CN109844101B - 使用极化巨噬细胞的细胞疗法,用于组织再生 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了诱导巨噬细胞极化为可用于组织修复的M2表型的体外方法。本发明所述方法包括将巨噬细胞体外暴露于重复系列的缺氧‑复氧。通过该方法获得的活化的M2巨噬细胞过表达对组织重塑和炎症改善重要的分子,例如NGAL和抗炎细胞因子(IL‑10)。因此,通过该方法获得的M2巨噬细胞可用作用于组织再生的细胞疗法。本发明还提供包含通过所述方法获得的M2巨噬细胞的药物组合物和试剂盒。本发明还涉及根据所述方法在分离的巨噬细胞上诱导缺氧和复氧条件的装置。

Description

使用极化巨噬细胞的细胞疗法,用于组织再生
技术领域
本发明属于用于组织修复的细胞疗法领域。具体地说,本发明涉及一种用于获得极化到适于组织再生的M2表型的巨噬细胞的体外方法。本发明也涉及通过该方法获得的M2巨噬细胞群,以及包含其的药物和药物组合物,其用于细胞治疗中损伤,受伤或受损组织的再生。
背景技术
巨噬细胞源自循环单核细胞,其离开脉管系统(vasculature)并侵入周围组织,在那里它们在局部信号的影响下分化成定居组织巨噬细胞(resident tissuemacrophages)。定居巨噬细胞具有各种各样的作用;它们巡视组织中的受损或凋亡细胞,通过吞噬作用将其清除,它们识别并消除侵入性病原体诸如细菌,真菌和病毒感染细胞,它们清除脂蛋白,并且它们还负责通过影响新血管的形成和调节血管通透性来调节组织氧化。
巨噬细胞是一种高度多能性细胞类型(highly versatile cell type),具有令人印象深刻的功能库,这取决于它们的位置和活化状态。这包括抗原呈递,抗菌和抗肿瘤活性,以及多种调节肽因子,前列腺素和酶的分泌。
因此,巨噬细胞是一群免疫细胞,其协调各种功能,包括炎症,组织修复和免疫反应。这种功能多样性是通过巨噬细胞的显著异质性来实现的,巨噬细胞由于分化的可塑性以及局部环境因素而具有显著改变其表型的能力。
作为免疫效应细胞,巨噬细胞在炎症和宿主防御中的作用已被充分表征。此外,巨噬细胞在促进正常伤口愈合以及响应病原性攻击或组织损伤的炎症消退中是不可或缺的(Christopher J.Ferrante and Samuel Joseph Leibovich,2012,Advances in woundcare,1:1,10-16)。这些不同的生理功能来源于巨噬细胞的显著可塑性,这使得这些细胞能够响应于局部环境信号显著改变其形态和功能。未受刺激的巨噬细胞通常是静止的;然而,刺激这些细胞导致响应于定居在局部微环境中的分子信号产生明显极化的表型。
目前巨噬细胞的分类将极化识别为两种不同的表型。因此,巨噬细胞通常被分类为经典(classically)(M1)或替代性(alternatively)(M2)活化。M1巨噬细胞具有促炎表型,其表现出增强的吞噬活性和促炎细胞因子的分泌,这有助于病原体和异常或受损组织的去除。M2巨噬细胞具有极性相反的表型,其表现出高水平的抗炎细胞因子和纤维化和血管生成因子,其用于消炎并促进伤口愈合(Martinez FO,Helming L,andGordonS.2009.Annu Rev Immunol;27:451–483)。M1和M2巨噬细胞都表达不同的分子标记。
M1巨噬细胞是通过识别病原体相关的分子模式,如细菌脂多糖(LPS)和肽聚糖,或损伤相关的分子模式,如释放的细胞内蛋白和核酸,以及通过T细胞分泌的细胞因子干扰素γ(IFN-γ)刺激而诱导的。M1代表促炎症表型,表现出增加的吞噬和抗原处理活性以及增加的促炎细胞因子(例如白细胞介素1[IL-1],IL-6,IL-12和肿瘤坏死因子α[TNF-α])和氧化代谢物(例如一氧化氮和超氧化物)的产生,以促进宿主防御和去除受损组织。相反,M2巨噬细胞由多种刺激(例如,IL-4/IL-13,糖皮质激素)诱导,并且代表在促进伤口愈合和组织重塑以及炎症消退方面可能重要的表型(Martinez FO,Sica A,Mantovani A,and LocatiM.2008.Front Biosci;13:453-461)。
巨噬细胞的显著可塑性对临床科学具有重要意义。适当的巨噬细胞极化在多个重要的生理过程中是必要的,包括但不限于伤口愈合,免疫应答和神经/肌肉再生(KigerlKA,et al.,2009,J Neurosci;29:13435–13444)。因此,巨噬细胞极化的畸变与在缺陷性伤口愈合,糖尿病,肌营养不良,纤维增生性疾病如类风湿性关节炎和肝和肺纤维化以及肿瘤进展中观察到的一些病理学相关并不令人奇怪。阐明导致巨噬细胞极化的特定微环境信号可能会潜在地导致用于巨噬细胞表型的药理学操作的方法以促进有利的过程(例如,伤口愈合)或抑制病理过程(例如,纤维增生性疾病和肿瘤生长)。
如前所述,巨噬细胞响应于不同的环境刺激而改变其表型的能力导致了大量的研究,以鉴定诱导这些表型的各种信号以及表征M1和M2巨噬细胞的分子谱。然而,巨噬细胞极化是一个复杂的过程,并且已经发现存在一组广泛的信号,其可以诱导不同的巨噬细胞表型。
存在于患病组织中增加的大量巨噬细胞中,许多被发现积聚在血管化不良的缺氧部位或与其相邻的部位,在这些部位可能已经发生了相当大的组织损伤。据报道,在乳腺癌和卵巢癌的无血管和坏死部位,皮肤伤口的缺氧区(Hunt,T.K.,et al.,1983,Surgery,96,48–54),动脉粥样硬化斑块的无血管部位,类风湿性关节炎的关节中滑膜,增生性视网膜病变的缺血部位以及脑疟疾的血管闭塞部位周围均存在有大量巨噬细胞。
巨噬细胞能够在这种不利条件下通过改变基因表达和适应它们的代谢活性而发挥作用。缺氧可以诱导巨噬细胞分泌活性的显著变化,引起巨噬细胞在体外和体内释放促血管生成和炎性细胞因子。一些研究已经对实验性缺氧对各种巨噬细胞功能的影响进行了综述(Claire Lewis,et al.,1999,Journal of Leukocyte Biology,66,889-900;María MEscribese,et al.,2012,Immunobiology,217,1233–1240)。
然而,由于缺氧通常在患病组织中是短暂的,并且如果有的话,很少作用于与其他致病性刺激分离的细胞,这些研究强调了需要共刺激(针对其对巨噬细胞的影响)。
从现有技术中已知多种用于在细胞培养中诱导缺氧的医疗装置。例如,在GB2499372中描述了一种用于细胞培养的低氧压力室,其包括具有气体入口和气体出口的塑料室。在US3886047中,公开了一种缺氧室,其具有用于在受控气氛下培养生长的入口和出口气体管。
还已知一种培养室,其描述于US2003092178中,其中监测氧浓度以控制室内的气体曲线。此外,文献WO2010058898提出了一种装置,其包括用于细胞培养的培养室,将空气从培养室排出到外部的真空泵,控制向培养室供给二氧化碳的二氧化碳罐的供给管和向培养室供给氮气的氮气罐的供给管的自动控制阀。
所有这些装置的共同之处在于其设计成用于在缺氧室中培养细胞,并且可用于研究目的。这些装置都不适用于临床应用,因为这些过程不是在无菌条件下进行的。在前面描述的所有系统中,细胞培养物被放置并从缺氧室移至外部环境,因此可以容易地被污染。
另一方面,已经设计了多种系统以从血液样品中分离和浓缩血液成分。一些实例是专利ES1059764,US7976796和US2016015884,但并没有描述为在这些装置中包含的细胞上诱导缺氧的系统。
总而言之,需要获得极化为促进伤口愈合和通常组织再生的表型的巨噬细胞的方法。具体地,将巨噬细胞人工极化成M2表型的方法将是特别令人感兴趣的,因为M2巨噬细胞表现出在促进伤口愈合和组织重塑以及炎症消退中重要的表型。因此,这些方法的发展将使得能够人工操纵巨噬细胞极化以获得巨噬细胞表型,所述巨噬细胞表型增强正常的生理过程,例如伤口修复。
发明内容
本发明提供了一种诱导巨噬细胞极化(分化)为可用于组织修复的M2表型的体外方法。通过该方法获得的活化的M2巨噬细胞过表达对组织重塑和炎症改善重要的分子,例如NGAL和抗炎细胞因子(IL-10)。因此,通过该方法获得的M2巨噬细胞可用作组织再生的细胞疗法。
本发明中描述的方法包括体外或离体暴露分离的巨噬细胞,优选在培养物中,更优选先前已经从患者中分离出的那些,进行重复和连续的一系列缺氧-复氧(hypoxia-reoxygenation)(每个系列组成如下:在缺氧条件下的第一步,随后在复氧条件下的第二步)。更优选地,该方法由3或4系列缺氧-复氧组成,甚至更优选该方法由4系列缺氧-复氧组成。在这些条件下培养的巨噬细胞由于缺氧-复氧周期而获得活化的M2表型。因此,这些得到的巨噬细胞可用于随后将其给予患者受损组织中,其中它们促进完全组织再生。
下面的实施例表明,与未经过本发明所述的缺氧-复氧方案的培养巨噬细胞相比(对照),通过本发明方法获得的那些极化M2巨噬细胞至少过量表达NGAL,并且优选还有IL-10(更优选在mRNA水平)。此外,在经历与本发明中提出的那些不同数量的缺氧-复氧系列的巨噬细胞中没有观察到这种NGAL过表达。例如,下面的实施例显示,与对照(未经历缺氧-复氧条件的巨噬细胞)相比,已经经历5次缺氧-复氧系列的那些巨噬细胞未显示NGAL表达的增加。这些结果证明,暴露于本文所述方法中指示的特定数量的缺氧-复氧系列优于其他不同数量的系列。因此,本发明所述的方法提供了有利的M2活化巨噬细胞,其不能通过其它诱导方案获得,甚至那些也涉及在缺氧条件下进行培养。
因此,通过本发明所述方法获得的M2巨噬细胞可用于细胞治疗方法,通过将其给予需要其的受试者的损伤区域来进行组织再生。优选地,所述M2巨噬细胞可以在受损区域注射,更优选通过肌内注射,用于组织再生,甚至更优选用于肌肉修复。
本发明的主要优点之一是在本发明方法中描述的条件下有待培养用于极化的巨噬细胞可以是自体的。这降低或消除了有待与极化细胞一起给药的患者中的不良免疫反应相关的那些风险。此外,在本发明方法中所述的条件下有待培养的巨噬细胞可以容易地从患者,优选从血流中获得和分离。此外,产生的M2巨噬细胞能够促进组织再生,炎症减少和瘢痕或纤维化清除(纤维化减少)。
因此,本发明的一个方面涉及一种获得极化或分化为M2表型的巨噬细胞的方法,以下称为“本发明的方法”,其包括:
a.使分离的巨噬细胞经受至少一个但少于五个系列的缺氧-复氧,和
b.回收在步骤(a)后得到的巨噬细胞。
本发明的方法也可以描述为“用于巨噬细胞极化/分化为M2表型的方法”,或“用于获得具有M2表型的巨噬细胞的方法”,或“用于获得具有诱导组织重塑,再生或修复的表型的活化巨噬细胞的方法”。
本发明该方法的步骤(a)中的巨噬细胞可以处于体外细胞培养中,或者优选地,可以在包含氧张力(oxygen tension)的外部控制的胶囊中分离。
本发明方法的一个优选实施例中,步骤(a)的巨噬细胞是人或非人哺乳动物巨噬细胞,更优选它们是人巨噬细胞。在甚至更优选的实施例中,巨噬细胞是自体的。术语“自体的(autologous)”是指从与将给药所得M2巨噬细胞的人相同的个体获得的巨噬细胞。因此,术语“自体”涉及一个(相同的)个体作为供体和受体。
“巨噬细胞(Macrophage)”是一种白细胞,位于免疫细胞内,其协调各种功能,包括炎症,组织修复和免疫反应。例如,它们在吞噬过程中吞噬和消化细胞碎片,外来物质,微生物,癌细胞和其表面上不具有健康体细胞特异性蛋白质类型的任何其它物质。巨噬细胞基本上存在于所有组织中,在那里它们通过变形虫样运动(amoeboid movement)搜寻潜在的病原体。它们在整个体内采取各种形式(具有不同的名称)(例如,组织细胞,库柏法细胞(Kupffer cell),肺泡巨噬细胞,小胶质细胞等),但它们都是单核吞噬细胞系统的一部分。除了吞噬作用外,它们在非特异性防御(先天免疫)中起着关键作用,并且还通过募集其他免疫细胞如淋巴细胞来帮助启动特定的防御机制(适应性免疫)。例如,它们作为T细胞的抗原呈递体是重要的。除了增加炎症和刺激免疫系统,巨噬细胞还起到重要的抗炎作用,并可通过释放细胞因子减少免疫反应。巨噬细胞可如下识别:例如但不限于,使用流式细胞术或通过蛋白质例如但不限于CD14,CD40,CD11b,CD64,F4/80(小鼠)/EMR1(人),溶菌酶M,MAC-1/MAC-3和/或CD68的特异性表达进行免疫组织化学染色。
本发明方法的步骤(a)中的巨噬细胞也可以是单核细胞或M1巨噬细胞。因此,本发明方法的步骤(a)中使用的术语“巨噬细胞”包括那些通过单核细胞分化产生的巨噬细胞,任何分化或未分化表型的巨噬细胞(包括M1巨噬细胞)和包含在单核吞噬细胞系统内的任何细胞,包括单核细胞。因此,在本发明方法的步骤(a)中使用的术语“巨噬细胞”是指“单核吞噬细胞系统的细胞”。同样地,本发明方法的步骤(a)中使用的术语“巨噬细胞”包括但不限于脂肪组织巨噬细胞,单核细胞,库柏法细胞,窦组织细胞,肺泡巨噬细胞(尘埃细胞(dust cell)),导致巨细胞的组织巨噬细胞(组织细胞),朗格汉斯细胞,小胶质细胞,霍夫包尔氏细胞,肾小球内系膜细胞(intraglomerular mesangial cell),破骨细胞,上皮样细胞,红髓巨噬细胞(red pulp macrophag)(窦内衬细胞),腹膜巨噬细胞,LysoMac等等。在优选实施例中,步骤(a)的巨噬细胞是腹膜巨噬细胞。在另一个优选实施例中,步骤(a)的巨噬细胞更优选地是预先从待治疗个体的血流中分离的单核细胞。
在步骤(a)之前,可以通过本领域技术人员已知的用于获得包含所需细胞的生物样品(在该特定情况下为巨噬细胞或单核细胞)的任何方法从个体,优选从血流中分离巨噬细胞。巨噬细胞也可以不仅从血流中分离,而且可以从任何组织(组织定居巨噬细胞)中分离。巨噬细胞优选通过用巯基乙醇酸盐腹膜内注射而分离。同样,巨噬细胞可以在本发明方法的步骤(a)中以任何方式和在本领域技术人员已知的适合于体外维持和生长细胞,优选巨噬细胞,更优选单核细胞,甚至更优选人单核细胞的任何培养基和支持物存在下培养。在一个优选实施例中,巨噬细胞在补充有胎牛血清(FBS)的RPMI培养基的存在下在该方法的步骤(a)中培养。
巨噬细胞可以通过微环境进行表型极化以安装特定的功能程序。极化的巨噬细胞可以广泛地分为两个主要的类别:经典活化的巨噬细胞(或M1)和可替代地活化的巨噬细胞(或M2)。
促进炎症的巨噬细胞被称为“M1巨噬细胞”,而那些减少炎症并促进组织修复的巨噬细胞被称为“M2巨噬细胞”。这种差异反映在它们的新陈代谢中;M1巨噬细胞具有将精氨酸代谢为“杀手”分子一氧化氮的独特能力,而M2巨噬细胞具有将精氨酸代谢为“修复”分子鸟氨酸的独特能力。M1巨噬细胞(以前称为“经典活化的巨噬细胞”)被LPS和IFN-γ活化,并分泌高水平的IL-12和低水平的IL-10。与此相反,M2“修复”命名(也称为“可替代地活化的巨噬细胞”)广义地指在诸如伤口愈合和组织修复的构建过程中起作用的巨噬细胞,以及通过产生抗炎细胞因子如IL-10而关闭破坏免疫系统活化的巨噬细胞。M2是定居组织巨噬细胞的表型,并且可以通过不同的刺激诸如IL-4,IL-13,免疫复合物加Toll样受体(TLR)或IL-1受体配体,IL10和糖皮质激素而进一步升高。M2巨噬细胞产生高水平的IL-10,TGF-β和低水平的IL-12。与肿瘤相关的巨噬细胞主要是M2表型,并且似乎能主动促进肿瘤生长。M2巨噬细胞与Th2免疫应答相关。它们对寄生虫的包裹很重要,但它们也负责II型超敏反应。抗原呈递上调(MHC II,CD86)。它们还有助于细胞外基质成分的产生和组织重塑。糖皮质激素影响巨噬细胞的粘附,分散,凋亡和吞噬作用。
“巨噬细胞极化”是其中巨噬细胞响应于微环境信号表达不同功能程序的过程。存在许多巨噬细胞极化的功能状态,它们可以完全极化并获得特定的表型,如M1或M2。这些特定的表型取决于巨噬细胞所在的组织和特定的微环境。一方面,巨噬细胞极化对宿主防御病原体非常重要,但另一方面,它对于维持内环境稳定是必不可少的。长期的M1型巨噬细胞对机体是有害的,这就是为什么组织修复和恢复是必要的。M2巨噬细胞负责组织修复,尽管它们也与慢性传染病有关。
各种炎性调节剂,信号传导分子和转录因子的协同作用参与调节巨噬细胞极化。在细胞水平,虽然M1和M2巨噬细胞活性不受T或B细胞的影响而存在,但是特异性或极化的T细胞(Th1,Th2,Tregs)确实在巨噬细胞极化活化中起作用。典型的IRF/STAT信号传导是调节巨噬细胞极化的中心途径。通过IFNs和TLR信号传导激活IRF/STAT信号通路将使巨噬细胞功能偏向M1表型(通过STAT1),而通过IL-4和IL-13激活IRF/STAT(通过STAT6)信号通路将使巨噬细胞功能偏向M2表型。由IL-10,糖皮质激素,凋亡细胞释放的分子和免疫复合物引发的信号也可以深刻地影响巨噬细胞功能状态。巨噬细胞极化也受到局部微环境条件如缺氧的调节。更重要的是,巨噬细胞M1-M2极化是一个高度动态的过程,极化巨噬细胞的表型在生理和病理条件下是可以逆转的。
在本发明方法的步骤(a)中,将分离的巨噬细胞进行1,2,3或4次连续系列的缺氧-复氧。因此,5或更多个缺氧-复氧系列排除在本发明的范围之外。优选地,本发明方法的步骤(a)由3或4系列缺氧-复氧组成。更优选地,该步骤(a)由4系列缺氧-复氧组成。如以下实施例所示,当巨噬细胞经受4次缺氧-复氧系列时,与未经受缺氧-复氧系列或经受不同(更低或更高)次数缺氧-复氧系列的对照巨噬细胞相比,实现了NGAL和IL-10显著更高的过表达。因此,该优选实施例(其中巨噬细胞在步骤(a)中进行4次缺氧-复氧系列)导致具有改进的M2表型的改进的巨噬细胞。
IL-10和NGAL的过表达对于所得巨噬细胞的组织再生和抗炎活性是重要的。“白细胞介素10(IL-10)”是一种在免疫调节和炎症中具有多种,多效性作用的抗炎细胞因子。它下调巨噬细胞上Th1细胞因子,MHC II类抗原和共刺激分子的表达。它还可以增强B细胞的存活,增殖和抗体产生。IL-10能够抑制由细胞诸如巨噬细胞和Th1T细胞产生的促炎细胞因子诸如IFN-γ,IL-2,IL-3,TNFα和GM-CSF的合成。另一方面,“NGAL”或“中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)”是脂质运载蛋白超家族的25-kDa蛋白质,并通过捕获和消耗铁载体(siderophore)发挥抑菌作用。NGAL在不同细胞类型中充当生长和分化因子。已经显示外源性NGAL引起反映早期上皮祖细胞的遗传标记的表达,并支持上皮细胞的增殖。NGAL还诱导中性粒细胞和淋巴细胞中的细胞死亡以限制炎症,相反非造血细胞和巨噬细胞是抗性的。阻断巨噬细胞中NGAL的产生降低了在肾缺血/再灌注损伤模型中用IL-10过表达巨噬细胞实现的保护作用,证实了NGAL相关的促增殖和抗炎特性。NGAL在巨噬细胞中的过表达诱导炎症前的组织再生并减少随后的炎症(炎症细胞因子水平降低,抗炎细胞因子水平升高)。因此,NGAL表现出促增殖,促再生和抗炎性质,使得通过本发明方法获得的所得巨噬细胞适合于组织再生/修复。
在本发明中,每个“缺氧-复氧系列”包括第一阶段,其中分离的巨噬细胞经受低氧条件。第一阶段紧接着是第二阶段,其中巨噬细胞经受标准氧气条件,即在该第二阶段,在细胞环境中恢复氧浓度。在一个优选的实施例中,每个缺氧-复氧系列包含2至5分钟,更优选3分钟的缺氧,随后进行至少45秒的复氧。更优选地,复氧阶段在不超过1分钟内进行。
“低氧条件”或“缺氧条件”是其中细胞经受0至0.6%的氧浓度,优选O2为0%的那些。更优选地,在以下条件下在低氧室中诱导缺氧:氮气95%;CO25%;O20%。
“标准氧条件”或“复氧条件”是其中细胞经受大气空气的那些。优选地,复氧条件是CO25%加大气空气。
在本发明所述的方法中,在步骤(a)中连续且持续地进行缺氧-复氧系列,这意味着在一个系列和随后的系列之间不存在时间段,但是在前一系列的复氧阶段之后紧接着是下一系列的缺氧阶段。
在另一个优选实施例中,本发明的方法包括在步骤(a)和(b)之间的附加步骤(a'),其包括对步骤(a)之后获得的巨噬细胞进行最终的复氧步骤。也就是说,在最后的缺氧-复氧系列之后,可以任选地执行由最终的复氧阶段组成的附加步骤。最后的复氧步骤在标准氧条件下进行。在一个更优选的实施例中,该最终的复氧步骤在不超过1小时30分钟的时间内进行。在甚至更优选的实施例中,该最终的复氧步骤在1小时30分钟内进行。
本发明的方法可另外包括其他步骤,例如但不限于,在步骤(a)之前,优选在至少24小时内,在标准培养条件下维持和生长巨噬细胞,和/或在步骤(b)之后,优选在至少1小时30分钟内,在标准条件下维持和生长所得巨噬细胞。
在本发明方法结束时获得的所得巨噬细胞具有典型的M2表型;然而,本领域已知巨噬细胞的基因表达谱和因此的功能可以基于诱导物刺激的性质而不同。因此,由于本发明的方法包括通过改变和触发特定信号通路影响巨噬细胞极化的特定缺氧-复氧条件,显然通过本发明的方法获得的那些特定M2巨噬细胞在基因表达谱方面,并且因此在功能性方面不同于通过其它刺激或通过与本文具体描述的那些不同的其它缺氧条件极化或活化的其它M2巨噬细胞。
因此,本发明的另一方面涉及通过本发明的方法获得或可获得的M2巨噬细胞或M2巨噬细胞群,其中所述M2巨噬细胞(和群体中包含的M2巨噬细胞)至少过表达NGAL。在下文中,这些也将被命名为“本发明的M2巨噬细胞”和“本发明的M2巨噬细胞群”。在优选的实施例中,本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群也过表达IL10。
本文所用的术语“过表达”是指基因表达水平,具体地是NGAL和IL-10基因表达水平,其高于,优选显著高于未进行缺氧-复氧(但在标准条件下培养)或未进行与研究中或待评估的巨噬细胞所用相同的缺氧-复氧条件的对照巨噬细胞相同基因的基因表达水平。
本发明涉及的“过表达”可以是蛋白质或mRNA水平,优选mRNA水平。因此,表述“基因表达水平”在本文中可以理解为“蛋白质表达水平”或“mRNA表达水平”。
所述基因表达水平可通过以下方法在细胞中测量或测定:例如但不限于,PCR,RT-LCR,RT-PCR,qRT-PCR或用于扩增核酸的任何其它方法,用通过任何方法沉积的寡核苷酸制备的DNA微阵列,用原位合成的寡核苷酸制备的DNA微阵列,使用特异性标记探针的原位杂交,电泳凝胶,膜转移和与特异性探针的杂交,RMN,在测定中与特定抗体孵育,例如蛋白质印迹,免疫沉淀,蛋白质阵列,免疫荧光,免疫组织化学,ELISA或任何其他酶促方法,通过与特定配体孵育,色谱法,质谱法等。
一旦在本发明方法的步骤(b)中回收所得的M2巨噬细胞,可将这些巨噬细胞对个体给药,优选在受损区域中,用于组织修复,或可以将它们加入到医药或药物组合物中,用作损伤或受损组织再生中细胞治疗的药物。因此,本发明的另一方面涉及药物组合物,下文称为“本发明的组合物”或“本发明的药物组合物”,其包含本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群。
本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体,赋形剂,佐剂和/或其他活性成分。
术语“赋形剂”是指有助于吸收本发明组合物的元素,稳定所述元素,活化或有助于制备组合物,使其具有稠度(consistency)的物质。因此,赋形剂可具有用于保持成分粘接在一起的粘接功能,例如在淀粉,糖或纤维素的情况下,甜味功能,染色功能,保护组合物的保护功能,例如,将其与空气和/或湿气隔离,用于填充药丸,胶囊或任何其他形式的呈现的填充功能,例如在磷酸氢钙的情况下,促进成分溶解及其吸收的崩解功能,不排除本段中没有提到的任何类型的赋形剂。
与赋形剂一样,“药学上可接受的载体”是组合物中用于稀释其中包含的任何成分最高至一定体积或重量的物质或物质组合。术语“载体”是指必须使用其给予本发明的组合物的溶剂,辅助剂,赋形剂或载体;显然,所述载体必须与所述组合物和包含在其中的细胞相容。药学上可接受的载体可以是但不限于固体,液体,溶剂或表面活性剂。载体的实例可以是但不限于水,油或表面活性剂,包括石油,动物,植物或合成来源的那些,例如,在非限制性意义上,花生油,大豆油,矿物油,芝麻籽油,蓖麻油,聚山梨醇酯,脱水山梨糖醇酯,醚硫酸盐,硫酸酯,甜菜碱,葡糖苷,麦芽糖苷,脂肪醇,壬苯醇醚(nonoxinole),泊洛沙姆,聚氧乙烯(polioxiethylene),聚乙二醇(poliethylenglycol),葡萄糖,甘油,毛地黄皂苷及其类似物。药理学上可接受的载体是具有与本发明组合物中包含的任何元素类似的作用的惰性物质或载体。载体的功能是促进其他元素的结合,实现更好的计量和给药或给予组合物一致性和形式。当呈现的形式是液体时,药理学上可接受的载体是溶剂。
本发明的组合物包含治疗有效量或密度的本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群。“治疗有效量”应理解为本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群的数量或密度,当为待治疗的患者给药时,产生所需的效果,从而促进组织修复和炎症减少。治疗有效量可以根据多种因素而变化,例如,但不限于,要服用本发明组合物的个体的组织中损伤的类型,严重程度和延伸,以及年龄,身体状况,对细胞疗法的反应或耐受能力等等。
本发明的组合物和/或其制剂可以多种方式给药,包括但不限于肠胃外,腹膜内,静脉内,皮内,硬膜外,脊柱内,基质内,关节内,眶内,睫状体内,病灶内,动脉内,心内,肌内,鼻内,颅内,皮肤或皮下,眼眶内,囊内,局部,眼科或眼,通过外科植入物,内外科涂料,输液泵或通过导管。
本发明的组合物可以现有技术中已知的各种方式配制以给药于动物,优选哺乳动物,包括人。制剂的实例可包括任何固体组合物(片剂,丸剂,胶囊,袋,瓶,粉末,颗粒,棒,笔,蒸发器,气溶胶等),半固体(软膏,乳膏,润唇膏,凝胶,水凝胶,泡沫,乳液,皂液,明胶等)或液体(水溶液或非水溶液,水醇或水二醇溶液(hydroglycolic solution),悬浮液,乳液,糖浆,无水组合物,水分散液,油,乳,香脂,搽剂,血清等)用于局部或肠胃外给药,优选肠胃外给药。本发明的组合物也可以是持续释放制剂或任何其它常规释放系统的形式。术语“持续释放”在常规意义上用于指能够在一段时间内逐渐释放所述细胞的化合物或细胞载体系统,并且优选地,尽管不是必需的,在一段时间内具有相对恒定的细胞释放。持续释放载体或系统的说明性实例包括,但不限于脂质体,混合脂质体,油质体(oleosome),类脂质体(niosome),外泌体(etosome),毫胶囊,微胶囊,纳米胶囊,海绵,环糊精,水泡,胶束,混合表面活性剂胶束,混合表面活性剂磷脂胶束,毫米球(milisphere),微球,纳米球,脂质球,微乳液,纳米乳液,小颗粒,毫米颗粒,微颗粒,纳米颗粒,固体脂质纳米颗粒,纳米结构脂质介质,聚合物材料,可生物降解或不可生物降解的贴剂或植入物,或可生物降解的微粒,例如可生物降解的微球。
本发明的组合物也适用于通过医疗装置施用,所述医疗装置能够以足够浓度在所需区域中释放本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群,用于组织再生和/或减少组织炎症。优选地,这些装置必须适于局部给予细胞,使治疗作用于受影响的区域而不被分散。所述装置可以,例如,但不限于,在其内部包括细胞或用其涂覆。
本发明的另一方面涉及包含本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群的植入物(固体,液体或半固体,例如凝胶)或医疗装置。所述植入物或医疗装置可在其内部包含巨噬细胞或可用它们涂覆。
本发明的另一方面涉及能够通过例如生物相容性梯度从个体,更优选地从血流中分离巨噬细胞,优选单核细胞的医疗装置或医疗器械,其中所述医疗装置或器械还包括能够在分离的细胞上诱导缺氧条件的室。也就是说,该医疗装置的室(缺氧室)能够使巨噬细胞经受缺氧。之后,可以将经历缺氧的巨噬细胞重新引入个体体内,优选在受损组织中,用于组织修复或再生。本发明的另一方面涉及该医疗装置或器械用于组织损伤的治疗,组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等等的用途。
因此,本发明的另一方面涉及一种能够在分离的细胞上诱导缺氧和复氧条件的装置。所提出的装置允许实现先前描述的方法。
所述装置包括可移除室,所述可移除室在无菌条件下可填充生物样品,优选血液样品或细胞级分(cell fraction),并且可进一步填充来自至少两个不同气体源的至少两种不同气体组合物。所述装置还允许回收适于将巨噬细胞注射到组织中的医疗器械中的细胞。
所述装置的可移除室还可用于离心生物样品,优选血液,以获得多个细胞级分并从生物样品中分离细胞级分。
本发明的另一方面涉及本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群作为药物,优选细胞治疗药物,更优选用于组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等等的用途。
本发明的另一方面涉及本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群用于制备药物的用途,优选其中所述药物是细胞治疗药物,更优选用于组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等。
本发明的另一方面涉及在有此需要的受试者中,用于组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等的方法,其包括给予受试者治疗有效量的本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群或本发明的药物组合物。
本发明的另一方面涉及本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群用作药物。在优选的实施例中,药物是细胞治疗药物。
如本文所用,“细胞疗法”(也称为“细胞医疗”或“细胞治疗”)是指其中将细胞材料或细胞注射到患者体内的疗法;在本发明的上下文中,这意味着完整的活细胞。
本发明的另一方面涉及本发明的M2巨噬细胞或本发明的M2巨噬细胞群用于治疗组织损伤,或用于组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等。
优选地,根据本发明待修复的组织是骨骼肌,皮肤,神经组织,肾,肝,脑,肺或通常任何肿胀的身体组织。更优选地,待修复的组织是骨骼肌,甚至更优选地是由于过度使用或创伤而损伤的骨骼肌。
本发明的另一方面涉及试剂盒,下文称为“本发明的试剂盒”,其包含本发明的M2巨噬细胞,本发明的M2巨噬细胞群,或本发明的药物组合物,优选为治疗有效量,和适于将巨噬细胞注射到组织中的医疗器械。
“适于将巨噬细胞注射到组织中的医疗器械”是可用于将细胞包含(优选注射)在体内或组织中的任何医疗装置或器械。这些装置或器械的实例是但不限于注射器,小瓶,导管,针,套管,或通常用于本领域已知细胞疗法的任何器械。
本发明的M2巨噬细胞,本发明的M2巨噬细胞群或本发明的药物组合物可以包封在例如小瓶中,标记和/或固定在本发明的试剂盒中的支持物中。
另外,本发明的试剂盒可以包含用于试剂盒中体外或离体维持本发明的M2巨噬细胞,本发明的M2巨噬细胞群或本发明的药物组合物的其它元件。
本发明的试剂盒还可以包括防止包含在其中的M2巨噬细胞污染的元件,例如抗生素,抑菌剂,杀菌和/或杀真菌化合物等。
本发明的试剂盒还可以包括适用于治疗组织损伤,组织修复,组织再生,组织重塑,伤口愈合,炎症消退,伤口的治疗和/或修复,(组织)炎症的治疗,损伤,受伤或受损组织的治疗等的其他化合物,药物组合物或药物。这些另外的化合物在使用本发明的M2巨噬细胞,本发明的M2巨噬细胞群或本发明的药物组合物的细胞疗法中将会作为佐剂(组合)。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在实施本发明时可以使用与本文中所描述的那些相似或等同的方法和材料。在整个说明书和权利要求书中,词语“包括”及其变体旨在不排除其它技术特征,添加剂,成分或步骤。通过研究本说明书,本发明另外的目标、优点和特征对于本领域技术人员来说将变得显而易见,或可以通过实践本发明来了解。以下实施例,附图和序列表是以举例说明的方式提供的,而不是对本发明进行限制。
附图说明
图1NGAL基因表达(mRNA)针对在经历1,2,3,4或5个缺氧-复氧系列,或在标准条件下培养(对照)的培养物中巨噬细胞中GAPDH归一化。*P<0.005。
图2IL10基因表达(mRNA)针对在经历1,2,3,4或5个缺氧-复氧系列或在标准条件下培养(对照)的培养物中的巨噬细胞中GAPDH归一化。P*<0.005。**P<0.001。
图3a示出了用于在分离的巨噬细胞上诱导缺氧和复氧条件的装置的图。图3b示出了用于在分离的巨噬细胞上诱导缺氧和复氧条件的装置的立体图。
图4a-图4d示出了图3a-图3b的装置中可移除室的不同实施例。
具体实施方式
实施例1短时间缺氧-复氧对腹膜巨噬细胞极化的影响。
1.1目的
目的是评估巨噬细胞暴露于1,2,3,4或5个缺氧-复氧系列(3'缺氧-45”复氧)是否促进巨噬细胞极化为M2表型,与经历标准孵育条件的对照相比,NGAL和IL10表达增加。
1.2.实验设计
a.对照组在氧标准条件下(CO25%加大气空气)。
从6只小鼠中提取并分离腹膜巨噬细胞,并在标准条件下培养24小时。
b.经受1,2,3,4或5个缺氧(氮气95%;CO25%;O20%)-复氧系列加上1小时30分钟复氧的实验组。
从6只小鼠中提取并分离腹膜巨噬细胞,并在标准条件下培养24小时。然后,将巨噬细胞进行1,2,3,4或5个缺氧-复氧系列(3'缺氧-45”复氧)。最后,将巨噬细胞进行1小时30分钟的复氧。
1.3.材料与方法
为了提取腹膜巨噬细胞,在6只小鼠中腹膜内注射2.5ml巯基乙醇酸盐(thioglycolate)。
该过程进行了6次,每只小鼠一次:
1.在20ml PBS中提取腹膜巨噬细胞。
2.将细胞重悬于1ml RPMI培养基10%PBS 1%P/S(青霉素/链霉素)中。
3.对细胞进行计数并接种每孔350万个活细胞(表1)。
表1
Figure BDA0002001082770000151
Figure BDA0002001082770000161
将细胞在标准条件下孵育24小时。
之后,我们的间歇性缺氧方案在以下条件下在缺氧室中进行:氮气95%和CO25%,0%O2。要评估的组如下:
1.对照组在氧标准条件下(CO25%加大气空气)。24小时内,在含有2ml RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。
2.1缺氧-复氧系列。在含有2ml RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。1系列由3'缺氧/45”复氧+1小时30分钟的复氧组成。
3.2缺氧-复氧系列。在含有2ml RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。2系列由3'缺氧/45”复氧+1小时30分钟的复氧组成。
4.3缺氧-复氧系列。在含有2ml RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。3系列由3'缺氧/45”复氧+1小时30分钟的复氧组成。
5.4缺氧-复氧系列。在含有2ml RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。4系列由3'缺氧/45”复氧+1小时30分钟的复氧组成。
6.5缺氧-复氧系列。在含有2m RPMI培养基10%FBS 1%P/S的孔中的腹膜巨噬细胞。5系列由3'缺氧/45”复氧+1小时30分钟的复氧组成。
一旦每个方案在每组中结束,将细胞在标准条件下孵育1小时30分钟。此后,收获细胞并冷冻成干燥粒用于随后的RNA提取方案。
从冷冻样品中提取RNA并进行逆转录成cDNA。按照制造商的方案(Qiagen,Barcelona,西班牙)使用RNeasy mini试剂盒分离来自细胞的总RNA。使用Nanodrop ND-1000(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,美国)从A260测定计算RNA浓度。根据制造商的建议,使用Bio-Rad的iScript cDNA合成试剂盒合成cDNA。根据制造商的说明,使用SYBRGreen RT-PCR检测试剂盒(Bio-Rad,Madrid,西班牙)在Bio-Rad iCycler iQ Real-Time-PCR检测系统上进行定量RT-PCR。使用来自Bio-Rad的Gene Expression Marco(版本1.1)定量实时PCR结果,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部对照用于稳定表达(管家基因)。
为了评估每组中的NGAL和IL10表达进行了多个RT-PCR。
1.4.结果
尽管1,2,和3系列的3'缺氧-45”复氧也导致NGAL表达增加,但只有4系列实现了测量的两个参数(NGAL和IL-10)的显著性,而5系列降低了NGAL水平(图1和图2)。
实施例2.该装置的优选实施例的描述。
在图3a中,可以理解为根据前述方法在分离的巨噬细胞上用于诱导缺氧和复氧条件所提出的的装置的图。在图3b中,示出了所述装置的立体图。
从所述图中可以看出,该装置的必要元件是可移除室(1),其配置成容纳分离的巨噬细胞,第一气体传导回路(2)和第二气体传导回路(3)。
第一气体传导回路(2)包括与可移除室(1)和第一气体源(5)和第二气体源(6)的第一可移除连接(4),其优选地是旋塞阀(stopcock)。第一和第二气体源(5,6)连接到电子阀(7),其被配置为选择气体源,气体从该气体源流到可移除室(1)。
第一气体传导回路(2)还可以包括放置在电子阀(7)和第一可移除连接(4)之间的压力传感器(16)。在本发明的其他实施例中,压力传感器(16)放置在电子阀(7)和气体传感器(11)或安全阀(10)或HEPA过滤器(9)之间。
第二气体传导回路(3)包括与可移除室(1)的第二可移除连接(8)和与外部环境的连接(15)或与真空装置的连接。第二气体传导回路(3)配置成控制可移除室(1)内部的气体的去除。
第一气体传导回路(2)还包括在第一气体源(5)和阀(7)之间或在第二气体源(6)和阀(7)之间的至少一个HEPA过滤器(9)和/或安全阀(10)。优选地,当该装置包括两个元件时,安全阀(10)放置在第一气体源(5)或第二体气源(6)和阀(7)之间。
在这种情况下,安全阀(10)用于保护第一气体传导回路(2)免受过压。这就是为什么必须将其放置在第一气体传导回路(2)的入口和出口中的原因。
该装置还可以在第一气体传导回路(2)中包括放置在阀(9)和与可移除室(1)的第一可移除连接(4)之间的气体传感器(11)。由于不可能在可移除室(1)的内部引入气体传感器,为了确保有待引入的气体量,在本发明的优选实施例中,在来自所述可移除室(1)的气体的入口/出口中存在气体传感器(11)。
优选地,第一气体传导回路(2)还包括在气体传感器和第一可移除连接(4)之间的安全阀(10)和/或HEPA过滤器(9)。
第一可移除连接(4)优选为鲁尔锁定连接器(luer-lock connector)或鲁尔锁定阀(luer-lock valve)。
此外,第二气体传导回路(3)可以包括在第二可移除连接(8)和与外部环境的连接(15)或与真空装置的连接之间的至少一个HEPA过滤器(9)和/或安全阀(10)。在存在两个元件的情况下,HEPA过滤器(9)优选地放置在第二可移除连接(8)和安全阀(10)之间。
第二可移除连接(8)优选为鲁尔锁定连接器或鲁尔锁定阀。
在第二传导回路(3)中,安全阀(10)用于保护所述气体传导回路(3)免受过压。
第一可移除连接(4)和第二可移除连接(8)被配置为至少连接到可移除室(1)的接收连接(14)。在本发明的一个实施例中,至少一个接收连接(14)是具有鲁尔锁定阀的止动锁(stop lock)。
第二气体传导回路(3)也可以包括在第二可移除连接(8)和与外部环境的连接(15)或与真空装置的连接之间的气体传感器(11)。
第二气体传导回路(3)还可以包括在第二可移除连接(8)和与真空装置的连接或与外部环境的连接(15)之间的至少一个电磁阀和/或泵(12)。
优选地,可移除室(1)是离心管。在图4a-图4d中,示出了可移除室(1)的一些不同实施例。该装置还可以包括控制器,其配置成用于接收来自气体传感器(11)的信号,并且根据接收的信号控制阀(7)和电磁阀或泵(12),以便选择从哪个气体源(5,6)填充可移除室(1)。
如前所述,可移除室(1)优选是管,更优选是离心管。它可以包括柱塞(plunger)(13),其可以纵向移动通过室,并且如图4a所示,所述柱塞(13)包括至少一个带有一个接收连接(14)的端口,优选地是鲁尔锁定阀,其可以连接到注射器或任何其他合适的装置以从可移除室(1)内部引入或移除细胞。此后,接收连接(14)可以密封地连接到第一和第二气体传导回路(5,6),以从可移除室(1)内部填充和去除气体。
在特定实施例中(图4b),柱塞(13)包括用于气体入口和出口的通用接收连接,其可连接到注射器,第二接收连接(14b),其可密封地连接到第一气体传导回路(2),和第三接收连接(14c),其可密封地连接到第二气体传导回路(3)。
在另一个可能的实施例中,如图4c所示,柱塞(13)可以用针冲孔以从可移除室(1)内部引入或移除细胞或者从可移除室(1)内部填充和移除气体组合物。
在另一个实施例中(图4d),柱塞(13)可以用针(14a)冲孔以从可移除室(1)内部引入或移除细胞,并包括可密封地连接到第一气体传导回路(2)的第一接收连接(14b)和可密封地连接到第二气体传导回路(3)的第二接收连接(14c)。
描述在装置中实施的示例过程。在这种情况下,使用注射器将来自个体的血液样品引入管(可移除室(1))中并进行离心以获得多个细胞级分。此后,将第二注射器连接到可移除室(1)的接收连接(14)(鲁尔锁定),并且将柱塞(13)向下移动通过可移除室(1),注射器填充有分离的细胞级分。该过程可以重复多次,直到关注的细胞级分在单个注射器中分离。
将关注的细胞级分引入到装置的可移除室(1)中。该可移动室(1)连接到该装置,并且首先填充第一气体组合物(N2),通过第二气体传导回路(3)置换(displace)可移除室(1)内的先前气体组合物,然后填充第二气体组合物(合成空气),通过第二气体传导回路(3)置换可移除室(1)内的第一气体组合物。该过程重复四次。
可移除室(1)与装置断开连接,注射器连接到接收连接(14),并且使柱塞(13)向下移动通过可移除室(1),细胞级分在注射器中回收。

Claims (2)

1.一种获得极化为M2表型的巨噬细胞的方法,包括:
a.使分离的巨噬细胞经受4系列的缺氧-复氧,其中每个系列的缺氧-复氧包含2至5分钟的0至0.6%的氧浓度的缺氧,随后是至少45秒的复氧,
a’.使步骤(a)之后获得的巨噬细胞经受在1小时30分钟内进行的最终的复氧步骤,和
b.回收前述步骤得到的巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤(a)的巨噬细胞是单核细胞。
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