IT202100006569A1 - Metodo per ottenere macrofagi rigenerativi educati dal tumore e loro uso nella medicina rigenerativa - Google Patents
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Description
METODO PER OTTENERE MACROFAGI RIGENERATIVI EDUCATI DAL TUMORE E LORO USO NELLA MEDICINA RIGENERATIVA
SETTORE DELL?INVENZIONE
La presente invenzione concerne una metodologia per rendere i macrofagi bioreattori rigenerativi per il loro utilizzo nella medicina rigenerativa. Il metodo descritto nella presente invenzione riguarda in particolare l?attivazione dei macrofagi in vitro a mezzo di un terreno condizionato da linea o stroma tumorale e specifiche pressioni parziali di ossigeno. I macrofagi cos? ottenuti assumono un fenotipo rigenerativo unico non presente in altri fenotipi di polarizzati, incluso i macrofagi M2. Il fenotipo di bioreattore rigenerativo come qui definito comprende un?ampia espressione di metalloproteasi (inclusa Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27), fattori trofici (incluso VEGFs, FGFs, IGFs) e molecole di contatto cellulare e di adesione (incluso Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6), mediatori che promuovono la sopravvivenza (incluso Rtn4rl2) e l?immunomodulazione (incluso Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6). L?invenzione si riferisce in aggiunta all?utilizzo del bioreattore cos? prodotto per la rigenerazione dei tessuti, incluso il tessuto nervoso.
TECNICA ANTERIORE
Il sistema nervoso centrale (SNC) comprende il cervello, che coordina le funzioni di livello superiore (cognitive), e il midollo spinale che serve principalmente come via di comunicazione tra il cervello e la periferia (esterocettiva e motoria). A differenza di altri tessuti umani, la capacit? rigenerativa del tessuto nervoso ? scarsa o nulla [1]. Lesioni del tessuto nervoso non guariscono spontaneamente. Nel SNC il tessuto perso viene sostituito da tessuto cicatriziale con componente di natura gliale, fibrotica, e composto da cellule immunitarie infiammatorie [2]. L?evoluzione della lesione comporta la sostituzione del tessuto neurale con quello cicatriziale con conseguente perdita della continuit? delle connessioni neuronali, della loro funzione e la comparsa di disabilit?. Le disabilit? dovute a lesioni dell?SNC dipendono dalla modalit?, dalla gravit? e dalla posizione anatomica dell'insulto.
Ogni anno nel mondo circa 250-500.000 persone subiscono una lesione spinale con conseguenti elevati costi di assistenza medica (stimati in circa 1-4 milioni di euro/paziente) [3, 4]. Nonostante gli elevati costi sociali ed economici, al momento sono pochi i possibili trattamenti sviluppati per la cura della lesione spinale. In aggiunta, al momento, le terapie disponibili sono in grado solo di limitare il danno secondario causato dal trauma spinale e preservare le poche connessioni assonali rimaste integre nel sito della lesione. Negli ultimi 30 anni la comunit? scientifica ha sviluppato molti approcci che hanno portato ad un aumento considerevole del tasso di sopravvivenza in seguito a SCI, tuttavia non esiste ancora una terapia efficace per la cura della lesione spinale e quindi per un ottimale recupero locomotorio completo. A livello patologico, la lesione spinale determina la perdita della componente neuronale nel sito della lesione che comporta un?interruzione della trasmissione degli impulsi tra SNC e periferia (muscoli). La degenerazione del tessuto nervoso ? conseguenza di un complesso fenomeno che coinvolge l?ischemia dei tessuti, la morte cellulare e l?infiammazione.
Microambiente patologico della lesione dell?SNC che induce progressione del danno neurale e impedisce la rigenerazione del tessuto neurale (Biological need)
Al danno primario che causa la lesione del tessuto nervoso, si aggiungono i danni secondari dovuti alla diminuzione di perfusione ematica, che comporta un inadeguato apporto di substrati (O2 e nutrienti) per mantenere il metabolismo delle cellule neurali, e all?aumento di permeabilit? vascolare che causa edema e infiltrato infiammatorio che comprime ulteriormente il tessuto nervoso rimasto attorno alla lesione e aggrava la lesione. Queste complesse condizioni aumentano la morte delle cellule del tessuto neurale circostanti la zona primariamente coinvolta. Per circoscrivere la zona del danno si sviluppa una forte infiammazione, con attivazione reattiva degli astrociti che delimitano la lesione. Gli astrociti che formano la cicatrice gliale, insieme alle cellule immunitarie infiammatorie, in particolare i macrofagi infiammatori (detti M1), e le cellule stromali producono poi una caratteristica matrice extracellulare che riempie la zona di lesione ma inibisce la crescita assonale e il differenziamento delle cellule neurali. Inoltre, le componenti infiammatorie sono cronicamente attivate dalla morte cellulare e contribuiscono alla progressione cronica del deterioramento del microambiente della lesione e del danno del tessuto neurale. I processi fisiopatologici indicano quindi un complesso coinvolgimento di molteplici fattori che contribuiscono alla formazione, progressione e cronicit? della lesione del tessuto neurale [4-6]. Attualmente le metodologie di medicina rigenerativa per le malattie caratterizzate da perdita di tessuto neurale si basano principalmente sull?utilizzo di cellule staminali finalizzate a sostituire (cell replacement) il tessuto nervoso perduto. Per questo sono state testate cellule staminali embrionali (ESCs) e/o staminali neurali fetali (NSCs) e i suoi derivati differenziati in senso neurale (es. precursori oligodendrocitari) o cellule pluripotenti indotte (iPSCs) differenziate in senso neurale (iPSC-NSCs) [7, 8]. Queste terapie non hanno ancora mostrato efficacia clinica nel modello di neurodegenerazione grave e cronica utilizzato dai presenti inventori, caratterizzato da lesione cronica e completa del midollo spinale.
Nella ricerca di una fonte di cellule che potesse essere presa direttamente dal paziente stesso per poi essere trapiantata a fine rigenerativo (setting autologo) sono state testate anche numerose altre popolazioni di cellule staminali adulte. Questi studi tuttavia hanno evidenziato un parziale beneficio di questi trattamenti, sostenuto non da un diretto differenziamento delle cellule iniettate in cellule neurali ma da un effetto ?bystander?, ovvero trofico e modulante l?infiammazione. Le cellule staminali che mostrano queste propriet? includono le cellule staminali neurali adulte (aNSCs, che esistono solo nel topo), le cellule staminali mesenchimali (MSCs) originate dal midollo osseo (BM-) o dal tessuto adiposo (A-), le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) [7]. Con efficacia variabile, questi tipi cellulari mostrano una certa capacit? rigenerativa, fornendo al tessuto danneggiato fattori trofici e diminuendo l?infiammazione. Tuttavia, questi approcci non sono risultati sufficientemente efficaci nelle terapie di malattie neurodegenerative croniche gravi. Come ultima classe di cellule, recentemente, ? stata testata anche la capacit? rigenerativa delle cellule immunitarie tra cui i macrofagi. Sono stati testati macrofagi indotti verso il fenotipo M2 iniettati e.v. o nel sito di lesione del tessuto neurale [9]. Questi hanno mostrato una parziale efficacia rigenerativa bench? i modelli utilizzati non corrispondessero ad una patologia neurodegenerativa grave e cronica.
Esiste tuttora la necessit? di una terapia in grado di curare le patologie caratterizzata da grave perdita del tessuto neurale, non esistendo ad oggi per queste condizioni alcuna terapia efficace.
DESCRIZIONE DELL?INVEZIONE
I presenti autori hanno messo a punto una terapia per patologie caratterizzata da grave perdita del tessuto neurale basata sull?utilizzo di un bioreattore complesso, i ?Tumor Educated Macrophages? (TEMs), che hanno dimostrato essere in grado di rigenerare parzialmente una grave perdita di tessuto neurale e promuovere il recupero motorio. Come paradigma di perdita di tessuto neurale i presenti autori hanno testato l?efficacia del trattamento in un modello animale sperimentale di lesione contusiva del midollo spinale (LM) severa (completa).
Sono state utilizzate le propriet? del tumore, considerato miglior esempio di ?rigenerazione? esistente in natura, per trasformare cellule immunitarie in bioreattori efficaci nella rigenerazione di malattie degenerative croniche caratterizzate da grave perdita di tessuto neurale. In particolare, vengono ?educate? cellule immunitarie con un condizionamento tumorale. I macrofagi murini sono stati ottenuti da cellule prelevate dal midollo osseo differenziate per 5 giorni in un medium Dulbecco modified Eagle (D-MEM) ad alto glucosio contenente 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM L-glutamina e 100 ng/ml di Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF). Per generare il bioreattore rigenerativo e ?educare? i macrofagi con condizionamento tumorale, le cellule differenziate sono state coltivate in un medium contenente medium condizionato dal tumore (TC-M) e D-MEM in rapporto 1:1 e coltivate in condizioni di ipossia (O2 1%) per 18 h. I macrofagi umani sono stati derivati da monociti circolanti. I monociti sono stati isolati da sangue periferico mediante centrifugazione in ripetuti gradienti (Lympholyte, Cederlane, #CL5020, and Percoll, Cytiva, #17089101). I monociti ottenuti vengono coltivati in vitro per 6 giorni in un medium RPMI 1640 contente 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM L-glutamina e 100 ng/ml di Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) con il 30% di TC-M. TC-M viene preferibilmente prodotto da linee di tumori o da resezioni di tumori dissociati e piastrati in vitro per un periodo di circa 12-72 ore.
I TEM (tumor educated macrophages) vengono quindi iniettati nel sito di lesione. La somministrazione di TEM ? terapeutica, ovvero le cellule vengono iniettate a distanza di giorni dalla lesione. I TEM sono stati testati in pi? di 200 animali in 7 esperimenti indipendenti e il loro effetto ? stato valutato utilizzando metodologie multidisciplinari.
Ci sono due principali risultati legati al presente approccio:
1- il livello di efficacia ? pi? alto in termini di livello di recupero motorio e frequenza di casi positivi rispetto a quanto da noi trovato con le attuali terapie proposte, inclusi i vari tipi di cellule staminali trapiantate;
2- a differenza di altri modelli terapeutici di intervento in cui il trattamento viene somministrato prima o subito dopo la lesione (24 ore), nel presente caso la terapia cellulare viene iniziata 4 giorni dopo la lesione, cio? in una fase corrispondente ad una condizione realistica per la terapia umana.
Forma pertanto oggetto dell?invenzione un metodo in vitro o ex vivo per indurre un cambiamento fenotipico e/o funzionale in una popolazione di fagociti mononucleati isolata da campioni biologici, comprendente l?incubazione di detta popolazione, preferibilmente per 12 ore-10 giorni, preferibilmente 3-7 giorni, pi? preferibilmente 18 ore o 6 giorni, in un terreno di coltura comprendente fattori rilasciati da colture o espianti tumorali, dove detta incubazione induce un cambiamento fenotipico e/o funzionale nei fagociti mononucleati della popolazione.
Preferibilmente la popolazione di fagociti mononucleati incubata ? una coltura in vitro di monociti isolati da campioni biologici.
I monociti possono essere ad esempio prelevati da sangue periferico mediante gradiente di centrifugazione o scongelati da precedente isolamento di cellule mononucleate da sangue periferico.
Il terreno di coltura comprende preferibilmente fattori in grado di differenziare i monociti in macrofagi, ad esempio il ?Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)?.
Preferibilmente i fagociti mononucleati sono macrofagi, preferibilmente murini o umani, preferibilmente ottenuti da cellule prelevate dal midollo osseo o derivati mediante gradiente di centrifugazione ripetuti.
Preferibilmente l?incubazione avviene in condizioni di ipossia. Per ipossia si intende l?utilizzo di concentrazioni di ossigeno inferiori a quella atmosferica.
I fagociti mononucleati indotti al cambio fenotipico e/o funzionale sono preferibilmente macrofagi.
Preferibilmente il terreno di coltura comprende un surnatante tumorale, detto surnatante essendo preferibilmente ottenuto da colture di espianti solidi di tumori o di linee cellulari tumorali, preferibilmente da fibrosarcoma o glioma.
Preferibilmente il surnatante tumorale ? un medium condizionato dal tumore (TC-M) preferibilmente prodotto da linee cellulari tumorali o da resezioni di tumori dissociati e piastrati in vitro preferibilmente per un periodo di circa 12 ore-20 giorni, pi? preferibilmente di circa 12-72 ore.
Preferibilmente il terreno di coltura ? costituto da terreno di coltura per cellule, ad esempio Eagle's minimal essential medium o suoi derivati, e/o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, e/o Media 199 e/o Fischer's medium, e 1-99%, preferibilmente 10-90%, pi? preferibilmente 30-50% di surnatante tumorale.
I macrofagi sono preferibilmente fatti differenziare in un terreno comprendente Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) e opzionalmente medium Dulbecco modified Eagle (D-MEM) e/siero fetale bovino inattivato dal calore e/o penicillina/streptomicina, e/o glutamina, preferibilmente per 5 giorni.
I macrofagi, preferibilmente differenziati, sono preferibilmente coltivati in un medium contenente medium condizionato dal tumore (TC-M) e D-MEM in rapporto 1:1 e preferibilmente coltivati in condizioni di ipossia (ad esempio O21%) preferibilmente per 18 h.
I macrofagi sono preferibilmente coltivati in vitro per 6 giorni preferibilmente in un medium RPMI 1640 contente 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM L-glutamina e 100 ng/ml di Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) con il 30% di TC-M.
Un altro oggetto dell?invenzione sono fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, ottenibili dal metodo secondo l?invenzione.
Detti fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, sono preferibilmente caratterizzati dall?espressione di almeno uno dei geni della Tabella 1 (Gene expression), e/o dalla secrezione di almeno una delle molecole della Tabella 2 (Secretoma), preferibilmente dall?espressione di metalloproteasi (ad esempio Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27); e/o fattori trofici (incluso VEGFs, FGFs, IGFs), e/o di molecole di contatto cellulare e di adesione (incluso Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaL, ItgaM, Adamtsl6, Adamtsl4) e/o mediatori che promuovono la sopravvivenza (Rtn4rl2) e l?immunomodulazione (ad esempio Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6), e/o dall?aver acquisito propriet? rigenerative.
I fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, secondo l?invenzione sono preferibilmente per uso medico, pi? preferibilmente per uso in terapia cellulare, preferibilmente nella riparazione dei tessuti o cellulare, nella rigenerazione dei tessuti o cellulare, nel rimodellamento dei tessuti, nel trattamento e/o nella riparazione e/o nella guarigione di ferite, nel trattamento e/o nella risoluzione dell'infiammazione, dell'infiammazione (dei tessuti), nel trattamento dei danni, tessuti danneggiati e simili, preferibilmente nel trattamento di lesioni caratterizzate da perdita di tessuto incluso del sistema nervoso centrale, preferibilmente nel trattamento di una lesione del midollo spinale, preferibilmente una lesione spinale severa.
I fagociti, preferibilmente macrofagi, sono preferibilmente somministrati da 2 a 60 giorni rispetto alla lesione, preferibilmente 4-21 giorni dopo rispetto alla lesione.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? una composizione farmaceutica comprendente i fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, secondo l?invenzione e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Il metodo secondo l?invenzione pu? inoltre comprendere di verificare che la coltura di fagociti mononucleati abbia subito il cambio fenotipico e/o funzionale dopo la rimozione del terreno di coltura. Detta verifica pu? essere effettuata mediante quantificazione dell?espressione dei geni caratterizzanti il fenotipo e in un set di test funzionali che prevedono l?aumento di sopravvivenza, il differenziamento neuronale e la capacit? di rimodellare la matrice extracellulare in colture di neuroni umani derivate da iPSCs.
Come qui utilizzato, l?espressione "cambiamento fenotipico e/o funzionale? comprende un cambiamento osservabile o rilevabile in una caratteristica, propriet?, attributo o funzione dei fagociti mononucleati o macrofagi nella popolazione. Ad esempio, caratteristiche/propriet?/funzioni fenotipiche di macrofagi che possono essere modificati o modulati secondo i metodi della presente invenzione includono, senza limitazione, attivit? proinfiammatoria, attivit? anti-infiammatoria, attivit? immunogenica, attivit? tolerogenica, attivit? di guarigione dei tessuti, attivit? migratoria, attivit? angiogenica, attivit? soppressiva, attivit? di presentazione dell'antigene o attivit? fagocitica, attivit? di rimodellamento della matrice extracellulare, attivit? trofica, attivit? di stimolo alla ricrescita assonale, attivit? di supporto metabolico.
Un cambiamento fenotipico e/o funzionale nei macrofagi pu? essere osservato o rilevato in diversi modi. Ad esempio, un cambiamento fenotipico e/o funzionale pu? essere osservato o rilevato eseguendo un test, un'osservazione o una misurazione sui macrofagi stessi oppure eseguendo un test, un'osservazione o una misurazione su altre cellule, tessuti, organi, ecc. pu? essere influenzato dai macrofagi o eseguendo un test, un'osservazione o una misurazione su un soggetto che contiene i macrofagi fenotipicamente modificati.
Il cambiamento o la modulazione fenotipica e/o funzionale possono essere valutati rilevando o misurando, ad esempio, (i) un cambiamento nell'espressione di uno o pi? geni (metalloproteasi, inclusa la Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27); fattori trofici (incluso VEGFs, FGFs, IGFs) e di molecole di contatto cellulare e di adesione (incluso Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaL, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6) mediatori che promuovono la sopravvivenza (Rtn4rl2), e l?immunomodulazione (Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6); (ii) il cambiamento nella secrezione di una o pi? molecole (ad esempio, citochine TGFb3, Il16, Cxcl16, Isg15, Cxcl3, Cxcl1), fattori di crescita (VEGFs, FGFs, IGFs) mediatori dell'infiammazione (Ptgs2, Ptges, Nos2, Arg1, ecc.); (iii) capacit? di modulare i fenotipi infiammatori (tipo M1) in cellule dell?immunit? preferibilmente macrofagi e di indurre in queste cellule un fenotipo di riparazione (tipo M2); (iv) capacit? di indurre il differenziamento neuronale di cellule neurali staminali murine e/o umane o di cellule inducibili pluripotenti indotte umane e di aumentare la sopravvivenza in condizioni di deprivazione di nutrienti (ossigeno e glucosio); (v) capacit? di indurre angiogenesi e (vi) rimodellare la matrice extracellulare.
I macrofagi ottenibili dal metodo della presente invenzione sono caratterizzati dall?espressione di uno o pi? geni indicati nelle tabelle 1 e 2; le tabelle infatti indicano i geni che sono up-regolati nelle cellule TAM.
I macrofagi ottenibili dal metodo della presente invenzione sono caratterizzati dalla secrezione di una o pi? molecole indicate nella tabella 2.
I metodi per osservare, rilevare e misurare questi cambiamenti fenotipici e/o funzionali sono noti nell'arte e qui descritti.
Ad esempio, i profili di espressione genica possono essere valutati a livello di RNA utilizzando analisi microarray di cDNA o oligonucleotidi, Northern blot, RT-PCR, sequenziamento, ecc.
L'espressione proteica pu? essere misurata utilizzando, ad esempio, immunoblotting, immunoistochimica, microarray proteici, ecc.
Possono anche essere usati vari saggi basati su cellule e modelli animali prontamente noti e utilizzati nella tecnica.
Le cellule della composizione dell'invenzione possono provenire dal paziente stesso (la composizione contiene quindi cellule autologhe) o da un donatore (la composizione contiene quindi cellule allogeniche).
Per le cellule allogeniche, ? richiesta la compatibilit? HLA e la corrispondenza tra il donatore e il paziente che riceve le cellule.
Preferibilmente detti macrofagi sono autologhi.
La composizione farmaceutica contiene, come principio attivo, le cellule trasformate sopra descritte. Inoltre contiene un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Il termine "eccipiente farmaceuticamente accettabile" indica un eccipiente che ? utile nella preparazione di una composizione farmaceutica che ? generalmente sicura, non tossica e desiderabile, e include eccipienti che sono accettabili per uso veterinario cos? come per uso farmaceutico umano.
Tali eccipienti possono essere solidi, liquidi, semisolidi o, nel caso di una composizione aerosol, gassosi. Le composizioni per la rigenerazione tissutale o cellulare possono essere generalmente somministrate per via parenterale, topica, endovenosa, orale, sottocutanea, intra-arteriosa, intracranica, intraparenchimale, intraperitoneale, intranasale o intramuscolare. Una tipica via di somministrazione ? endovenosa o intraparenchimale, sebbene altre vie possano essere ugualmente efficaci.
Per la somministrazione endovenosa, la composizione dell'invenzione sar? sotto forma liquida.
Conterr? quindi, oltre alle cellule, un diluente farmaceuticamente accettabile che non influenza l'attivit? biologica delle cellule dell'invenzione. Esempi di tali diluenti sono la soluzione fisiologica tamponata con fosfato, le soluzioni di Ringer, la soluzione di destrosio e la soluzione di Hank. Inoltre, la composizione o formulazione farmaceutica pu? anche includere altri veicoli, adiuvanti o stabilizzanti non tossici, non terapeutici, non immunogeni e simili.
In una forma di realizzazione preferita, la composizione dell'invenzione ? sotto una forma liquida.
Le composizioni farmaceutiche dell'invenzione possono essere somministrate da sole o combinate con un'altra composizione farmaceutica o un altro principio attivo.
In particolare, le composizioni farmaceutiche dell'invenzione possono contenere le composizioni cellulari dell'invenzione nonch? un altro principio attivo, combinati nello stesso contenitore.
Come qui utilizzato, il termine "combinato" non implica che le cellule dell'invenzione e l'altro principio attivo siano necessariamente somministrati simultaneamente.
Si estende anche a qualsiasi uso o presentazione che preveda la loro somministrazione a intervalli di tempo diversi o in contenitori separati.
"Somministrazione concomitante" di detto principio attivo con la composizione farmaceutica della presente invenzione significa somministrazione con le cellule dell?invenzione in un momento tale che sia il principio attivo che la composizione della presente invenzione avranno un effetto terapeutico.
Tale somministrazione concomitante pu? comportare la somministrazione simultanea (cio? contemporaneamente), precedente o successiva del principio attivo rispetto alla somministrazione delle cellule dell'invenzione.
Una persona di ordinaria esperienza nell'arte non avrebbe difficolt? a determinare la tempistica, la sequenza e i dosaggi di somministrazione appropriati per particolari farmaci e composizioni della presente invenzione.
Il rilascio in vivo della composizione cellulare dell'invenzione, in un soggetto che ne ha bisogno, ? qui proposto come un modo semplice ed efficace di rigenerare i tessuti e le cellule.
Di solito, il suddetto soggetto ? un essere umano, ma possono essere trattati anche mammiferi non umani, ad es. animali da compagnia come cani, gatti, cavalli, ecc., mammiferi da laboratorio come conigli, topi, ratti, ecc. e simili.
Un "soggetto che ne ha bisogno? come qui inteso, ? quindi un mammifero, preferibilmente un essere umano, che presenta ad esempio una lesione tissutale.
La presente invenzione comprende metodi di trattamento in cui la composizione cellulare dell'invenzione viene somministrata a detto soggetto che ne ha bisogno mediante iniezione.
Il metodo dell?invenzione pu? comprendere anche il prelievo e l?isolamento dei fagociti mononucleati o dei loro precursori o cellule staminali dal sangue, dal midollo osseo o dal cordone ombelicale, o da cellule somatiche riprogrammate pluripotenti del soggetto che ne ha bisogno o da un donatore sano, prima della incubazione di queste cellule come descritto sopra, in modo da ottenere / isolare una popolazione di fagociti, preferibilmente monociti.
Facoltativamente, il metodo comprende il confezionamento e/o immagazzinamento delle cellule cos? ottenute, e l?eventuale somministrazione al paziente.
Dosi efficaci dell'entit? terapeutica della presente invenzione, variano a seconda di molti fattori differenti, inclusi mezzi di somministrazione, sito bersaglio, stato fisiologico del paziente, se il paziente ? umano o animale, altri farmaci somministrati e se il trattamento ? profilattico o terapeutico.
I dosaggi del trattamento possono essere titolati per ottimizzare la sicurezza e l'efficacia.
La composizione dell'invenzione e/o le sue formulazioni possono essere somministrate in una variet? di modi inclusi, ma non limitati a, intraspinale, intraencefalico, epidurale, intratecale, intracranica, parenterale, intraperitoneale, endovenoso, intradermico, intrastromale, intraarticolare, intrasinoviale, intralesionale, intraarterioso , intracardiaca, intramuscolare, intranasale, cutanea o sottocutanea, intraorbitale, intracapsulare, a tema, oftalmologico o oculare, mediante impianto chirurgico, pittura chirurgica interna, pompa per infusione o tramite catetere.
La composizione della presente invenzione pu? essere formulata per la somministrazione ad un animale, preferibilmente un mammifero, inclusi gli esseri umani, in una variet? di modi noti nello stato della tecnica. Esempi di preparati potrebbero includere qualsiasi composizione solida (compresse, pillole, capsule, sacchetti, flaconi, polveri, granuli, barrette, matite, vaporizzatori, aerosol, ecc.), semi-solidi (unguento, crema, balsamo, gel, idrogel, schiuma , lozione, sapone, gelatina, ecc.) o liquido (soluzioni acquose o non acquose, soluzioni idroalcoliche o idroglicoliche, sospensioni, emulsioni, sciroppi, composizioni anidre, dispersioni acquose, oli, latti, balsami, linimenti, sieri, ecc.) per somministrazione topica o parentale, preferibilmente somministrazione intratissutale. La composizione della presente invenzione pu? anche essere sotto forma di formulazioni a rilascio prolungato o qualsiasi altro sistema di rilascio convenzionale. Il termine "rilascio prolungato" ? usato nel senso convenzionale in riferimento a un composto o sistema di veicolazione cellulare che consente il rilascio graduale di dette cellule durante un periodo di tempo e preferibilmente, sebbene non necessariamente, con rilascio cellulare relativamente costante per un periodo di tempo. Esempi illustrativi di veicoli o sistemi a rilascio prolungato includono, ma non sono limitati a, liposomi, liposomi misti, oleosomi, niosomi, etosomi, milicapsule, microcapsule, nanocapsule, spugne, ciclodestrine, blister, micelle, micelle di tensioattivi misti, micelle di fosfolipidi tensioattivi misti, milisfere, microsfere, nanosfere, liposfere, microemulsioni, nanoemulsioni, miniparticelle, miliparticelle, microparticelle, nanoparticelle, nanoparticelle lipidiche solide, mezzi lipidici nanostrutturati, materiali polimerici, cerotti o impianti biodegradabili o non biodegradabili, o microparticelle biodegradabili come ad esempio microparticelle biodegradabili.
La presente invenzione verr? ora illustrata con esempi non limitativi in riferimento alle seguenti figure.
Figura 1. Peso degli animali al momento della chirurgia.
Il grafico rappresenta il peso degli animali presi in considerazione negli esperimenti al momento della prima operazione chirurgica (lesione spinale) al giorno 0.
Figura 2. Rappresentazione schematica dei punti di iniezione di TEM e macrofagi M2 nel modello di lesione spinale severa.
Gli animali sottoposti a lesione spinale severa hanno ricevuto trapianto cellulare multiplo di TEM o M2 o infusione di soluzione salina. Le frecce nere indicano i punti nei quali sono state eseguite le iniezioni. Gli stessi punti identificati negli animali di controllo si riferiscono all?infusione di soluzione salina. La linea tratteggiata indica la separazione tra la regione dorsale (dove sono state eseguite le iniezioni) e ventrale del parenchima spinale.
Figura 3. Incremento funzionale del recovery locomotorio in animali sottoposti a lesione spinale severa a seguito di trapianto multiplo di TEM.
Il grafico rappresenta gli score di BMS (Basso Mouse Scale), scala di misurazione delle capacit? locomotorie misurabili in topi sottoposti a lesioni midollari; la scala ? validata, stabile e affidabile [10]. Nel grafico il BMS degli animali sottoposti a trapianto multiplo di cellule TEM (linea grigio scuro, n=24 su un totale di 5 esperimenti), degli animali sottoposti a trapianto multiplo di cellule M2 (linea grigio chiaro, n=12 su un totale di 4 esperimenti) e degli animali di controllo sottoposti a infusione di soluzione salina sterile (linea nera, n=26 su un totale di 7 esperimenti). Le frecce indicano i time-points in cui sono stati effettuati i trapianti. Il BMS deli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM presenta un graduale miglioramento della performance locomotoria, che risulta significativamente maggiore (1.792 ? 0.327) rispetto a quella degli animali sottoposti a trapianto multiplo di cellule M2 (0.375 ? 0.109) e degli animali di controllo (0.712 ? 0.157). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate con i metodi di analisi statistica 2wayANOVA test e post-hoc Sidak post-test. I dati sono mostrati sotto forma di media ? SEM. *p?0.05, **p?0.01, ***p?0.001, ****p?0.0001.
Figura 4. Migliore flessibilit? dell?articolazione della caviglia in animali sottoposti a lesione spinale severa a seguito di trapianto multiplo di TEM.
Il grafico rappresenta gli score relativi alla flessibilit? dell?articolazione della caviglia degli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (linea grigio scuro, n=24 su un totale di 7 esperimenti), degli animali sottoposti a trapianto multiplo di cellule M2 (linea grigio chiaro, n=12 su un totale di 3 esperimenti) e degli animali di controllo sottoposti a infusione di soluzione salina sterile (linea nera, n=26 su un totale di 7 esperimenti) da 15 dpi fino a fine esperimento. A 31 dpi, la flessibilit? della caviglia negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (0.799 ? 0.037) ? significativamente maggiore rispetto a quella degli animali sottoposti a trapianto multiplo di M2 (0.659 ? 0.049) e al gruppo di controllo (0.612 ? 0.045). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate con i metodi di analisi statistica 2wayANOVA test e post-hoc Tukey post-test. I dati sono mostrati sotto forma di media ? SEM. *p?0.05, **p?0.01.
Figura 5 (EMG). Gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM a seguito di lesione spinale severa mostrano valori di durata di attivazione muscolare pi? fisiologici.
Il grafico mostra le durate di attivazione elettromiografiche del muscolo gastrocnemio laterale in animali di controllo (bianco), in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero) e in animali sani (grigio). Negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM la durata di attivazione elettromiografica del muscolo gastrocnemio laterale ? statisticamente minore (0.338s ? 0.048s) rispetto a quella degli animali di controllo (0.593s ? 0.101s) avvicinandosi maggiormente alla condizione fisiologica del muscolo negli animali sani (0.231s ?0.038s). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate con i metodi di analisi statistica ONEwayANOVA test e post-hoc Tukey post-test. I dati sono mostrati sotto forma di media ? SEM. *p?0.05, **p?0.01.
Figura 6. L?analisi dei trascritti globali evidenzia un?espressione dei geni legati all?angiogenesi e al rimodellamento della matrice extracellulare a pi? alti livelli nelle cellule TEM rispetto a preparazioni cellulari non terapeuticamente attive.
(A) Principal Component Analysis (PCA) dell?RNA sequencing relativo alle cellule TEM (pallini neri) e macrofagi M2 prima (pallini grigi). L?analisi mostra che i cluster di TEM (pallini neri) e macrofagi M2 (pallini grigi) sono fra loro separati, evidenziando la differenza di fenotipo tra le cellule prima del trapianto.
Figura 7. In seguito a trapianto, le cellule TEM ed M2 persistono e diffondono radialmente e longitudinalmente nel parenchima spinale.
(A) Grafico rappresentante la percentuale di distribuzione di TEM nel parenchima lungo il midollo spinale. Le diverse aree di distribuzione (parenchima, ciste, meningi) sono indicate con diversi colori (legenda in figura). Come mostrato nel grafico, i TEM diffondono longitudinalmente a partire dal sito del trapianto in diverse aree del midollo spinale, concentrandosi nella sezione corrispondente al trauma spinale nell?area della ciste. (B) Grafico rappresentante la percentuale di distribuzione di M2 nel parenchima lungo il midollo spinale. Come mostrato nel grafico, i M2 diffondono longitudinalmente a partire dal sito del trapianto in diverse aree del midollo spinale, concentrandosi nella sezione corrispondente al trauma spinale nell?area della ciste. (C) Grafico rappresentante la percentuale di distribuzione di TEM ed M2 nel parenchima spinale e nella ciste in corrispondenza del sito della lesione. Gruppo sperimentale TEM (grigio scuro, parenchima 46.46% ? 10.40%, ciste 53.54% ? 10.40%, n=5), gruppo sperimentale M2 (grigio chiaro, parenchima 46,90% ? 10.95%, ciste 53.10% ? 10.95%, n=3). (D) Immagine rappresentativa della distribuzione radiale e longitudinale dei TEM lungo il midollo spinale. Le differenze tra le condizioni sperimentali analizzate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=3 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05. M2= macrofagi di fenotipo 2; TEM= Tumor-Educated Macrophages.
FIGURA 8. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un?aumentata gliosi e una riduzione dell?area della ciste rispetto agli animali di controllo.
(A-D) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per gli astrociti GFAP (grigio chiaro) e TO-PRO3 (grigio scuro) in animali di controllo e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM in cui sono rappresentate le aree considerate per la quantificazione. (A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per gli astrociti GFAP (grigio chiaro) e TO-PRO3 (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). (C-D) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per gli astrociti GFAP (grigio chiaro) e TO-PRO3 (grigio scuro) in animali di controllo (C) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (D). L?area grigio scuro indica l?area della cicatrice gliale. L?area tratteggiata indica l?area della ciste. Queste due regioni nel loro complesso rappresentano l?area totale della lesione. (E) Grafico rappresentante il rapporto percentuale tra l?area della ciste (area grigio chiaro) e l?area totale della cicatrice gliale in animali di controllo (bianco) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Il trapianto multiplo di TEM determina, negli animali trattati, una riduzione significativa dell?area della ciste (21.38% ? 2.05%, n=3) rispetto agli animali di controllo (33.24% ? 0.87%, n=3). (F) Grafico rappresentante il rapporto percentuale tra l?area della cicatrice gliale (area tratteggiata) e l?area totale della sezione in animali di controllo (bianco) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Non si rilevano differenze nella percentuale dell?area della cicatrice gliale sull?area totale della sezione tra gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (6.79% ? 0.85%, n=3) e gli animali di controllo (6.69% ? 0.53%, n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. **P<0.01. GFAP= Glia Fibrillary Acid Protein.
FIGURA 9. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano una riduzione dell?area della ciste rispetto agli animali di controllo.
Grafico rappresentante il rapporto percentuale tra l?area della ciste (area grigio chiaro) e l?area della sezione totale in animali di controllo (bianco) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Il trapianto multiplo di TEM determina, negli animali trattati, una riduzione significativa dell?area della ciste (2.03% ? 0.30%, n=3) rispetto agli animali di controllo (4.73% ? 0.15%, n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali analizzate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. **P<0.01.
FIGURA 10. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un aumento del numero di neuroni totali rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per cellule neuronali NeuN (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (C) Numero percentuale di cellule NeuN+ presenti nel parenchima midollare di animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). La percentuale di cellule neuronali (NeuN+) ? normalizzata per il numero di nuclei totali. Come mostrato in figura, la percentuale dei neuroni totale ? risultata significativamente maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (13.13% ? 0.632%, n=5) rispetto agli animali di controllo (6.81% ? 0.726%, n=4). Le differenze tra le condizioni sperimentali analizzate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=5 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. ***P<0.001.
FIGURA 11. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un aumento del numero di neuroni colinergici rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per cellule neuronali ChAT (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (C) Grafico rappresentante il numero percentuale di cellule ChAT+ presenti nel parenchima midollare di animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). La percentuale di neuroni colinergici (ChAT+) ? normalizzata per il numero di nuclei totali. Come mostrato in figura, la percentuale dei neuroni colinergici ? risultata significativamente maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (0.412% ? 0.011%, n=4) rispetto agli animali di controllo (0.245% ? 0.038%, n=4). Le differenze tra le condizioni sperimentali considerate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. **P<0.01. ChAT= Choline acetyltransferase.
FIGURA 12. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un aumento del contenuto in neurofilamento rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Ingrandimento di una regione peri-lesione ottenuta da sezioni longitudinali di midollo spinale sottoposte ad immunostaining con il marker specifico per le proteine il neurofilamento NF200 (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). (C) Grafico rappresentante il rapporto percentuale tra l?area esprimente il marker NF200 (area NF200+) e l?area totale considerata per l?analisi in animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). La percentuale di mielina ? stata calcolata come pixel positivi per il NF200 presenti nella ROI rispetto ai pixel totali della ROI considerata. Come mostrato, la percentuale di NF200 ? risultata significativamente maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (16.36% ? 2.09%, n=3) rispetto agli animali di controllo (9.723% ? 0.133%; n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali studiate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05. NF200= Neurofilament-200, ROI= Region Of Interest.
FIGURA 13. Successivamente a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un aumento della mielina rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a Luxol Fast Blue (LFB) staining in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). LFB permette di rivelare la mielina (area grigio scuro) contenuta nel parenchima del midollo spinale e nello specifico, nell?area del cordone posteriore (ROI). (C) Percentuale di mielina presente nella ROI in animali di controllo (bianco) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). La percentuale di mielina ? stata calcolata come pixel positivi per la mielina presenti nella ROI rispetto ai pixel totali della ROI considerata. Come mostrato in figura, la percentuale di mielina contenuta nel cordone posteriore del midollo spinale ? risultata significativamente maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (26.470% ?1.075%, n=5) rispetto agli animali di controllo (19.870% ? 1.999%, n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali analizzate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=5 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05. ROI= Region Of Interest.
FIGURA 14. Successivamente a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un reclutamento intensivo di cellule dell?immunit? rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte ad immunostaining con il marker specifico per cellule appartenenti alla popolazione microgliale e macrofagica Iba1 (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (C) Percentuale di cellule Iba1+ presenti nel parenchima midollare in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero) e in animali di controllo (bianco). La percentuale di cellule della microglia attivate (Iba1+), normalizzata per il numero di nuclei totali, ? risultata significativamente maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (5.820% ? 0.411%, n=5) rispetto agli animali di controllo (3.847% ? 0.597%, n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali studiate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=5 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05.
FIGURA 15. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano un reclutamento intensivo di cellule dell?immunit? rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte ad immunostaining con il marker specifico per cellule appartenenti alla popolazione macrofagica CD68 (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (C-D) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte ad immunostaining con il marker specifico per cellule appartenenti alla popolazione macrofagica di fenotipo prorigenerativo (M2) CD206 (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (C) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (D). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (E) Percentuale di cellule CD68+ nel parenchima midollare in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero) e in animali di controllo (bianco). La percentuale di macrofagi (CD68+), normalizzata per il numero di nuclei totali, ? risultata maggiore negli animali di controllo (6.143% ? 0.554%, n=3) rispetto agli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (5.484% ? 0.367%, n=5). (F) Percentuale di cellule CD206+ nel parenchima midollare in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero) e in animali di controllo (bianco). La percentuale di macrofagi di fenotipo 2 (CD206+), normalizzata per il numero di nuclei totali, ? risultata significativamente maggiore negli animali di controllo (2.320% ? 0.080%, n=3) rispetto agli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (5.655% ? 0.497%, n=4). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=5 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05, **P<0.01.
FIGURA 16. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano una riduzione della matrice extracellulare.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per la matrice extracellulare Agrina (grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata in arancione delimita l?area di interesse considerata per la quantificazione (area totale della ciste). (C) Percentuale di Agrina presente nella ciste di animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero), normalizzata per l?area totale della sezione (linea tratteggiata bianca). Come mostrato in figura, la percentuale di Agrina contenuta nella regione considerata ? risultata significativamente minore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (3.500% ? 1.112%, n=3) rispetto agli animali di controllo (12.570% ? 2.140%, n=3). (D) Percentuale di Fibronectina presente nella ciste in animali di controllo (bianco) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero) normalizzata per l?area totale della sezione (linea tratteggiata bianca). Come mostrato in figura, la percentuale di Fibronectina contenuta nella regione considerata ? minore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (5.190% ? 2.019%, n=3) rispetto agli animali di controllo (9.625% ? 3.375%, n=3). La percentuale dei vari componenti della matrice extracellulare ? stata calcolata come pixel positivi per lo specifico componente della matrice extracellulare (Agrina, Fironectina) presenti nella ciste rispetto ai pixel totali della ROI considerata. Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=3 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05.
FIGURA 17. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano una riduzione delle aree ipossiche rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a staining per la rivelazione dei tioli liberi in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). La linea tratteggiata delimita l?area considerata per la quantificazione (area totale della sezione trasversale). (C) Percentuale dell?area ipossica nel parenchima midollare di animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). L?area ipossica percentuale ? stata calcolata come pixel positivi per area ipossica presenti nella sezione totale rispetto ai pixel totali della sezione totale. Come mostrato in figura, l?area ipossica percentuale ? risultata significativamente minore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (3.173% ? 0.528%, n=3) rispetto agli animali di controllo (5.866% ? 0.745%, n=3). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05.
FIGURA 18. In seguito a lesione spinale severa, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM mostrano vasi con un aumentato numero di ramificazioni e una maggiore lunghezza massima rispetto agli animali di controllo.
(A-B) Regioni di interesse (ROI) rappresentative ottenute da sezioni trasversali di midollo spinale sottoposte a immunostaining con il marker specifico per le cellule endoteliali CD31 (grigio) in animali di controllo (A) e in animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (B). (C) Numero medio di vasi/campo nell?area considerata (ROI) in animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Come mostrato, il numero medio di vasi/campo ? risultato maggiore negli animali di controllo (37.070 ? 0.379, n=3) rispetto agli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (30.940 ? 3.592, n=3). (D) Numero medio di ramificazioni/vaso nell?area considerata (ROI) in animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Come mostrato, il numero medio di vasi/campo ? risultato maggiore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (2.110 ? 0.165, n=3) rispetto agli animali di controllo (1.793 ? 0.073, n=3). (E) Lunghezza massima media dei vasi nell?area considerata (ROI) in animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Come mostrato, il numero medio di ramificazioni/vaso e la lunghezza massima media dei vasi/campo sono risultate significativamente maggiori negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (55.410 ?m ? 2.500 ?m) rispetto agli animali di controllo (43.450 ?m ? 0.751 ?m). (F) Valore medio della tortuosit? dei vasi nell?area considerata (ROI) in animali di controllo (bianco) e di animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (nero). Il valore della tortuosit? non ha mostrato differenza tra i gruppi sperimentali considerati (1.168 ? 0.005 animali sottoposti a trapianto mutiplo di TEM, 1.153 ? 0.015 controlli). Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=5 animali, analizzate 8 sezioni/animale per ogni gruppo. *P<0.05. ROI= Region Of Interest.
FIGURA 19. L?aggiunta di TEM alle colture umane di iPSCs ne promuove il differenziamento neuronale.
A-B) Immunostaining di IPSCs umane differenziate in motoneuroni con il marker specifico per i neuroni ?III Tubulina (Tub3; grigio chiaro) e DAPI (grigio scuro) in colture di controllo (A), in co-colture con TEM (B) e in co-colture con M2 (C). (D) Area di espressione della Tub3 normalizzata per il valore dell?area totale considerata per l?analisi in campioni di controllo (bianco), in co-colture con TEM (nero) e con macrofagi M2 (grigio). Come mostrato, l?area di espressione della Tub3 nelle co-colture con TEM risulta significativamente maggiore rispetto ai controlli ed alle co-colture con M2. (6.423% ? 0.494% controlli, co-colture con TEM 9.097% ? 0.253%, co-colture con M2 7.235% ? 0.492%). Le differenze tra le condizioni sperimentali studiate sono state analizzate mediante Unpaired t-test. I dati sono espressi come media ? SEM; n=3 donatori, analizzate 40 campi/donatore, 4 immagini/campo. *P<0.05, **P<0.01.
TABELLA 1. Gene expression. Tabella contenente la lista dei geni up-regolati nelle cellule TEM ottenuta mediante sequenziamento degli RNA messaggeri (RNAseq).
TABELLA 2. Secretoma. Tabella contenente la lista dei geni up-regolati nelle cellule TEM ottenuta mediante sequenziamento degli RNA messaggeri (RNAseq) relativamente ai trascritti specifici per il secretoma (proteine secrete).
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Risultati
Parametri del modello animale di lesione spinale contusiva severa
Topi maschi adulti (7 settimane di et?) C57BL/6J acquistati da Charles River sono stati sottoposti a laminectomia e quindi a lesione contusiva severa del midollo spinale a livello della vertebra toracica 11 (T11). Prima di effettuare le chirurgie, tutti gli animali sono stati pesati e solo i topi rientranti in un range di peso tra i 17 e 31g sono stati considerati per l?esperimento e sottoposti a chirurgia. Il peso degli animali al momento della chirurgia ? mostrato in Figura 1. Le operazioni chirurgiche di lesione e trapianto cellulare hanno determinato la morte di 26 animali su 142 a causa della gravit? delle procedure applicate o a causa di complicazioni durante il periodo di recupero.
Protocollo per il trapianto di Tumor-Educated Macrophages (TEM) ed M2 nel modello di lesione spinale severa
Gli animali sottoposti a lesione spinale severa sono stati suddivisi in 3 gruppi: (i) il gruppo di controllo (ricevente infusione di soluzione salina), (ii) il gruppo TEM (ricevente trapianto multiplo di TEM), (iii) il gruppo M2 (ricevente trapianto multiplo di macrofagi M2).
Le colture di macrofagi TEM e M2 sono state ottenute a partire da midollo osseo femorale (BMDM) di topi transgenici esprimenti la proteina fluoreseente rossa dtTomato al fine di poterne tracciarne la distribuzione nel contesto dell?area lesa.
Il giorno prima del trapianto cellulare, colture omogenee di macrofagi sono state condizionate opportunamente allo scopo di ottenere i fenotipi cellulari desiderati (TEM, M2). Il condizionamento ? stato effettuato modificando la composizione del medium di coltura BMDM. Per ottenere colture omogenee di TEM il medium ? stato modificato con un medium costituito per il 50% da surnatante tumorale (ottenuto da colture di espianti solidi di fibrosarcoma e glioma, da cui ? stato selezionato il surnatante ricco in fattori rilasciati dal tumore) e la coltura ? stata mantenuta in condizioni di ipossia per 18 ore.
Per ottenere colture omogenee di M2 il medium ? stato modificato con l?aggiunta di IL-4 (20 ng/ml).
Il giorno del trapianto, TEM e macrofagi M2 in coltura sono stati staccati dalle piastre utilizzando Acutase, centrifugati per eliminare il surnatante e risospesi in soluzione fisiologica alla concentrazione di 0.5*10<6 >cellule/?l.
Ogni animale sperimentale appartenente al gruppo TEM o M2, il giorno del trapianto ha ricevuto 4 iniezioni (1 ?l/iniezione) in 4 punti diversi, separati l?uno dall?altro di 2 mm nella colonna dorsale (profondit? di iniezione: 0.5 mm) nella sezione del midollo spinale centrata sulla lesione (Figura 2).
Il trapianto cellulare ? stato effettuato ad una velocit? di 0.5 ?l/minuto utilizzando un capillare di vetro collegato con un microinettore e ad un apparato stereotassico. Il capillare in vetro dopo ogni iniezione ? stato mantenuto per 5 minuti in posizione allo scopo di minimizzare il pi? possibile il reflusso della sospensione cellulare. Trascorsi i 5 minuti, la ferita dorsale ? stata suturata e disinfettata, ed ? stato somministrato sottocute 1 ml di soluzione fisiologica. Al termine di tutte le procedure, l?animale ? stato posizionato su un tappetino riscaldante e monitorato fino al completo risveglio.
Piano sperimentale
Una volta sottoposti a lesione spinale contusiva severa, gli animali sono stati suddivisi in 3 gruppi sperimentali: un primo gruppo ? stato sottoposto a trapianto multiplo di TEM, un secondo gruppo ? stato sottoposto a trapianto multiplo di macrofagi M2 e, infine, un terzo gruppo ? stato sottoposto ad iniezioni di soluzione salina sterile. Prima di suddividere gli animali nei tre gruppi sperimentali, il giorno del primo trapianto (3 giorni dopo la lesione spinale contusiva, 3 dpi), sono state valutate le performance locomotorie degli animali e solo gli animali con una lesione spinale severa che determinava un valore compreso tra 0 e 0.5 nella Basso Mouse Scale analysis (BMS) sono stati utilizzati per la fase successiva della sperimentale. Sono state effettuati 3 o 4 trapianti/iniezioni di soluzione fisiologica (time points 3 trapianti: 3 dpi, 10 dpi, 17 dpi; time points 4 trapianti: 3 dpi, 10 dpi, 17 dpi e 24 dpi). Gli esperimenti si sono conclusi 31 giorni dopo la lesione spinale (31 dpi).
Alla fine della sperimentazione nei gruppi sperimentali considerati sono stati valutati i valori di recupero funzionale e le caratteristiche istologiche .
VALUTAZIONI LOCOMOTORIE
Valutazioni locomotorie in open-field
Per valutare l?effetto delle cellule TEM ed M2 sul recupero della funzionalit? locomotoria a seguito della lesione contusiva severa del midollo spinale, ? stata condotta la valutazione BMS. Le performance locomotorie di ogni animale sono state valutate a 1, 3, 7 dpi durante la prima settimana successiva alla lesione e, successivamente, 2 volte a settimana (10, 14, 17, 18, 21, 24, 28, 31 dpi) fino al termine dell?esperimento (31 dpi) quando gli animali sono stati perfusi e il midollo spinale dissezionato per successive analisi istologiche.
Come mostrato in Figura 3, il valore BMS degli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (1.792 ? 0.327) ? significativamente superiore rispetto a quello degli animali sottoposti a trapianto multiplo di M2 (0.375 ? 0.109) ed a quello degli animali di controllo (0.712 ? 0.157). Come mostrato in Figure 3, l?analisi post-hoc ha evidenziato una differenza significativa tra animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM e veicoli nei valori di BMS in corrispondenza dei time points 14, 17, 18, 21, 24, 28 e 31 dpi. Allo stesso modo, l?analisi post-hoc ha evidenziato una differenza significativa tra animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM e animali sottoposti a trapianto multiplo di macrofagi M2 nei valori di BMS in corrispondenza dei time points 17, 18, 21, 24, 28 e 31 dpi.
Analisi della flessibilit? della caviglia
Diversi studi hanno dimostrato come la ?spasticit?? sia uno dei sintomi pi? comuni che si sviluppa a seguito di lesioni del midollo spinale e questo fenomeno ? una delle cause principali di disabilit? negli individui affetti da patologie colpiscono il sistema nervoso centrale, come le lesioni del midollo spinale [4]. Allo scopo di determinare se il trapianto cellulare fosse in grado di evitare l?instaurarsi di una condizione di spasticit?, ? stata valutata la performance di flessibilit? relativa all?articolazione della caviglia. Questa condizione ? stata monitorata ogni giorno a partire da 15 dpi fino alla fine dell?esperimento (31 dpi).
Come mostrato in Figura 4, la flessibilit? dell?articolazione della caviglia ? significativamente migliore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (0.799 ? 0.037) rispetto a quello degli animali sottoposti a trapianto multiplo di M2 (0.659 ? 0.049) ed a quello degli animali di controllo (0.612 ? 0.045), suggerendo un pi? veloce recupero della spasticit? muscolare in seguito a lesione spinale. Come mostrato in Figure 4, l?analisi post-hoc ha evidenziato una differenza significativa tra animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM e veicoli nei valori di flessibilit? dell?articolazione della caviglia in corrispondenza dei time points 15, 21, 22, 26, 27, 28, 29, 30 e 31 dpi. Inoltre, come mostrato in Figure 4, l?analisi post-hoc ha evidenziato una differenza significativa nei valori della flessibilit? della caviglia tra animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM e animali sottoposti a trapianto multiplo di macrofagi M2 in corrispondenza del time point a 28 dpi.
Elettromiografia
Al fine di verificare i dati ottenuti dalle precedenti analisi funzionali, sono state effettuate registrazioni elettromiografiche (EMG) dei potenziali spontanei in vivo relativamente ai muscoli gastrocnemio laterale e tibiale anteriore. Sono stati presi in considerazione sia l?ampiezza che la durata dei segnali elettromiografici durante la contrazione muscolare. L?ampiezza dei tracciati elettromiografici ? proporzionale al numero di motoneuroni attivati: sia gli animali trapiantati che gli animali controllo mostrano ampiezze elettromiografiche ridotte circa del 50% rispetto ad animali sani. Le durate di attivazione dei tracciati elettromiografici sono proporzionali all?eccitabilit? dei motoneuroni che risulta essere aumentata a seguito di lesione del midollo spinale (in particolare le durate di attivazione dei tracciati elettromiografici degli animali controllo sono aumentate di 2.5 volte).
L?aumento dell?eccitabilit? dei motoneuroni dopo lesione spinale ? dovuto alla perdita di funzionalit? sia dei circuiti inibitori che agiscono su larga scala sia di quelli locali. Negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM la durata di attivazione elettromiografica del muscolo gastrocnemio laterale ? statisticamente minore (0.338s ? 0.048s) rispetto a quella degli animali di controllo (0.593s ? 0.101s), avvicinandosi maggiormente alla condizione fisiologica del muscolo negli animali sani (0.231s ?0.038s) (Figura 5A). Anche per quanto riguarda il muscolo tibiale anteriore, le durate di attivazione elettromiografiche negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM sono minori (0.416s ? 0.058s) rispetto a quella degli animali di controllo (0.450s ? 0.077s). Gli animali sani presentano una durata di attivazione elettromiografica del muscolo tibiale anteriore minore statisticamente inferiore rispetto a tutti gli altri gruppi sperimentali (0.161s ?0.020s) (Figura 5B). Questi dati indicano che il trattamento con TEM ristabilisce la normale eccitabilit? dei motoneuroni flessori, sebbene non abbia effetto in termini di reinnervazione.
Analisi trascrittomica
Considerati gli effetti osservati nelle analisi funzionali in vivo, allo scopo di analizzare pi? approfonditamente le caratteristiche delle cellule trapiantate (TEM e macrofagi M2) ? stato analizzato il loro fenotipo mediante sequenziamento degli RNA messaggeri (RNAseq). La Principal Component Analysis (PCA) di questi dati nei 3 campioni analizzati per ogni gruppo sperimentale ha confermato che prima del trapianto TEM e macrofagi M2 presentano fenotipi completamente distinti (Figura 6A). L?analisi trascrittomica riguardante i trascritti inerenti il secretoma e recettoma, inoltre, ha indicato che i geni up-regolati maggiormente significativi nella popolazione TEM sono in relazione con le categorie funzionali di Gene Ontology inerenti l?angiogenesi (es. VEGFs e VEGFc) e il rimodellamento della matrice extracellulare (Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19) (Figura 6B).
ANALISI ISTOLOGICA
Gli eventi traumatici che si verificano a livello del midollo spinale provocano danni meccanici e una conseguente degenerazione tissutale. Questi eventi includono: degradazione della membrana cellulare degli assoni, degenerazione della barriera emato-encefalica, demielinizzazione, migrazione di cellule immunitarie e morte delle cellule del parenchima spinale [2, 5]. Per studiare come il trapianto di TEM contribuisca alla rigenerazione tissutale del midollo spinale, sono state studiate inizialmente la distribuzione delle cellule nel parenchima spinale a 31 dpi e successivamente le caratteristiche istologiche relative alla formazione della ciste, alla cicatrice gliale, al numero di neuroni e in particolare dei neuroni colinergici (motoneuroni), al contenuto di mielina, all?attivazione della risposta immunitaria, alla matrice extracellulare e alla vascolarizzazione tissutale.
Distribuzione delle cellule trapiantate
Allo scopo di valutare la persistenza delle cellule trapiantate, la loro vitalit? e localizzazione ? stata analizzata la distribuzione delle cellule trapiantate a fine esperimento (31 dpi). Il numero di TEM ed M2 ? stato quantificato in sezioni trasversali di midollo spinale in seguito a lesione spianale severa e trapianto multiplo rappresentanti una regione midollare pari a 0.6 cm di lunghezza (9 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. Per l?analisi ? stato considerato il numero assoluto di cellule fluorescenti rosse (tomato+; TEM o M2) colocalizzanti con il marcatore nucleare 4?,6-diamino- 2-phenylindole (DAPI). La distribuzione dei TEM ? stata analizzata sulla base della loro diversa localizzazione nel tessuto spinale (parenchima, area della ciste, meningi dorsali/ventrali). Come mostrato in Figura 7A-B, TEM e macrofagi M2 persistono nel parenchima spinale anche nei giorni successivi ai trapianti, e se ne rileva la presenza non solo nella sezione della lesione spinale ma anche nelle sezioni limitrofe. La diffusione delle cellule trapiantate (TEM e macrofagi M2) quindi non ? solo radiale rispetto al sito di trapianto, ma anche longitudinale in direzione rostrale e caudale. I valori percentuali sono stati normalizzati sul totale di cellule TEM o M2 presenti nelle sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 0.6 cm di lunghezza (9 sezioni trasversali di midollo spinale/animale). Nella sezione corrispondente al trauma spinale, sebbene risultino concentrati nell?area ciste (53.54% ? 10.40% TEM, n=5; 53.10% ? 10.95% M2, n=3), una rilevante percentuale risulta diffusa nel parenchima circostante (46.46% ? 10.40% TEM, n=5; 46,90% ? 10.95% M2, n=3) (Figura 7 C). I valori percentuali sono stati normalizzati sul totale di cellule TEM o M2 nella sezione del trauma spinale. In Figura 7 D ? rappresentato lo schema di distribuzione radiale e longitudinale delle cellule trapiantate in relazione al sito del trauma spianale. Nel complesso questi dati suggeriscono che le cellule trapiantate (TEM e macrofagi M2) sono in grado di sopravvivere per giorni nell?ambiente ostile che si instaura in seguito a lesione spinale.
Ciste e cicatrice gliale
A seguito di una lesione spinale, la formazione della cicatrice gliale e della ciste a livello del sito di lesione costituiscono un meccanismo compensativo che contribuisce a limitare il danno secondario conseguente il trauma [2]. Ciononostante, la loro presenza impedisce la rigenerazione assonale in quanto costituiscono una barriera fisica e molecolare [11]. Considerando l?importanza della risposta delle cellule gliali a seguito di lesione spinale nel recupero funzionale, allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM nella formazione della cicatrice gliale e nell?attivazione della risposta astrocitaria sono stati eseguite analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker specifico per gli astrociti, la Proteina Fibrillare Acida della Glia (GFAP) (Figura 8A-D). Sono state analizzate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 0.6 cm di lunghezza (9 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. L?area della ciste rispetto all?area totale della cicatrice gliale risulta di dimensione minore negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (21.38% ? 2.05%, n=3) rispetto agli animali di controllo (33.24% ? 0.87%, n=3) (Figura 8E). Inoltre, la cicatrice gliale generata dagli astrociti, delimitante l?area di lesione, si presenta di uguale dimensione nei gruppi sperimentali analizzati (TEM: 6.79% ? 0.85%, n=3) rispetto ai controlli (6.69% ? 0.53%, n=3) (Figura 8F). Gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM presentano un?area della ciste significativamente pi? piccola (2.03% ? 0.30%, n=3) paragonata a quella dei controlli (4.73% ? 0.15%, n=3) rispetto all?area della sezione totale (Figura 9). Questi dati sono compatibili con la promozione di meccanismi di rigenerazione tissutale/limitazione di meccanismi degenerativi in corrispondenza del sito della lesione negli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM.
Contenuto neuronale
La degenerazione tissutale del midollo spinale dovuta alla lesione meccanica primaria ? seguita da un danno secondario che determina un?ulteriore perdita di cellule neuronali [5]. Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM a livello del contenuto neuronale in seguito di lesione spinale contusiva, sono stati eseguiti delle analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker specifico per i neuroni NeuN (Figura 10A-B). Sono state analizzate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 1.5 cm di lunghezza (8 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. Inizialmente ? stata quantificata la percentuale di cellule NeuN+. Come mostrato Figura 10C, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM presentano una percentuale di neuroni maggiore (13.13% ? 0.632%, n=5) rispetto agli animali di controlli (6.81% ? 0.726%, n=4). Nel parenchima del midollo spinale sono presenti diverse popolazioni neuronali. In particolare, sono presenti i motoneuroni che nello specifico sono localizzati a livello della lamina IX nella regione ventrale del midollo spinale [12]. Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM sul contenuto in motoneuroni a seguito di lesione contusiva del midollo spinale, sono stati eseguite analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker specifico per i neuroni colinergici correlato con l?espressione della colina-acetiltransferasi, ChAT (Figura 11). Sono state analizzate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 1.5 cm di lunghezza (8 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. Anche per quanto riguarda la percentuale di cellule ChAT+, gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM presentano una percentuale maggiore di motoneuroni (0.412% ? 0.011%, n=4) rispetto ai controlli (0.245% ? 0.038%, n=4) (Figura 11C).
Le proteine strutturali maggiormente espresse a livello degli assoni nei neuroni maturi sono i neurofilamenti (NFs). La loro espressione ? strettamente correlata alla crescita assonale e al mantenimento dell?omeostasi neuronale [13]. A seguito di lesioni del midollo spinale si osserva perdita neuronale a livello della materia grigia accompagnata dalla perdita di proteine del neurofilamento e di mielina [13]. Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM nella rigenerazione assonale, sono state eseguite analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker specifico per la proteina del neurofilmanento NF200 (Figura 12A-B). Sono state analizzate sezioni longitudinali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 3 mm di larghezza (5 sezioni longitudinali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale.Gli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM presentano un contenuto di NF200 (16.360% ? 2.090%, n=3) significativamente maggiore rispetto ai controlli (9.723% ? 0.133%; n=3) (Figura 12C).
Il fenomeno della demielinizzazione determina significative conseguenze a seguito di una lesione spinale contribuendo alla perdita funzionale del tessuto nervoso [5]. Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM nella rimielinizzazione del parenchima spinale, sono state eseguite analisi istologiche con Luxol Fast Blue (LFB), un colorante specifico per la rivelazione della mielina (Figura 13A-B). Sono state analizzate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 0.6 cm di lunghezza (8 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. Come mostrato in Figura 13C, gli animali sottoposti a trapiantato multiplo di TEM presentano un contenuto di mielina (26.470% ?1.075%, n=5) significativamente maggiore rispetto ai controlli (19.870% ? 1.999%, n=3).
Valutazione della risposta immunitaria
La cascata di eventi conseguenti il danno spinale, determina la propagazione della risposta infiammatoria anche nei tessuti limitrofi al sito del danno meccanico spinale con conseguenze negative e positive sulla rigenerazione del tessuto midollare [2, 5, 6]. in particolare, considerando il ruolo cruciale dei macrofagi nella risposta immunitaria innata e le loro diverse funzionalit? dipendenti dalla loro polarizzazione fenotipica (M1 ? macrofagi pro-infiammatori; M2-macrofagi pro-rigenerativi), abbiamo valutato la componente macrofagica endogena e il loro relativo fenotipo. Il marker pi? comunemente utilizzato per la valutazione del contenuto in cellule appartenenti alla microglia e al lineage delle sottopopolazioni di monociti/macrofagi, ? la molecola Ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba1) [14] mentre per la valutazione dei macrofagi e il loro fenotipo M2 sono stati utilizzati rispettivamente i marker specifici CD68 e CD206. Il marker CD68 infatti ? legato all?espressione da parte di macrofagi e altri fagociti mononucleati, di una glicoproteina transmembrana di tipo 1 altamente glicosilata [15] mentre il marker CD206 ? correlato con l?espressione di un recettore del mannosio presente principalmente sulla superficie di macrofagi di tipo M2 [6].
Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM sulla risposta infiammatoria implicata nella fisiopatologia della lesione spinale severa, abbiamo quindi eseguito analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker Iba1 (Figura 14A-B). Per approfondire ulteriormente l?analisi e valutare la componente macrofagica e il suo fenotipo abbiamo successivamente eseguito analisi di immunofluorescenza utilizzando rispettivamente i markers CD68 e CD206 (Figura 15A-D). Nell?analisi sono state considerate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 0.6 cm di lunghezza (8 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. La Figura 14C mostra come, dopo la lesione spinale severa, la percentuale di cellule della microglia presente nel parenchima del midollo spinale aumenti nel parenchima spinale degli animali sottoposti a trapianti multipli di TEM rispetto ai controlli (5.820% ? 0.411%, n=5 animali sottoposti a trapianto con TEM, 3.847% ? 0.597%, n=3 controlli). Inoltre, dall?analisi approfondita della componente macrofagica e del relativo fenotipo, ? emerso che la percentuale di macrofagi ? maggiore nei controlli rispetto agli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (5.484% ? 0.367%, n=5 animali sottoposti a trapianto con TEM, 6.143% ? 0.554%, n=3 controlli) (Figure 15E), dove tuttavia la componente M2 ? significativamente maggiore (5.655% ? 0.497%, n=4 animali sottoposti a trapianto con TEM, 2.320% ? 0.080%, n=3 controlli) (Figure 15F).
Analisi della matrice extracellulare
Uno dei componenti principali dell?ambiente extracellulare ? la matrice extracellulare (ECM). Essa ? caratterizzata dalla concentrazione di molecole che presentano un duplice effetto sulla crescita neuronale promuovendola o inibendola. A seguito di un trauma spinale si osserva un aumento nella concentrazione dimolte di queste molecole nell?area danneggiata, tra cui fibronectina, agrina, collagene, e proteoglicani [2, 5, 11, 16]. Tra le molecole inibitorie, la superfamiglia dei condroitin-solfato proteoglicani (CSPG) ? la pi? rappresentata e comprende diverse categorie di molecole in grado di influenzare lo sviluppo e la rigenerazione assonale come Neurocan e Aggrecan [11, 16]. Sebbene in situazioni fisiologiche alcune di queste molecole non comportano alcun fenomeno di inibitorio, a seguito di un trauma il loro accumulo a livello della ciste e della cicatrice gliale contribuisce alla formazione di strutture che impediscono la rigenerazione assonale [16]. Diversi processi si attivano a livello della lesione per cercare di arginare questo fenomeno. Un ruolo fondamentale viene svolto dalle metalloproteasi, molecole ben conosciute per il loro ruolo nel rimodellamento dell?ECM [17].
Allo scopo di valutare l?effetto del trapianto multiplo di TEM sul rimodellamento dell?ECM a seguito di lesione spinale severa, abbiamo eseguito analisi di immunofluorescenza utilizzando marker specifici correlati con i principali componenti della ECM: Agrina e Fibronectina (Figura 16A-B). Sono state analizzate sezioni trasversali e longitudinali di midollo spinale (almeno 1 sezione longitudinale/trasversale di midollo spinale/animale) centrate sul sito della lesione spinale. Per valutare il contenuto di Agrina e Fibronectina ? stata condotta analisi morfometrica valutando l?estensione delle aree positive (numero di pixel) rapportati alle rispettive aree della ciste.
La Figura 16C-D mostra come, dopo lesione spinale severa, la percentuale di molecole di Agrina e Fibronectina presenti a livello della ciste diminuisca negli animali sottoposti a trapianti multipli di TEM rispetto ai controlli (Agrina: 3.500% ? 1.112%, n=3 animali sottoposti a trapianto con TEM, 12.570% ? 2.140% animali di controllo, n=3; Fibronectina: 5.190% ? 2.019%, n=3 animali sottoposti a trapianto con TEM, animali di controllo 9.625% ? 3.375%, n=3).
Ipossia e analisi morfologica dei vasi
Il midollo spinale ? caratterizzato da un sistema vascolare particolarmente complesso, tale che un danno ai principali vasi o l?alterazione della regolazione del flusso sanguigno pu? comportare la riduzione o il temporaneo blocco della perfusione tissutale. La lesione spinale traumatica pu? comportare l?immediata cessazione della perfusione tissutale con conseguenze a lungo termine che portano ad ipossia cronica e determinano modificazione dello stato redox tissutale, essenziale per la normale funzionalit? della fisiologia e del metabolismo cellulare, e conseguentemente neurodegenerazione [5, 18]. Considerando i risultati ottenuti dall?esperimento di analisi del trascrittoma, e nello specifico l?aumento significativo dei trascritti di geni coinvolti nella vasculogenesi, abbiamo analizzato la morfologia dei vasi e lo stato di eventuale carenza di ossigeno (ipossia) nel parenchima midollare in animali sottoposti a trapianti multipli e in animali di controllo.
Per la valutazione dell?ipossia si ? proceduto con l?analisi dei tioli liberi basata sull?utilizzo di N-etilammide (NEM) e acido iodoacetico (IAA) per l?alchilazione dei tioli (Figura 17A-B). I tioli legati alle cisteine proteiche, infatti, sono i gruppi pi? sensibili alle fluttuazioni dello stato redox cellulare. In condizioni fisiologiche, il citoplasma ? caratterizzato da una condizione altamente riducente in grado di mantenere la maggior parte dei tioli proteici in uno stato ridotto. Tuttavia, condizioni di eccessivo stress ossidativo possono portare alla formazione di speci molecolari che determinano un?irreversibile ossidazione dei tioli proteici, deplezione di glutatione e morte cellulare. Per la valutazione della morfologia dei vasi abbiamo invece eseguito analisi di immunofluorescenza utilizzando il marker specifico per le cellule endoteliali CD31 (Halder et al., 2019) (Figura 18 A-B). Per l?analisi delle aree ipossiche sono state considerate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 1.5 cm di lunghezza (almeno 8 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. La Figura 17C mostra come, dopo lesione spinale severa, la percentuale di area ipossica presente nel parenchima del midollo spinale diminuisca nel parenchima del midollo spinale degli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM rispetto ai controlli (3.173% ? 0.528%, n=3; animali sottoposti a trapianto di TEM; 5.866% ? 0.745%, n=3 controlli).
Per l?analisi della morfologia dei vasi sono state considerate sezioni trasversali di midollo spinale rappresentanti una regione midollare pari a 0.5 cm di lunghezza (almeno 4 sezioni trasversali di midollo spinale/animale) centrata sul sito della lesione spinale. Sulle sezioni traversali considerate sono quindi state selezionate 5 aree di interesse (ROI) sulle quali ? stata effettuata l?analisi della morfologia (numero di vasi/campo, numero medio di ramificazioni/vaso, lunghezza massima dei vasi; tortuosit? dei vasi). Il valore della tortuosit? dei vasi ? stato calcolato come rapporto tra la lunghezza media totale dei vasi in rapporto con il valore medio totale della distanza Euclidea di tutte le ramificazioni. Come mostrato in Figura 18C, l?analisi morfologica indica un maggior numero di vasi nel parenchima spinale degli animali di controllo (37.070 ? 0.379, n=3) rispetto agli animali sottoposti a trapianto multiplo di TEM (30.940 ? 3.592, n=3); tuttavia quest?ultimi presentano vasi con un maggior numero di ramificazioni (2.110 ? 0.165 animali sottoposti a trapianto con TEM, n=3; 1.793 ? 0.073 controlli, n=3) (Figura 18D), e una lunghezza massima significativamente maggiore (55.410 ? 2.500 animali sottoposti a trapianto con TEM, n=3, 43.450 ? 0.751 controlli, n=3) (Figura 18E). Il valore della tortuosit? non mostra differenza tra i due gruppi sperimentali considerati (1.168 ? 0.005 animali sottoposti a trapianto con TEM, n=3, 1.153 ? 0.015 controlli, n=3), Figura 18F.
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSCs) umane
I dati mostrati indicano che in vivo il trapianto multiplo di TEM determina un effetto prorigenerativo/protettivo del parenchima spinale su vari fronti(a livello neuronale, della cicatrice gliale, della componente mielinica), suggerendo che l?effetto delle cellule trapiantante non sia limitato ad un solo specifico tipo cellulare. Considerando il potenziale traslazionale del trattamento in analisi, e quindi allo scopo di valutare se l?effetto dei TEM osservato in vivo fosse applicabile anche sulle cellule neuronali umane, abbiamo valutato l?effetto di TEM e macrofagi M2 su colture di cellule staminali pluripotenti umane differenziate in motoneuroni. Durante la fase finale del differenziamento neuronale, alle colture sono stati aggiunti TEM o M2 e una volta completata la fase di differenziamento ? stata valutata l?area di espressione di uno dei marker specifici dei neuroni, la ?III Tubulina (Tub3), quale indicatore del numero di dendriti e della loro estensione normalizzando il valore per l?area totale considerata per la quantificazione (40 campi/donatore, 4 immagini/campo, n=3) (Figura 19A-C). Come mostrato in Figura 19D l?area di espressione della Tub3 risulta significativamente maggiore nelle co-colture con i TEM (9.097% ? 0.253%) rispetto a quelle con macrofagi M2 (7.235% ? 0.492%) ed alle colture di controllo (6.423 ? 0.494), suggerendo un maggior differenziamento neuronale e una maggiore estensione dei dendriti.
Claims (10)
1. Un metodo in vitro o ex vivo per indurre un cambiamento fenotipico e/o funzionale in una popolazione di fagociti mononucleati isolata da campioni biologici comprendente l?incubazione di detta popolazione, preferibilmente per 12 ore-10 giorni, preferibilmente 3-7 giorni, pi? preferibilmente 18 ore o 6 giorni, in un terreno di coltura comprendente fattori rilasciati da colture o espianti tumorali,
dove detta incubazione induce un cambiamento fenotipico e/o funzionale nei fagociti mononucleati della popolazione,
preferibilmente dove la popolazione di fagociti mononucleati incubata ? una coltura in vitro di monociti isolati da campioni biologici e/o dove il terreno di coltura comprende fattori in grado di differenziare i monociti in macrofagi, ad esempio il ?Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)?.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove l?incubazione avviene in condizioni di ipossia.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove i fagociti mononucleati indotti al cambio fenotipico e/o funzionale sono macrofagi.
4. Il metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, dove il terreno di coltura comprende un surnatante tumorale, detto surnatante essendo preferibilmente ottenuto da colture di espianti solidi di tumori o di linee cellulari tumorali, preferibilmente da fibrosarcoma o glioma, o essendo preferibilmente un medium condizionato dal tumore (TC-M) preferibilmente prodotto da linee cellulari tumorali o da resezioni di tumori dissociati e piastrati in vitro, preferibilmente per un periodo di circa 12 ore-20 giorni, pi? preferibilmente di circa 12-72 ore.
5. Il metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, dove il terreno di coltura ? costituto da terreno di coltura per cellule, Eagle's minimal essential medium o suoi derivati, e/o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, e/o Media 199 e/o Fischer's medium, e 1-99%, preferibilmente 10-90%, pi? preferibilmente 30-50% di surnatante tumorale.
6. I fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, ottenibili dal metodo secondo una delle rivendicazioni 1-5.
7. I fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, secondo la rivendicazione 6, caratterizzati dall?espressione di almeno uno dei geni della Tabella 1, e/o dalla secrezione di almeno una delle molecole della Tabella 2, preferibilmente dall?espressione di metalloproteasi (ad esempio Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27) e/o di fattori trofici (ad esempio VEGFs, FGFs, IGFs) e/o molecole di contatto cellulare e di adesione (ad esempio Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6), e/o mediatori che promuovono la sopravvivenza (ad esempio Rtn4rl2) e l?immunomodulazione (ad esempio Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6) e/o dall?aver acquisito propriet? rigenerative.
8. I fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, secondo una delle rivendicazioni 6 o 7 per uso medico, preferibilmente per uso in terapia cellulare, preferibilmente nella riparazione dei tessuti o cellulare, nella rigenerazione dei tessuti o cellulare, nel rimodellamento dei tessuti, nel trattamento e / o nella riparazione e/o nella guarigione di ferite, nel trattamento e/o nella risoluzione dell'infiammazione, dell'infiammazione (dei tessuti), nel trattamento dei danni, tessuti danneggiati e simili, preferibilmente nel trattamento di lesioni caratterizzate da perdita di tessuto incluso del sistema nervoso centrale, preferibilmente nel trattamento di una lesione del midollo spinale, preferibilmente una lesione spinale severa.
9. I fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, per uso secondo la rivendicazione 8, dove i fagociti sono somministrati da 2 a 60 giorni rispetto alla lesione, preferibilmente 4-21 giorni dopo rispetto alla lesione.
10. Composizione farmaceutica comprendente i fagociti mononucleati, preferibilmente macrofagi, secondo una delle rivendicazioni 6 o 7 e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
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