JP2024512001A - 腫瘍低酸素教育済み再生マクロファージを得る方法、及びその、再生医療における使用 - Google Patents

腫瘍低酸素教育済み再生マクロファージを得る方法、及びその、再生医療における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、生体サンプルから単離した単核食細胞の集団の表現型変化及び/又は機能変化を誘導するインビトロ又はエクスビボ方法であって、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地中での前記集団のインキュベーションを含み、インキュベーションが、低酸素条件下で起こり、前記インキュベーションが、集団の単核食細胞の表現型変化及び/又は機能変化を誘導する、方法に関する。このように得られるマクロファージは、他の分極化した表現型において存在しない固有の再生表現型とみなされ、M2マクロファージが挙げられる。加えて、本発明は、神経組織が挙げられる組織の再生のための、このように生成されるバイオリアクタの使用に関する。

Description

本発明は、再生医療における使用のための、再生バイオリアクタとしての機能を果たすマクロファージを製造する方法に関する。本発明で開示される方法は、詳細には、腫瘍塊から分離した腫瘍細胞株若しくは腫瘍細胞、又は分離した腫瘍外植片若しくは腫瘍摘出物、及び特定の酸素分圧によって馴化された(conditioned)培地によるマクロファージのインビトロ活性化に関する。このように得られるマクロファージは、他の分極化した表現型において存在しない固有の再生表現型とみなされ、M2マクロファージが挙げられる。本明細書中で定義されるマウス由来細胞の再生バイオリアクタ表現型は、メタロプロテアーゼ(Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27が挙げられる)、栄養因子(VEGF、FGF、IGFが挙げられる)、細胞接触及び接着分子(Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6が挙げられる)、生存(Rtn4rl2が挙げられる)及び免疫調節(Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd6が挙げられる)を促進するメディエータの広い発現を含む。本明細書中で定義されるヒト由来細胞の表現型は、創傷治癒(Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfaが挙げられる)、血管形成(Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Aplnが挙げられる)、解毒及び防御応答の調節(Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1が挙げられる)、低酸素に対する応答(Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4が挙げられる)、細胞外マトリックスリモデリング(Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3が挙げられる)、並びにニューロン生存及びミエリン形成(Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3が挙げられる)に関連する遺伝子の広い発現を含む。加えて、本発明は、神経組織が挙げられる組織の再生のための、このように生成されるバイオリアクタの使用に関する。
中枢神経系(CNS)は、脳(より高いレベルの機能を協調させる)(認知)及び脊髄(主に脳と末梢との間の伝達経路の役目を果たす)(外受容及び運動)を含む。他のヒト組織とは異なって、神経組織の再生能は悪く、神経組織病変は自発的に治癒しない[1]。神経組織病変は、自発的に治癒しない。CNSにおいて、失われた組織は、瘢痕組織によって、線維性構成要素である神経膠と置き換えられて、炎症性免疫細胞で構成される[2]。病変の進化は、瘢痕組織との神経組織の置換を包含し、結果としてニューロン結合の連続性、その機能の喪失、及び障害の出現が起こる。CNS損傷に起因する障害は、損傷のモード、重症度、及び解剖学的位置に依存する。
毎年、全世界のおよそ250～500,000人が脊髄損傷を被り、医療費が高くなっている(およそ100万～400万ユーロ/患者と推定されている)[3、4]。社会的コスト及び経済的コストが高いにもかかわらず、脊髄損傷治療のために開発されている、可能性のある処置は現在、ほとんど存在しない。加えて、現在、利用可能な治療法は、脊髄外傷によって引き起こされる二次障害を制限して、病変の部位にてごく少数の軸索接合を無傷のままに維持することができるのみである。ここ30年で、科学界は、脊髄損傷(SCI)後に生存率のかなりの上昇に至る多くのアプローチを開発してきた。しかしながら、脊髄損傷の処置に有効な治療は依然として存在せず、そしてゆえに最適な、完全な運動器官の回復に有効な治療は依然として存在しない。病理学的レベルにて、脊髄損傷は、損傷部位にてニューロン構成要素の喪失を引き起こして、CNSと末梢(筋肉)との間のインパルスの伝達の中断の原因となる。神経組織変性は、組織虚血、細胞死、及び炎症を包含する複雑な現象の結果である。
神経系の損傷の進行を誘導して神経組織の再生(生物学的要求)を妨げる、CNS病変の病理学的微環境
神経組織への損傷によって引き起こされる一次障害に加えて、血液潅流の低下に起因する二次障害が存在し、これは、神経細胞の代謝を維持するには不十分な基質(O2及び栄養)の供給、並びに浮腫を引き起こす血管浸透性、及び病変の周りに残っている神経組織を更に圧迫して病変を悪化させる炎症性浸透物の増大を包含する。これらの複雑な症状は、主に影響される領域を囲む神経組織細胞の死を増大させる。障害の領域を制限するために、強い炎症が、病変の範囲を定める星状膠細胞の反応性の活性化により生ずる。続いて、炎症性免疫細胞、特に炎症性マクロファージ(M1と呼ばれる)と共に膠瘢痕を形成する星状膠細胞、及び間質細胞は、病変領域を満たすが、軸索成長及び神経細胞分化を阻害する特徴的な細胞外マトリックスを生成する。更に、炎症性構成要素は、細胞死によって慢性的に活性化されて、病変の微環境障害及び神経組織損傷の慢性的進行に寄与する。したがって、病理生理学的プロセスは、神経組織病変の形成、進行、及び慢性度に寄与する複数の因子の複雑な関与を示す[4～6]。現在、神経組織の喪失によって特徴付けられる疾患のための再生医療の方法は、主に、失われた神経組織を置き換えることを目的とする幹細胞の使用(細胞置換)に基づく。これについて、胚性幹細胞(ESC)及び/又は胎児神経幹細胞(NSC)、並びにその神経分化誘導体(例えば乏突起膠細胞前駆細胞)、又は神経分化人工多能性細胞(iPSC)(iPSC-NSC)が試験されてきた[7、8]。これらの治療法は、本発明者らによって用いられて、完全挫傷性脊髄損傷によって特徴付けられる重度の神経変性モデルにおいて、臨床有効性をまだ示していない。
患者自身によって直接とられてから再生目的で移植され得る細胞源を求めて(自己由来のセッティング)、多数の他の成人幹細胞集団も試験されてきた。しかしながら、これらの研究は、神経細胞中に注射される細胞の直接的分化によってではなく「バイスタンダー」効果、すなわち栄養と炎症の調節によって支持される、これらの処置の部分的な利益を示した。これらの特性を示す幹細胞として、骨髄(BM-)又は脂肪組織(A-)に起源する成人神経幹細胞(マウスにおいてのみ存在するaNSC)、造血幹細胞(HSC)、及び間葉系幹細胞(MSC)が挙げられる[7]。様々な有効性により、これらの細胞型は、損傷を受けた組織に栄養因子を提供して炎症を低下させる特定の再生能を示す。しかしながら、これらのアプローチは、重度の慢性神経変性疾患の治療法において、十分に有効でなかった。細胞の最後のクラスとして、マクロファージが挙げられる免疫細胞の再生能もまた、最近試験されている。静脈内に、又は神経組織損傷の部位にて注射されるM2表現型に向けて誘導されたマクロファージは、部分的再生有効性を示したが、用いられたモデルは、重度の慢性神経変性疾患に対応していなかった[9]。M2マクロファージ移植の治療効果は、脊髄損傷患者による第二相臨床試験において試験された。M2移植は、重大ないかなる有害事象も示さなかったが、当該研究は、対照の非処置患者と比較して、M2処置の主要アウトカムに関する有意差を実証できなかった[10]。したがって、Lammertseらによる研究は、自己由来M2マクロファージによる急性完全SCIの処置の有効性を支持しなかった。
米国特許第5,639,275号 欧州特許出願公開第301,777号 米国特許第4,353,888号 米国特許第4,744,933号 米国特許第4,749,620号 米国特許第4,814,274号 米国特許第5,084,350号 米国特許第5,089,272号 米国特許第5,578,442号 米国特許第5,676,943号
Chang, P.ら、1999年 Matthew, H. W.ら、1991年 Yanagi, K.ら、1989年 Cai Z. H.ら、1988年 Chang, T. M.ら、1992年 Legland、Arganda-Carreras & Andrey、2016年 Halderら、2019年 S S Easter Jrら、J Neurosci, Initial tract formation in the mouse brain、1993年
結論として、先行技術分析は、神経組織の重度の喪失によって特徴付けられる疾患を処置することができる治療法が依然として必要とされていることを示している。というのも、これらの症状について有効な治療が存在しないからである。
本発明者らは、複雑なバイオリアクタ、「腫瘍低酸素教育済みマクロファージ」(THEM)(「腫瘍教育済みマクロファージ」(TEM)とも定義され得る)の使用に基づく、神経組織の重度の喪失によって特徴付けられる疾患の治療法を開発した。これは、神経組織の重度の喪失を部分的に再生させて、運動神経の回復を促進することができることを示した。神経組織喪失のパラダイムとして、本著者らは、重度の(完全)挫傷性脊髄損傷(SCI)の実験動物モデルにおいて、処置有効性を試験した。
自然界に存在する「再生」の最高の例と考えられる腫瘍の特性を用いて、免疫細胞を、神経組織の重度の喪失によって特徴付けられる変性疾患の再生に有効なバイオリアクタに形質転換した。特に、免疫細胞は、後述する腫瘍馴化及び低酸素により「教育される」。
続いて、THEM(腫瘍及び低酸素教育済みマクロファージ)を、SCI動物内に、病変部位にて注射した。THEMの投与は治療である、すなわち、細胞は損傷の数日後に注射される。THEMを、7件の独立した実験において200頭を超える動物に試験して、その効果を、学際的な方法を用いて評価した。
本アプローチに関連する2つの主要な発見がある:
1-有効性のレベルは、運動神経の回復のレベル及び陽性症例の頻度に関して、発明者らが、種々の種類の移植幹細胞が挙げられる現在提案されている治療法により見出したものに対して、より高い、
2-病変の前又は直後(24時間)に処置が施される他の治療干渉モデルとは異なり、当該症例において、細胞療法は、病変の4日後に、すなわちヒト治療法についての現実的な症状に対応するフェーズにおいて、開始される。
THEM再生効果に及ぼす低酸素の役割を評価するために、発明者らは、THEM分子及び機能的表現型に及ぼす特定の低酸素誘導効果を特徴付けることを意図したインビトロ及びインビボ実験を実行した。
特に、発明者らは、(低酸素で培養した)THEMのトランスクリプトーム全体を分析することによって、低酸素特異的シグネチャーによりTHEMを定義し、そしてこれを、低酸素なしで培養したTHEM(腫瘍馴化マクロファージ、TCM)、並びにM0及びM2表現型に向けて分極化したマクロファージのものと比較した。
また、発明者らは、THEM(低酸素で培養した)、TCM(低酸素なしで培養した)、及びM2マクロファージを比較して、低酸素がTHEMのSDF-1に対する走化性応答を増大させることを確認するための遊走性アッセイ(migratory assay)を実行した。発明者らは、iPSCに由来するヒト運動ニューロンとの共培養実験を実行して、マウス及びヒト双方の低酸素で培養したTHEM、低酸素なしで培養したTCM、及びM2マクロファージのニューロンプロセスの生成及び伸長に及ぼす効果を比較して、低酸素処理が、ヒト運動ニューロンに対するTHEMインビトロニューロン再生機能を付与することを確認した。更に、発明者らは、THEM(低酸素で培養した)及びTCMの、脊髄損傷マウスの運動神経の回復に及ぼすインビボ効果を比較して、低酸素処理がTHEMインビボニューロン再生機能を付与することを確認した。
したがって、本発明の目的は、生体サンプルから単離した単核食細胞の集団の表現型変化及び/又は機能変化を誘導するインビトロ又はエクスビボ方法であって、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地中での前記集団のインキュベーションを含み、インキュベーションが、低酸素条件下で起こり、前記インキュベーションが、集団の単核食細胞の表現型変化及び/又は機能変化を誘導する、方法である。
好ましくは、インキュベートされた単核食細胞集団は、生体サンプルから単離した単球(マクロファージの循環前駆細胞と定義され得る)のインビトロ培養物である。単球は、例えば、末梢血から遠心分離勾配によって抽出することもできるし、末梢血からの単核細胞の以前の単離物から解凍することもできる。
好ましくは、単核食細胞は単球である。
培養培地は好ましくは、単球をマクロファージに分化させることができる因子、例えば、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)又はIL34又は顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む。
好ましくは、単核食細胞は、好ましくは、例えば繰り返される遠心分離勾配によって、骨髄からとられるか、又は血液に由来する細胞から得られる、好ましくはマウス又はヒトの、マクロファージである。
好ましくは、インキュベーションは、低酸素条件下で起こる。低酸素条件は、大気濃度よりも低い酸素濃度の使用を指す。
集団は、好ましくは、6時間又は12時間～15又は20日間、より好ましくは6時間～10日間、又は好ましくは3～8日若しくは6時間～72時間、更により好ましくは18時間～24時間又は6日間、更に好ましくは7日間又は18時間インキュベートされる。
表現型変化及び/又は機能変化によって誘導される単核食細胞は、好ましくはマクロファージである。したがって、好ましい実施形態において、得られる細胞はマクロファージである。
好ましくは、培養培地は、腫瘍上清を含み、好ましくは、前記上清は、好ましくは線維肉腫又は神経膠腫由来の、固形腫瘍、腫瘍外植片、又は腫瘍細胞株の培養物から得られる。
好ましくは、腫瘍上清は、好ましくは腫瘍細胞株、腫瘍外植片、若しくは固形腫瘍から、又は分離且つプレーティングされたインビトロ腫瘍の摘出物から、好ましくは約12時間～20日間、より好ましくは約12～72時間生成された腫瘍で馴化された培地(本明細書中で馴化腫瘍培地(CTM)としても定義される)である。
好ましくは、培養培地は、細胞培養培地、例えばイーグル最小必須培地若しくはその派生物、及び/又はRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640及び/又はMedia 199及び/又はフィッシャー培地からなり、1～99%、好ましくは10～90%、より好ましくは30～50%、更により好ましくは30%又は50%の培地が、腫瘍(CTM)又は腫瘍上清で馴化されている。
マクロファージは、好ましくは、M-CSF又はGM-CSF、並びに、場合によっては、ダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)及び/又は熱不活化胎仔ウシ血清及び/又はペニシリン/ストレプトマイシン及び/又はグルタミンを含む培地中に、好ましくは6日間、分化する。
好ましくは分化したマクロファージは、好ましくは、腫瘍(CTM)及びD-MEMで、1:9～9:1の比率、好ましくは1:1の比率で馴化された培地中で培養され、好ましくは18時間、好ましくは低酸素条件(例えば1%O2)の下で増殖される。
好ましい態様において、マクロファージは好ましくは、6日間、好ましくは、10%熱不活化ウシ胎仔血清及び100ng/mlマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、そして場合によっては100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン(30%CTM入り)を含有するRPMI 1640培地中でインビトロ培養される。
単球培養は、7日の培養期間全体、又は最後の6～96時間、好ましくは最後の18～24時間、より好ましくは最後の18時間、低酸素条件(0.5～20%O2、好ましくは1%O2)中でインキュベートされる。
本発明の別の目的は、本発明に従う方法によって入手可能な単核食細胞、好ましくはマクロファージである。
好ましくは、前記食細胞は:
i)以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aの少なくとも1つを発現し、且つ/又は
ii)以下の遺伝子:PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARの少なくとも1つを低いレベルで発現する/発現しない。
M2細胞は実際に、CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aを非常に低いレベルで発現し/発現せず、そしてPLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARを発現する(図22b及びc参照)。
本発明の更なる目的は:
i)以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aの少なくとも1つを発現し、且つ/又は
ii)以下の遺伝子:PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARの少なくとも1つを低いレベルで発現する/発現しない、
単離した単核食細胞、好ましくはマクロファージである。
好ましくは、本発明の単核食細胞、好ましくはマクロファージは:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aを発現し;そしてPLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARを低いレベルで発現する/発現しない。
本発明の更なる目的は、本明細書中で定義される少なくとも1つの単核食細胞を含む単核食細胞の集団である。
好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである本発明の単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団は、好ましくは、Table 1(表1)及び/若しくはTable 2(表2)及び/若しくはTable 3(表3)及び/若しくはTable 6(表6)の遺伝子の少なくとも1つの発現によって、且つ/又はTable 2(表2)の分子の少なくとも1つの分泌によって特徴付けられる。
好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである本発明の単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団は、好ましくは、メタロプロテアーゼ(例えば、Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)、並びに/若しくは栄養因子(例えば、VEGF、FGF、IGF)、並びに/若しくは細胞接触及び接着分子(例えば、Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)、並びに/若しくは生存(例えばRtn4rl2)及び免疫調節(例えば、Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd1)を促進するメディエータの発現、並びに/又は後天性再生特性を有することを特徴とする。
好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである本発明の単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団は、好ましくは、創傷治癒(例えば、Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、並びに/又は血管形成(例えば、Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、並びに/又は解毒及び防御応答の調節(例えば、Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、並びに/又は低酸素に対する応答(例えば、Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、並びに/又は細胞外マトリックスリモデリング(例えば、Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)、並びに/又はニューロン生存及びミエリン形成(例えば、Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)に関連する遺伝子の少なくとも1つの発現によって特徴付けられる。
本発明に従うか、又は本明細書中に記載される単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージは、好ましくは医療的使用のためであり、より好ましくは細胞療法及び/又は再生医療における使用のためである。
本発明に従うか、又は本明細書中に記載される単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージは、好ましくは、神経変性、網膜変性、遺伝的疾患(例えばALS)、自己免疫疾患(例えば、関節炎、コラーゲン異常症)、又は更に膵島の変性が起こる糖尿病に起因する変性が挙げられる変性の症状の、創傷、創傷における組織喪失、外科的潰瘍、糖尿病性創傷の、組織又は細胞修復に、組織又は細胞再生に、組織リモデリングに、予防及び/又は処置及び/又は修復及び/又は治癒に、炎症の、組織の炎症の、損傷の、損傷を受けた組織等の予防及び/又は処置及び/又は寛解における使用のためである。
本発明に従うか、又は本明細書中に記載される単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージは、好ましくは、中枢神経系の包埋組織の喪失によって特徴付けられる病変の予防及び/又は処置における使用のためである。
本発明に従うか、又は本明細書中に記載される単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージは、好ましくは、脊髄の病変又は損傷、例えば重度の脊髄損傷又は脊髄損傷、好ましくは重度又は挫傷性の脊髄損傷の予防及び/又は処置における使用のためである。
食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージは、好ましくは、病変(又は損傷)後の2日～60日又は1年、好ましくは病変(又は損傷)後の4～21又は15～60日に投与される。
本発明の更なる目的は、本発明に従う少なくとも1つの単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団、好ましくはマクロファージ、及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本発明に従う方法は更に、単核食細胞培養物が、培養培地の除去後の表現型変化及び/又は機能変化を経たことを確認することを含み得る。そのような確認は、表現型を特徴付ける遺伝子の発現の定量化によって、そしてiPSCに由来するヒトニューロン培養物における生存の増大、ニューロンの分化、及び細胞外マトリックスをリシェイプする能力を予測する一セットの機能試験において実行することができる。
本明細書中で用いられる用語「マクロファージ」は、当該技術における一般的な意味を有し、食細胞活性を有する哺乳動物免疫系の抗原提示細胞の一種類を指す。当該細胞は、特徴的な形態学、及び表面MHC-クラスII、CD68、CD11b発現の高いレベルによって特徴付けられる。マクロファージは、樹状細胞でない単球由来食細胞、又は局所的増殖によって組織マクロファージに由来する細胞である。体内で、当該細胞は組織特異的であり、例えば、肝臓におけるクップファー細胞、肺における肺胞マクロファージ、脳における小膠細胞、骨における破骨細胞その他を指す。当業者であれば、マクロファージ細胞を特定する方法、マクロファージ細胞をヒト又は動物の体から単離する方法、並びにマクロファージ細胞をそのサブクラス及び亜集団に関して特徴付ける方法の知識がある。
マクロファージは歴史的に、2つの表現型的に多様な集団、すなわち、M1分極化又は「古典的活性化」集団、及びマクロファージM2分極化又は「選択的活性化」集団に分けられてきた。
M1表現型を示すマクロファージは、炎症誘発性であり、病原体及び腫瘍抗原を直接的に(病原体パターン認識受容体)、又は間接的に(Fc受容体、補体受容体)認識することができる(すなわち、抗腫瘍活性を示す)。M1マクロファージは、活性酸素種を生成して、炎症誘発性サイトカイン及びケモカイン、例えば、限定されないが、TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-18、IL-23、及びiNOSを分泌する。また、M1マクロファージは、高いレベルのMHC、共刺激分子、及びFCyRを発現する。M1表現型は、GM-CSFによってトリガーされ、そして更にインターフェロン-γ(IFN-γ)、細菌リポ多糖(LPS)、又は腫瘍壊死因子(TNFα)によって刺激され、そして転写のシグナルトランスデューサ及びアクティベータ(STAT)、活性化B細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサ(NFKB)、及び有糸分裂活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)を包含するいくつかのシグナル伝達経路によって媒介される。これらの事象は、活性酸素種及び一酸化窒素等の物質の生成を増強し、且つ以降の炎症性免疫応答を、抗原提示能力を増大させることによって、そしてサイトカイン、例えばIL-12の生成を介してThl免疫を誘導することによって促進する。
これに対し、M2表現型を示すマクロファージは、多くの場合、抗炎症且つ免疫抑制であると特徴付けられる。というのも、T細胞応答を抑制し、且つTh2型免疫応答に関与するからである。M2マクロファージ表現型は、組織修復、創傷治癒を促進し、線維化促進的(profibrotic)である。M2マクロファージは、I1-4R、FcsR、Dectin-1、CD 136、CD206、及びCD209Aの高い表面発現によって特徴付けられる。M2マクロファージとして、IL-4/IL-13刺激マクロファージ、IL-10誘導マクロファージ、及び免疫複合体トリガーマクロファージが挙げられる。
ゆえに、本発明の方法は、マクロファージの集団の1つ又は複数の表現型の変化を誘導して、所望の表現型を有するようにマクロファージの集団を調整するのに適している。
本明細書中で用いられるフレーズ「表現型変化及び/又は機能変化」は、集団中の単核食細胞又はマクロファージの特徴、特性、属性、又は機能の観察可能又は検出可能な変化を包含する。例えば、本発明の方法に従って修飾又は調節され得るマクロファージの表現型の特徴/特性/機能として、限定されないが、炎症誘発性活性、抗炎症活性、免疫原性活性、食細胞活性、免疫寛容原性活性、組織治癒活性、遊走性活性、血管形成活性、抑制性活性、抗原提示活性又は食細胞活性、細胞外マトリックスリモデリング活性、細胞外マトリックス堆積活性、栄養活性、幹/前駆細胞自己再生、細胞増殖、細胞分化、細胞死の阻害、細胞生存、細胞分泌、成長/栄養因子分泌、軸索再生刺激活性、ミエリン形成刺激活性、代謝支援活性が挙げられる。
マクロファージの表現型変化及び/又は機能変化は、いくつかの様式で観察又は検出され得る。例えば、表現型変化及び/又は機能変化は、マクロファージ自体上での試験、観察、若しくは測定を実行することによって、又はマクロファージによって影響され得る他の細胞、組織、器官その他上で試験、観察、若しくは測定を実行することによって、又は表現型的に修飾されたマクロファージを含有する対象に試験、観察、若しくは測定を実行することによって観察又は検出され得る。
表現型及び/又は機能の変化又は調節は、例えば、(i)1つ若しくは複数の遺伝子(メタロプロテアーゼ、Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27が挙げられる);栄養因子(VEGF、FGF、IGFが挙げられる)、並びに細胞接触及び接着分子(Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaL、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6が挙げられる)、生存(Rtn4rl2)及び免疫調節(Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd6)を促進するメディエータの発現の変化、(ii)1つ若しくは複数の分子(例えば、サイトカインTGFb3、Il16、Cxcl16、Isg15、Cxcl3、Cxcl1)、成長因子(VEGF、FGF、IGF)、炎症のメディエータ(Ptgs2、Ptges、Nos2、Arg1その他)の分泌の変化、(iii)免疫細胞、好ましくはマクロファージにおいて炎症性表現型(M1型)を調節して、当該細胞において修復表現型(M2型)を誘導する能力、(iv)ヒト及び/若しくはマウスの神経幹細胞若しくは誘導性の多能性ヒト細胞のニューロン分化を誘導して、栄養欠乏(酸素及びグルコース)の条件下で生存を増大させる能力、並びに/又は(v)血管形成を誘導する能力、並びに(vi)細胞外マトリックスのリモデル、並びに/又は(vii)SDF1に対する走化性応答を検出又は測定することによって評価され得る。
また、表現型及び/又は機能の変化若しくは調節は、例えば、創傷治癒(例えば、Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、並びに/又は血管形成(例えば、Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、並びに/又は解毒及び防御応答の調節(例えば、Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、並びに/又は低酸素に対する応答(例えば、Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、並びに/又は細胞外マトリックスリモデリング(例えば、Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)、並びにニューロン生存及びミエリン形成(Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)に関する1つ又は複数の遺伝子の発現の変化を検出又は測定することによって評価され得る。
本明細書中で用いられる用語CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A、PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARは、当該技術における一般的な意味を有する。例示的且つ非限定的なヒト配列が、NCBI受託NO(Gene ID):それぞれ7852、9595、6515、4502、5362、10808、54205、57103により開示される配列によって表される。
本明細書中で用いられる、本明細書中に記載の遺伝子は、当該技術における一般的な意味を有する。例示的且つ非限定的な配列が、表に示すNCBI受託NO(Gene ID)により開示される配列によって表される。
本発明の方法において、マクロファージを生成/培養するのに当業者に知られているあらゆる方法が用いられ得、例えば、単球を骨髄若しくは血液又はあらゆる派生物(例えば、白血球分離、バフィコート)から単離すること、及び/或いはこれらを、M-CSF若しくはGM-CSF又はそのようなサイトカインのあらゆる生物源(形質移入された細胞株が挙げられる)の存在下でインビトロ培養することによってマクロファージに分化させることを含む。
本発明の好ましい態様において、単核食細胞は、骨髄から単離される。好ましくは、単核食細胞は、例えばM-CSFを含む培地中で、例えば6日間、培養することによって、マクロファージに分化する。マクロファージは、好ましくは、低酸素条件下で例えば18時間、CTM内で培養される。
本発明の好ましい態様において、単核食細胞は、末梢血から単離されて、CD14+単球についてソートされる。単球は、好ましくは、例えば30%のCTMと共に、酸素正常状態で、例えば6日間、そして低酸素中で、例えば18～24時間、培養される。
これ以外にも、CTMによる培養は、最初に低酸素条件下で、その後酸素正常状態で実行され得る。
本発明の好ましい態様において、マウスマクロファージは、10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及び100ng/ml M-CSFを含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)又はイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で6日間分化した骨髄細胞から得られる。再生バイオリアクタを生成して、マクロファージを腫瘍馴化により「教育する」ために、分化した細胞は、好ましくは、CTM及びD-MEMを、好ましくは1:1の比率で含有する培地中で培養され、そして低酸素条件(例えば、5～20%O2、好ましくは1%O2)の下で6～96時間、好ましくは18時間培養される。ヒトマクロファージは、好ましくは、循環単球に由来する。(循環)単球は、好ましくは、CD14+単球の繰り返される勾配遠心分離(例えば、Lympholyte、Cederlane社、#CL5020、及びPercoll、Cytiva社、#17089101)及び/又は免疫磁気富化(例えばMilteniy Biotec社)によって、末梢血から単離される。得られた単球は、好ましくは、6時間～15日間、好ましくは7日間、20～50%、好ましくは30%CTM入りの、10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及び100ng/ml M-CSFを含有するRPMI 1640培地中でインビトロ培養される。単球培養は、低酸素条件(例えば、0.5～20%O2、好ましくは1%O2)で、7日の培養期間全体、又は最後の6～96時間、好ましくは最後の18時間インキュベートされ得る。CTMは、好ましくは、腫瘍細胞株、腫瘍外植片、若しくは固形腫瘍から、又は分離且つプレーティングされたインビトロ腫瘍の摘出物から、約6時間～20日間、好ましくは12～72時間生成される。
好ましくは本発明の細胞は、好ましくは血液由来のCD14+単球に由来する、単球によって由来する。一実施形態において、本発明の細胞は、血液由来CD14+単球を、腫瘍馴化培地を含む培養培地により、例えば70%培養培地(好ましくは、RPMI+10%FBS+100ng/ml M-CSF)及び30%腫瘍馴化培地によりインビトロ培養することによって得られる。好ましくは、培養は、酸素正常状態で1～15日間、好ましくは6日間に続いて、低酸素の6時間～5日間、好ましくは18～24時間である。好ましくは腫瘍馴化培地は、好ましくは約6時間～20日間、好ましくは12～72時間、分離且つインビトロプレーティングされた腫瘍の腫瘍株又は摘出物の上清から得られる。
好ましくは本発明の細胞は、例えば、好ましくはdT-Tomato雄マウス骨髄に由来する骨髄から単離した、新しい単球に由来する。一実施形態において、本発明の細胞は、好ましくは37℃、5%CO2の、酸素正常状態条件で1～15日間、好ましくは6日間、好ましくは懸垂での、好ましくは10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びマウスマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が補充された、細胞培養培地(例えばIMDM)中での培養によって得られる。続いて、培地は、好ましくは、50%腫瘍上清(例えば、固形線維肉腫及び神経膠腫外植片の培養から得られ、そこから腫瘍リッチ上清を選択した)及び50%IMDMからなる培地で改変されて、培養物は、低酸素条件(1%O2)の下で6～72時間、好ましくは18時間維持される。
本方法において、低酸素条件は、CTMとの全インキュベーションに、又はインキュベーションの一部(例えば6～96時間、好ましくは18時間)に施され得る。
好ましくは、本発明の方法は、更なる工程(腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地とのインキュベーションと付随して、又はインキュベーションの前若しくは後に実行され得る)を含み、単球は、例えばM-CSFと培養することによって、マクロファージに向けて分化するように誘導される。
したがって、本発明はまた、生体サンプル、例えば血液サンプルから単離した単球、好ましくはCD14+に由来するマクロファージの集団の表現型変化及び/又は機能変化を誘導するインビトロ又はエクスビボ方法であって、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地中での前記集団のインキュベーションを含み、インキュベーションが、低酸素条件下で起こり、前記インキュベーションが、集団の単核食細胞の表現型変化及び/又は機能変化を誘導する、方法を提供する。
表現型変化及び/又は機能変化と共に誘導される単核食細胞は、好ましくはマクロファージである。
本発明の方法によって入手可能なマクロファージ若しくは細胞、又は本発明のマクロファージ若しくは細胞は、好ましくは、実際、Table 1(表1)、Table 2(表2)、Table 3(表3)、Table 5(表5)、及び/又はTable(表6)に示される1つ又は複数の遺伝子の発現によって特徴付けられ、表は、THEM細胞内で上方制御される遺伝子を示す。
本発明の方法によって入手可能なマクロファージ若しくは細胞、又は本発明のマクロファージ(又は細胞)は、好ましくは、Table 4(表4)に示される1つ又は複数の遺伝子の低い発現/発現なしによって特徴付けられ、これらは、THEM細胞内で発現されないか、若しくは非常に低く発現される遺伝子、及び/又はALOX15、CCL8、及びCCL26の1つ又は複数の遺伝子を報告する。
本発明の方法によって入手可能なマクロファージ(又は細胞)又は本発明のマクロファージ(又は細胞)は、好ましくは、Table 2(表2)に示される1つ又は複数の分子の分泌によって特徴付けられる。
これらの表現型変化及び/又は機能変化を観察、検出、且つ測定する方法は、当該技術において知られており、そして本明細書中に記載されている。
例えば、遺伝子発現プロファイルは、cDNA又はオリゴヌクレオチドのマイクロアレイ分析、ノーザンブロット、RT-PCR、配列決定その他を用いて、RNAレベルにて評価することができる。
タンパク質発現は、例えば、イムノブロッティング、免疫組織化学、タンパク質マイクロアレイその他を用いて測定することができる。
また、当該技術において容易に知られ、且つ用いられる細胞及び動物モデルに基づく種々の試験が用いられ得る。
本発明の組成物の細胞は、患者自身(したがって、組成物は、自己由来の細胞を含有する)に、又はドナー(ゆえに、組成物は、同種異系細胞を含有する)に由来し得る。
同種異系細胞について、ドナーと、細胞を受ける患者との間で、HLA適合性及びマッチングが必要とされる。
本発明の文脈において、「腫瘍上清」は、好ましくは、腫瘍由来の細胞がインビトロ培養される培地を示しており、用語「腫瘍リッチ上清」、「腫瘍によって馴化した培地」、「腫瘍培養物又は外植片から放出される因子」を含む。腫瘍上清は、好ましくは、固形腫瘍、例えば線維肉腫、若しくは腫瘍外植片、例えば神経膠腫の、又は、好ましくは分離且つインビトロ培養された、腫瘍細胞株若しくは腫瘍摘出物の培養物から得られる。培養は、好ましくは、6時間～20日間、好ましくは12～72時間実行される。
本発明の文脈において「酸素正常状態」は、好ましくは、正常な大気圧(21%、160mmHg)での空気中の酸素(O2)のレベルを示し、例えば、好ましくは37℃の温度での、5%CO2の存在を示す。
本発明の文脈において、「低酸素」又は「低酸素条件」は、好ましくは、正常な大気圧(21%、160mmHg)の下での空気中の酸素(O2)のレベルを示し、例えば、0.5～20%O2、好ましくは1%O2の存在を示す。
本発明の文脈において、M2は、選択的活性化マクロファージ、以前に記載される高レベルのCD206、CD163、及びArg1遺伝子を発現する分極化したマウスマクロファージ、又は以前に記載される、CD206、CD163、CD86、TREM2、IL1RN、IL10、STAT3、STAT6、fabp4、sphk1、HOMOX1、IRF4、PPAR-CCL22を高いレベルで発現し、そしてCCR7、IL2RA、及びCXCL11を非常に低いレベルで発現する/発現しないヒトマクロファージと定義され得る(11、12)。
本発明の文脈において、TCMは、CTMと(低酸素なしで)インキュベートしたマウス又はヒトマクロファージと定義され得、TGFBI、DAB2、FUCA1、CYP1B1、MAFB、CCL2を高いレベルで発現し、そしてMT2A及びMTFP1を非常に低いレベルで発現する/発現しない。
本発明の文脈において、M0は、分化非分極化(differentiated not polarized)マクロファージと定義され得、以前に記載される(13)ように、NINJ1、F13A1、SCARB1及びSTAB1、AOAH、TLR7、A2M、FNBP1、CD209、SH3KBP1、並びにITSN1を高いレベルで発現する。
本発明の文脈において、THEMは、本発明の方法によって得られる細胞、又は本発明の細胞について開示される本明細書中の表現型若しくは機能、又は表現型変化及び/若しくは機能変化の少なくとも1つによって特徴付けられる細胞と定義され得る。
本発明の好ましい態様において、方法は更に、低酸素条件下でのインキュベーション前に、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地中での集団のインキュベーションを含む。これは、例えば、細胞又は細胞の集団が、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地と酸素正常状態でしばらくの間、例えば1～15日間、好ましくは6日間インキュベートされることを意味する。細胞又は細胞の集団は、その後、低酸素条件下で、例えば6時間～15日間、好ましくは18～96時間維持又は培養される。
培養培地は好ましくは、腫瘍上清を含み、前記上清は、好ましくは腫瘍固形外植片又は腫瘍細胞株の培養物から、好ましくは線維肉腫又は神経膠腫から得られ、或いは好ましくは、好ましくは腫瘍細胞株、腫瘍外植片、若しくは固形腫瘍から、又は分離且つプレーティングされたインビトロ腫瘍の摘出物から、好ましくは約6時間～20日間、より好ましくは約12～72時間生成された腫瘍(CTM)で馴化された培地である。
本発明の文脈において、用語「とインキュベートされる」は好ましくは、細胞が培養されるか、増殖するか、又は処理されることを意味する。本明細書中で用いられる用語「治療的に有効な量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な、必須の投薬量及び時間の量を指す。本発明の薬剤の治療的に有効な量は、個人の疾患状態、年齢、性別、及び体重等の要因、並びに本発明の薬剤の、個人において所望の応答を誘発する能力に従って、変動し得る。本発明の薬剤についての有効な投薬量及び投与計画は、処置されることとなる疾患又は症状次第であり、当業者によって決定され得る。当該技術において通常の技術を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効な量を容易に決定且つ処方し得る。例えば、医師であれば、所望の治療効果を達成し、且つ所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増大させるのに必要とされるよりも低いレベルにて、医薬組成物に使用される本発明の薬剤の投与を始めることができる。一般に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与計画に従って治療効果をもたらすのに有効な最も低い用量である化合物の量となろう。そのような有効量は、通常、上述の要因によって決まることとなる。特に好ましい実施形態において、本発明の細胞は、場合によっては補助剤入りの、本発明の方法に特に適した特定の増殖培地中で増殖する。そのような増殖培地は、単球の増殖、分化、及び/又は機能活性化を調節する造血成長因子、例えばM-CSFを含み得る。
本発明の方法は、特定の特性を有する細胞を産出し、これもまた本明細書中に記載される。ゆえに、本発明の方法によって入手可能な細胞は、本明細書中に記載される細胞であることが特に好ましい。
また、本発明は、マクロファージに関する。また、本発明のマクロファージは、「本発明の細胞」又は単に「細胞」と称され得る。本発明の細胞又はマクロファージは、好ましくは、(a)以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A遺伝子の少なくとも1つを発現し、且つ/又は(b)以下の遺伝子:PLXNA2、HSPH1、CYCS、TIGARの少なくとも1つを発現しないことを特徴とする。好ましくは、細胞は、単離した細胞である。より好ましくは、細胞は、CD14+単球(好ましくは血液に由来する)に由来する。好ましくは、細胞は、霊長類細胞である。最も好ましくは、細胞はヒト細胞である。
ヒト細胞の場合、ヒト細胞は、Table 3(表3)及び/又はTable 6 (表6)に開示される遺伝子の少なくとも1つ、好ましくは2つの少なくともあらゆる組合せ、最も好ましくは全てを発現することが好ましい。更に、ヒト細胞の場合、細胞は、Table 4(表4)に開示される遺伝子の少なくとも1つ、好ましくは2つの少なくともあらゆる組合せ、最も好ましくは全てを提示も発現もしないことが好ましい。
好ましい実施形態において、細胞はマクロファージである。
本発明に従う細胞は、本発明に従う方法によって入手可能な細胞である。
また、本発明は、細胞の集団に関する。集団は、本発明に従う少なくとも1つの細胞を含む。より好ましくは、細胞集団は、多数の細胞を含み、これらの少なくとも70%(細胞数)、好ましくは80%(細胞数)、好ましくは少なくとも90%(細胞数)、より好ましくは少なくとも95%、例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%(それぞれ細胞数)が、本発明に従う細胞である。また、第2の態様の全ての好ましい実施形態は、本発明の第3の態様に当て嵌まる。細胞の総数の好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%、最も好ましくは100%が、本明細書中で定義される細胞であり、場合によっては、1つ又は複数が、好ましい実施形態において、単独又は組合せである。細胞集団は、好ましくは、CXCR4及び/若しくはCYTIP及び/若しくはSLC2A3及び/若しくはMT2A遺伝子の発現について陽性であり、且つ/又はPLXNA2及び/若しくはHSPH1及び/若しくはCYCS及び/若しくはTIGARの発現について陰性である。細胞集団は、好ましくは、Table 1(表1)及び/又はTable 2(表2)及び/又はTable 3(表3)及び/又はTable 4(表4)及び/又はTable 6(表6)の遺伝子の少なくとも1つの発現について陽性である。細胞集団は、好ましくは、Table 4(表4)の遺伝子の少なくとも1つの発現について陰性である。
好ましくは、集団は、細胞の単離集団である。
用語「同種異系」は、本明細書中で、同じ種の異なる個人に由来するあらゆるものを説明するのに用いられる。2人以上の個人は、1つ又は複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
用語「自己由来」は、本明細書中で、同じ対象に由来するあらゆるものを説明するのに用いられる。一例として、「自己由来細胞」は、同じ対象に由来する細胞を指す。自己由来細胞の移植は、時折、普通であれば拒絶となる免疫性障害を克服するので、有利であると考えられる。
用語「細胞集団」及び「細胞の集団」は、互換的に、複数の細胞のアンサンブルを指す。最も狭い実施形態において、細胞集団は、2つの細胞、より典型的には多数の細胞を含む。
本明細書中で用いられる用語「増殖させる(expand)」又は、「増殖(expanding)」は、一般に、細胞、又は細胞の集団の増殖(proliferation)を指す。典型的には、本発明の文脈内の増殖は、インビトロ又はエクスビボで起こる。典型的には、増殖は、細胞の単離後の活動又はプロセスである。典型的には、増殖の間、細胞の総数は増大する。また、用語「培養」を含み得る。
本明細書中で用いられる用語「発現する」、「発現された」、「発現」、及び「遺伝子発現」等は、機能遺伝子産物の合成における遺伝子由来の情報の使用に関する。遺伝子発現は、少なくとも転写を含み、そして場合によっては、RNA編集、翻訳、及び翻訳後修飾を含むオープンリストから場合によって選択される、1つ又は複数の追加の特徴を含む。遺伝子発現が確定されると、発現生成物、例えば、非編集若しくは編集RNA、又は更にコードされたタンパク質の存在が確定される。特定の遺伝子又は遺伝子座と関連して用いられる上述の用語は、当該遺伝子又は遺伝子座からの遺伝情報の発現を明示することを意図している;例えば、CXCR4が発現されると言われる場合、CXCR4遺伝子が発現されることを言うことを意味する。
低いレベルの発現について、これは好ましくは、ハウスキーピング遺伝子、例えばベータ-アクチンの発現レベルよりも少なくとも5倍低い、意図される遺伝子発現レベルである。
また、用語「発現しない」は、低いレベルで発現する/発現しないという用語を含み得、又は特定の遺伝子が、例えばM2細胞と比較して、下方制御されることを意味し得る。
特定の態様において、用語「低いレベルで発現する/発現しない」は、「発現しない」と同じ意味を有し得る。
また、用語「発現する」は、特定の遺伝子が、例えばM2細胞と比較して、上方制御されることを意味する。
「単離した」が意味するのは、通常、天然の状態で随伴する構成要素が実質的に、又は本質的にない材料である。例えば、本明細書中で用いられる「単離した細胞」は、天然に存在する状態で細胞を囲む細胞環境及び細胞外環境、例えば組織又は流体から精製された細胞を指す。代わりの説明では、本明細書中で用いられる「単離した細胞」等は、その天然の細胞環境からの、そして細胞が通常存在する組織の他の構成要素との結合からの細胞のインビトロ単離及び/又は精製を指す。文脈がそうでないと述べていない限り、「単離した細胞」は、必ずしも、他のいかなる細胞も全くない単一の細胞である必要はない;対照的に、2つ以上の細胞、例えば多数の細胞の集団ですら、細胞の前記集団が、通常、そのような細胞の集団を天然の状態で随伴する構成要素が実質的に、又は本質的にないという意味で単離されている場合に、「単離した」と称され得る。これに従って、本明細書中で用いられる文言「単離した」、「単離すること」の定義は、「単離した」材料、例えば単離した細胞を得るための動作を説明する動詞である。
本明細書中で用いられる用語「培地」は、細胞、特に哺乳動物細胞の培養に適した水性混合物を指すことを意味する。水性混合物は、典型的には溶液であるが、懸濁液及びコロイド混合液も含まれる。培地は、典型的には液体であるが、一部の培地は、例えば保存目的で、一時的に凍結することもできる;いずれにせよ、培地は、液体である場合、細胞培養に用いられる。培地は、定義された水性混合物である「基本培地」、又は基本培地及び少なくとも1つの補助剤を含む水性混合物であり、そして通常、細胞の生存能力をエクスビボで、そして場合によっては細胞の増殖を(エクスビボでも)持続させる能力を有する「増殖培地」であり得る。基本培地は、好ましくは既知組成培地である。増殖培地は、好ましくは、基本培地(典型的には85vol/vol%～99.5vol/vol%)プラス少なくとも1つのヒト由来であるか、動物由来であるか、又は植物由来の補助剤、例えば血清、細胞可溶化物を含む。
細胞と関連して本明細書中で用いられる場合の用語「分泌する」又は「放出する」は、通常、細胞から外部環境中に外部化されるあらゆる物質を指す。前記物質は、典型的に、細胞によって生成且つ/又は修飾されているが、これは必要条件でない。例えば、一部の細胞は、タンパク質及び/若しくは調節分子、例えば、ホルモン、プロスタグランジン、及び神経伝達物質、並びに/又は微小胞及び/又はエキソソームを、それらのそれぞれの外部環境中に分泌する。例えば、細胞によって産生されるプロスタグランジンは、細胞の環境中に外部化され得る。本明細書中で用いられる前記用語は、文脈がそうでないと述べていない限り、インビボ分泌/インビボ環境にも、インビトロ分泌/インビトロ環境にも限定されない。
追加の工程は、場合によっては、しかし好ましくは、特に、以下で詳細に説明される増殖工程で構成される。
本発明の方法に従う方法の第1の工程は、単核食細胞(の集団)を生体サンプルから単離させることを特徴とする工程(a)である。
ゆえに、本発明に従えば、細胞は好ましくは、血液又は骨髄から単離される。
本発明に従う増殖培地又は培養培地は、典型的に、基本培地及び1つ又は複数の補助剤を含むこととなる。広義には、用いられる基本培地の種類は、特に限定されない。
好ましくは、基本培地は、既知組成である。既知組成基本培地は、化学構成要素の全てが知られている、ヒト細胞又は動物細胞のインビトロ細胞培養に適した基本培地であり、特に、既知組成培地は、構成要素の全てが特定されていなければならず、且つそれらの正確な濃度が知られていなければならないことを必要とする。したがって、既知組成培地は、動物由来の構成要素が完全にない必要があり、そして血清又は血清由来のタンパク質、例えば、胎仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、又はヒト血清アルブミンを含有し得ない。既知組成基本培地は、組換えタンパク質及び/又はホルモンのみを含まない。これを達成するために、既知組成培地は、ヒト源又は動物源由来の構成要素、例えばタンパク質及び/又は成長因子を含まない;特に、ヒト源又は動物源由来のアルブミンも、ヒト源又は動物源由来の成長因子も含まない。好ましくは、通常、非ヒト、非動物源、例えば、植物細胞及び細菌に由来する組換えアルブミン及び/若しくは組換え成長因子、並びに/又は合成化学物質、例えばポリビニルアルコールを含む。
基本培地は、例えば、以下に制限されないが、イーグル最小必須培地(EMEM)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、アルファ-MEM、RPMI-1640、IMDMその他を含むリストから選択され得る。所望されるならば、1つ又は複数の血清置換成分が、これらの培地に加えられる。これによって、無血清基本培地が得られる。
細胞は、標準的な手順に従って凍結され得、例えば液体窒素中で急速凍結され得る。そのような凍結した細胞を解凍して、例えば、脱解凍後に更なる継代培養にかけることが十分に可能である。凍結は、バッチ全体として、又はアリコートで起こり得る。一実施形態において、細胞は、マクロファージ細胞内で通常見出されない少なくとも1つの特徴(構造的又は機能的)によって特徴付けられる。例えば、そのような特徴は、本発明の細胞が入手可能である方法に特有の特徴であり得る。そのような構造的特徴又は機能的特徴は、本開示に明示的に記載される特徴から、且つ/又は本開示に明示的に記載されない特徴から選択され得るが、本発明の細胞に固有であり、例えば本発明の方法から入手可能な細胞に固有である。本発明に従う細胞は、培養によってインビトロで増殖させることができる。これによって、由来細胞を得ることができる。また、由来細胞は、本発明の細胞を定義する特許請求される特徴に従う限り、本発明の細胞である。ゆえに、本発明の細胞の特性に起因して、本発明は、細胞の複数の世代をカバーすることができる。複数の世代は、本明細書中に記載される増殖によって入手可能である。実際に、本発明に従う細胞の特定の実施形態は、細胞のエクスビボ増殖を含む。ゆえに、細胞は単離されるが、後代を、同じであるか、又は類似した細胞に伝えるので、細胞集団を生成することができる。
一般に、本発明の細胞は、種々の組織、例えば骨髄、及び流体、例えば血液に起源し得る。好ましくは、本発明に従う細胞は、骨髄又は血液に起源又は由来する。
一実施形態において、本発明の細胞は、新しく単離した細胞である。新しく単離した細胞は、これが起源する組織からの単離によって、例えば本明細書中に記載される方法によって直接得られた細胞である。しかしながら、より好ましくは、本発明の細胞は、最も典型的にはインビトロ増殖又は培養によって、新しく単離した細胞に由来する細胞である。
本発明に従う細胞は、遺伝子発現パターンによって特徴付けられ得る。本明細書中で用いられる「遺伝子発現パターン」は、少なくとも1つの遺伝子が発現されるか、発現されないか、又は事情次第で、特定のレベルにて発現されることを意味する。ゆえに、この特定の遺伝子が発現されるか、発現されないか、又は特定のレベルにて発現されるという事実は、例えばリファレンス細胞からの識別の目的で、本発明に従う細胞を特徴付ける。同じことは、複数の遺伝子、例えば、2つの遺伝子、3つの遺伝子、4つの遺伝子、5つの遺伝子、6つの遺伝子、7つの遺伝子、8つの遺伝子、9つの遺伝子、10個の遺伝子その他の発現に当て嵌まる。本発明の細胞が、1つ又は複数の遺伝子の発現によって特徴付けられる場合、その文脈において述べられていない他のあらゆる遺伝子の発現について具体的な記載をしていることは所望されない。実例として、本発明の細胞がCXCR4を発現すると本明細書中で言われる場合はいつでも、このことは、文脈がそうでないと述べていない限り、特定の他のあらゆる遺伝子もまた発現されるか、発現されないか、又は特定のレベルにて発現されるという記載としてとられるべきでない。
一般に、遺伝子の発現は、核酸レベル及びタンパク質レベルの双方について、種々の方法によって試験することができる。遺伝子発現は、分子生物学、生化学、及び細胞生物学において比較的一般的に試験することができ、そしてそれらについて知られている、又は適しているあらゆる方法が、本発明の文脈において用いられ得る。いくつかの方法が以下に記載されている。遺伝子発現に関する方法は、トランスクリプトーム法とも称され得る。それゆえに、細胞の遺伝子発現プロファイルは、トランスクリプトームとも称され得る。一実施形態において、本発明の細胞は、その遺伝子発現プロファイルによって特徴付けられる。
異なる用語を用いて、遺伝子の発現が分析されていることを記載することができる:例えば、発現は、試験される、分析される、評価される、アッセイされる、測定される、判定される等と言うことができる。これらの用語は、定性的判定、すなわち、それぞれの遺伝子が発現されているか否かという疑問、及び定量的判定、すなわち、どのレベルにてそれぞれの遺伝子が発現されるかの疑問の双方を含む。
典型的には、遺伝子発現の判定のために、1つの細胞又は多数の細胞(これが好ましい)のサンプルが、細胞集団からとられてから、当該サンプルにおいて遺伝子発現が分析され、これによって当該サンプル中の細胞は、事情次第で破壊されてもされなくてもよい。本発明に従う細胞集団は、通常同質である(その中に含まれる実質的に全ての個々の細胞が、非常に似ているか類似していることを意味する)ので、細胞集団からとられたサンプル(代表サンプル)内に含まれる細胞における遺伝子発現に関する発見は、通常、文脈がそうでないと述べていない限り、且つ/又は細胞集団が、実質的には同質であるようでない限り、当該集団内の残りの細胞にも当て嵌まるであろう。
それぞれのあらゆる遺伝子の発現の判定は、無向の判定(すなわち、遺伝子発現が、1つの遺伝子に集中することなく一般にアッセイされる(例えば、マイクロアレイ等の広いアプローチによる))であってもよいし、有向の判定(それぞれの遺伝子が発現されるかが特異的に試験される)であってもよい。特に2番目の場合には、それぞれの遺伝子は、「注目する遺伝子」であるとも言われ得る。
いくつかのトランスクリプトーム技術を用いて、遺伝子発現分析のためのデータを生成することができる。例えば、DNAマイクロアレイは、以前に特定された標的遺伝子の相対活性を測定する。RNA-Seqのような配列ベースの技術が、発現レベルに加えて、遺伝子の配列に関する情報を提供する。
本発明の細胞は、1つ若しくは複数のマーカー又は遺伝子を発現し得、そして1つ若しくは複数のマーカー又は遺伝子の発現を欠き得る。特定の場合には、Table 1(表1)及び/若しくはTable 2(表2)及び/若しくはTable 3(表3)及び/若しくはTable 5(表5)及び/若しくはTable 6(表6)、並びにそれらの組合せから選択される少なくとも1つのマーカー若しくは遺伝子を発現し;且つ/又はTable 4(表4)及びそれらの組合せから選択される少なくとも1つのマーカー若しくは遺伝子の発現を欠き得る。
本明細書中又は表中で提供されるNCBI又はEnsemblリファレンスは、例示であり、リファレンスをそれらの配列に限定しない。実際に、本明細書中で示される各遺伝子/マーカー/タンパク質は、その受託番号(すなわち、Ensembl又はNCBIの遺伝子ID)によって特徴付けられ得るが、全てのアイソフォーム、バリアント、類似体、オーソログ、断片、誘導体も含む。
本開示の文脈において、本明細書中で開示される遺伝子への言及は、当該分子の全ての形態への、そしてそれらの機能断片、変異体、又はバリアントへの言及である。加えて、mRNA又は当該分子の異性体若しくは多型形態の選択的スプライシングから生じ得るあらゆるアイソフォームへの言及である。
「表現型プロファイル」又は「表現型」への言及は、対象マーカーをコードする遺伝子の転写及び/又はそこから変換された発現産物の細胞表面発現の有無への言及として理解されるべきである。特許請求される細胞集団の範囲内に入るほとんどの細胞が、対象マーカーの有無によって細胞表面固定発現産物として特徴付けられることとなるが、定義される集団内に入る一部の細胞は、最初に、例えば、所与のマーカーの転写が上方制御されたが、細胞表面固定発現産物がまだ生じ得ない場合に、トランスクリプトームレベルにてのみ変化を示す場合があると認識されるべきである。一般に、新しい分化ステージに進む細胞が、発現産物のレベルへの変化の文脈においてまだはっきりしていない遺伝子発現変化を一過的に示すこととなる。しかしながら、当該細胞はそれでもやはり、特許請求される細胞集団の範囲内に入る。
「馴化培地」は、例えば、特定の細胞又は細胞の集団が培養されてから除去された培地である。細胞が培地中で培養される場合、細胞因子を分泌し得、これは、栄養支持を他の細胞に提供することができる。栄養因子は、細胞の生存、成長、増殖、及び/若しくは成熟を促進するか、若しくは少なくとも支持するか、又は細胞の活性の増大を刺激する物質である。そのような栄養因子として、以下に限定されないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス(ECM)、タンパク質、ベシクル、抗体、及び顆粒が挙げられる。細胞因子を含有する培地は、馴化培地である。現在の組成物又は方法の一部の実施形態において、栄養因子が用いられる。
本開示の組成物又は方法のいずれも、細胞カプセル化を含むことが意図されている。一部の実施形態において、細胞は、個々にカプセル化されている。一部の実施形態において、多くの細胞は、同じ膜内にカプセル化されている。細胞が移植後に除去されることとなる一部の実施形態において、例えば単一の膜内に、多くの細胞をカプセル化する比較的大きなサイズ構造が、取り出しに便利な手段を提供するのに使用され得る。多種多様な材料が、種々の実施形態において、幹細胞のマイクロカプセル化に用いられ得る。そのような材料の例として、ポリマーカプセル、アルギネート-ポリ-F-リシン-アルギネートマイクロカプセル、バリウムポリ-F-リシンアルギネートカプセル、バリウムアルギネートカプセル、ポリアクリロニトリル/ポリ塩化ビニル(PAN/PVC)中空繊維、及びポリエーテルスルホン(PES)中空繊維が挙げられる。幹細胞の投与に用いられ得る細胞のマイクロカプセル化の技術が当業者に知られており、例えば、Chang, P.ら、1999年;Matthew, H. W.ら、1991年;Yanagi, K.ら、1989年;Cai Z. H.ら、1988年;Chang, T. M.、1992年、及び米国特許第5,639,275号(例えば、生物学的に活性な分子を安定して発現する細胞の長期間の維持用の生体適合性カプセルを記載している)に記載されている。カプセル化の追加の方法が、欧州特許出願公開第301,777号、並びに米国特許第4,353,888号、米国特許第4,744,933号、米国特許第4,749,620号、米国特許第4,814,274号、米国特許第5,084,350号、米国特許第5,089,272号、米国特許第5,578,442号、米国特許第5,639,275号、及び米国特許第5,676,943号にある。前述のものは全て、細胞のカプセル化に関連する部分が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示の特定の実施形態は、本発明の細胞を、ポリマー、例えば生体ポリマー又は合成ポリマー中に組み込む。生体ポリマーの例として、以下に限定されないが、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、コラーゲン、及びプロテオグリカンが挙げられる。他の因子、例えばサイトカインもまた、ポリマー中に組み込まれ得る。本開示の他の実施形態において、細胞が、三次元ゲルの隙間に組み込まれ得る。大きなポリマー又はゲルが、典型的に、外科的に埋め込まれることとなる。十分小さな粒子又は繊維に製剤化することができるポリマー又はゲルを、他の共通の、より便利な非外科的経路によって投与することができる。
本開示の一部の実施形態において、標準的な増殖条件が利用される。本明細書中で用いられる用語「標準的な増殖条件」は、5%CO2を含む標準大気中で、例えば37℃にて、細胞を培養することを指す。相対湿度は、例えば約100%にて、維持される。このような条件は培養するのに有用である一方、そのような条件は、細胞を培養するのに、例えば、温度、CO2、相対湿度、酸素、増殖培地等を変えるのに、当該技術において利用可能なオプションを認識する当業者によって変えることができると理解されるべきである。
実施形態として、本発明の細胞、又はそれに由来する生成物を含む、医薬、治療組成物、製剤、調製品、及び再生医療における使用のための関連方法が挙げられる。
組成物は、例えば、溶液、懸濁液、膜の形態をとり、そして約10%～約95%、又は約25%～約70%の細胞又はそれに由来する生成物を含有する。実施形態において、組成物は、いくつかの適切な方法のいずれかによっても投与される。組成物は、例えば静脈内及び動脈内によって全身的に、例えば髄腔内、脳室内によって、又はOmmayaリザーバーによって局所的に投与され得る。他の手段として、経皮的、経直腸的、経膣的、舌下的、及び鼻腔内が挙げられる。
組成物は、適合するように、そして治療的に有効な、容認でき、且つ安全な量で投与される。投与される量は、処置されることとなる対象次第である。投与される必要がある細胞の正確な量は、実務者の判断次第である。
多くの例において、多くとも、又は少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10回以上(又はその中で導き出せるあらゆる範囲)の複数回の投与があることが所望され得る。投与は、1日から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週以上(又はその中で導き出せるあらゆる範囲)の複数週の間隔に及び得る。投与の経過後に、例えば、徴候、痛み、気分、挙動、又は破局視の評価が続き得る。
患者には、本明細書中に記載される組成物又は化合物の組合せが、少なくとも、又は多くとも約0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500mg/kg/日(又はその中で導き出せるあらゆる範囲)の量で投与され得る。
本発明の細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒト由来の細胞である。ゆえに、一実施形態において、本発明の細胞は、哺乳動物の細胞である。したがって、特に明記しない限り、具体的な遺伝子への全ての指摘は、それぞれの哺乳動物の遺伝子を意味する。
より好ましくは、本発明の細胞は、霊長類由来の、より詳細にはヒト由来の細胞である。ゆえに、より好ましくは、本発明の細胞は、ヒト細胞である。したがって、その実施形態において、特定の遺伝子への全ての指摘は、それぞれのヒト遺伝子を意味する。
好ましくは、本発明の細胞は、遺伝子導入細胞でない。したがって、その実施形態において、特定の遺伝子の発現に関する全ての指摘は、それぞれの遺伝子がゲノムから発現されることを意味し、それぞれの遺伝子はコードされており、より詳細には、それぞれの遺伝子は、メンデル性遺伝によってコードされている。しかしながら、一部の他の実施形態において、本発明の細胞は、遺伝子導入細胞である。
この文脈における同種は、実質的に全ての細胞が非常に似ているか、又は類似していることを意味する。遺伝子の発現は、例えば典型的には、遺伝子産物、例えば特定のメッセンジャーRNA(mRNA)又はその前駆体若しくは分解産物の存在、及び必要であれば、又は所望されるならば、レベルの判定を含む分子生物学方法によって、直接的に試験され得る;或いはこれ以外にも、遺伝子の発現は、例えば典型的には、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質、例えば特定の細胞表面タンパク質又はその前駆体若しくは分解産物の存在、及び必要であれば、又は所望されるならば、レベルの判定を含む生化学方法によって、間接的に試験され得る。本発明の細胞の特性評価に適した表面タンパク質は、特に、分化クラスター(CD)を含む。
また、遺伝子の発現を試験するための知られているあらゆる方法が、本発明に用いられ得る。適切な方法として、以下に限定されないが、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応、そのようなPCR、例えば好ましくは、RT-qPCRが挙げられる定量的PCR(qPCR)、転写産物の配列決定、あらゆる種類のトランスクリプトーム分析その他を含むリストから選択されるものが挙げられる。核酸レベルについて、好ましい方法として、マイクロアレイ及びqPCRが挙げられる。
一実施形態において、遺伝子発現は、遺伝子発現プロファイリングによって判定される。分子生物学の分野において、遺伝子発現プロファイリングは、細胞の遺伝子発現のグローバルピクチャーを作成するための、遺伝子のいくつかの、多くの場合何千もの、典型的には全ての発現の一度での測定を指す。例えば、遺伝子発現プロファイリングは、細胞のグローバルピクチャーを作成するための、遺伝子のいくつかの、必須ではないが典型的には何千もの発現の一度での測定である。遺伝子発現プロファイリングは、例えば、本発明の細胞と他の細胞とを見分けることができる。ゲノム全体の発現を同時に、すなわち、特定の細胞内に存在する遺伝子毎に判定することすら可能である。このソートの多くの実験は、ゲノム全体を同時に、すなわち、特定の細胞内に存在する遺伝子毎に測定する。いくつかのトランスクリプトミクス技術を用いて、分析するのに必須のデータを生成することができる。マイクロアレイは、本発明の一部の実施形態において、好ましい。
次世代シーケンシング(NGS)のような高スループット配列決定が挙げられる配列ベースの技術を用いて、本発明において遺伝子発現を判定することができる。例えば、全トランスクリプトームショットガン配列決定とも呼ばれるRNA-Seq(RNA配列決定)は、遺伝子の配列に関する情報を、その発現レベルに加えて提供することができる。RNA-Seqは、次世代シーケンシング(NGS)を用いて、所与の時点での生体サンプルにおけるRNAの存在及び量を明らかにする。一実施形態において、遺伝子発現は、RNA-Seq又はPCR及びそのあらゆるバリエーションのような配列ベースの技術により判定される。
例えば、マイクロアレイ等による遺伝子発現プロファイリングによって明らかにされる、一部又は全ての遺伝子の発現は、定量的RT PCR(qRT PCR)によって確認することができる。
一般的に知られている定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)としても知られている)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくラボ方法であり、核酸の量を判定するのに適している。特に、転写産物(例えばmRNA)の量を判定するための最良の方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)である。他のRNA定量化方法、例えばノーザンブロットと比較して、qRT-PCRは、通常、RNAレベルの検出のための最も強力で、感度が高く、且つ定量的なアッセイであると考えられているので、本発明において好ましい。また、qRT-PCRは、例えば蛍光一次又は二次抗体による免疫装飾及びフローサイトメトリーによる、免疫検出等の、タンパク質レベルでの遺伝子発現産物の間接的な判定よりも、遺伝子発現の判定について、ずっと感度が高い。qRT PCRは、典型的には、それぞれの核酸に特異的なプライマーを必要とする。しかしながら、その配列は通常、例えばヒト遺伝子についての、配列データベースを通して入手可能であるか、又はそのような情報に基づいて、当業者によって設計することができる。qRT-PCR用の市販のキット及び機械が入手可能であり、そして本発明に用いることができる。qRT PCRによる遺伝子発現の判定のための鋳型の役目を果たす核酸(「標的」とも称される)は、転写産物、典型的にはmRNAである。
好ましくは、本発明の細胞は、マクロファージに特有の少なくとも1つの遺伝子を発現する。本発明の細胞は、とりわけ、以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2Aの少なくとも1つを発現することを特徴とする。より好ましくは、前記少なくとも1つの遺伝子は、リファレンス細胞内での前記少なくとも1つの遺伝子対ベータ-アクチンの発現比率と関連する、ハウスキーピング遺伝子ベータ-アクチンと比較して、高いレベルにて発現され、又はM2マクロファージ内での発現レベルと比較して、上方制御される。
一実施形態において、遺伝子発現は、間接的に判定される、すなわち、一次転写産物、mRNA、又はその前駆体、又はその分解産物の判定によってではなく、更に下流側での特定の産物の判定によってである。典型的には、更に下流側での特定の産物は、mRNAによってコードされるタンパク質である;しかしながらこれは、他の特定のいずれかの産物、例えば特定の、例えば酵素的に活性なタンパク質の存在に特有である代謝物質であり得る。
好ましくは、タンパク質の存在が判定される。より好ましくは、細胞表面上のタンパク質の存在が判定される。言い換えると、タンパク質が細胞表面上に提示されるかが判定される。
細胞表面上で特定のタンパク質を提示する細胞は、例えば、免疫学的に活性な分子、例えば特異抗体及び他の免疫反応性分子によって分析することができる。「細胞表面」は、当該技術における標準的な意味に従って本明細書中で用いられるので、具体的に、タンパク質及び他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。タンパク質が、細胞の表面上に(前記細胞の表面に少なくとも部分的に位置するならば)提示されて、抗原結合分子、例えば細胞に加えられる抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である。一実施形態において、細胞の表面上に提示されるタンパク質は、抗体によって認識され得る細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。本発明の文脈における用語「細胞外部分」又は「エキソドメイン」は、分子、特にタンパク質の部分を意味し、これは、細胞の細胞外空間に向いており、好ましくは、例えば、細胞の外側に位置する抗体等の結合分子によって、前記細胞の外側からアクセス可能である。好ましくは、当該用語は、1つ又は複数の細胞外ループ若しくはドメイン又はその断片を指す。本明細書中で用いられている用語「部分」は、アミノ酸配列等の構造の連続要素又は不連続要素を指す。タンパク質配列の部分又は一部は、好ましくは、タンパク質を形成するアミノ酸配列の少なくとも5つ、特に少なくとも8つ、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも50個、又は少なくとも100個の連続アミノ酸及び/又は非連続アミノ酸を含む。
抗体又は他の免疫反応性分子によって検出可能なタンパク質は、抗原とも称され得る。一部の実施形態において、本発明の細胞は、1つ又は複数の特異性抗原を提示するか、又は提示しないことを特徴とし得る。本発明の文脈において、そのような抗原は、好ましくは、細胞の表面上に提示される。また、そのような抗原は、「表面抗原」とも称され得る。
その例が、Table 5(表5)に記載されている。
厳密な意味での文言「発現する」は、遺伝子が発現されることを意味するが、文言「発現する」はまた、前記遺伝子によってコードされるタンパク質、特に細胞表面タンパク質が、細胞上で提示されることを説明することを意味する。
本発明に従えば、抗原は、発現のレベルが検出限界を超えているならば、且つ/又は発現のレベルが、細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合を可能にするほど十分に高いならば、細胞上に提示されている。本発明に従えば、抗原は、発現のレベルが検出限界未満であるならば、且つ/又は発現のレベルが低過ぎて、細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合を許容しないならば、細胞上で発現されていないと言われる。好ましくは、細胞内で発現される抗原が、発現又は曝露される、すなわち、前記細胞の表面上に存在するので、細胞に加えられる抗体又は他の免疫反応性分子等の抗原特異的分子による結合に利用可能である。場合によっては、検出の一助となる二次分子、例えば、場合によっては標識されている二次抗体もまた加えられる。
抗体又は他の免疫反応性分子は、細胞上のエピトープを認識し得る。用語「エピトープ」は、分子、例えば抗原内の抗原決定基を、すなわち、免疫系によって認識される、すなわち結合される、例えば、抗体又は他の免疫反応性分子によって認識される分子の一部又は断片を指す。特定のいずれかの抗原に特異的なエピトープの検出により、通常、特定の抗原が、分析されている細胞上で発現されると結論を下すことが可能となる。
一実施形態において、本発明の細胞は、免疫表現型タイピングによって特徴付けられ得る。「免疫表現型タイピング」は、一般に、細胞が、細胞に加えられて抗原が細胞上で発現されるかを判定する抗原特異的分子、例えば抗体又は他の免疫反応性分子によって特徴付けられ得ることを意味する。免疫表現型タイピングとして、フローサイトメトリーが挙げられる種々の方法を用いるセルソーティングが挙げられる。
免疫表現型タイピングの好ましい方法は、フローサイトメトリー、特にFACSである。分析物、特に細胞表面タンパク質は、通常、抗体又は他の免疫反応性分子により認識される。抗体又は他の免疫反応性分子は、フルオロフォア標識されているそれ自体であるか、又はその目的のために加えられるフルオロフォア標識された二次抗体若しくは他の免疫反応性分子によって認識される。
本発明に従う細胞は、CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2Aの少なくとも1つを発現することを特徴とする。それらの発現は、好ましくは遺伝子発現レベルで、最も好ましくはRNAseqによって検出される。その例が、図22に示されている。
特定のいかなる理論によっても拘束されることを望むものではないが、CXCR4、CYTIP、SLC2A3、又はMT2Aが、細胞の走化能、細胞接着の調節、細胞代謝、及び抗酸化剤防御にとって重要であると考えられている。実施例に示されるように、本発明に従う細胞は、とりわけCXCR4、CYTIP、SLC2A3、及び/又はMT2Aの発現によって、M2細胞から見分けられる。ゆえに、本発明に従うCXCR4、CYTIP、SLC2A3、及び/又はMT2A発現細胞は、先行技術によって記載されるマクロファージと明らかに異なる。
しかしながら、本発明に従う細胞は、低いレベルのPLXNA2、HSPH1、CYCS、及び/又はTIGARを発現するか、又は発現しない。これらの遺伝子は、M2及び/又はTCM及び/又はM0マクロファージによって発現される。ゆえに、本発明の細胞は、M2マクロファージでもTCMマクロファージでもM0マクロファージでもない。
好ましくは、細胞は、マクロファージ細胞に特有の少なくとも1つの遺伝子を発現する。好ましくは、細胞は、その表面上に、マクロファージ細胞に特異的な少なくとも1つの表面マーカー、例えばCD45、CD68、CD11b、及びMHCIIを提示する。
好ましくは、本発明の細胞は、細胞生存、ニューロン細胞成長が挙げられる細胞成長、血管形成、細胞外マトリックスリモデリング、免疫細胞調節を促進することができる。例えば、炎症誘発性活性、抗炎症活性、免疫原性活性、食細胞活性、免疫寛容原性活性、組織治癒活性、遊走性活性、血管形成活性、抑制性活性、抗原提示活性若しくは食細胞活性、細胞外マトリックスリモデリング活性、細胞外マトリックス堆積活性、栄養活性、幹/前駆細胞自己再生、細胞増殖、細胞分化、細胞死の阻害、細胞生存、細胞分泌、成長/栄養因子分泌、軸索再生刺激活性、及び/又は代謝支援活性を示す。
本発明の細胞は、好ましくは、ヒト運動ニューロンに対する存在するインビトロニューロン再生機能及び/又はインビボニューロン再生機能を付与する。
また、本発明に従う細胞は、細胞が入手可能である方法によって特徴付けられ得る。これはおそらく、本発明に従う細胞が、以前に記載される方法(実施例参照)に従って得られる細胞と異なる特性を有するので、本発明に従う細胞を得る方法が、固有の特性を有する細胞を生成するからである。
一態様において、本発明は、細胞の集団(細胞集団)に関する。細胞集団は、本発明の第2の態様に従う少なくとも1つの細胞を含む。
細胞集団は、CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及び/又はMT2Aを発現する少なくとも1つの細胞を含む。これは、通常、細胞集団のサンプルが、前記遺伝子の発現について陽性であることを示すことによって確認することができる。言い換えると、細胞集団は、上述の遺伝子及び/又はタンパク質の発現によって特徴付けられる。一実施形態において、細胞集団内の大部分の細胞は、上述の遺伝子及び/又はタンパク質を発現する。好ましくは、細胞集団内に含まれる細胞の少なくとも80%(細胞数)、好ましくは少なくとも90%(細胞数)、より好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%(それぞれ細胞数)が、上述の遺伝子及び/又はタンパク質を発現する。
細胞集団は、好ましくは更に、全ての細胞が、本質的に均一な物理的特徴によって特徴付けられることを特徴とする。「本質的に均一な」は、細胞の少なくとも90%、例えば細胞の少なくとも91%、例えば細胞の少なくとも92%、例えば細胞の少なくとも93%、例えば細胞の少なくとも94%、例えば細胞の少なくとも95%、例えば細胞の少なくとも96%、例えば細胞の少なくとも97%、例えば細胞の少なくとも98%、好ましくは細胞の少なくとも91%が、1つ又は複数の所望の物理的特徴に対応することを意味する。
好ましくは、マクロファージは自己由来である。
医薬組成物は、上述の形質転換細胞を活性成分として含有する。また、薬学的に許容される賦形剤を含有する。
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、通常、安全であり、非毒性であり、且つ所望である医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤を意味し、獣医学的用途及びヒトの医薬用途に許容可能である賦形剤を含む。
そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、又は、エーロゾル組成の場合、気体であり得る。組織又は細胞の再生のための組成物は、通常、非経口的に、局所的に、静脈内に、経口的に、皮下に、動脈内に、頭蓋内に、実質内に、腹膜内に、鼻腔内に、又は筋肉内に投与することができる。典型的な投与経路は静脈又は実質内であるが、他の経路が等しく有効であり得る。
静脈内投与には、本発明の組成物は、液体形態となろう。
したがって、細胞に加えて、本発明の細胞の生物活性に影響を与えない薬学的に許容される希釈剤を含有することとなる。そのような希釈剤の例は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びHank's溶液である。更に、医薬組成物又は製剤はまた、他の非毒性の、非治療的な、非免疫原性ビヒクル、アジュバント、又はスタビライザー等を含むことができる。
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、液体形態である。
本発明の医薬組成物は、単独で投与することもできるし、別の医薬組成物又は別の活性成分と組み合わせることもできる。
特に、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞組成物及び別の活性成分を、同じコンテナ内に組み合わせて含有することができる。
本明細書中で用いられる用語「組み合わせた」は、本発明の細胞及び他の活性成分が必ずしも同時に投与されることを包含しない。
また、異なる時間間隔での、又は別々のコンテナによる投与を含むあらゆる使用又は提示に及ぶ。
本発明の医薬組成物との前記活性成分の「同時投与」は、活性成分及び本発明の組成物の双方が治療効果を有することとなるような、本発明の細胞の一度での投与を意味する。
そのような同時投与は、本発明の細胞の投与に関して、活性成分の同時の(すなわち同時性の)、先の、又は後の投与を含み得る。
当業者であれば、特定の薬物及び本発明の組成物にとって適切なタイミング、順序、及び投与量を決定する困難はなかろう。
本発明の細胞組成物のインビボ放出は、これを必要とする対象において、本明細書中で、組織及び細胞を再生するのに単純且つ有効な様式として提唱される。
通常、上述の対象はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えば、ペット、例えば、イヌ、ネコ、ウマその他、ラボ哺乳動物、例えば、ウサギ、マウス、ラットその他も処置することができる。
したがって、本明細書中で理解される「これを必要とする対象」は、例えば組織病変を有する、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本発明は、本発明の細胞組成物が、これを必要とする前記対象に注射によって投与される処置法を含む。
本発明の方法は更に、先で開示されるように、単核食細胞若しくはその前駆細胞、又は幹細胞を、血液、骨髄、若しくは臍帯から、又はこれらを必要とする対象の再プログラム化多能性体細胞から、又は健康なドナーから、これらの細胞のインキュベーションの前に収集及び単離して、食細胞、好ましくは単球の集団を得る/単離することを含み得る。
場合によっては、方法は、このように得られた細胞をパッケージング且つ/又は保存することと、おそらく患者に投与することとを含む。
本発明の治療実体の有効量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的であるか治療的であるかが挙げられる、多くの異なる要因に応じて変わる。
処置投薬量は、安全性及び有効性を最適化するように漸増させることができる。
本発明の組成物及び/又はその製剤は、以下に限定されないが、脊椎内、脳内、硬膜外、クモ膜下腔内、頭蓋内、非経口、腹腔内、静脈、皮内、間質内、関節内、滑液嚢内、病巣内、動脈内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、皮膚若しくは皮下、眼窩内、包内、セマティック、眼科的若しくは眼球、外科用移植片、内部外科用塗布、注入ポンプ、又はカテーテルが挙げられる種々の様式で投与することができる。
本発明の組成物は、当該技術の情勢において知られている種々の様式で、動物、好ましくはヒトが挙げられる哺乳動物への投与用に製剤化することができる。製剤の例として、局所投与又は非経口投与、好ましくは内部組織投与用のあらゆる固体組成物(タブレット、ピル、カプセル、サシェ、バイアル、粉末、顆粒、バー、ペンシル、ベーパライザ、エーロゾルその他)、半固体(軟膏、クリーム、コンディショナ、ジェル、ヒドロゲル、泡、ローション、石鹸、ゼラチンその他)、又は液体(水性又は非水性溶液、水アルコール又は水グリコール性(hydroglycolic)溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、無水組成物、水性分散系、油、乳、コンディショナ、リニメント剤、血清その他)が挙げられ得る。また、本発明の組成物は、持続放出製剤又は他のあらゆる従来の放出系の形態であり得る。用語「持続放出」は、ある期間にわたる前記細胞の徐放を、好ましくは、必ずしも必要ではないが、ある期間にわたる比較的一定の細胞放出と共に可能にする細胞送達化合物又は系に関連して、従来の意味で用いられている。持続放出ビヒクル又は系の実例として、以下に限定されないが、リポソーム、混合リポソーム、オレオソーム、ニオソーム、エトソーム、ミリカプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、スポンジ、シクロデキストリン、ブリスター、ミセル、混合界面活性剤ミセル、混合界面活性剤リン脂質ミセル、ミリスフェア、マイクロスフェア、ナノスフェア、リポスフェア、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミニ粒子、ミリ粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ナノ構造脂質媒質、ポリマー材料、生分解性若しくは非生分解性パッチ若しくは移植片、又は生分解性マイクロ粒子、例えば生分解性マイクロ粒子が挙げられる。
本明細書中で引用される文献(全ての特許、特許出願、科学出版物、メーカーの仕様書、説明書、表示その他が挙げられる)は各々、上記か下記かにかかわらず、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特に明記しない限り、本明細書中で用いられる用語「約」、「ca.」、及び「実質的には」は全て、およそ又はほぼを意味し、本明細書中で示される数値又は範囲の文脈において、好ましくは、列挙されるか、又は特許請求される数値又は範囲の+/-10%、より好ましくは+/-5%を示す。細胞の特徴に関する「実質的に～ない」、「実質的に不在の」その他のような用語は、それぞれの特徴が、当該技術の情勢に従ってそれぞれの領域で通常用いられる分析法により細胞上で検出することができず、且つ/又はそのように記載される集団における実質的に全ての細胞が、それぞれの特徴を有していないことを意味する。
明示的にそうでないと指定されない限り、文言「含む(comprise)」、又は「含む」の変形(comprises若しくはcomprising)は、本文献の文脈において、更なるメンバーが、場合によっては、「含む(comprising)」によって導入されるリストのメンバーに加えて存在し得ることを示すのに用いられる。しかしながら、本発明の特定の実施形態として、用語「含む(comprising)」は、更なるメンバーが存在しない可能性を包含すること、すなわち、当該実施形態の目的で、「含む(comprising)」は、「からなる(consisting of)」の意味を有すると理解されるべきであることが意図される。
本発明を、以下の図を参照して、非限定的な例によって具体的に説明する。
外科手術の時点での動物の体重(weight(g))。グラフは、0日目の最初の外科手術(脊髄損傷)の時点での実験において考慮される動物の体重を示す。 重度の脊髄損傷モデルにおけるTHEM及びM2マクロファージ注射部位の図。重度の脊髄損傷を受けた動物が、複数のTHEM又はM2細胞移植又は生理食塩水の注入を受けた。黒色の矢印は、注射をどこに実行したかを示す。対照動物において特定される同じ点は、生理食塩水の注入を指す。破線は、脊髄柔組織の背側領域(注射を実行した場所)と腹側領域との分離を示す。 主成分分析によるグローバル転写産物変動の分析は、血管形成及び細胞外マトリックスリモデリングに関与する遺伝子のより高いレベルでの発現と関連する、治療的に活性でないM2細胞に対する、THEM細胞における明らかに異なったトランスクリプトームを示す。配列決定RNAの主成分分析(PCA)は、THEM細胞(黒色のドット)及びM2マクロファージ(灰色のドット)に関した。分析は、THEM(黒色のドット)及びM2マクロファージ(灰色のドット)のクラスターが互いに分離していることを示し、移植前の細胞間での表現型(phenotype)の差異を強調している。 重度の脊髄損傷を受けた動物における、複数のTHEM移植後の運動器官の回復の向上。グラフは、骨髄病変を受けたマウスにおいて測定可能な運動器官の能力を測定するためのスケールであるBMS(Basso Mouse Scale)のスコアを示す;スケールは証明されており、安定しており、且つ信頼性が高い[14]。グラフにおいて、複数のTHEM細胞移植を受けた動物(濃い灰色の線、5件の実験のn=24)の、複数のM2細胞移植を受けた動物(薄い灰色の線、4件の実験のn=12)の、そして滅菌生理食塩水注入を受けた対照動物(黒色の線、7件の実験のn=26)のBMS。矢印は、移植を実行した時点を示す。複数のTHEM移植を受けた動物のBMSは、運動器官のパフォーマンスの緩やかな向上を示した。これは、複数のM2移植を受けた動物(0.375±0.109)及び対照動物(0.712±0.157)のものに対して有意に高い(1.792±0.327)。実験条件間の差異を、二元配置ANOVA検定及びSidak事後統計分析法により分析した。データを、平均±SEMの形態で示す。*p<0.05、**p<0.01、***p≦0.001、****p≦0.0001。 重度の脊髄損傷を受けた動物における、複数のTHEM移植後の足関節の柔軟性の向上。グラフは、15dpiから実験の最後までの、複数のTHEM移植を受けた動物(濃い灰色の線、総計7件の実験のn=24)の、複数のM2細胞移植を受けた動物(薄い灰色の線、総計3件の実験のn=12)の、そして滅菌生理食塩水注入を受けた対照動物(黒色の線、総計7件の実験のn=26)の足関節柔軟性スコア(Ankle flexibility score)を示す。31dpiにて、複数のTHEM移植を受けた動物における足首柔軟性(0.799±0.037)は、複数のM2移植(0.659±0.049)を受けた動物及び対照群(0.612±0.045)におけるよりも有意に大きかった。実験条件間の差異を、二元配置ANOVA検定及びチューキー事後統計分析法により分析した。データを、平均±SEMの形態で示す。*p≦0.05、**p≦0.01。 重度の脊髄損傷後の複数THEM移植動物は、筋電図記録法によって、より高い生理学的筋肉活性化期間値を示す。グラフは、対照動物(白色)、複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)、及び健康な動物(灰色)における外側腓腹筋の筋電図記録の活性化(gastrocnemius electromyographic activation)期間を示す。複数のTHEM移植を受けた動物において、外側腓腹筋の筋電図記録の活性化の期間は、対照動物(0.593s±0.101s)のものに対して、統計学的により短く(0.338s±0.048s)、これは、健康な動物における筋肉の生理学的条件(0.231s±0.038s)により近い。実験条件間の差異を、一元配置ANOVA検定及びチューキー事後統計分析法により分析した。データを、平均±SEMの形態で示す。*p≦0.05、**p≦0.01。 移植後に、THEM及びM2細胞は、脊髄柔組織において存続して、半径方向に、そして長手方向に拡散する。脊髄に沿った柔組織内でのTHEM分布のパーセンテージを示すグラフ。異なる分布領域(柔組織、嚢胞、髄膜)を、異なる色により示す(図内の説明)。グラフに示すように、THEMは、移植部位から脊髄の異なる領域まで長手方向に広がって、嚢胞の領域において、脊髄外傷に相当する断面内に濃縮する。(B)脊髄に沿う柔組織におけるM2の分布パーセンテージを示すグラフ。グラフに示すように、M2は、移植部位から脊髄の異なる領域内に長手方向に拡散して、嚢胞の領域において、脊髄外傷に相当する断面内に濃縮する。(C)病変部位での脊髄柔組織及び嚢胞におけるTHEM及びM2の分布パーセンテージを示すグラフ。実験THEM群(濃い灰色、柔組織46.46%±10.40%、嚢胞53.54%±10.40%、n=5)、実験M2群(薄い灰色、柔組織46.90%±10.95%、嚢胞53.10%±10.95%、n=3)。(D)脊髄に沿ったTHEMの半径方向及び長手方向の分布を表す画像。分析した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;各群についてn=3動物、8つの断面/分析した動物。*P<0.05。M2=表現型2マクロファージ;THEM=腫瘍-低酸素教育済みマクロファージ。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、病変領域の低下を示す。(A～D)対照動物、及び複数のTHEM移植を受けた動物における、GFAP星状膠細胞(薄い灰色、Glial scar))及びTO-PRO3(濃い灰色)に特異的なマーカーによる免疫染色を受けた脊髄断面であり、定量化のために考慮した領域を示す。(A～B)対照動物(A)及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、GFAP星状膠細胞(薄い灰色)及びTO-PRO3(濃い灰色)に特異的なマーカーによる免疫染色を受けた脊髄断面。(C～D)対照動物、及び複数のTHEM移植を受けた動物(D)における、GFAP星状膠細胞(薄い灰色)及びTO-PRO3(濃い灰色)に特異的なマーカーによる免疫染色を受けた脊髄断面。濃い灰色の領域は、膠瘢痕の領域を示す。破線の領域は、嚢胞領域を示す。これらの2領域は併せて、病変の総領域を表す。(E)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における、嚢胞領域(薄い灰色の部分、area cyst)の、総膠瘢痕領域に対する比率パーセンテージを示すグラフ。複数のTHEM移植は、対照動物(33.24%±0.87%、n=3)に対して、処置された動物(21.38%±2.05%、n=3)において嚢胞領域の有意な引下げをもたらす。(F)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における、膠瘢痕領域(破線の領域)の、総断面領域に対する比率パーセンテージを示すグラフ。複数のTHEM移植を受けた動物(6.79%±0.85%、n=3)と対照動物(6.69%±0.53%、n=3)との間の断面の総領域上の膠瘢痕領域のパーセンテージの差異はなかった。実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;8つの断面/動物を群毎に分析する。**P<0.01。GFAP=神経膠線維酸性タンパク質。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、嚢胞領域の引下げを示す。対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における、嚢胞領域(薄い灰色の領域)の、総断面領域に対する比率パーセンテージを示すグラフ。複数のTHEM移植は、対照動物(4.73%±0.15%、n=3)に対して、処置された動物(2.03%±0.30%、n=3)において嚢胞領域の有意な引下げをもたらす。分析した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;8つの断面/動物を群毎に分析する。**P<0.01。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、総ニューロン数の増大を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、ニューロン細胞特異的マーカーNeuNによる免疫染色(薄い灰色)及びDAPI(濃い灰色)を受けた脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面領域)の範囲を定めている。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)の髄様柔組織内に存在するNeuN+細胞数パーセンテージ。ニューロン細胞(NeuN+)のパーセンテージは、総核数について正規化している。図に示すように、総ニューロンのパーセンテージは、対照動物(6.81%±0.726%、n=4)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に高かった(13.13%±0.632%、n=5)。分析した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=5動物、群毎に分析した8つの断面/動物。***P<0.001。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、コリン作動性ニューロン数の増大を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、ニューロン細胞特異的マーカーChATによる免疫染色(薄い灰色)及びDAPI(濃い灰色)を受けた脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面領域)の範囲を定めている。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)の髄様柔組織内に存在するChAT+細胞数パーセンテージを示すグラフ。コリン作動性ニューロン(ChAT+)のパーセンテージは、総核数について正規化している。図に示すように、コリン作動性ニューロンのパーセンテージは、対照動物(0.245%±0.038%、n=4)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に高かった(0.412%±0.011%、n=4)。考慮した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;8つの断面/動物を群毎に分析する。**P<0.01。ChAT=コリンアセチルトランスフェラーゼ。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、ニューロフィラメント含有量の増大を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、NF200(薄い灰色)に特異的なマーカーによる免疫染色及びDAPI(濃い灰色)ニューロフィラメントタンパク質を受けた脊髄の長手方向の断面から得た病変周辺領域の拡張。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における、NF200マーカーを表す領域(NF200+領域)と分析のために考慮した総領域との間の比率パーセンテージを示すグラフ。ミエリンのパーセンテージを、考慮したROIの総ピクセルに対する、ROI内に存在するNF200-ポジティブピクセルとして算出した。示すように、NF200のパーセンテージは、対照動物(9.723%±0.133%;n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に高かった(16.36%±2.09%、n=3)。研究した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;8つの断面/動物を群毎に分析する。*P<0.05。NF200=ニューロフィラメント-200、ROI=関心領域。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、ミエリン(myelin)の増大を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、Luxol Fast Blue(LFB)染色を受けた脊髄断面。LFBは、脊髄の柔組織内に、詳細には後神経束の領域(ROI)内に含有されるミエリン(濃い灰色の領域)を検出するのを可能にする。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)におけるROI内に存在するミエリンのパーセンテージ。ミエリンのパーセンテージを、考慮したROIの総ピクセルに対する、ROI内に存在するミエリンポジティブピクセルとして算出した。図に示すように、脊髄の後神経束内に含有されるミエリンのパーセンテージは、対照動物(19.870%±1.999%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に高かった(26.470%±1.075%、n=5)。分析した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=5動物、群毎に分析した8つの断面/動物。*P<0.05。ROI=関心領域。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、免疫細胞の強い漸増を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、ミクログリア及びマクロファージ集団Iba1+(薄い灰色)に属する細胞について特異的なマーカーによる免疫染色、並びにDAPI(濃い灰色)を受けた脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面領域)の範囲を定めている。(C)複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)、及び対照動物(白色)における髄柔組織内に存在するIba1+細胞のパーセンテージ。総核数について正規化した、活性化された小膠細胞(Iba1+)のパーセンテージは、対照動物(3.847%±0.597%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に高かった(5.820%±0.411%、n=5)。研究した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=5動物、群毎に分析した8つの断面/動物。*P<0.05。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、免疫細胞の強い漸増を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、マクロファージ集団CD68に属する細胞について特異的なマーカーによる免疫染色(薄い灰色)、及びDAPI(濃い灰色)を受けた脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面領域)の範囲を定めている。(C～D)対照動物(C)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(D)における、CD206のマクロファージ集団に属する細胞について特異的なマーカーによる免疫染色(薄い灰色)、及びDAPI(濃い灰色)プロ再生(pro-regenerative)表現型(M2)を受けた脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面領域)の範囲を定めている。(E)複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)、及び対照動物(白色)における髄柔組織内のCD68+細胞のパーセンテージ。総核数について正規化した、マクロファージ(CD68+)のパーセンテージは、複数のTHEM移植を受けた動物(5.484%±0.367%、n=5)に対して、対照動物(6.143%±0.554%、n=3)においてより高かった。(F)複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)、及び対照動物(白色)における、髄柔組織内のCD206+細胞のパーセンテージ。総核数について正規化した、表現型2マクロファージ(CD206+)のパーセンテージは、複数のTHEM移植を受けた動物(5.655%±0.497%、n=4)に対して、対照動物(2.320%±0.080%、n=3)において有意に高かった。実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=5動物、群毎に分析した8つの断面/動物。*P<0.05、**P<0.01。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、細胞外マトリックス堆積の引下げを示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、細胞外マトリックス特異的マーカーAgrinaによる免疫染色(薄い灰色)及びDAPI(濃い灰色)を受けた脊髄断面。橙色の破線は、定量化のために考慮した関心領域(嚢胞の総領域)の範囲を定めている。(C)断面の総領域(白色の破線)について正規化した、対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)の嚢胞内に存在するアグリン(Agrin)のパーセンテージ。図に示すように、考慮した領域内に含有されるアグリンのパーセンテージは、対照動物(12.570%±2.140%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物(3.500%±1.112%、n=3)において有意に低かった。(D)断面の総領域(白色の破線)について正規化した、対照動物(白色)及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における嚢胞内に存在するフィブロネクチン(Fibronectin)のパーセンテージ。図に示すように、考慮した領域内に含有されるフィブロネクチンのパーセンテージは、対照動物(9.625%±3.375%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物(5.190%±2.019%、n=3)において、引下げの傾向を示した。細胞外マトリックスの種々の構成要素のパーセンテージを、考慮したROIの総ピクセルに対して、嚢胞内に存在する細胞外マトリックスの特定の構成要素(アグリン、フィロネクチン)についてポジティブなピクセルとして算出した。実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=3動物、群毎に分析した8つの断面/動物。*P<0.05。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、低酸素領域(Hypoxic area)の引下げを示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、遊離チオールの検出のために染色された脊髄断面。破線は、定量化のために考慮した領域(総断面積)の範囲を定めている。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)の髄柔組織における低酸素領域のパーセンテージ。低酸素領域パーセンテージを、総断面の総ピクセルに対して、総断面内に存在する低酸素領域あたりのポジティブなピクセルとして算出した。図に示すように、低酸素領域パーセンテージは、対照動物(5.866%±0.745%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において有意に低かった(3.173%±0.528%、n=3)。実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;8つの断面/動物を、群毎に分析している。*P<0.05。 重度の脊髄損傷の後に、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物に対して、枝数が増大し、且つ最大長がより大きい管(vessel)を示す。(A～B)対照動物(A)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(B)における、CD31内皮細胞について特異的なマーカーによる免疫染色(灰色)を受けた脊髄断面から得た代表的な関心領域(ROI)。(C)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における考慮下領域(ROI)内の管(Vessel)/フィールドの平均数。示すように、管/フィールドの平均数は、複数のTHEM移植を受けた動物(30.940±3.592、n=3)に対して、対照動物(37.070±0.379、n=3)においてより高かった。(D)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における考慮下領域(ROI)内の枝(breaching)/管の平均数。示すように、管/フィールドの平均数は、対照動物(1.793±0.073、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物(2.110±0.165、n=3)においてより高かった。(E)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における考慮下領域(ROI)内の管の最大平均長。示すように、枝/管の平均数及び管/フィールドの最大平均長は、対照動物(43.450μm±0.751μm)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物(55.410μm±2.500μm)において有意に大きかった。(F)対照動物(白色)、及び複数のTHEM移植を受けた動物(黒色)における考慮下領域(ROI)内の管のねじれ(Tortuosity)の平均値。ねじれ値は、考慮した実験群間で差異を示さなかった(1.168±0.005複数のTHEM移植を受けた動物、1.153±0.015対照)。実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=5動物、群毎に分析した8つの断面/動物。*P<0.05。ROI=関心領域。 マウスTHEMの、iPSCのヒト培養物への添加は、運動ニューロン分化を促進する。(A～B)対照培養物(A)、THEMとの共培養(B)、及びM2との共培養(C)における、ニューロンβIIIチューブリン(Tub3;薄い灰色)に特異的なマーカーによる、運動ニューロンに分化したヒトIPSCの免疫染色、及びDAPI(濃い灰色)。(D)対照サンプル(白色)、THEMとの共培養(黒色)、及びM2マクロファージとの共培養(灰色)における分析のために考慮した総領域の値について正規化したTub3の発現の領域。示すように、THEMとの共培養におけるTub3発現の領域は、対照、及びM2との共培養に対して、有意に大きい(6.423%±0.494%対照、THEMとの共培養9.097%±0.253%、M2との共培養7.235%±0.492%)。研究した実験条件間の差異を、対応のないt検定によって分析した。データを、平均±SEMとして表す;n=3ドナー、40フィールド/ドナー、4画像/フィールドを分析。*P<0.05、**P<0.01。 トランスクリプトームプロファイル全体についてのPCAは、THEMが、腫瘍馴化及び低酸素を必要とする固有の分子シグネチャーを有することを示す。未分化M0マクロファージ(三角形)、M2分極化マクロファージ(円)、低酸素なしで培養したTCM(十字)、及びTHEM(四角)のトランスクリプトームの主成分分析。PCA分析は、THEMクラスターが他の群から十分に分離していることを示し、THEM固有の分子シグネチャーを強調しており、そしてTHEMを生成するための低酸素の必要性を実証している。 低酸素なし、M0マクロファージ、そしてM2マクロファージで培養したTCMと比較した、THEMにおけるトップ富化遺伝子オントロジーのヒートマップ。 M0、M2、及び低酸素なしで培養したTCMに対するTHEMの差分遺伝子発現。A)M0(左側のパネル)、M2(中央のパネル)、及び低酸素なしで培養したTCM(右側のパネル)と比較した、THEMによって発現された遺伝子のLog2倍変化を示すVulcanoプロット。M0、M2、及び低酸素なしで培養したTCMに対するTHEMの差分遺伝子発現。A)M0(左側のパネル)、M2(中央のパネル)、及び低酸素なしで培養したTCM(右側のパネル)と比較した、THEMによって発現された遺伝子のLog2倍変化を示すVulcanoプロット。B)M2及びM0と比較した、THEMにおいて上方制御且つ高度に発現される遺伝子の発現レベルを示すグラフ。C)M2及びM0と比較した、THEMにおいて低いレベルにて下方制御される/下方制御されない遺伝子の発現レベルを示すグラフ。 走化性としてのSDF-1による、THEM、TCM、及びM2マクロファージについての遊走アッセイ。トランスウェル遊走アッセイを、走化性としてのより下方のチャンバにおけるSDF-1a(100ng/ml)により、24ウェル走化性チャンバ(8μm細孔サイズ)において実行した。バーは、遊走細胞の数(migrated cell number)の、対照と比較した倍変化を表す。 ヒト運動ニューロンに対するマウスTHEMニューロン再生機能。(A)共培養なし(CRTL)で、マウスTHEM共培養(THEM)により、低酸素共培養なしTCMにより、そしてM2共培養(M2)により運動ニューロンに分化した、特異的ニューロンマーカーβIIIチューブリン(Tub3、緑色)により染色したヒトiPSCの免疫染色、及びDAPI(青色)。(B)共培養なし、THEM、低酸素なしTCM、そしてM2共培養による、iPSC由来運動ニューロンにおける、分析のために考慮した総領域により正規化したTub3発現領域を表すグラフ。THEM共培養におけるTub3発現領域は、他の全ての群よりも統計学的に高い結果となり、このことは、THEMが、より高いニューロン分化及びニューロンプロセス伸長を誘導したことを示す。重要なことに、THEM共培養により観察されるTub3の発現は、低酸素共培養なしのTCMと比較して、より高く、このことは、低酸素処理が、THEMの有効な再生表現型を定義するのに必須であることを示す。 ヒト運動ニューロンに対するヒトTHEMニューロン再生機能。(A)対照、ヒトTHEM共培養、ヒトTCM共培養、ヒトM0共培養、及びインビトロヒトM2共培養における、分析のために考慮した総領域によって正規化したTub3表現領域を表すグラフ。示すように、ヒトTHEM共培養におけるTub3発現領域は、対照細胞、M0共培養、M2マクロファージ共培養、及びヒトTCM共培養よりも有意に高い結果となり、これは、より高いニューロン分化及びニューロンプロセス伸長を示唆している。加えて、TCM共培養におけるよりもTHEM共培養におけるTub3のより高い発現は、低酸素処理が、THEMの適切な有効な表現型を確定するのに必須であることを示す。 脊髄損傷マウス運動回復に対するTHEM及びTCMインビボニューロン再生機能。THEM、TCM、及びビヒクル(細胞なし)移植動物のBMSスコアを表すグラフ。黒色の矢印は、移植を実行した時点を示す。THEM移植動物は、ビヒクルスコア(0.711±0.068)及びTCMスコア(0.300±0.200)よりも有意に高いスコア(2.188±0.195)に達する、運動器官のパフォーマンスの緩やかな向上を示した。実験群間の統計差異は、二元配置ANOVA検定及びSidak事後検定によって分析した。データを、平均±SEMとして示す。*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001、****p≦0.0001。
材料及び方法
マウスTHEM、M2、及びTCMマクロファージを得るためのプロトコール
THEM(腫瘍及び低酸素教育済みマクロファージ)を得るために、dT-Tomato雄マウス骨髄から単離した新しい単球を、10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びマウスマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補充した細胞培養培地(IMDM)中で、37℃、5%CO2の酸素正常状態条件で6日間、懸垂培養した。続いて、培地を、50%腫瘍上清(固形線維肉腫及び神経膠腫外植片の培養から得、そこから腫瘍リッチ上清を選択した)及び50%IMDMからなる培地で改変して、培養物を、低酸素条件(1%O2)の下で最後の18時間維持した。
TCM(腫瘍馴化マクロファージ)を得るために、dT-Tomato雄マウス骨髄から単離した新しい単球を、10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びマウスマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補充した細胞培養培地(IMDM)中で、37℃、5%CO2の酸素正常状態条件で6日間、懸垂培養した。続いて、培地を、50%腫瘍上清(固形線維肉腫及び神経膠腫外植片の培養から得、そこから腫瘍リッチ上清を選択した)及び50%IMDMからなる培地で改変して、培養物を、酸素正常状態で、実験前の最後の18時間維持した。
M2マクロファージを得るために、dT-Tomato雄マウス骨髄から単離した新しい単球を、10%熱不活化胎仔ウシ血清、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及びマウスマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補充した細胞培養培地(IMDM)中で、37℃、5%CO2の酸素正常状態条件で1週間、懸垂培養した。続いて、20ng/mLのIL-4を加えたIMDM培地と、酸素正常状態条件(21%O2)で37℃、5%CO2にて、実験前の最後の18時間インキュベートした。
ヒトTHEM、TCM、M2、及びM0マクロファージを得るためのプロトコール
THEMを得るために、血液由来CD14+単球を、70%培養培地(RPMI+10%FBS+100ng/ml M-CSF)及び30%腫瘍馴化培地により、酸素正常状態の6日間に続く18～24時間の低酸素でインビトロ培養した。腫瘍馴化培地を、約12～72時間、インビトロで分離且つプレーティングした腫瘍の腫瘍株又は摘出物の上清から得る。
TCM(腫瘍馴化マクロファージ)を得るために、血液由来CD14+単球を、70%培養培地(RPMI+10%FBS+100ng/ml M-CSF)及び30%腫瘍馴化培地により、酸素正常状態で7日間、インビトロ培養した。
M0非分極化マクロファージを得るために、血液由来CD14+単球を、100%培養培地(RPMI+10%FBS+100ng/ml M-CSF)により、酸素正常状態で7日間、インビトロ培養した。
M2マクロファージを得るために、M0マクロファージを生成してから、最後の18時間、IL4(20ng/ml)の追加により分極化した。
トランスクリプトーム分析
全RNAを、RNeasy Plus Micro Kit(Qiagen社、Cat No.74034)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってマウス又はヒトマクロファージから抽出して、RNA完全性を、Fragment Analyzer(Agilent Technologies社)を用いて評価した。RNAseqライブラリ調製を、「TruSeq Stranded mRNAライブラリプレップキット」(Illumina社、San Diego、米国)を用いて、100ng高品質全RNAから始めて実行した。簡潔に、mRNA画分を、ポリA捕捉によって全RNAから精製して、フラグメント化して、cDNA合成にかけた。バーコード化したDNAアダプターを、二本鎖cDNAの双方の末端にライゲートして、PCR増幅にかけた。ライブラリ産物を、Fragment Analyzer(Agilent Technologies社)を用いて評価してから、Illumina NextSeq500シーケンサにより、75bpシングルエンドリードを用いて配列決定して、サンプル単位で約1700万リードを生成した。品質管理を、ソフトウェアScythe(v0.991)及びSickle(v1.33)を用いて行った。続いて、各サンプルにおいて、マウストランスクリプトーム(Gencode M23-GRCm38)のリファレンス配列に対してコンピュータソフトウェアSalmon v.1.0.0を走らせることによって、転写産物発現レベルを定量化した。
配列カウントデータに関する差分発現分析を、Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較についてのp値を調整するRソフトウェア(https://www.r-project.org/)のライブラリDESeq2において実行される負の二項分布モデルを用いて実行した。転写産物発現倍変化を、全ての比較において、発現された転写産物毎に推定した。続いて、最も関連する上方制御遺伝子を、Rのライブラリdnetにおいて実行される遺伝子オントロジーに基づくエンリッチメント分析によって、生物学的プロセス及び分子機能に要約した。
重度の挫傷性脊髄損傷の動物モデル
Charles River社から購入した雄成体(7週齡)C57BL/6Jマウスに、以前に記載されるように(15、16)、胸椎11(T11)のレベルでの椎弓切除、そしてその後重度の挫傷性脊髄損傷を受けさせた。簡潔に、7週齡のC57BL/6雄マウスを、2%イソフルランで麻酔して、椎弓切除をT11レベルにて実行した。5grロッドを、MASCIS Impactorを用いて6.25mmの高さから落として、11秒間圧縮状態のままにした。Baytril(25mg/ml)及びRimadyl(50mg/ml)の皮下注射を、損傷後の最初の7日(dpi)、毎日与えた。動物の世話を、全ての実験の間毎日実行して、動物の体重を1日1回量り、そして膀胱を5dpiまで1日2回、その後実験の最後まで1日1回空にした。外科手術を実行する前に、全ての動物の体重を量って、17～31gの体重範囲内のマウスのみ実験を考慮して、外科手術にかけた。外科手術の時点での動物の体重を、図1に示す。外科的病変及び細胞移植により、施した手技の過酷さに起因して、又は回復期間の間の合併症に起因して、142頭の動物のうち26頭が死亡した。
重度の脊髄損傷モデルにおけるTHEM、M2、及びTCMマクロファージ移植プロトコール
移植の日に、培養物中のTHEM、TCM、及びM2マクロファージを、Acutaseを用いてプレートから取り出して、遠心分離して上清を除去して、0.5×106細胞/μlの濃度にて生理食塩水中に再懸濁させた。移植セッション毎に、THEM、TCM、M2、又はビヒクル群に属する各実験動物は、病変に中心がある脊髄断面内の脊柱において互いに2mm隔てられた異なる4点にて4回の注射(1μl/注射)を受けた(注射深さ:0.5mm)(図2)。細胞移植を、微量注入器及び定位装置と連結されたグラスキャピラリを用いて、0.5μl/分の速度にて実行した。各注射の後に、細胞懸濁液の還流を可能な限り最小にするために、グラスキャピラリを適所に5分間維持した。5分後に、背の創傷を縫合して殺菌して、1mLの生理食塩水を皮下投与した。全ての手順の終わりに、動物を暖房マット上に置いて、完全な覚醒まで監視した。
研究設計1 THEM有効性の評価
重度の挫傷性脊髄損傷を受けさせて、動物を3つの実験群に分けた:第1の群に、複数のTHEM移植を受けさせ、第2の群に、複数のM2マクロファージ移植を受けさせ、そして最後に、第3の群に、滅菌生理食塩水注射を受けさせた。動物を3つの実験群に再分割する前に、第1の移植の日(挫傷性脊髄病変の3日後、3dpi)に、動物の運動器官のパフォーマンスを評価して、Basso Mouse Scale分析(BMS)において0～0.5の値に終わった重度の脊髄損傷のある動物のみを、実験プランの次の段階に用いた。3つ又は4つの移植/生理食塩水注射を実行した(時点3移植:3dpi、10dpi、17dpi;時点4移植:3dpi、10dpi、17dpi、及び24dpi)。実験を、脊髄損傷の31日後(31dpi)に終えた。治験の終了後、機能回復値及び組織学的特徴を、考慮する実験群において評価した。
研究設計2 TCMと比較したTHEM有効性の評価
重度の挫傷性脊髄損傷を受けさせて、動物を3つの実験群に分けた:第1の群に、複数のTHEM移植を受けさせ、第2の群に、複数のTCMマクロファージ移植を受けさせ、そして最後に、第3の群に、滅菌生理食塩水注射を受けさせた。動物を3つの実験群に再分割する前に、第1の移植の日(挫傷性脊髄病変の3日後、3dpi)に、動物の運動器官のパフォーマンスを評価して、Basso Mouse Scale分析(BMS)において0～0.5の値に終わった重度の脊髄損傷のある動物のみを、実験プランの次の段階に用いた。3つのマクロファージ又は生理食塩水注射を実行した(時点3移植:3dpi、10dpi、17dpi)。実験を、脊髄損傷の31日後(31dpi)に終えた。治験の終了後、機能回復値を、考慮する実験群において評価した。
運動器官の評価
オープンフィールドでの運動器官の評価
THEM移植、M2移植、及びビヒクルマウスの運動器官の機能を、1、3、4、5、7、10、11、14、17、18、21、24、28、及び31dpiに、Basso Mouse Scale(BMS)(14)を用いて評価した。Basso Mouse Scaleは、「0」～「9」までの10ステージを含み、「0」は「運動なし」に、そして「9」は標準的な運動器官の機能に相当する。
足首柔軟性分析
足関節柔軟性分析を、14DPIから実行して、以前に記載される(16、17)ように、足首背屈筋及び足底屈筋に関与する筋肉の痙性を評価した。以下のスコアを割り当てた:標準的な運動に対して、「0」は運動の欠如(痙攣性の状態、前脛骨筋と前足との間の180°の角度に相当)に、「0.25」は135°の角度に、「0.5」は90°の角度に、「0.75」は45°の角度に、そして「1」は0°の角度に相当する。
筋電図検査
自発的筋肉活性のインビボ筋電図検査(EMG)記録を、前脛骨筋(TA)及び外側腓腹筋(LG)の筋肉において実行した。合計で、発明者らは、17頭のマウス由来の32個のTA筋肉、及び16頭のマウス由来の29個のLG筋肉を記録した。各動物において、異なる筋肉の記録を順番に(すなわち、同時にではない)実行した。麻酔した(イソフルラン2%)動物において、発明者らは、短い皮膚切開を通して、筋肉あたり、筋肉の長手方向軸と平行な裸の先端を有し、且つアンプ(CyberAmp 320、Axon Instruments社、Foster City、CA)に接続された、ニス塗りして保護した2本の125μm厚のステンレス鋼ワイヤを挿入した。リファレンス電極として、発明者らは、動物の背中の皮膚下に、カットした短い20Gステンレス鋼針を挿入して、接地した。EMG選択性を最大にするために、発明者らは、差分記録して、隣接の筋肉を除神経するか、又は横方向に繊維カットした。EMGシグナルを5000×増幅して、100～1200Hzの帯域通過をフィルターに通して、更にhum pick-up suppression(Hum-Bug、Quest Scientific社、Vancouver、カナダ)により向上させて、10KHzにてデジタル化して、シグナルソフトウェア(6.0.2、Cambridge Electronic Design社、Cambridge、U.K.)により得た。運動アーチファクトを減らすために、動物を、胴体、四肢、及び尾を越えてテープにより腹臥位に抑えた。記録を、麻酔からの完全な回復の10分後に始めて、筋肉毎に3分続け、その時間の間に、10～15秒毎にひげ、前肢、及び後肢に触れて、動物を刺激した。続いて、動物を再麻酔して、座骨神経を相互に、又は脊髄をT10にて(すなわち、頭側でSCIレベルに)カットした。続いて、EMG記録の第2のセッションを、麻酔からの完全な回復の10分後に開始して、筋肉毎に1分続けた。実験終了後、動物を灌流した。EMG分析(Signal and Spike2、5.0.9、Cambridge Electronic Design社)は、以下からなった:i)その平方二乗平均(RMS)値を測定することによる、収縮中の電気シグナルの電力の定量化、及びii)収縮中の電気シグナルの期間の定量化。RMSを測定するために、全EMGトレースを、40ms長の断面に分割して、RMSを、各断面において、10msの時定数で算出した。発明者らは、座骨神経又は脊髄切開の後に平均+1.9標準偏差RMS値として各筋肉において判定したカットオフレベルを上回る値の筋肉活性に関するRMSとみなした。最後に、発明者らは、トレースに沿った位置に関係なく、測定した全ての値の間で10の最も大きなRMSを平均することによって、強い筋肉活性の期間に相当するRMS値を抽出した。
組織化学及び免疫蛍光分析
脊髄固定及びプロセシング
動物を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)及び4%スクロースで心臓内に灌流した。脊髄を抽出して、4%PFA、4%スクロース中に一晩浸漬して、30%スクロース中で4℃にて保存した。組織化学的分析のために、1.5cmの切開した脊髄(病変の部位から吻側の0.75cm及び尾側の0.75cm)を低温切開(25μm厚の横断面又は20μm厚の縦断面)して、分析まで-20℃にて保存した。
Luxol Fast Blue染色
ミエリン含有量を、記載される(16、18)ように、脊髄断面においてLuxol Fast Blue(LFB)染色(Sigma-Aldrich社、Cat#L0294)によって定量化した。簡潔に、LFB(Sigma-Aldrich社)を95%エタノール(EtOH、Carlo Erba社)及び1.22%氷酢酸(Carlo Erba社)中に可溶化して、0.1%LFB溶液を調製した。断面を、EtOH溶液(100、95、70、及び50%)中で水和してから、0.1%LFB溶液で40℃にて40分間染色した。続いて、断面を水道水でリンスすると、0.05%Li2CO3溶液(Sigma-Aldrich社)中で差異が生じた。断面を、ミエリン含有量の光学顕微鏡観察分析のために(Zeiss Axioskop 2)、EtOH溶液(50、70、95、及び100%)中で脱水して、キシレン(Carlo Erba社)中できれいにして、Entellan(Merck-Millipore社)によりマウントした。
チオール染色
マウスを、最初に経心的に、1.85%ヨードアセテート及び1.25%N-エチルマレイミドを加えたPBS 1×によって構成した溶液で、その後4%PFA、1.85%ヨードアセテート、及び1.25%N-エチルマレイミドを含有する溶液で灌流した。脊髄を抽出して、4%PFA O/N中に置いておいた。低温切開した後に、サンプルをPBS 1×中で10分間洗浄して、4mM TCEP(トリス(2カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロリド)のPBS 1×溶液中で1時間インキュベートした。続いて、サンプルを、0.1%CPM(7-ジエチルアミノ-3-(4'-マレイミドイルフェニル)-4-メチルクマリン)のPBS 1×溶液中で30分間インキュベートした。PBS 1×中での洗浄後、サンプルをDABCOによりマウントした。染色後、スライスを蛍光顕微鏡により得て、低酸素領域を蛍光青色スポットとした。続いて、領域を、ImageJソフトウェア(米国国立衛生研究所)による閾値によって定量化した。
組織免疫蛍光
免疫蛍光を、以前に記載される(16、19)ように実行した。簡潔に、凍結切片を0.25%/0.5%トリトンX-100、2%BSAにより浸透性にして、ブロッキング溶液中で一次抗体と4℃にて一晩インキュベートした。ブロッキング溶液中での5分間の6回のリンスの後に、適切な二次抗体を、室温にて4時間アプライした。ブロッキング溶液中、その後PBS 1×中での最終洗浄工程の後に、TOPRO(商標)-3(1:3000、Invitrogen Thermo Fisher Scientific社)又は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:2000、Thermo Fisher Scientific社、Cat#D-1306)による核染色を実行して、スライドを、1.4-ジアザビシクロ(2.2.2)オクタン(DABCO、Sigma Aldrich社、Cat#D-2522)を用いてマウントした。画像を、40×油対物レンズ(Carl Zeiss社 LSM710共焦点顕微鏡、Munich、独国)及び20×対物レンズ(Nikon社Ti Eclipse蛍光顕微鏡)を用いて得た。以下の一次抗体を免疫蛍光分析に用いた:TOMM20(マウス、1:200、Abcam社、Cat#AB56783)、ニューロフィラメント-200(ウサギ、1:200、Sigma社、Cat#N4142)、NeuN(マウス、1:200、Millipore社、Cat#MAB377)、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体ChAT(ヤギ、1:200、Millipore社、Cat#AB144P)、イオン化カルシウム結合アダプター分子1 IBA1(ウサギ、1:200、和光純薬工業株式会社、Cat#019-19741)、分化クラスター206 CD206(ヤギ、1:400、R&D system社、Cat#AF2535)、アグリン(マウス、1:200、Stressgen社、Cat#AGR-520)、コラーゲン-I抗体(ウサギ、1.200、Abcam社、Cat#AB34710)、コラーゲン-III抗体(マウス、1.200 GeneTex社、Cat#GTX26310)、CD31(血小板内皮細胞接着分子、PECAM-1)、抗体(ラット、1:200、BD Biosciences社、Cat#557355)、フィブロネクチン(ウサギ、1:200、Dako社、Cat#A0245)、CD68(ラット、1:200、Thermo Fischer Scientific社、Cat#14-0681-82)、GFAP(ヤギ、1:200、Abcam社、Cat#ab53554)。適切な二次抗体を用いた:ロバ抗マウスAlexa Fluor 488(1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A2120)、ロバ抗ウサギAlexa Fluor 488(1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A21206)、ロバ抗ヤギAlexa Fluor 488(1:500、Jackson社、Cat#AB-2340428)、ロバ抗ラットAlexa Fluor 488(1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A11006)、ヤギ抗マウスCY3(ヤギ、1:500、Amersham社、Cat#PA43002)、ロバ抗ウサギAlexa Fluor 546(ロバ、1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A10040)、ロバ抗ヤギAlexa Fluor 546(ロバ、1:500、Thermo Fisher Scientific社によるInvitrogen社、Cat#A-11056)、ロバ抗マウスAlexa Fluor 647(1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A32787)、ロバ抗ウサギAlexa Fluor 647(1:500、Thermo Fisher Scientific社、Cat#A32795)、TO-PRO(商標)-3(1:3000、Thermo Fisher Scientific社)、又はDAPI(1:2000、Thermo Fisher Scientific社)。
画像分析及び定量化
定量的分析を、NIH ImageJソフトウェア(米国国立衛生研究所)により行った。脊髄の横断面及び縦断面を、少なくとも3～5回の技術的反復(スライドガラス)で分析した。総核数に対して正規化する分析のために、およそ5115±87個の核を考慮した。3～5頭のマウスを分析毎に考慮した。
形態測定血管(CD31)分析
脊髄横断面画像を、FIJI 1.52p(米国国立衛生研究所)により走るカスタム設計プラグインを用いて分析した。各断面において、左後角、右後角、右前角、及び左前角に対応する4つの関心領域(ROI)を選択した。画像の輝度及びコントラストを調整して、画像をバイナリイメージに変換した。「MorphoLibJ」(Legland、Arganda-Carreras & Andrey、2016年)を用いる形態学的フィルターを使用して、同じ管の内側の小さなギャップをクローズした。続いて、画像をスケルトン化して、スケルトンを、プラグイン「Analyze Skeleton(2D/3D)」を用いて分析した。分析のために、以下のパラメータを考慮した:グループ化管数、平均枝数、単一の管群の内側の平均枝長、平均最大枝長(すなわち、ROIの内側の各管群の最長枝長)、各管群の平均枝長、ユークリッド距離(管の長さとユークリッド距離との間の比率は、管のねじれの尺度を与える)、及び関心の各フィールドの内側の総枝数。
移植マクロファージ分布分析
嚢胞に中心がある組織の0.5cmの部分を、移植THEM又はM2分布分析に考慮した。3回の複数回移植(2×106細胞)を受けた損傷マウスの脊髄柔組織を分析した。複数回の移植を受けたマウスの脊髄の4～9つの横断面(25μm)を、5頭の動物について少なくとも8回の技術的反復(スライドガラス)で分析した。スライスを、4'.6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、Thermo Fisher Scientific社、1:2000)により染色して、細胞核を特定した。tomato及びDAPI二重陽性細胞の数を、FIJI ImageJ 1.52p(米国国立衛生研究所)によりマニュアルでカウントした。
マクロファージとのヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来運動ニューロン共培養
以前に記載される(15、16)ように、参加者からの事前の書面でのインフォームドコンセントがある3人の健康なドナーの皮膚生検由来線維芽細胞を再プログラム化して、iPSCを得た。続いて、細胞を、以前に記載される(15)ように、運動ニューロンに分化させた。ヒト又はマウスマクロファージを、分化iPSCと2日間共培養してから、細胞を、免疫蛍光分析のために4%パラホルムアルデヒドで固定した。免疫蛍光を、以前に記載される(15)ように、抗β3チューブリン(マウス、1:400、Promega社、Cat#G7121)、ロバ抗マウスAlexa Fluor 488(1:1000)抗体により染色することによって実行した。画像を、20×対物レンズ(Nikon社Ti Eclipse蛍光顕微鏡)を用いて得た。スライドガラス毎に5つのフィールドを得て、フィールド毎に、20×対物レンズによる2×2大画像を得た。
統計分析
特に明記しない限り、n≧3サンプル又は反復を統計分析に用いた。GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad社、La Jolla、CA、バージョン7.0)を用いて、対応のない両側スチューデントt検定、反復測定による通常の一元配置又は二元配置分散分析(ANOVA)に続くチューキー事後検定を実行した。データを平均±SEMとして示し、統計有意性をp<0.05に設定した。
****p<0.0001、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05、ns 統計学的に有意でない
結果
マウスTHEM及びM2マクロファージは、完全に異なった分子シグネチャーを示す
マウスTHEMマクロファージの分子シグネチャーを特徴付けるために、発明者らは、トランスクリプトームプロファイル全体を分析して、M2マクロファージのトランスクリプトームと比較した。3つのサンプルを実験群毎に分析した。主成分分析(PCA)は、THEM及びM2マクロファージが、異なる群にクラスター化することを示し、完全に異なった表現型を有することを確認した(図3)。予想されるように、M2マクロファージは、高レベルのCD206、CD163、及びArg1遺伝子を発現した。また、セクレトーム及びリセットーム転写産物のトランスクリプトーム分析(Table 1(表1)及びTable 2(表2)参照)は、THEM集団内の最も有意な上方制御遺伝子が、血管形成に関連する遺伝子オントロジーの機能カテゴリー(例えば、VEGF及びVEGFc)及び細胞外マトリックスリモデリング(Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19)に関連することを示した(図3)。全体的に、これらの結果は、THEMが、M2マクロファージと異なる特定の分子同一性を有することを示した。
THEMは、重度のSCIのマウスモデルにおいて、運動能力を向上させる
THEMは運動回復を促進する
THEMインビボ再生能を評価するために、THEM、M2、又はビヒクルを、材料及び方法に記載される(研究設計1)ように、重度のSCIマウスに注射した。BMS評価を実行して、重度の挫傷性脊髄損傷後の運動器官の機能回復に及ぼすTHEM及びM2移植の効果を評価した。各動物の運動器官のパフォーマンスを、損傷後第1週の間に1、3、7dpiにて、その後、実験の最後(31dpi)まで、1週あたり2回(10、14、17、18、21、24、28、31dpi)評価した。図4に示すように、複数のTHEM移植を受けた動物のBMS値(1.792±0.327)は、複数のM2移植を受けた動物のもの(0.375±0.109)、そしてビヒクルを注射した動物のもの(0.712±0.157)と比較して、有意に高かった。統計分析は、複数のTHEM移植を受けた動物と、ビヒクルを受けた動物との間で、時点14、17、18、21、24、28、及び31dpiにて、BMS値の有意差を示した。同様に、複数のTHEM移植を受けた動物と、複数のM2マクロファージ移植を受けた動物との間で、BMS値の有意差が、時点17、18、21、24、28、及び31dpiにて観察された。これらの結果は、THEMのみが、ビヒクルと比較して、重度のSCIマウスの運動回復を大幅に向上させるのに効果的であることを示唆した一方、M2は何の効果も示さなかった。
THEMは足首柔軟性を促進する
いくつかの研究は、「痙性」が、脊髄損傷の結果として発症する最も共通の徴候の1つであること、そしてこの現象が、脊髄損傷等の中枢神経系に影響を与える疾患を患う個人の障害の主因の1つであることを示してきた[4]。細胞移植が痙性症状の発症を予防することができたかを判定するために、足関節と関連する柔軟性パフォーマンスを評価した。この症状を、15dpiから実験の最後(31dpi)まで、毎日監視した。
図5に示すように、足関節柔軟性は、複数のTHEM移植を受けた動物(0.799±0.037)において、複数のM2移植を受けた動物のもの(0.659±0.049)、そして対照動物のもの(0.612±0.045)に対して、有意に良好であり、脊髄損傷後の筋肉痙性のより速い回復を示唆している。統計分析は、複数のTHEM移植を受けた動物と、ビヒクルを受けた動物との間の、足関節柔軟性値の有意差を、時点15、21、22、26、27、28、29、30、及び31dpiにて示した。更に、図5に示すように、統計分析は、複数のTHEM移植を受けた動物と、複数のM2マクロファージ移植を受けた動物との間で、足首柔軟性値の有意差を、時点28dpiにて示した。
THEMは、屈筋運動ニューロンの正常な興奮性を回復する
以前の機能分析から得たデータを確認するために、自然電位の筋電図記録(EMG)を、前脛骨筋及び外側腓腹筋と関連させて、インビボで実行した。筋収縮の間の筋電図記録のシグナルの振幅及び期間の双方を考慮した。筋電図記録のトレースの振幅は、活性化された運動ニューロンの数と比例する:移植された動物及び対照動物は双方とも、健康な動物に対して約50%引き下げられた筋電図記録の振幅を示した。筋電図記録のトレースの活性化の期間は、脊髄損傷後に増大する運動ニューロンの興奮性と比例する(特に、対照動物の筋電図記録のトレースの活性化の期間は、2.5倍増大する)。
脊髄損傷後の運動ニューロンの興奮性の増大は、大規模且つ局所的な阻害回路の機能性の喪失に起因する。複数のTHEM移植を受けた動物において、外側腓腹筋の筋電図記録の活性化の期間は、対照動物のもの(0.593s±0.101s)と比較して、統計学的により短く(0.338s±0.048s)、これは、健康な動物の筋肉の生理学的状態(0.231s±0.038s)により近い(図6A)。また、前脛骨筋に関して、複数のTHEM移植を受けた動物における筋電図記録の活性化期間は、対照動物のもの(0.450s±0.077s)と比較して、より短かった(0.416s±0.058s)。健康な動物は、他の全ての実験群に対して、筋電図記録の前脛骨筋活性化期間が統計学的により短かった(0.161s±0.020s)(図6B)。これらのデータは、THEMによる処置が、神経再支配に関しては効果がないが、屈筋運動ニューロンの正常な興奮性を回復することを示した。
THEMは、重度のSCIマウス脊髄組織の再生を促進する
脊髄のレベルにて起こる外傷となる事象が、機械的な損傷及びそれに伴う組織変性を引き起こす。これらの事象として:軸索の細胞膜の分解、血脳関門の変性、脱ミエリン化、免疫細胞の遊走、及び脊髄実質細胞の死が挙げられる[2、5]。THEM移植が、脊髄の組織再生、31dpiでの脊髄柔組織における細胞の分布、及び嚢胞形成に関連する組織学的特徴にいかに寄与するかを研究するために、膠瘢痕、ニューロンの、特にコリン作動性ニューロン(運動ニューロン)の数、ミエリン含有量、免疫応答の活性化、細胞外マトリックス、及び組織血管新生を最初に研究した。
脊髄組織における移植したTHEMの分布
移植した細胞の持続性、その生存度、及び位置を評価するために、実験終了(31dpi)後の移植細胞の分布を分析した。THEM及びM2の数を、重度の脊髄損傷、及び複数の移植後の脊髄断面(脊髄損傷の部位に中心がある0.6cm長の脊髄領域(9つの脊髄/動物断面)を表す)において定量化した。分析のために、核マーカー4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)と共局在化する蛍光赤血球(dT-Tomato;THEM又はM2)の絶対数を考慮した。THEMの分布を、脊髄組織(柔組織、嚢胞領域、背/腹側の髄膜)における異なる位置に基づいて分析した。図7A～Bに示すように、THEM及びM2マクロファージは、移植後の日々においてすら、脊髄柔組織内に存続し、その存在は、脊髄病変の断面だけでなく隣接する断面においても検出される。したがって、移植細胞(THEM及びM2マクロファージ)の拡散は、移植部位に対して半径方向にあるだけでなく、吻側方向及び尾側方向の長手方向にもある。パーセンテージ値を、脊髄断面(0.6cm長に等しい髄領域(9つの脊髄/動物断面)を表す)内に存在する総THEM及びM2細胞について正規化した。脊髄外傷に相当する断面において、これらは、嚢胞領域内に集中する(53.54%±10.40%THEM、n=5;53.10%±10.95%M2、n=3)が、かなりのパーセンテージが、周囲柔組織内に広く行き渡っている(46.46%±10.40%THEM、n=5;46.90%±10.95%M2、n=3)(図7C)。パーセンテージ値を、脊髄外傷断面内で総THEM又はM2細胞に対して正規化した。図7Dは、脊髄外傷部位に関して、移植細胞の半径方向及び長手方向の分布ダイアグラムを示す。全体として、これらのデータは、移植細胞(THEM及びM2マクロファージ)が、脊髄損傷後に確立された苛酷な環境において何日も生き残ることができることを示唆した。
THEMは、嚢胞及び膠瘢痕を縮小する
脊髄損傷の後に、損傷部位での膠瘢痕及び嚢胞の形成は、外傷に由来する二次損傷の制限に寄与する補償機構を構成する[2]。それでもやはり、それらの存在は、軸索再生を妨げる。というのも、物理的障壁及び分子障壁を構成するからである[20]。機能回復における脊髄損傷後の膠細胞応答の重要性を考慮して、星状膠細胞特異的マーカー神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)を用いる免疫蛍光分析を実行して、膠瘢痕形成、及び星状膠細胞応答の活性化に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価した(図8A～D)。脊髄損傷の部位に中心がある髄領域0.6cm長を表す脊髄断面(9つの脊髄/動物断面)を分析した。膠瘢痕の総領域と比較した嚢胞の領域は、対照動物(33.24%±0.87%、n=3)に対して、複数のTHEM移植を受けた動物において、より小さい(21.38%±2.05%、n=3)(図8E)。更に、病変領域の範囲を定める、星状膠細胞によって生成される膠瘢痕は、対照(6.69%±0.53%、n=3)に対して、分析される実験群において等しいサイズである(THEM:6.79%±0.85%、n=3)(図8F)。複数のTHEM移植を受けた動物は、総断面の領域に関して、対照のもの(4.73%±0.15%、n=3)と比較して、嚢胞領域が有意に小さい(2.03%±0.30%、n=3)(図9)。これらのデータは、複数のTHEM移植を受けた動物における損傷の部位での変性機構の組織再生/制限の増大と一致する。
THEMは、ニューロン及びミエリン含有量を増大させる
一次機械損傷に起因する脊髄の組織変質の後に、ニューロン細胞の更なる喪失に終わる二次損傷が続く[5]。挫傷性脊髄損傷後のニューロン含有量に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、免疫蛍光分析を、ニューロン特異的マーカーNeuNを用いて実行した(図10A～B)。脊髄損傷の部位に中心がある狭い領域1.5cm長を表す脊髄断面(8つの脊髄/動物断面)を分析した。NeuN+細胞のパーセンテージを最初に定量化した。図10Cに示すように、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照動物(6.81%±0.726%、n=4)に対して、ニューロンのパーセンテージがより高い(13.13%±0.632%、n=5)。いくつかのニューロン集団が、脊髄の柔組織内に存在する。特に、脊髄の腹側領域における薄膜IXのレベルにて特異的に位置する運動ニューロンが存在する[21]。挫傷性脊髄損傷後の運動ニューロン含有量に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、免疫蛍光分析は、コリンアセチルトランスフェラーゼ発現、ChATと相関する特異的コリン作動性ニューロンマーカーを用いて実行した(図11)。脊髄損傷の部位に中心がある狭い領域1.5cm長を表す脊髄断面(8つの脊髄/動物断面)を分析した。また、ChAT+細胞のパーセンテージに関して、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照(0.245%±0.038%、n=4)に対して、運動ニューロンのパーセンテージがより高い(0.412%±0.011%、n=4)(図11C)。
成熟ニューロンにおいて軸索レベルにて最も発現される構造タンパク質は、ニューロフィラメント(NF)である。その発現は、軸索成長、及びニューロンホメオスタシスの維持に密接に関連している[22]。脊髄損傷の結果、ニューロン損失は、知能のレベルにて観察され、ニューロフィラメントタンパク質及びミエリンの損失が付随する[22]。軸索再生に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、免疫蛍光分析を、ニューロフィラメントタンパク質NF200に特異的なマーカーを用いて実行した(図12A～B)。脊髄損傷の部位に中心がある3mm幅の髄領域(脊髄の5つの縦断面/動物髄)を表す脊髄の縦断面を分析した。複数のTHEM移植を受けた動物は、対照(9.723%±0.133%;n=3)に対して、NF200含有量が有意に高い(16.360%±2.090%、n=3)(図12C)。
脊髄損傷に由来する脱ミエリン化原因の現象は、神経組織の機能喪失に寄与する重要な結果をもたらす[5]。脊髄柔組織再ミエリン化に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、組織学的分析を、ミエリン検出に特異的な色素Luxol Fast Blue(LFB)により実行した(図13A～B)。脊髄損傷の部位に中心がある狭い領域0.6cm長を表す脊髄断面(8つの脊髄/動物断面)を分析した。図13Cに示すように、複数のTHEM移植を受けた動物は、対照(19.870%±1.999%、n=3)に対して、ミエリン含有量が有意に高い(26.470%±1.075%、n=5)。
THEMは、内因性プロ再生免疫応答を増大させる
脊髄損傷が生じる事象のカスケードは、脊髄機械損傷の部位に隣接する組織における炎症性応答の伝播を決定し、髄様組織の再生に関する負と正の結果がある[2、5、6]。特に、自然免疫応答、及びその、表現型の分極化(M1-炎症誘発性マクロファージ;M2-プロ再生マクロファージ)に依存する、異なる機能におけるマクロファージの重要な役割を考慮して、発明者らは、内因性マクロファージ構成要素及びその相対的な表現型を評価した。小膠細胞に属する細胞、及び単球/マクロファージ亜集団の系統の含有量の評価に最も一般的に用いられるマーカーは、分子イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)である[23]一方、特異的マーカーCD68及びCD206をそれぞれ、マクロファージ及びそのM2表現型の評価に用いた。実際、マーカーCD68は、高度にグリコシル化された1型膜貫通糖タンパク質のマクロファージ及び他の単核食細胞による発現に関連する[24]一方、マーカーCD206は、M2マクロファージの表面上に主に存在するマンノース受容体の発現に関連する[6]。
重度の脊髄病変病態生理学に関与する炎症性応答に及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、発明者らは次に、マーカーIba1を用いて免疫蛍光分析を実行した(図14A～B)。マクロファージ構成要素及びその表現型を更に調査するために、発明者らはその後、マーカーCD68及びCD206をそれぞれ用いて免疫蛍光分析を実行した(図15A～D)。分析において、脊髄損傷の部位に中心がある狭い領域0.6cm長を表す脊髄断面(8つの脊髄/動物断面)を考慮した。図14Cは、重度の脊髄損傷の後に、脊髄柔組織内に存在する小膠細胞のパーセンテージが、対照に対して、複数のTHEM移植を受けた動物の脊髄柔組織においていかに増大するかを示している(5.820%±0.411%、n=THEM移植を受けた5動物、3.847%±0.597%、n=3対照)。更に、マクロファージ構成要素及びその表現型の詳細な分析は、総マクロファージのパーセンテージが、複数のTHEM移植を受けた動物と比較して、対照におけるよりも高いことを示した(5.484%±0.367%、n=THEM移植を受けた5動物、6.143%±0.554%、n=3対照)(図15E)。しかしながら、M2構成要素は、有意により高い(5.655%±0.497%、n=THEM移植を受けた4動物、2.320%±0.080%、n=3対照)(図15F)。
これらの結果は、THEM移植が、SCIマウス脊髄のプロ再生内因性M2マクロファージのパーセンテージを増大させることを示唆した。
THEMは、細胞外マトリックスリモデリングを誘導する
細胞外環境の主要構成要素の1つが、細胞外マトリックス(ECM)である。これは、ニューロン成長を促進又は阻害することによってこれに二重の影響を及ぼす分子の濃度によって特徴付けられる。脊髄外傷の後に、損傷を受けた領域において当該分子の溶解濃度の上昇が観察される(フィブロネクチン、アグリン、コラーゲン、及びプロテオグリカンが挙げられる)[2、5、20、25]。阻害分子のうち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)スーパーファミリーが最も見受けられ、これは、軸索の発達及び再生に影響するいくつかのカテゴリーの分子、例えばNeurocan及びアグリカンを含む[20、25]。生理学的状況において、そういった分子は、いかなる阻害現象にも関与しないが、外傷の後に、嚢胞及び膠瘢痕のレベルでの蓄積が、軸索再生を妨げる構造の形成に寄与する[25]。いくつかのプロセスが、損傷のレベルにて、この現象を抑制しようと活性化される。ECMリモデリングにおける役割が周知である分子メタロプロテアーゼによって、重要な役割が果たされる[26]。
重度の脊髄損傷後のECMリモデリングに及ぼす複数のTHEM移植の効果を評価するために、発明者らは、ECMの主要な構成要素:アグリン及びフィブロネクチンと相関する特異的マーカーを用いて免疫蛍光分析を実行した(図16A～B)。脊髄損傷の部位に中心がある脊髄の断面及び縦断面(脊髄の少なくとも1つの縦/横断面/動物)を分析した。形態測定分析を実行して、アグリン及びフィブロネクチンの含有量を評価して、嚢胞の各領域に関連する陽性領域(ピクセル数)の範囲を評価した。図16C～Dは、重度の脊髄損傷の後に、嚢胞レベルにて存在するアグリン及びフィブロネクチン分子のパーセンテージが、対照に対して、複数のTHEM移植を受けた動物においていかに低下するかを示す(アグリン:3.500%±1.112%、n=THEM移植を受けた3動物、12.570%±2.140%対照動物、n=3;フィブロネクチン:5.190%±2.019%、n=THEM移植を受けた3動物、対照動物9.625%±3.375%、n=3)。
THEMは低酸素を弱めて、血管形成を誘導する
脊髄は、主要な管への損傷又は血流調節の変更が、組織潅流の引下げ又は一時的な遮断をもたらす虞があるような、特に複雑な血管系によって特徴付けられる。外傷性脊髄損傷は、組織潅流の即時の停止に至って、慢性的な低酸素の原因となって、生理学及び細胞代謝の正常な機能に必須の組織酸化還元状態の変更を、そしてその結果として神経変性をもたらすという長期の結果を伴う虞がある[5、27]。トランスクリプトーム分析実験から得た結果、詳細には、脈管形成に関与する遺伝子の著しいTHEM上方制御を考慮して、発明者らは、THEM複数回移植を受けた動物、及び対照動物において、管の形態学及び脊髄柔組織内の考えられる酸素不足(低酸素)の状況を分析した。
低酸素の評価のために、チオールのアルキル化のためのN-エチルアミド(NEM)及びヨード酢酸(IAA)の使用に基づいて、遊離チオールを分析した(図17A～B)。実際、タンパク質システインに結合したチオールは、細胞酸化還元状況の変動に最も感度が高い基である。生理学的条件の下で、細胞質は、ほとんどのタンパク質チオールを還元状態に維持することができる高度な還元条件によって特徴付けられる。しかしながら、過剰な酸化ストレスの条件は、タンパク質チオールの不可逆性の酸化、グルタチオン枯渇、及び細胞死を判定する分子種の形成につながり得る。低酸素領域の分析について、脊髄損傷の部位に中心がある狭い領域1.5cm長を表す脊髄断面(少なくとも8つの脊髄/動物断面)を考慮した。図17Cは、重度の脊髄損傷の後に、低酸素領域のパーセンテージが、ビヒクルに対して、複数のTHEM移植を受けた動物の脊髄柔組織においていかに低下するかを示す(3.173%±0.528%、n=3;THEM移植を受けた動物;5.866%±0.745%、n=3対照)。
管の形態学を評価するために、発明者らは、内皮細胞CD31に特異的なマーカーを用いて免疫蛍光分析を実行した(Halderら、2019年)(図18A～B)。管形態学の分析のために、脊髄損傷の部位に中心がある0.5cm長の脊髄領域を表す脊髄断面(少なくとも4つの脊髄/動物断面)を考慮した。続いて、考慮した断面について、5つの関心領域(ROI)を選択して、形態学分析を実行した(管の数/フィールド、枝の平均数/管、管の最大長さ;管のねじれ)。管ねじれ値を、全ての枝のユークリッド距離の総平均値に対する管の総平均長の比率として算出した。図18Cに示すように、形態学的分析は、対照動物の脊髄柔組織において、複数のTHEM移植を受けた動物(30.940±3.592、n=3)に対してより多数の管(37.070±0.379、n=3)を示した;しかしながら、後者は、管がより多数の枝を有し(2.110±0.165 THEM移植を受けた動物、n=3;1.793±0.073対照、n=3)、(図18D)、そして最大長が有意に長い(55.410±2.500 THEM移植を受けた動物、n=3、43.450±0.751対照、n=3)(図18E)。ねじれ値は、考慮した2つの実験群間で、差異を示さない(1.168±0.005 THEM移植を受けた動物、n=3、1.153±0.015対照、n=3)、図18F。これらのデータは、THEMが、管長及び分枝を増大させることによって脈管構造を回復させることを示唆した。
ヒト運動ニューロンに及ぼすマウスTHEMのインビトロ再生効果
示すデータは、インビボ複数THEM移植が、種々の最前部上の脊髄柔組織のプロ再生/保護効果をもたらすことを示しており(ニューロンレベルにて、膠瘢痕、ミエリン成分)、このことは、移植細胞の効果が、単一の特定の細胞型に限定されないことを示唆している。分析下での処置の変換能を考慮して、そしてインビボで観察されるTHEMの効果が、ヒトニューロン細胞にも応用可能かを評価するために、発明者らは、運動ニューロンに分化するヒト多能性幹細胞の培養物に及ぼすTHEM及びM2マクロファージの効果を評価した。ニューロン分化の最終段階の間に、THEM又はM2を培養物に2日間加えた。分化段階が完了すると、ニューロン特異的マーカーβIIIチューブリン(Tub3)の発現領域を、樹状突起の数及びその伸長の指標として評価した(40フィールド/ドナー、4画像/フィールド、n=3)(図19A～C)。図19Dに示すように、Tub3の発現の領域は、THEMとの共培養において、M2マクロファージ(7.235%±0.492%)及び対照ビヒクル培養物(6.423±0.494)とのものに対して有意に大きい(9.097%±0.253%)。これらの結果は、THEMが、M2マクロファージ及び対照ビヒクルと比較して、ヒト運動ニューロンの樹状突起のより大きなニューロン分化及びより大きな伸長を促進することを示唆した。
ヒトTHEMは、固有の分子同一性を示す
発明者らは、全トランスクリプトーム分析を実行して、THEM特異的分子シグネチャーを定義し、そしてTHEMシグネチャー仕様における低酸素の役割を特定した。発明者らは、低酸素で培養したTHEMの全遺伝子発現を、TCM、低酸素なしの腫瘍馴化で培養したマクロファージ、分極化M2マクロファージ、及び未処理未分化M0マクロファージのものと比較した。サンプル毎に4つの異なるドナーのトランスクリプトームに分析を実行した。主成分分析(PCA)は、THEMが、低酸素、M2、及びM0なしで培養したTCMから明らかに分離した群にクラスター化することを示した(図20)。この結果は、i)THEMが、腫瘍馴化及び低酸素の双方を必要とする固有の分子シグネチャーを有すること、ii)THEM分子シグネチャーが、低酸素、M2、及びM0マクロファージなしで培養したTCMのものと異なることを示した。
異なるマクロファージ集団の分子シグネチャーは、以下のことを明らかにした:
- THEMは、CYTIP、VEGFA、GLUT1、GLUT3、CXCR4、LFA-1、MMP9、MT2A、MT1G、ANGPTL4、NDRG1、HK2、及びVCANの高い遺伝子発現レベルによって特徴付けられる(Table 3(表3)、Table 6(表6))。THEMは、PLXNA2、HSPH1、CYCS、TIGAR(Table 4(表4))、ALOX15、CCL8、及びCCL26を非常に低いレベルで発現する/発現しない、
-低酸素なしで培養したTCMは、TGFBI、DAB2、FUCA1、CYP1B1、MAFB、CCL2を高いレベルで発現し、且つMT2A及びMTFP1を低いレベルで発現する/発現しない、
- M2マクロファージは、高いレベルのCD206、CD163、CD86、TREM2、IL1RN、IL10、STAT3、STAT6、fabp4、sphk1、HOMOX1、IRF4、PPAR-γ、CCL22を発現する。M2マクロファージは、CCR7、IL2RA、及びCXCL11を非常に低いレベルで発現する/発現しない。トランスクリプトーム分析は、M2マクロファージについて予想されるシグネチャーを確認した(11、12)、
- M0マクロファージは、以前に記載(13)される、高いレベルのNINJ1、F13A1、SCARB1、及びSTAB1、AOAH、TLR7、A2M、FNBP1、CD209、SH3KBP1、並びにITSN1を発現する。
低酸素で培養したTHEMにおいて最も上方制御される遺伝子は、以下に関する遺伝子オントロジーに関連する:創傷治癒(Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、血管形成(Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、解毒及び防御応答の調節(Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、低酸素に対する応答(Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、細胞外マトリックスリモデリング(Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)、並びにニューロン生存及びミエリン形成(Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)(図21、Table 3(表3)、及びTable 6(表6))。
低酸素で培養したTHEMは統計学的に(p<0.05)、低酸素なしで培養したTCM(4012個の遺伝子)、M2マクロファージ(6786個の遺伝子)、及びM0マクロファージ(4097個の遺伝子)と比較して、多数の遺伝子を示差的に発現し、PLXNA2、HSPH1、CYCS、TIGARの上方制御、並びにPLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARの下方制御が挙げられる(図22)。
THEM固有の同一性は、TCM、M2、M0マクロファージと比較して、特定の、23個の遺伝子の上方制御及び24個の遺伝子の下方制御によって特徴付けられた(Table 3(表3)及びTable 4(表4))。
ヒトTHEM走化性特性
発明者らは、THEM、低酸素なしで培養したTCM、及びM2マクロファージの、SDF-1(100ng/ml)に対する走化性特性を、トランスウェルアッセイを用いて評価した。結果は、THEMが、TCM及びM2マクロファージよりもSDF-1に対する統計学的に有意に高い走化性応答を有することを示した(図23参照)。これらのデータは、他のマクロファージと比較して、THEMにおけるSDF-1受容体CXCR4遺伝子発現の上方制御と一致する。これらのデータは、THEMにおいてのみ存在する低酸素処理が、SDF-1に対する走化性応答の増大に必要とされることを示唆した。
低酸素誘導は、ヒト運動ニューロンに対してヒトTHEM及びマウスTHEMインビトロニューロン再生機能を付与することが必要とされる
発明者らは、ヒトTHEM及びマウスTHEMの双方の、ヒト運動ニューロンに対するニューロン再生機能を評価した。
脊髄において、運動ニューロンが、中枢神経系を末梢に接続するプロセスに達する。SCI後に、運動ニューロンが損傷を受けて、ニューロンプロセスを再生させることができない。THEMの運動ニューロン再生能を評価するために、そして低酸素処理がTHEMニューロン再生機能に必要とされることを確認するために、発明者らは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する運動ニューロンのニューロンプロセスの生成を促進するTHEM能力を試験した。発明者らは、低酸素で培養したマウスTHEMの、iPSC由来の運動ニューロンニューロンプロセス伸長に及ぼす効果を、TCM及びマウスM2マクロファージと比較した。発明者らは、ニューロン分化の最終段階の間に、マクロファージを、iPSC由来運動ニューロンと2日間共培養した。特異的ニューロンマーカーβIII-チューブリン(Tub3)とニューロン細胞骨格との間の相関を考慮して(S S Easter Jrら、J Neurosci, Initial tract formation in the mouse brain、1993年)、発明者らは、ニューロンプロセスの数の、そしてその伸長の指標として、Tub3の発現を定量化した。Tub3発現領域を、考慮する総領域について正規化する閾値によって定量化した。図24に示すように、Tub3発現は、対照(細胞なし、CTRL、4.83%±0.162%)、M2マクロファージ共培養(4.779%±0.284%)、及びTCM(3.937%±0.192%)と比較して、THEM共培養(6.502%±0.204%)において有意に高かった。これらの結果は、低酸素で培養したTHEMのみが、固有の神経再生能を確認する、ヒト運動ニューロンのニューロンプロセス及びその伸長の増大を促進することができることを示した。重要なことに、低酸素なしの腫瘍馴化で得たTCMマクロファージは、ニューロンプロセスを増大させることができず、THEMの再生表現型を確定するための低酸素の基本的寄与を確認した。
発明者らは更に、ヒトマクロファージも用いて、マウスマクロファージにより観察されるヒト運動ニューロンに及ぼす再生効果を評価した。発明者らは、低酸素で培養したヒトTHEM、低酸素なしの腫瘍馴化で培養したTCM、未分化M0ヒトマクロファージ、及び分極化M2ヒトマクロファージを、ヒトiPSCに由来する運動ニューロンと共培養した。共培養の2日後(分化プロトコール終了後)、発明者らは、ニューロンプロセスの数の、そしてその伸長の指標として、Tub3の発現を定量化した。Tub3発現領域を、総領域について正規化する閾値によって定量化した。マウスTHEMにより観察されたものに類似して、この分析は、低酸素処理ヒトTHEMのみが、対照(細胞なし、CTRL、3.55%±0.409%;p<0.001)、TCM(2.873%±0.184%)、M0(1.94%±0.358%、P<0.01)、M2(2.89%±0.258%、P<0.01)と比較して、ニューロン分化及びニューロンプロセス伸長を増大させる(ヒトTHEM:5.96%±0.360%)ことを示した(図25)。これらの結果は、ニューロン分化を誘導するヒトTHEM固有の特性を確認して、ニューロンプロセス伸長を増大させて、更に、THEM再生シグネチャーを得るのに必要とされる低酸素の役割を支持した。
低酸素誘導が、有効なインビボTHEMを得るのに必要とされる
発明者らは、追加のインビボ実験を実行して:i)THEMの存在は、SCI後に脊髄ニューロン組織の再生を促進する、脊髄ニューロン組織に有益な効果を発揮すること、そしてii)低酸素の役割は、THEMが再生能を達成するのを可能にする基礎となることを確認した。
発明者らは、重度の挫傷性脊髄損傷(SCI)後の運動器官の機能に及ぼす低酸素処理したTHEMのインビボ効果を試験した。発明者らは、低酸素処理したTHEMの再生効果を、腫瘍馴化あり、そして低酸素なしで培養したTCMマクロファージのものと比較して、Basso Mouse Scale(BMS)により運動器官の回復を分析した。異なるマクロファージを、損傷後3、14、17日目に注射した。1dpiにて0.5未満のBMSスコアを示したマウスのみを分析において考慮して、BMSスコアがより高い動物を破棄した。図26に示すように、低酸素処理THEMは、SCIマウスに従って、運動回復に及ぼす効果を有したが、低酸素なしで培養したTCMはそうでなかった。特に、図26に示すように、複数のTHEM移植は、TCM(0.300±0.200)、又はビヒクル(細胞なし、0.711±0.068)の複数の移植と比較して、運動器官の回復の有意な向上を示した。統計分析は、14、17、18、21、24、及び28dpiにて、THEM移植マウスとビヒクル注射マウスとの間で、BMSスコアに関する有意差を示した。同様に、統計分析は、17、18、21、24、及び28dpiにて、TCMと比較して、THEM移植マウス間で、BMSスコアに関する有意差を示した。これらのデータは、THEM再生機能を得るのに低酸素誘導が必要とされることを確認した。
[参考文献]
Figure 2024512001000009
Figure 2024512001000010

Claims (15)

  1. 生体サンプルから単離した単核食細胞の集団の表現型変化及び/又は機能変化を誘導するインビトロ又はエクスビボ方法であって、腫瘍培養物又は外植片から放出される因子を含む培養培地中での前記集団のインキュベーションを含み、
    インキュベーションが、低酸素条件下で起こり、
    前記インキュベーションが、集団の単核食細胞の表現型変化及び/又は機能変化を誘導する、
    方法。
  2. 単核食細胞が単球であり、且つ/又はインキュベートされた単核食細胞集団が、生体サンプルから単離した単球のインビトロ培養であり、且つ/又は培養培地が、単球をマクロファージに分化させることができる因子、例えばマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 集団が、6時間若しくは12時間～20日間、より好ましくは6時間～10日間、又は好ましくは6時間～72時間若しくは3～8日間、更により好ましくは18時間～24時間若しくは6日間、更により好ましくは18時間若しくは7日間インキュベートされる、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 表現型変化及び/又は機能変化に誘導される単核食細胞が、マクロファージである、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 培養培地が、腫瘍上清を含み、前記上清が、好ましくは、固形腫瘍、腫瘍外植片、又は腫瘍細胞株の培養物から、好ましくは線維肉腫又は神経膠腫から得られ、或いは好ましくは、好ましくは腫瘍細胞株、腫瘍外植片、若しくは固形腫瘍から、又は分離且つプレーティングされたインビトロ腫瘍の摘出物から、好ましくは約6時間～20日間、より好ましくは約12～72時間生成された腫瘍(CTM)で馴化された培地である、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 培養培地が、細胞培養培地、イーグル最小必須培地若しくはその派生物、及び/又はRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640及び/又はMedia 199及び/又はフィッシャー培地及び/又はイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)からなり、1～99%、好ましくは10～90%、より好ましくは30～50%、更により好ましくは30%又は50%の培地が、腫瘍(CTM)又は腫瘍上清で馴化されている、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項1～6のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な単核食細胞、好ましくはマクロファージであって、好ましくは、前記食細胞が
    i)以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aの少なくとも1つを発現し、且つ/又は
    ii)以下の遺伝子:PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARの少なくとも1つを低いレベルで発現する/発現しない、
    単核食細胞。
  8. 単離した単核食細胞、好ましくはマクロファージであって:
    i)以下の遺伝子:CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aの少なくとも1つを発現し、且つ/又は
    ii)以下の遺伝子:PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARの少なくとも1つを低いレベルで発現する/発現しない、
    単離した単核食細胞。
  9. 前記食細胞が:
    i)CXCR4、CYTIP、SLC2A3、及びMT2Aを発現し、且つ
    ii)PLXNA2、HSPH1、CYCS、及びTIGARを低いレベルで発現する/発現しない、
    請求項7又は8に記載の単核食細胞、好ましくはマクロファージ。
  10. 請求項7～9のいずれか一項に記載の少なくとも1つの単核食細胞を含む単核食細胞の集団。
  11. 好ましくは、Table 1(表1)及び/若しくはTable 2(表2)及び/若しくはTable 3(表3)及び/若しくはTable 6(表6)の遺伝子の少なくとも1つの発現によって、且つ/又はTable 2(表2)の分子の少なくとも1つの分泌によって特徴付けられ、好ましくは、メタロプロテアーゼ(例えば、Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)、並びに/若しくは栄養因子(例えば、VEGF、FGF、IGF)、並びに/若しくは細胞接触及び接着分子(例えば、Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)、並びに/若しくは生存(例えばRtn4rl2)及び/若しくは免疫調節(例えば、Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd1)を促進するメディエータの発現、並びに/又は後天性再生特性を有すること、並びに/或いは創傷治癒に対する応答(例えば、Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、並びに/又は血管形成(例えば、Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、並びに/又は解毒及び防御応答の調節(例えば、Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、並びに/又は低酸素に対する応答(例えば、Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、並びに/又は細胞外マトリックスリモデリング(例えば、Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)、並びに/又はニューロン生存及びミエリン形成(例えば、Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)に関連する遺伝子の少なくとも1つの発現によって特徴付けられる、好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである、請求項7～9のいずれか一項に記載の単核食細胞、又は請求項10に記載の単離した単核食細胞の集団。
  12. 医療的使用のための、好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである、請求項7～9若しくは11のいずれか一項に記載の単核食細胞、又は請求項10若しくは11に記載の単離した単核食細胞の集団。
  13. 細胞療法及び/又は再生医療、好ましくは、創傷、創傷における組織喪失、外科的潰瘍、糖尿病性創傷の、組織又は細胞修復に、組織又は細胞再生に、組織リモデリングに、処置及び/又は修復及び/又は治癒に、神経変性、網膜変性、遺伝的疾患(例えばALS)、自己免疫疾患(関節炎、コラーゲン異常症)、又は更に膵島の変性が起こる糖尿病に起因する変性が挙げられる変性の症状の処置に、炎症の、組織の炎症の処置及び/又は分析に、損傷の、損傷を受けた組織等の処置に、好ましくは、中枢神経系の包埋組織の喪失によって特徴付けられる病変の処置に、好ましくは、脊髄の病変又は損傷、例えば重度の脊髄損傷又は脊髄損傷、好ましくは重度又は挫傷性の脊髄損傷の処置における使用のための、好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである、請求項7～9若しくは11のいずれか一項に記載の単核食細胞、又は請求項10若しくは11に記載の単離した単核食細胞の集団。
  14. 食細胞が、病変後の2日～60日又は1年、好ましくは病変後4～21又は15～60日に投与される、好ましくは前記単核食細胞が請求項11又は12に記載の使用のためのマクロファージである、請求項12又は13に記載の使用のための単核食細胞又は単離した単核食細胞の集団。
  15. 好ましくは前記単核食細胞がマクロファージである、請求項7～9若しくは11のいずれか一項に記載の単核食細胞、又は請求項10若しくは11に記載の単離した単核食細胞の集団、及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
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