였다. (Forrester, 2010; Catron, J. Exp. Med ., Vol. 203, pgs. 1045-1054 (2006); Kuffova, et al., Transplantation이식, Vol. 72, pgs. 1292-1298 (2001)). 그러나, 마우스 눈에서 각막을 이식하는 수술 과정은 인간에서의 이식과 비교하여 더욱 심각한 조직 손상 및 수술-유도된 염증을 유발하였다. 더 큰 동물 모델에서의 추가 연구가 유익할 것이다.

결과는 다양한 동물 모델의 심장, 폐, 피부 및 섬 (islet)과 같은 기관 이식에서 관찰된 MSC의 유리한 효과를 잘 설명할 수 있다. (Crop, 2009; Casiraghi, et al., J. Immunol ., Vol. 181, pgs. 3933-3946 (2008); Jawinen, et al., J. Immunol ., Vol. 181, pgs. 4389-4396 (2008); Sbano, et al., Arch . Dermatol. Res ., Vol. 300, pgs. 115-124 (2008); Ding, et al., Transplantation, Vol. 89, pgs. 270-273 (2010)). 또한, 데이타는 이식물 생존을 향상시키기 위해 MSC에 대한 메카니즘으로서의 면역 내성 검사에 주로 촛점을 맞춘 이전 연구에 따라 확장될 수 있다. 또한, 조기 염증 반응은 치료를 위한 인바이팅 타겟 (inviting target)일 수 있다. 여기서 제시된 결과는 이식된 환자에서 약물학적 면역억제 요구를 감소시키기 위해 제 1 또는 제 2 치료법으로서 MSC를 사용하는 것에 대한 또 다른 이유를 부가한다. 게다가, 재조합 TSG-6의 IV 투여는 hMSC의 많은 유리한 효과를 재현하였기 때문에, 결과는 단백질 요법이 세포 요법보다 더욱 유용할 수 있다는 가능성을 증가시킨다.

요약하면, 본 발명자들의 결과는, MSC가 이식 후 수술-유도된 조기 염증을 억제함으로써 각막 동종이식편의 생존을 연장시켰음을 나타낸다. MSC의 작용은 각막에서 세포의 현저한 생착 없이 그리고, 주로 항-염증 분자 TSG-6을 포함하는 영양 인자를 분비함으로써 발휘되었다. 이러한 관찰은 고형 기관의 모델 및 세포성 이식에서 전에 관찰된 MSC의 유리한 효과를 설명할 수 있다. 게다가, 이러한 데이타는 각막 및 가능하게는 다른 기관의 이식물의 생존을 향상시키기 위해 MSC 또는 TSG-6를 사용할 근거를 제공한다.

모든 특허, 문헌 (공개된 특허 출원 포함), 예탁 기탁 번호, 및 데이타베이스 접근 번호에 대한 기재는, 각 특허, 문헌, 예탁 기탁 번호 및 데이타베이스 접근 번호가 개별적으로 참조로서 포함되는 바와 같이 동일한 정도로 본원에 참조로서 포함된다.

그러나, 본 발명의 범위는 상기 기술된 특정 구체예로 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 특별하게 기술된 것 이외의 것으로 실시될 수 있으며, 여전히 첨부된 청구범위의 범위내에 있을 수 있다.

참조

Claims (8)

1. 동물에 중간엽 줄기 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 각막 이식의 거부를 예방하거나 치료하는 방법으로서,
   상기 중간엽 줄기 세포가 상기 동물에서 상기 각막 이식 거부를 예방하거나 치료하는데 유효한 양으로 투여되는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체를 추가로 포함하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 항-염증 단백질이 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체인 방법.
4. 동물에 하나 이상의 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 이식된 세포, 조직 및/또는 기관의 거부를 예방하거나 치료하는 방법으로서,
   상기 항-염증 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체가 상기 동물에서 상기 이식된 세포, 조직 및/또는 기관의 상기 거부를 치료하거나 예방하는데 유효한 양으로 투여되는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 하나 이상의 항-염증 단백질이 TSG-6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편, 유도체 또는 유사체인 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 조성물이 중간엽 줄기 세포를 추가로 포함하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 면역조절제 및/또는 하나 이상의 면역억제제를 추가로 포함하는 방법.
8. 제 4항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 면역조절제 및/또는 하나 이상의 면역억제제를 추가로 포함하는 방법.
   
   

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