KR20230157465A - 종양-저산소증 학습된 재생 대식세포의 수득 방법 및 재생 의학에서의 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 집단의 인큐베이션을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 단리된 단핵 식세포 집단의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법에 관한 것으로서, 상기 인큐베이션은 저산소 조건 하에서 일어나고, 상기 인큐베이션은 집단의 단핵 식세포의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도한다. 따라서, 수득된 대식세포는 M2 대식세포를 포함한 다른 극성 표현형에는 존재하지 않는 고유한 재생 표현형을 가정한다. 또한, 본 발명은 따라서 신경 조직을 포함하는 조직의 재생을 위해 생성된 생물반응기의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재생 의학에 사용하기 위한 재생 생물반응기로서 작용하는 대식세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 방법은 특히 종양 세포주 또는 종양 덩어리로부터 분리된 종양 세포, 또는 분리된 종양 체외이식편 또는 종양 절제 및 특정 부분 산소압에 의해 조건화된 배지에 의해 시험관 내에서의 대식세포의 활성화에 관한 것이다. 따라서 수득된 대식세포는 M2 대식세포를 포함한 다른 극성 표현형에는 존재하지 않는 고유한 재생 표현형을 가정한다.
본원에 정의된 바와 같은 마우스 유래 세포의 재생 생물반응기 표현형은 메탈로프로테아제(Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27 포함), 영양 인자(VEGF, FGF, IGF 포함), 및 세포 접촉 및 부착 분자(Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6 포함), 생존을 촉진하는 매개체(Rtn4rl2 포함), 및 면역조절(Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6 포함)의 광범위한 발현을 포함한다. 본원에 정의된 인간 유래 세포의 표현형은 상처 치유(Adm, Bnip3, Pdgfb, Vegfa 포함), 혈관신생(Vegfa, Angptl4, Cxcl8, Lep, Rora, Apln 포함), 해독 및 방어 반응의 조절(Ndrg1, Mt1e, Mt1f, Mt1g, Mt1h, Mt1x, Mt2a, Mt3, Ddit4, Nupr1 포함), 저산소증에 대한 반응 (Hk2, Pfkfb3, Slc2a1, Slc2a3, Cxcr4, Plin2, Adm, Bnip3, Lep, Rora, Ndrg1, Egln3, Mt3, Plod2, Hilpda, Angptl4 포함), 세포외 기질 리모델링(Mmp9, Vcan, Fgf11, Cxcl8, Lep, Pdgfb, Plod2, Vegfa, Angptl4, Sulf2, Egln3 포함), 및 뉴런 생존 및 수초화(Mt3, Jam2, Vldlr, Nupr1, Egln3 포함)와 관련된 유전자의 광범위한 발현을 포함한다.
또한, 본 발명은 신경 조직을 포함하는 조직의 재생을 위해 생성된 생물반응기의 용도에 관한 것이다.
중추 신경계(CNS)는 더 높은 수준의 기능(인지)을 조정하는 뇌와, 주로 뇌와 말초(외감각 및 운동) 사이의 소통 경로 역할을 하는 척수를 포함한다. 인간의 다른 조직과 달리, 신경 조직의 재생 능력은 낮고, 신경 조직 병변은 저절로 치유되지 않는다[1]. 신경 조직 병변은 저절로 치유되지 않는다. CNS에서, 손실된 조직은 신경교, 섬유증 성분이 있고 염증성 면역 세포로 구성된 반흔 조직(scar tissue)으로 대체된다[2]. 병변의 진행은 신경 조직이 반흔 조직으로 대체되어 결과적으로 신경 연결의 연속성 상실, 그의 기능 및 장애의 출현을 수반한다. CNS 손상으로 인한 장애는 손상의 형태, 중증도 및 해부학적 위치에 따라 다르다.
매년 전 세계적으로 약 250 내지 500,000명이 척추 손상을 입어 높은 의료 비용이 발생한다(환자당 약 100만 내지 400만 유로로 추정)[3,4]. 높은 사회적 및 경제적 비용에도 불구하고, 현재 척추 손상 치료를 위해 개발된 가능한 치료법은 거의 없다. 또한, 현재 이용 가능한 치료법은 척수 외상으로 인한 2차 손상을 제한하고 병변 부위에 손상되지 않고 남아 있는 소수의 축삭 연결을 보존하는 것만 가능하다. 지난 30년 동안 과학계는 척추 손상(SCI) 후 생존율을 상당히 증가시키는 많은 접근법을 개발했지만, 척추 손상을 치료하여 그에 따른 최적의 완전한 운동 회복을 위한 효과적인 치료법은 아직 없다. 병리학적 수준에서, 척추 손상은 손상 부위의 신경 성분의 손실을 유발하여, CNS와 말초(근육) 사이의 자극 전달을 중단시킨다. 신경 조직 변성은 조직 허혈, 세포 사멸 및 염증과 관련된 복잡한 현상의 결과이다.
신경 손상의 진행을 유도하고 신경 조직의 재생을 방해하는 CNS 병변의 병리학적 미세환경 (생물학적 필요)
신경 조직의 손상으로 인한 1차 손상 외에 혈액 관류의 저하로 인한 2차 손상이 있는데, 이는 신경 세포의 대사를 유지하기 위한 기질(O2 및 영양분)의 공급 부족, 그리고 부종과 염증성 침윤을 유발하여 병변 주변에 남아 있는 신경 조직을 더욱 압박하여 병변을 악화시키는 혈관 투과성 증가에 관여한다. 이러한 복잡한 병태는 주로 관련된 부위를 둘러싼 신경 조직 세포의 사멸을 증가시킨다. 손상 부위를 제한하기 위해 강한 염증이 발생하고, 성상교세포의 반응성 활성화가 병변을 구분시킨다. 염증성 면역 세포, 특히 염증성 대식세포(M1이라고 함) 및 간질 세포와 함께 신경교 흉터를 형성하는 성상교세포는 병변 부위를 채우지만 축삭 성장과 신경 세포 분화를 억제하는 특징적인 세포외 기질을 생성한다. 또한, 염증성 성분은 세포 사멸에 의해 만성적으로 활성화되어 병변의 미세환경 손상 및 신경 조직 손상의 만성 진행에 기여한다. 따라서 병리생리학적 과정은 신경 조직 병변의 형성, 진행 및 만성화에 기여하는 여러 요인들의 복합적인 관련을 나타낸다[4-6]. 현재, 신경조직의 상실을 특징으로 하는 질환에 대한 재생 의학 방법은 주로 상실된 신경 조직을 대체(세포교체)하는 것을 목적으로 하는 줄기세포의 사용을 기본으로 하고 있다. 이를 위해, 배아 줄기세포(ESC) 및/또는 태아 신경 줄기세포(NSC) 및 이의 신경 분화 유도체(예를 들어, 희돌기아교세포 전구체) 또는 신경 분화 유도 다능성 세포(iPSC)(iPSC-NSC)가 테스트되었다[7,8]. 이들 치료법은 완전 좌상성 척추 손상(complete contusive spinal cord injury)을 특징으로 하는, 본 발명자들에 의해 사용된 중증 신경변성 모델에서 아직 임상적 효능을 나타내지 않았다.
환자 자신이 직접 채취하여 재생 목적(자가 조직)을 위해 이식될 수 있는 세포 공급원을 찾는 과정에서, 수많은 다른 성체 줄기세포 집단도 테스트되었다. 그러나, 이러한 연구는 신경 세포에 주입된 세포의 직접적인 분화가 아니라 "방관자" 효과, 즉 영양 및 염증 조절에 의해 뒷받침되는 이러한 치료의 부분적인 이점을 보여주었다. 이러한 성질을 나타내는 줄기세포로는 골수(BM-) 또는 지방 조직(A-) 유래의 성체 신경 줄기세포(마우스에만 존재하는 aNSC), 조혈줄기세포(HSC), 및 중간엽 줄기세포(MSC)가 포함된다[7]. 다양한 효능으로, 이러한 세포 유형은 특정 재생 능력을 보여, 손상된 조직에 영양 인자를 제공하고 염증을 감소시킨다. 그러나, 이러한 접근법은 중증 만성 신경퇴행성 질환의 치료에는 충분히 효과적이지 않았다. 세포의 마지막 클래스로서 대식세포를 포함한 면역 세포의 재생 능력도 최근 테스트되었다. 정맥내로 또는 신경 조직 손상 부위에 주입된 M2 표현형을 유도한 대식세포는 부분적인 재생 효능을 보였지만, 사용된 모델은 중증의 만성적인 신경퇴행성 질환에 해당하지 않았다[9]. M2 대식세포 이식의 치료 효과는 척추 손상 환자를 대상으로 한 2상 임상 시험에서 테스트되었다. M2 이식은 어떠한 심각한 부작용도 나타내지 않았지만, 이 연구에서는 치료받지 않은 대조군 환자와 비교하여 M2 치료의 주요 결과에 있어서 유의미한 차이를 입증하지 못했다[10]. 따라서, Lammertse 등에 의한 연구는 자가 M2 대식세포를 이용한 급성 완전 SCI 치료의 효능을 뒷받침하지 못했다.
결론적으로, 선행 기술 분석은 심각한 신경 조직 손실을 특징으로 하는 질환을 위한 효과적인 치료법이 존재하지 않기 때문에 이를 치료할 수 있는 치료법이 여전히 필요하다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 심각한 신경 조직 손실을 부분적으로 재생하고 운동 회복을 촉진할 수 있는 것으로 나타난, 복합 생물반응기인 "종양 저산소증 학습된 대식세포"(THEM)("종양 학습된 대식세포"(TEM)로도 정의될 수 있음)의 사용을 기반으로 심각한 신경 조직 손실을 특징으로 하는 질환에 대한 치료법을 개발하였다. 신경 조직 손실의 패러다임으로서, 본 저자들은 심각한 (완전) 좌상성 척추 손상(SCI)의 실험 동물 모델에서 치료 효능을 테스트하였다(SCI).
자연에 존재하는 "재생"의 가장 좋은 예로 간주되는 종양의 특성은 심각한 신경 조직 손실을 특징으로 하는 퇴행성 질환의 재생에서 면역 세포를 효과적인 생물반응기로 변환하는 데 사용되었다. 특히, 면역 세포는 아래에 설명되는 바와 같이 종양 조건화 및 저산소증으로 "학습"된다.
그런 다음 THEM(종양 및 저산소증 학습된 대식세포)을 SCI 동물의 병변 부위에 주입하였다. THEM의 투여는 치료적이며, 즉, 세포는 손상 후 며칠 후에 주입된다. THEM은 7회의 독립적인 실험을 통해 200마리 이상의 동물을 대상으로 테스트되었으며, 그의 효과는 다학제적 방법을 사용하여 평가되었다.
현재 접근방식과 관련된 두 가지 주요 결과가 있다:
1-
다양한 유형의 이식된 줄기세포를 포함하여 현재 제안된 치료법에서 발명자가 발견한 것과 관련하여 운동 회복 수준 및 양성 사례의 빈도 측면에서 효과 수준이 더 높다;
2-
병변 전 또는 직후(24시간)에 치료가 투여되는 다른 치료 중재 모델과 달리, 본 경우 세포 치료는 병변 후 4일, 즉 인간 치료를 위한 실제 조건에 해당하는 단계에서 개시된다.
THEM 재생 효과에 대한 저산소증의 역할을 평가하기 위해, 발명자들은 THEM 분자 및 기능적 표현형에 대한 특정 저산소증-유발 효과를 특성화하기 위한 목적으로 시험관 내 및 생체 내 실험을 수행했다.
특히, 발명자들은 THEM(저산소증과 함께 배양됨)의 전체 전사체를 분석하여 저산소증 특이적 시그니처(signature)가 있는 THEM을 정의하고, 이를 저산소증 없이 배양된 THEM(종양 조건화된 대식세포(TCM: Tumor Conditioned Macrophages)) 및 M0 및 M2 표현형으로 극성화된 대식세포의 것과 비교했다.
그들은 또한 THEM(저산소증과 함께 배양), TCM(저산소증 없이 배양) 및 M2 대식세포를 비교하는 이동성 분석을 수행하여 저산소증이 THEM의 SDF-1에 대한 화학주성(chemotactic) 반응을 증가시키는 것을 확인하였다. 그들은 iPSC에서 유래된 인간 운동 뉴런과 공동-배양 실험을 수행하고, 저산소증 상태에서 배양된 뮤린 및 인간 THEM, 저산소증 없이 배양된 TCM, 및 M2 대식세포의 신경 과정 생성 및 신장(elongation)에 미치는 영향을 비교하여, 저산소증 치료가 인간 운동 뉴런의 THEM 시험관 내 뉴런 재생 기능에 부여되는지 확인했다. 추가로, 발명자들은 THEM(저산소증과 함께 배양됨) 및 TCM의 척추 손상 마우스 운동 회복에 대한 생체 내 효과를 비교하고, 저산소증 치료가 생체 내 뉴런 재생 기능을 THEM에 부여한다는 것을 확인했다.
따라서, 본 발명의 목적은 생물학적 샘플로부터 단리된 단핵 식세포 집단의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법이며, 이는 저산소 조건 하에서 인큐베이션이 일어나고, 상기 인큐베이션이 집단의 단핵 식세포의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하는 종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 집단을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 인큐베이션된 단핵 식세포 집단은 생물학적 샘플로부터 단리된 단핵구(대식세포의 순환 전구체로 정의될 수 있음)의 시험관 내 배양물이다.
단핵구는 예를 들어 원심분리 구배에 의해 말초 혈액으로부터 채취되거나, 말초 혈액으로부터 단핵 세포의 이전 단리로부터 해동될 수 있다.
바람직하게는, 단핵 식세포는 단핵구이다.
배양 배지는 바람직하게는 단핵구를 대식세포로 분화시킬 수 있는 인자, 예를 들어 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF) 또는 IL34 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.
바람직하게는 단핵 식세포는 대식세포, 바람직하게는 뮤린 또는 인간이고, 바람직하게는 골수에서 채취하거나 혈액에서 유래한 세포로부터 예를 들어 반복적인 원심분리 구배를 통해 얻는다.
바람직하게는, 인큐베이션은 저산소 조건 하에서 수행된다. 저산소 조건은 대기 농도보다 낮은 산소 농도를 사용하는 것을 지칭한다.
집단은 바람직하게는 6시간 또는 12시간 내지 15 또는 20일, 더욱 바람직하게는 6시간 내지 10일 또는 바람직하게는 3 내지 8일 또는 6시간 내지 72시간, 더욱 더 바람직하게는 18시간 내지 24시간 또는 6일, 더욱 더 바람직하게는 7일 또는 18시간 동안 인큐베이션된다.
표현형 및/또는 기능적 변화에 의해 유도된 단핵 식세포는 바람직하게는 대식세포이다. 따라서, 바람직한 구현예에서 수득된 세포는 대식세포이다.
바람직하게는, 배양 배지는 종양 상청액을 포함하며, 상기 상청액은 바람직하게는 섬유육종 또는 신경아교종으로부터의 바람직하게는 고형 종양, 종양 체외이식편 또는 종양 세포주의 배양물로부터 수득된다.
바람직하게는, 종양 상청액은 바람직하게는 종양 세포주, 종양 체외이식편, 또는 고형 종양으로부터, 또는 바람직하게는 약 12시간 내지 20일, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 72시간의 기간 동안 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제로부터 생성된 종양으로부터 조건화된 배지(조건화된 종양 배지, CTM으로도 정의됨)이다.
바람직하게는 배양 배지는 세포 배양 배지, 예를 들어, 이글의 최소 필수 배지(Eagle's minimal essential medium) 또는 이의 유도체, 및/또는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640, 및/또는 Media 199 및/또는 Fischer의 배지, 및 1 내지 99%, 바람직하게는 10 내지 90%, 더욱 바람직하게는 30 내지 50% 더욱 더 바람직하게는 30% 또는 50%의, 종양 또는 종양 상청액으로부터 조건화된 배지(CTM)로 이루어진다.
대식세포는 바람직하게는 6일 동안 바람직하게는 M-CSF 또는 GM-CSF 및 선택적으로 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM: Dulbecco's modified Eagle's medium) 및/또는 열-불활성화 소 태아 혈청 및/또는 페니실린/스트렙토마이신, 및/또는 글루타민을 포함하는 배지로 분화된다.
바람직하게는 분화된 대식세포는 바람직하게는 종양으로부터 조건화된 배지(CTM) 및 D-MEM에서 1:9 내지 9:1 비율, 바람직하게는 1:1 비율로 배양되고, 바람직하게는 18시간 동안 저산소 조건(예를 들어, 1% O2) 하에 바람직하게는 성장된다.
바람직한 양태에서, 대식세포는 바람직하게는 30% CTM과 함께 10% 열-불활성화 송아지 태아 혈청 및 100 ng/ml 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF) 및 선택적으로 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 바람직하게는 6일 동안 시험관 내에서 배양된다.
단핵구 배양물은 전체 배양 기간 7일 동안, 또는 마지막 6 내지 96시간 동안, 바람직하게는 마지막 18 내지 24시간 동안, 더욱 바람직하게는, 마지막 18시간 동안 저산소 조건(0.5 내지 20% O2, 바람직하게는 1% O2)에서 인큐베이션된다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포이다.
바람직하게는 상기 식세포는:
i)
다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A 중 적어도 하나를 발현하고/하거나;
ii)
낮은 수준/전혀 없는 수준의 다음 유전자: PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR 중 적어도 하나를 발현한다.
M2 세포는 실제로 매우 낮은 수준/전혀 없는 수준의 CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A를 발현하고, PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR을 발현한다(도 22b 및 c 참조).
본 발명의 추가 목적은:
i)
다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A 중 적어도 하나를 발현하고/하거나;
ii)
낮은 수준/전혀 없는 수준의 다음 유전자: PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR 중 적어도 하나를 발현하는
단리된 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포이다.
바람직하게는, 본 발명의 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포는, CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A를 발현하고; 낮은 수준/전혀 없는 수준의: PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR을 발현한다.
본 발명의 추가 목적은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 단핵 식세포를 포함하는 단핵 식세포의 집단이다.
본 발명의 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단(바람직하게는 상기 단핵 식세포는 대식세포임)은, 바람직하게는 표 1 및/또는 표 2 및/또는 표 3, 및/또는 표 6의 유전자들 중 적어도 하나의 발현, 및/또는 표 2의 분자들 중 적어도 하나의 분비에 의해 특성화된다.
본 발명의 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단(바람직하게는 상기 단핵 식세포는 대식세포임)은, 바람직하게는 메탈로프로테아제(예를 들어 Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27)및/또는 영양 인자(예를 들어 VEGF, FGF, IGF) 및/또는 세포 접촉 및 부착 분자(예를 들어 Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6), 및/또는 생존을 촉진하는 매개체(예를 들어 Rtn4rl2) 및 면역조절을 촉진하는 매개체(예를 들어 Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd1) 및/또는 획득된 재생 특성들을 갖는 매개체의 발현에 의해 특성화된다.
본 발명의 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단(바람직하게는 상기 단핵 식세포는 대식세포임)은, 바람직하게는 상처 치유와 관련된 유전자(예를 들어 Adm, Bnip3, Pdgfb, Vegfa) 및/또는 혈관신생과 관련된 유전자(예를 들어 Vegfa, Angptl4, Cxcl8, Lep, Rora, Apln) 및/또는 해독 및 방어 반응의 조절과 관련된 유전자(예를 들어 Ndrg1, Mt1e, Mt1f, Mt1g, Mt1h, Mt1x, Mt2a, Mt3, Ddit4, Nupr1) 및/또는 저산소증에 대한 반응과 관련된 유전자(예를 들어 Hk2, Pfkfb3, Slc2a1, Slc2a3, Cxcr4, Plin2, Adm, Bnip3, Lep, Rora, Ndrg1, Egln3, Mt3, Plod2, Hilpda, Angptl4) 및/또는 세포외 기질 리모델링과 관련된 유전자(예를 들어 Mmp9, Vcan, Fgf11, Cxcl8, Lep, Pdgfb, Plod2, Vegfa, Angptl4, Sulf2, Egln3), 및/또는 뉴런 생존 및 수초화와 관련된 유전자(예를 들어 Mt3, Jam2, Vldlr, Nupr1, Egln3) 중 적어도 하나의 발현에 의해 특성화된다.
본 발명에 따르거나 본원에 기술된 바와 같은 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포는 바람직하게는 의학적 용도를 위한 것이고, 더욱 바람직하게는 세포 치료법 및/또는 재생 의학에 사용하기 위한 것이다.
본 발명에 따르거나 본원에 기술된 바와 같은 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포는 바람직하게는 조직 또는 세포 복구, 조직 또는 세포 재생, 조직 리모델링, 예방 및/또는 치료 및/또는 상처, 상처의 조직 손실, 외과적 궤양, 당뇨병성 상처, 신경변성, 망막 변성, 유전 질환(예컨대, ALS), 자가면역 질환(예컨대, 관절염, 교원병증) 또는 심지어 췌장섬의 퇴행이 일어나는 당뇨병으로 인한 변성을 포함하는 퇴행 병태의 회복 및/또는 치유; 염증, 조직 염증, 손상, 손상된 조직 등의 예방 및/또는 치료 및/또는 해결에 사용하기 위한 것이다.
본 발명에 따르거나 본원에 기술된 바와 같은 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포는 바람직하게는 중추 신경계 포매 조직의 상실을 특징으로 하는 병변의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명에 따르거나 본원에 기술된 바와 같은 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포는 바람직하게는 척추 병변 또는 손상, 예컨대, 중증도의 척추 손상, 또는 척추 손상, 바람직하게는 중증 또는 좌상성 척추 손상의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포는 바람직하게는 병변 (또는 손상) 후 2일 내지 60일 또는 1년까지, 바람직하게는 병변 (또는 손상) 후 4 내지 21일 또는 15 내지 60일에 투여된다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 적어도 하나의 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단, 바람직하게는 대식세포 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명에 따른 방법은 배양 배지 제거 후 단핵 식세포 배양물이 표현형 및/또는 기능적 변화를 겪었는지 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 확인은 표현형을 특성화하는 유전자 발현의 정량화와 iPSC에서 유래된 인간 뉴런 배양물에서 생존율 증가, 뉴런 분화 및 세포외 기질 재구성 능력을 예측하는 일련의 기능 테스트를 통해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대식세포"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 식세포 활성을 갖는 포유류 면역계의 항원-제시 세포 유형을 지칭한다. 이 세포는 그들의 구별되는 형태와 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II, CD68, CD11b 발현에 의해 특성화된다. 대식세포는 수지상 세포 또는 국소 증식에 의해 조직 대식세포로부터 유래된 세포가 아닌 단핵구-유래 식세포이다. 신체에서 이러한 세포는 조직 특이적이며, 예를 들어 간의 쿠퍼(Kupffer) 세포, 폐의 폐포 대식세포, 뇌의 미세아교 세포, 뼈의 파골세포 등을 지칭한다. 당업자는 대식세포 세포를 식별하는 방법, 인간 또는 동물의 신체에서 대식세포를 단리하는 방법, 및 하위클래스 및 하위집단과 관련하여 대식세포를 특성화하는 방법을 알고 있다.
대식세포는 역사적으로 표현형이 다양한 2개의 집단, 즉 M1 극성화 또는 "전통적으로 활성화된" 집단과 대식세포 M2 극성화 또는 "대안적으로 활성화된" 집단으로 나누어졌다.
M1 표현형을 나타내는 대식세포는 전염증성이고, 병원체 및 종양 항원을 직접적(병원체 패턴 인식 수용체) 또는 간접적(Fc 수용체, 보체 수용체)으로 인식할 수 있다(즉, 항종양 활성을 나타냄). M1 대식세포는 활성 산소종을 생성하고, 전염증성 사이토카인 및 케모카인, 예컨대, 예를 들어, 제한 없이, TNFα, IL-1, IL-6, IL-15, IL-18, IL- 23, 및 iNOS를 분비한다. M1 대식세포는 또한 높은 수준의 MHC, 보조자극 분자, 및 FCyR을 발현한다. M1 표현형은 GM-CSF에 의해 유발되고, 인터페론-γ(IFN-γ), 세균성 지질다당류(LPS), 또는 종양 괴사 인자 a(TNFα)에 의해 추가로 자극되며, 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT), 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄 강화제(NFKB) 및 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)와 연관된 여러 신호 전달 경로에 의해 매개된다. 이러한 현상은 활성 산소종 및 산화질소와 같은 작용제의 생성을 강화하고, 항원 제시 능력을 증가시키고 IL-12와 같은 사이토카인 생성을 통해 Th1 면역을 유도함으로써 후속 염증성 면역 반응을 촉진한다.
대조적으로, M2 표현형을 나타내는 대식세포는 T-세포 반응을 억제하고 Th2-유형 면역 반응에 관여하기 때문에 종종 항염증 및 면역억제성을 특징으로 한다. M2 대식세포 표현형은 조직 복구, 상처 치유를 촉진하고, 섬유화를 촉진한다. M2 대식세포는 I1-4R, FcsR, Dectin-1, CD 136, CD206, 및 CD209A의 높은 표면 발현에 의해 특성화된다. M2 대식세포는 IL-4/IL-13-자극된 대식세포, IL-10-유도된 대식세포, 및 면역 복합체-유발된 대식세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법은 대식세포 집단에서 하나 이상의 표현형 변화를 유도하여 대식세포 집단이 원하는 표현형을 갖도록 조정하는데 적합하다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "표현형 및/또는 기능적 변화"는 집단 내 단핵 식세포 또는 대식세포의 특징, 특성, 속성 또는 기능의 관찰 가능하거나 검출 가능한 변화를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 변형되거나 조절될 수 있는 대식세포의 표현형적 특징/특성/기능에는, 제한 없이, 전염증성 활성, 항염증성 활성, 면역원성 활성, 식세포 활성, 관용원성 활성, 조직 치유 활성, 이동 활성, 혈관신생 활성, 억제 활성, 항원 제시 활성 또는 식세포 활성, 세포외 기질 리모델링 활성, 세포외 기질 침착 활성, 영양 활성, 줄기/전구 세포 자가-재생, 세포 증식, 세포 분화, 세포 사멸 억제, 세포 생존, 세포 분비, 성장/영양 인자 분비, 축삭 재성장 자극 활성, 수초화 자극 활성, 대사 지원 활성이 포함된다.
대식세포의 표현형 및/또는 기능적 변화는 여러 가지 방식으로 관찰되거나 검출될 수 있다. 예를 들어, 표현형 및/또는 기능적 변화는 대식세포 자체에 대한 시험, 관찰 또는 측정을 수행하거나, 대식세포에 의해 영향을 받을 수 있는 다른 세포, 조직, 기관 등에 대한 시험, 관찰 또는 측정을 수행하거나, 또는 표현형적으로 변형된 대식세포가 함유된 대상체에 대한 시험, 관찰 또는 측정을 수행하여, 관찰되거나 검출될 수 있다.
표현형 및/또는 기능적 변화 또는 조절은 예를 들어, (i) 하나 이상의 유전자(Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27을 포함하는 메탈로프로테아제); 영양 인자(VEGF, FGF, IGF 포함) 및 세포 접촉 및 부착 분자(Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaL, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6 포함), 생존을 촉진하는 매개체(Rtn4rl2), 및 면역조절을 촉진하는 매개체(Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd6)의 발현 변화; (ii) 하나 이상의 분자(예를 들어, 사이토카인 TGFb3, Il16, Cxcl16, Isg15, Cxcl3, Cxcl1), 성장 인자(VEGF, FGF, IGF), 염증 매개체(Ptgs2, Ptges, Nos2, Arg1, 등)의 분비 변화; (iii) 면역 세포, 바람직하게는 대식세포에서 염증성 표현형(M1형)을 조절하고, 이들 세포에서 복구 표현형(M2형)을 유도하는 능력; (iv) 인간 및/또는 뮤린 신경 줄기세포 또는 유도성 다능성 인간 세포의 뉴런 분화를 유도하고 영양 결핍(산소 및 글루코스)의 조건 하에 생존을 증가시키는 능력, 및/또는 (v) 혈관신생을 유도하는 능력 및 (vi) 세포외 기질 리모델링 및/또는 (vii) SDF1에 대한 화학주성 반응을 검출하거나 측정하여 평가될 수 있다.
표현형 및/또는 기능적 변화 또는 조절은 또한, 예를 들어, 상처 치유와 관련된 하나 이상의 유전자(예를 들어 Adm, Bnip3, Pdgfb, Vegfa) 및/또는 혈관신생과 관련된 하나 이상의 유전자(예를 들어 Vegfa, Angptl4, Cxcl8, Lep, Rora, Apln), 및/또는 방어 반응의 해독 및 조절과 관련된 하나 이상의 유전자(예를 들어 Ndrg1, Mt1e, Mt1f, Mt1g, Mt1h, Mt1x, Mt2a, Mt3, Ddit4, Nupr1) 및/또는 저산소증에 대한 반응과 관련된 하나 이상의 유전자(예를 들어 Hk2, Pfkfb3, Slc2a1, Slc2a3, Cxcr4, Plin2, Adm, Bnip3, Lep, Rora, Ndrg1, Egln3, Mt3, Plod2, Hilpda, Angptl4) 및/또는 세포외 기질 리모델링과 관련된 하나 이상의 유전자(예를 들어 Mmp9, Vcan, Fgf11, Cxcl8, Lep, Pdgfb, Plod2, Vegfa, Angptl4, Sulf2, Egln3), 및 뉴런 생존 및 수초화와 관련된 하나 이상의 유전자(Mt3, Jam2, Vldlr, Nupr1, Egln3)의 발현 변화를 검출하거나 측정하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 CXCR4, CYTIP, SLC2A3, MT2A, PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR은 해당 분야에서 일반적인 의미를 갖는다. 예시적이고 비제한적인 인간 서열은 각각 NCBI 수탁 번호(유전자 ID): 7852, 9595, 6515, 4502, 5362, 10808, 54205, 57103로 개시된 서열로 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 언급된 유전자는 해당 분야에서의 일반적인 의미를 갖는다. 예시적이고 제한적인 서열은 표에 표시된 NCBI 수탁 번호(유전자 ID)로 개시된 서열로 표시된다.
본 발명의 방법에서, 대식세포를 생성/배양하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법으로서, 예를 들어 골수 또는 혈액 또는 임의의 유도체로부터 단핵구를 단리하는 방법(예를 들어 백혈구 성분채집술(leukapheresis), 연막(buffy coat)) 및/또는 M-CSF 또는 GM-CSF, 또는 형질감염된 세포주를 포함하는, 이러한 사이토카인의 임의의 생물학적 공급원의 존재 하에 시험관 내에서 배양하여 이를 대식세포로 분화시키는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 단핵 식세포는 골수로부터 단리된다. 바람직하게는, 단핵 식세포는 예를 들어 6일 동안 예를 들어 M-CSF를 포함하는 배지에서 배양함으로써 대식세포로 분화된다. 대식세포는 바람직하게는, 저산소 조건 하에서, 예를 들어 18시간 동안 CTM에서 배양된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 단핵 식세포는 말초 혈액으로부터 단리되고, CD14+ 단핵구에 대해 분류된다. 단핵구는 바람직하게는 정상산소증에서, 예를 들어 6일 동안, 그리고 저산소증에서, 예를 들어 18 내지 24시간 동안 CTM과 함께, 예를 들어 30% 배양된다.
대안적으로, CTM과의 배양은 먼저 저산소증 조건 하에 수행될 수 있고, 이어서 정상산소증 조건 하에 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 마우스 대식세포는 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 100 ng/ml M-CSF를 함유하는 고-글루코스 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM) 또는 Iscove의 변형된 둘베코 배지(IMDM)에서 6일 동안 분화된 골수 세포로부터 획득된다. 재생 생물반응기를 생성하고, 종양 조건화(tumor conditioning)로 대식세포를 "학습"시키기 위해, 분화된 세포는 바람직하게는 CTM 및 D-MEM을, 바람직하게는 1:1 비율로 함유하는 배지에서 배양되고, 저산소 조건(예를 들어, 0.5 내지 20% O2, 바람직하게는 1% O2) 하에 6 내지 96시간, 바람직하게는 18시간 동안 배양된다. 인간 대식세포는 바람직하게는 순환하는 단핵구로부터 유래된다. (순환하는) 단핵구는 바람직하게는 반복 구배 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 단리되고(예를 들어 Lympholyte, Cederlane, #CL5020, 및 Percoll, Cytiva, #17089101)/되거나, CD14+ 단핵구의 면역-자기 농축에 의해 단리된다(예를 들어 Milteniy Biotec). 수득된 단핵구는 바람직하게는 20 내지 50% CTM, 바람직하게는 30% CTM과 함께 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 100 ng/ml M-CSF를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 6시간 내지 15일, 바람직하게는 7일 동안 시험관 내에서 배양된다. 단핵구 배양물은 저산소 조건(예를 들어 0.5 내지 20% O2, 바람직하게는 1% O2)에서 전체 배양 기간 7일 동안 또는 마지막 6 내지 96시간, 바람직하게는 마지막 18시간 동안 인큐베이션될 수 있다. CTM은 바람직하게는 종양 세포주 또는 종양 체외이식편, 또는 고형 종양으로부터, 또는 약 6시간 내지 20일, 바람직하게는 12 내지 72시간의 기간 동안 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제로부터 생성된다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 단핵구, 바람직하게는 혈액-유래 CD14+ 단핵구로부터 유래된다. 한 구현예에서, 본 발명의 세포는 종양 조건화된 배지를 포함하는 배양 배지, 예를 들어 70% 배양 배지(바람직하게는 RPMI + 10% FBS+ 100 ng/ml M-CSF) 및 30% 종양 조건화된 배지와 함께 혈액-유래 CD14+ 단핵구를 시험관 내 배양함으로써 수득된다. 바람직하게는, 배양은 정상산소증에서 1 내지 15일, 바람직하게는 6일 동안, 이어서 저산소증에서 6시간 내지 5일, 바람직하게는 18 내지 24시간 동안 이루어진다. 종양 조건화된 배지는 바람직하게는 종양 계통의 상청액으로부터, 또는 바람직하게는 약 6시간 내지 20일, 바람직하게는 12 내지 72시간의 기간 동안 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제로부터 수득된다.
본 발명의 세포는 예를 들어 골수, 바람직하게는 dT-Tomato 수컷 마우스 골수로부터 단리된, 바람직하게는 신선한 단핵구로부터 유래된다. 한 구현예에서, 본 발명의 세포는 바람직하게는 정상산소증 조건, 바람직하게는 37℃, 5% CO2에서 1 내지 15일, 바람직하게는 6일 동안 부착된, 바람직하게는 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 뮤린 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)가 보충된 세포 배양 배지(예를 들어 IMDM)에서 배양하여 수득된다. 그런 다음, 배지는 바람직하게는 50% 종양 상청액(예를 들어, 고형 섬유육종 및 신경아교종 체외이식편의 배양물로부터 수득됨, 이로부터 종양-풍부 상청액이 선택됨) 및 50% IMDM으로 이루어진 배지로 변형되고, 배양물은 6 내지 72시간, 바람직하게는 18시간 동안 저산소 조건(1% O2)에서 유지된다.
본 방법에서, 저산소 조건은 CTM과의 모든 인큐베이션 동안, 또는 인큐베이션의 일부(예를 들어 6 내지 96시간, 바람직하게는 18시간) 동안 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 단핵구가 예를 들어 M-CSF와 함께 배양하여, 대식세포로 분화되도록 유도되는 추가 단계(종양 배양물 또는 체외외식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지와 함께 인큐베이션함과 동시에, 또는 인큐베이션하기 전 또는 후에 수행될 수 있음)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플로부터 단리된 단핵구, 바람직하게는 CD14+로부터 유래된 대식세포 집단에서 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법으로서, 종양 배양물 또는 체외외식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지에서의 상기 집단의 인큐베이션 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 인큐베이션은 저산소 조건 하에서 일어나고, 상기 인큐베이션은 집단의 단핵 식세포의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도한다.
표현형 및/또는 기능적 변화로 유도된 단핵 식세포는 바람직하게는 대식세포이다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 대식세포 또는 세포 또는 본 발명의 대식세포 또는 세포는 바람직하게는 표 1, 2, 3, 5 및/또는 6에 표시된 하나 이상의 유전자의 발현으로 특성화된다. 실제로, 표는 THEM 세포에서 상향조절되는 유전자를 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 대식세포 또는 세포 또는 본 발명의 대식세포(또는 세포)는 바람직하게는 표 4에 표시된 하나 이상의 유전자의 낮은 수준/전혀 없는 수준의 발현으로 특성화되며, 이는 THEM 세포 및/또는 ALOX15, CCL8, 및 CCL26 중 하나 이상에서 발현되지 않거나 매우 낮게 발현되는 유전자를 보고한다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 대식세포(또는 세포) 또는 본 발명의 대식세포(또는 세포)는 바람직하게는 표 2에 표시된 하나 이상의 분자의 분비로 특성화된다.
이러한 표현형 및/또는 기능적 변화를 관찰, 검출 및 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 기술되어 있다.
예를 들어, 유전자 발현 프로파일은 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드의 마이크로어레이 분석, 노던 블롯, RT-PCR, 시퀀싱 등을 사용하여 RNA 수준에서 평가될 수 있다.
단백질 발현은 예를 들어, 면역블롯팅, 면역조직화학, 단백질 마이크로어레이 등을 사용하여 측정될 수 있다.
당업계에 쉽게 알려져 사용되고 있는 세포 및 동물 모델을 기반으로 한 다양한 시험도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 세포는 환자 자신(따라서 조성물은 자가 세포를 함유함) 또는 공여자(따라서 조성물은 동종이계 세포를 함유함)로부터 유래될 수 있다.
동종이계 세포의 경우, 공여자와 세포를 받는 환자 사이의 HLA 적합성과 매칭이 필요하다.
본 발명과 관련하여 "종양 상청액"은 바람직하게는 종양 유래 세포가 시험관 내에서 배양되는 배지를 나타내고, 용어 "종양-풍부 상청액", "종양에 의해 조건화된 배지", "종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자"를 포함한다. 종양 상청액은 바람직하게는 고형 종양, 예컨대 섬유육종, 또는 종양 체외이식편, 예컨대 신경아교종, 또는 바람직하게는 해리되고 시험관 내 배양된 종양 세포주 또는 종양 절제의 배양물로부터 수득된다. 배양은 바람직하게는 6시간 내지 20일, 바람직하게는 12 내지 72시간 동안 수행된다.
본 발명과 관련하여 "정상산소증"은 바람직하게는 정상 대기압(21%, 160 mmHg)에서 공기 중 산소(O2)의 수준을 나타내며, 예를 들어 이는 바람직하게는 37℃의 온도에서 5% CO2의 존재를 나타낸다.
본 발명과 관련하여 "저산소증" 또는 "저산소 조건"은 바람직하게는 정상 대기압(21%, 160 mmHg) 미만의 공기 중 산소(O2)의 수준을 나타내며, 예를 들어 이는 0.5 내지 20% O2, 바람직하게는 1% O2의 존재를 나타낸다.
본 발명과 관련하여 M2는 대안적으로 활성화된 대식세포, 이전에 기술된 바와 같이 높은 수준의 CD206, CD163, 및 Arg1 유전자를 발현하는 극성화된 마우스 대식세포 또는 높은 수준의 CD206, CD163, CD86, TREM2, IL1RN, IL10, STAT3, STAT6, fabp4, sphk1, HOMOX1, IRF4, PPAR-CCL22를 발현하는, 인간 대식세포 및 이전에 설명한 대로 매우 낮거나/전혀 없는 수준의 CCR7, IL2RA 및 CXCL11로 정의될 수 있다(11,12).
본 발명과 관련하여, TCM은 높은 수준의 TGFBI, DAB2, FUCA1, CYP1B1, MAFB, CCL2 및 매우 낮은 수준/전혀 없는 수준의 MT2A 및 MTFP1을 발현하는, CTM(저산소증 없이)과 함께 인큐베이션된 마우스 또는 인간 대식세포로 정의될 수 있다.
본 발명과 관련하여, M0는 앞서 설명한 바와 같이 높은 수준의 NINJ1, F13A1, SCARB1, 및 STAB1, AOAH, TLR7, A2M, FNBP1, CD209, SH3KBP1, 및 ITSN1을 발현하는 분화된 분극화되지 않은 대식세포로 정의될 수 있다(13).
본 발명과 관련하여, THEM은 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포, 또는 본 발명의 세포에 대해 본원에 개시된 표현형, 또는 기능 또는 표현형 및/또는 기능적 변화 중 적어도 하나를 특징으로 하는 세포로 정의될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 방법은 저산소 조건 하에서 인큐베이션하기 전에, 종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지에서 집단을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 이는 예를 들어 세포 또는 세포 집단이 일정 기간 동안, 예를 들어 1 내지 15일, 바람직하게는 6일 동안, 정상산소 상태에서 종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지와 함께 인큐베이션됨을 의미한다. 세포 또는 세포 집단은 이후 저산소 조건 하에서, 예를 들어 6시간 내지 15일, 바람직하게는 18 내지 96시간 동안 유지되거나 배양된다.
배양 배지는 바람직하게는 종양 상청액을 포함하며, 상기 상청액은 약 6시간 내지 20일, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 72시간의 기간 동안, 바람직하게는 종양 고형 체외이식편 또는 종양 세포주의 배양물로부터, 바람직하게는 섬유육종 또는 신경아교종으로부터 얻어지거나, 바람직하게는 종양으로부터 조건화된 배지(CTM), 바람직하게는 종양 세포주, 또는 종양 체외이식편, 또는 고형 종양으로부터, 또는 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제로부터 생성된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "인큐베이션된"은 바람직하게는 세포가 배양되거나, 성장되거나, 처리된다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서, 그리고 기간 동안 유효한 양을 의미한다. 본 발명의 제제의 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 본 발명의 제제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 제제에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 병태에 따라 달라지며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 해당 분야에 통상적인 기술을 갖춘 의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 낮은 수준에서 약제학적 조성물에 사용되는 본 발명의 제제의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 늘릴 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 용량은 특정 투여 요법에 따라 치료 효과를 생성하는데 효과적인 최저 용량인, 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 위에서 설명한 인자들에 따라 달라진다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 세포는 선택적으로 보충제와 함께 본 발명의 방법에 특히 적합한 특정 성장 배지에서 증폭된다. 그러한 성장 배지는 M-CSF와 같은 단핵구의 증식, 분화 및/또는 기능적 활성화를 조절하는 조혈 성장 인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 본원에 기술된 특정 특성을 갖는 세포를 생성한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 세포는 본원에 기술된 세포인 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 대식세포에 관한 것이다. 본 발명의 대식세포는 "본 발명의 세포"로 지칭되거나, 간단히 "세포"로 지칭될 수도 있다. 본 발명의 세포 또는 대식세포는 바람직하게는 (a) 다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3, MT2A 유전자 중 적어도 하나를 발현하고/하거나, (b) 다음 유전자: PLXNA2, HSPH1, CYCS, TIGAR 중 적어도 하나를 발현하지 않는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 세포는 단리된 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 CD14+ 단핵구로부터 유래되고, 바람직하게는 혈액으로부터 유래된다. 바람직하게는, 세포는 영장류 세포이다. 가장 바람직하게는, 세포는 인간 세포이다.
인간 세포의 경우, 인간 세포는 표 3 및/또는 6에 개시된 유전자 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 가지의 임의의 조합, 가장 바람직하게는 모든 유전자를 발현하는 것이 바람직하다. 또한, 인간 세포의 경우, 세포는 표 4에 개시된 유전자 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 가지의 임의의 조합, 가장 바람직하게는 모든 유전자를 나타내거나 발현하지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 세포는 대식세포이다.
본 발명에 따른 세포는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 세포이다.
본 발명은 또한 세포 집단에 관한 것이다. 집단은 본 발명에 따른 적어도 하나의 세포를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 세포 집단은 다수의 세포를 포함하며, 그 중 적어도 70%(세포 수 기준), 바람직하게는 80%(세포 수 기준), 바람직하게는 적어도 90%(세포 수 기준), 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%(각각 세포 수 기준)가 본 발명에 따른 세포이다. 두 번째 양태의 모든 바람직한 구현예는 본 발명의 세 번째 양태에도 적용된다. 바람직하게는, 총 세포 수의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%는 본원에 정의된 바와 같은 세포이며, 선택적으로 하나 이상의 그의 바람직한 구현예는 단독 또는 조합되어 있다. 세포 집단은 바람직하게는 CXCR4 및/또는 CYTIP 및/또는 SLC2A3 및/또는 MT2A 유전자의 발현에 대해 양성이고/이거나, PLXNA2 및/또는 HSPH1 및/또는 CYCS 및/또는 TIGAR의 발현에 대해 음성이다. 세포 집단은 바람직하게는 표 1 및/또는 2 및/또는 3 및/또는 4 및/또는 6의 유전자 중 적어도 하나의 발현에 대해 양성이다. 세포 집단은 바람직하게는 표 4의 유전자 중 적어도 하나의 발현에 대해 음성이다.
바람직하게는, 집단은 단리된 세포 집단이다.
용어 "동종이계"는 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 모든 것을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않을 때 두 명 이상의 개체가 서로 동종이계라고 한다.
용어 "자가"는 동일한 대상체에서 유래된 모든 것을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "자가 세포"는 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 자가 세포 이식은 거부반응을 초래하는 면역학적 장벽을 극복하기 때문에 때때로 유리한 것으로 간주된다.
용어 "세포 집단" 및 "세포의 집단"은 복수의 세포의 집합체를 상호교환적으로 지칭한다. 가장 좁은 구현예에서, 세포 집단은 2개의 세포를 포함하지만, 더욱 전형적으로는 다수의 세포를 포함한다.
용어 "확장" 또는 "확장하는"은 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 세포 또는 세포 집단의 증식을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명과 관련하여, 확장은 시험관 내 또는 생체 외에서 발생한다. 전형적으로 확장은 세포 단리 이후에 발생하는 활성 또는 과정이다. 전형적으로 확장 중에는 총 세포 수가 증가한다. 여기에는 "배양"이라는 용어도 포함될 수 있다.
용어 "발현하다", "발현된" 및 "발현", "유전자 발현" 등은 본원에 사용된 바와 같이, 기능성 유전자 산물의 합성에서 유전자로부터의 정보를 사용하는 것과 관련된다. 유전자 발현은 적어도 전사를 포함하고, 선택적으로 RNA 편집, 번역 및 번역 후 변형을 포함하는 공개 목록에서 선택되는 추가 특징 중 하나를 선택적으로 포함한다. 유전자 발현이 결정되면, 편집되지 않았거나 편집된 RNA 또는 심지어 암호화된 단백질과 같은 발현 산물의 존재가 결정된다. 특정 유전자 또는 유전자좌와 관련하여 사용된 위의 용어는 해당 유전자 또는 유전자좌로부터의 유전 정보의 발현을 명시하고자 하며; 예를 들어, CXCR4가 발현된다는 것은 CXCR4 유전자가 발현된다는 것을 의미한다.
낮은 발현 수준의 경우, 바람직하게는 의도된 유전자 발현 수준이며, 이는 하우스키핑 유전자, 예를 들어 베타-액틴의 발현 수준보다 적어도 5배 더 낮다.
용어 "발현하지 않는다"는 또한, 발현 수준이 낮다/없음이라는 용어를 포함하거나, 특정 유전자가 예를 들어 M2 세포와 비교하여 하향조절되는 것을 의미한다.
특정 양태에서, 용어 "발현 수준이 낮다/없음"은 "발현하지 않는다"와 동일한 의미를 가질 수 있다.
용어 "발현"은 또한 특정 유전자가 예를 들어 M2 세포와 비교하여 상향조절되는 것을 의미한다.
"단리된"이란 원래 상태에서 일반적으로 수반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, "단리된 세포"는 본원에 사용된 바와 같이, 자연-발생 상태에서 이를 둘러싸고 있는 조직 또는 체액과 같은 세포 및 세포외 환경으로부터 정제된 세포를 의미한다. 대안적인 설명에서, "단리된 세포" 등은 본원에 사용된 바와 같이, 자연적인 세포 환경으로부터, 그리고 세포가 정상적으로 존재하는 조직의 다른 성분들과의 결합으로부터 세포를 시험관 내 단리 및/또는 정제하는 것을 의미한다. 문맥상 달리 명시되지 않는 한, "단리된 세포"는 반드시 다른 세포가 없는 단일 세포일 필요는 없으며; 대조적으로, 다수의 세포와 같은 2개 이상의 세포 집단이라도, 상기 세포 집단이 일반적으로 그러한 원래 상태의 세포 집단에 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없다는 의미에서 단리될 때 "단리된" 것으로 지칭될 수 있다. "단리된", "단리하다"라는 단어의 정의에 따르면, 본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 물질, 예컨대 예를 들어 단리된 세포를 얻기 위한 활동을 설명하는 동사이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배지"는 세포, 특히 포유류 세포의 배양에 적합한 수성 혼합물을 지칭하는 것을 의미한다. 현탁액과 콜로이드 혼합물도 포함되어 있지만 수성 혼합물은 전형적으로 용액이다. 배지는 전형적으로 액체이지만, 일부 배지는 예를 들어, 저장 목적으로 일시적으로 동결될 수도 있다.; 임의의 경우에 배지가 액체인 경우 세포 배양에 사용된다. 배지는 정의된 수성 혼합물인 "기본 배지"이거나, 기본 배지와 적어도 하나의 보충제를 포함하는 수성 혼합물이고 일반적으로 생체 외 세포의 생존력, 및 선택적으로 또한 생체 외 세포 확장을 유지하는 능력을 갖는 "성장 배지"일 수 있다. 기본 배지는 바람직하게는 화학적으로 정의된 배지이다. 성장 배지는 바람직하게는 기본 배지(전형적으로 85% 내지 99.5% vol./vol.)에 혈청, 세포 용해물과 같은 적어도 하나의 인간-유래, 동물-유래 또는 식물-유래 보충제를 포함한다.
본원에서 세포와 관련하여 사용될 때, 용어 "분비" 또는 방출"은 일반적으로 세포에서 외부 환경으로 표면화되는 모든 물질을 의미한다. 상기 물질은 전형적으로 세포에 의해 생산되고/되거나 변형되었지만, 이것이 필수 요건은 아니다. 예를 들어, 일부 세포는 단백질 및/또는 호르몬, 프로스타글란딘 및 신경전달물질과 같은 조절 분자, 및/또는 미세소포 및/또는 엑소좀을 각각의 외부 환경으로 분비한다. 예를 들어, 세포에서 생산된 프로스타글란딘은 세포 환경으로 외부화될 수 있다. 상기 용어는 본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명시되지 않는 한 생체 내 분비/생체 내 환경 또는 시험관 내 분비 시험관 내 환경에 제한되지 않는다.
추가 단계는 선택적으로 그러나 바람직하게는 특히 확장 단계를 포함하며, 이에 대해서는 아래에 자세히 설명되어 있다.
본 발명의 방법에 따른 방법의 첫 번째 단계는 생물학적 샘플로부터 단핵 식세포(의 집단)를 단리하는 것을 특징으로 하는 단계 (a)이다.
따라서, 본 발명에 따르면, 세포는 바람직하게는 혈액 또는 골수로부터 단리된다.
본 발명에 따른 성장 또는 배양 배지는 전형적으로 기본 배지 및 하나 이상의 보충제를 포함할 것이다. 넓은 의미에서, 사용되는 기본 배지의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
바람직하게는, 기본 배지는 화학적으로 정의된다. 화학적으로 정의된 기본 배지는 모든 화학 성분이 알려져 있는 인간 또는 동물 세포의 시험관 내 세포 배양에 적합한 기본 배지이며, 특히 화학적으로 정의된 배지는 모든 성분이 확인되어야 하고 그의 정확한 농도가 알려져 있음을 요구한다. 따라서, 화학적으로 정의된 배지는 동물-유래 성분이 전혀 없어야 하며, 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 또는 혈청-유래 단백질을 함유할 수 없다. 화학적으로 정의된 기본 배지는 재조합 단백질 및/또는 호르몬만으로 이루어지지 않는다. 이를 달성하기 위해, 화학적으로 정의된 배지는 단백질 및/또는 성장 인자와 같은 인간 또는 동물 공급원의 성분을 포함하지 않으며; 특히, 이는 인간 또는 동물 공급원의 알부민이나 인간 또는 동물 공급원의 성장 인자를 포함하지 않는다. 바람직하게는 이는 일반적으로 식물 세포 및 박테리아와 같은 비인간, 비동물 공급원으로부터 유래된 재조합 알부민 및/또는 재조합 성장 인자, 및/또는 예를 들어 폴리비닐 알코올과 같은 합성 화학물질을 포함한다.
기본 배지는 예를 들어 이글 최소 필수 배지(EMEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 알파-MEM, RPMI-1640, IMDM 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 목록에서 선택된다. 원하는 경우, 하나 이상의 혈청-대체 성분이 이러한 배지에 추가된다. 이로써, 무혈청 기본 배지가 수득된다.
세포는 표준 절차에 따라 액체 질소에서 동결, 예를 들어 급속-냉동될 수 있다. 이러한 동결된 세포를 해동하고, 예를 들어 해동 후 추가 배양 계대를 거치는 것도 가능하다. 동결은 전체 배치(batch)로 또는 분취량으로 일어날 수 있다. 한 구현예에서, 세포는 대식세포에서 일반적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 특징(구조적 또는 기능적)에 의해 특성화된다. 예를 들어, 이러한 특징은 본 발명의 세포를 얻을 수 있는 방법에 특이적인 특징일 수 있다. 이러한 구조적 또는 기능적 특징은 본 개시내용에서 명시적으로 설명된 특징, 및/또는 본 개시내용에서 명시적으로 설명되지 않았지만 본 발명의 세포에 고유한, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 세포에 고유한 특징으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 배양에 의해 시험관 내에서 증폭될 수 있다. 이로써 유래된 세포가 수득될 수 있다. 유래된 세포도 본 발명의 세포를 정의하는 청구된 특징을 준수하는 한 본 발명의 세포이다. 따라서, 본 발명의 세포의 특성으로 인해, 본 발명은 여러 세대의 세포를 커버할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 확장을 통해 다수의 세대가 수득될 수 있다. 실제로, 본 발명에 따른 세포의 특정 구현예는 세포의 생체 외 확장을 포함한다. 따라서, 세포가 단리되더라도 동일하거나 유사한 세포에 자손을 낳아 세포 집단을 생성할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 세포는 골수와 같은 다양한 조직, 및 혈액과 같은 체액에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 골수 또는 혈액으로부터 유래하거나 유래된다.
한 구현예에서, 본 발명의 세포는 새로 단리된 세포이다. 새로 단리된 세포는 본원에 기술된 방법과 같이 자신이 유래한 조직으로부터 단리하여 직접 얻은 세포이다. 더욱 바람직하게는, 그러나, 본 발명의 세포는 가장 전형적으로 시험관 내 확장 또는 배양에 의해 새로 단리된 세포로부터 유래된 세포이다.
본 발명에 따른 세포는 유전자 발현 패턴에 의해 특성화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "유전자 발현 패턴"은 경우에 따라, 적어도 하나의 유전자가 발현되거나, 발현되지 않거나, 특정 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 따라서, 이 특정 유전자가 발현되거나 발현되지 않거나 특정 수준으로 발현된다는 사실은 예를 들어 참조 세포와의 구별을 목적으로 본 발명에 따른 세포를 특성화한다. 2개 이상의 유전자, 예컨대 예를 들어 2개의 유전자, 3개의 유전자, 4개의 유전자, 5개의 유전자, 6개의 유전자, 7개의 유전자, 8개의 유전자, 9개의 유전자, 10개의 유전자 등의 발현에도 동일하게 적용된다. 본 발명의 세포가 1개 이상의 유전자의 발현으로 특성화되는 경우에는, 해당 문맥에서 언급되지 않은 임의의 다른 유전자의 발현에 대해 구체적인 진술을 하는 것은 바람직하지 않다. 예시적인 예로서, 본원에서 본 발명의 세포가 CXCR4를 발현한다고 언급될 때마다, 이는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 임의의 다른 특정 유전자도 발현되거나 발현되지 않거나 특정 수준에서 발현된다는 진술로 받아들여져서는 안 된다.
일반적으로, 유전자의 발현은 핵산 수준과 단백질 수준 모두에서 다양한 방법으로 테스트될 수 있다. 유전자 발현은 분자 생물학, 생화학 및 세포 생물학에서 비교적 일반적으로 테스트될 수 있으며, 이에 대해 공지되거나 적합한 임의의 방법이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 몇 가지 방법이 아래에 설명되어 있다. 유전자 발현과 관련된 방법은 전사체 방법으로도 지칭될 수 있다. 따라서, 세포의 유전자 발현 프로파일을 전사체라고도 할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 세포는 그의 유전자 발현 프로파일로 특성화된다.
유전자의 발현이 분석되고 있음을 설명하기 위해 다양한 용어가 사용될 수 있다: 예를 들어, 발현은 테스트, 분석, 평가, 검정, 측정, 결정된다고 말할 수 있다. 이러한 용어에는 정성적 판단, 즉 각 유전자가 발현되는지 여부에 대한 질문과 정량적 판단, 즉 각 유전자가 어느 수준에서 발현되는지에 대한 질문이 포함된다.
전형적으로, 유전자 발현을 결정하기 위해 하나의 세포 또는 다수의 세포(바람직함)로 구성된 샘플을 세포 집단에서 채취한 다음, 해당 샘플에서 유전자 발현을 분석하여, 해당 샘플의 세포가 경우에 따라 파괴되거나, 파괴되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 세포 집단은 일반적으로 균질하기 때문에(즉, 그 안에 포함된 실질적으로 모든 개별 세포가 매우 유사하거나 유사함을 의미), 세포 집단(대표 샘플)에서 채취한 샘플에 포함된 세포의 유전자 발현에 대한 발견은 일반적으로 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 해당 집단의 나머지 세포에도 적용될 것이고/이거나, 세포 집단이 실질적으로 균질한 것으로 보이지 않는다.
각 유전자의 발현에 대한 결정은 비방향성 결정(undirected determination), 즉 유전자 발현이 하나의 유전자에 초점을 두지 않고 일반적으로(예를 들어, 마이크로어레이와 같은 광범위한 접근법에 의해) 분석되는 경우이거나, 또는 각 유전자가 발현되는지 여부를 구체적으로 테스트하는 방향성 결정(directed determination)일 수 있다. 특히 두 번째 경우에, 각 유전자는 "관심 유전자(gene of interest)"라고 할 수도 있다.
유전자 발현 분석을 위한 데이터를 생성하기 위해 여러 가지 전사체 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 마이크로어레이는 이전에 동정된 표적 유전자의 상대적 활성을 측정한다. RNA-Seq과 같은 서열 기반 기술은 그들의 발현 수준 외에도 유전자 서열에 대한 정보를 제공한다.
본 발명의 세포(들)는 하나 이상의 마커 또는 유전자를 발현할 수 있고, 하나 이상의 마커 또는 유전자의 발현이 부족할 수 있다. 특정 경우에, 이들은 표 1 및/또는 2 및/또는 3 및/또는 5 및/또는 6 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 또는 유전자를 발현하고/하거나; 표 4 및 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 또는 유전자의 발현이 부족할 수 있다.
본 명세서 또는 표에 제공된 NCBI 또는 Ensembl 참조는 예시적이며, 해당 서열에 대한 참조를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 표시된 각 유전자/마커/단백질은 그의 수탁 번호(즉, Ensembl 또는 NCBI 유전자 ID)로 특성화될 수 있지만, 모든 이소형, 변이체, 유사체, 동족체, 단편, 유도체도 포함한다.
본 개시내용과 관련하여, 본원에 개시된 유전자에 대한 언급은 이들 분자의 모든 형태 및 이의 기능적 단편, 돌연변이체 또는 변이체에 대한 언급이다. 또한, 이들 분자의 mRNA 또는 이성질체 또는 다형성 형태의 대체 스플라이싱으로 인해 발생할 수 있는 임의의 이소형에 대한 언급이다.
"표현형 프로파일" 또는 "표현형"에 대한 언급은 대상체 마커를 암호화하는 유전자의 전사 및/또는 그로부터 번역된 발현 생성물의 세포 표면 발현의 존재 또는 부재에 대한 언급으로 이해되어야 한다. 청구된 세포 집단의 범위 내에 속하는 대부분의 세포는 세포 표면 고정된 발현 생성물로서 대상체 마커의 존재 또는 부재에 의해 특성화되지만, 정의된 집단 내에 속하는 일부 세포는 주어진 마커의 전사가 상향 조절되었지만 아직 세포 표면 고정된 발현 생성물이 생성되지 않았을 때와 같은 전사체 수준에서만 초기에 변화를 나타낼 수 있음을 이해해야 한다. 일반적으로, 새로운 분화 단계로 진행되는 세포는 발현 생성물 수준의 변화와 관련하여 아직 명백하지 않은 유전자 발현 변화를 일시적으로 나타낼 것이다. 그러나, 그럼에도 불구하고 이들 세포는 청구된 세포 집단의 범위 내에 속한다.
"조건화된 배지"는 예를 들어 특정 세포 또는 세포 집단이 배양된 다음 제거되는 배지이다. 세포가 배지에서 배양되면, 이들은 다른 세포에 영양 지원을 제공할 수 있는 세포 인자를 분비할 수 있다. 영양 인자는 세포의 생존, 성장, 증식 및/또는 성숙을 촉진하거나 적어도 지원하거나, 세포의 증가된 활성을 자극하는 물질이다. 이러한 영양 인자에는 호르몬, 사이토카인, 세포외 기질(ECM), 단백질, 소포, 항체 및 과립이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포 인자를 함유하는 배지는 조건화된 배지이다. 본 발명의 조성물 또는 방법의 일부 구현예에서, 영양 인자가 사용된다.
본 개시내용의 임의의 조성물 또는 방법은 세포 캡슐화를 포함하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 세포는 개별적으로 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 많은 세포가 동일한 막 내에 캡슐화된다. 이식 후 세포를 제거해야 하는 일부 구현예에서, 단일 막 내에서와 같이 많은 세포를 캡슐화하는 상대적으로 큰 크기의 구조를 사용하여 편리한 회수 수단을 제공할 수 있다. 줄기세포의 마이크로캡슐화를 위한 다양한 구현예에서 다양한 재료가 사용될 수 있다. 이러한 물질에는 예를 들어 중합체 캡슐, 알기네이트-폴리-F-리신-알기네이트 마이크로캡슐, 바륨 폴리-F-리신 알기네이트 캡슐, 바륨 알기네이트 캡슐, 폴리아크릴로니트릴/폴리염화비닐(PAN/PVC) 중공 섬유 및 폴리에테르술폰(PES) 중공 섬유가 포함된다. 줄기세포의 투여에 사용될 수 있는 세포의 마이크로캡슐화 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Chang, P., et al., 1999]; [Matthew, H. W., et al., 1991]; [Yanagi, K., et al., 1989]; [Cai Z. H., et al., 1988]; [Chang, T. M., 1992] 및 미국 특허 제5,639,275호(예를 들어, 생물학적 활성 분자를 안정적으로 발현하는 세포의 장기간 유지를 위한 생체적합성 캡슐을 기술하고 있음.]에 기술되어 있다. 캡슐화의 추가 방법은 유럽 특허 공개 번호 제301,777호 및 미국 특허 제4,353,888호; 제4,744,933호; 제4,749,620호; 제4,814,274호; 제5,084,350호; 제5,089,272호; 제5,578,442호; 제5,639,275호; 및 제5,676,943호에 기술되어 있다. 전술한 모든 내용은 세포 캡슐화와 관련된 부분에서 인용되어 본원에 포함된다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본 발명의 세포를 생체고분자 또는 합성 중합체와 같은 중합체에 통합시킨다. 생체고분자의 예에는 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 콜라겐 및 프로테오글리칸이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 사이토카인과 같은 다른 인자도 중합체에 통합될 수 있다. 본 개시내용의 다른 구현예에서, 세포는 3차원 겔의 간극에 통합될 수 있다. 전형적으로 큰 중합체나 겔이 외과적으로 이식된다. 충분히 작은 입자 또는 섬유로 제형화될 수 있는 중합체 또는 겔은 다른 일반적이고 보다 편리한 비수술적 경로로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 표준 성장 조건이 활용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준 성장 조건"은 예를 들어 37℃에서, 5% CO2를 포함하는 표준 대기에서의 세포의 배양을 의미한다. 상대습도는 예를 들어, 약 100%에서 유지된다. 전술한 조건은 배양에 유용하지만, 이러한 조건은 세포 배양을 위해 당업계에서 이용 가능한 옵션, 예를 들어 온도, CO2, 상대 습도, 산소, 성장 배지 등을 변화시키는 옵션을 인식할 숙련된 기술자에 의해 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
구현예에는 본 발명의 세포 또는 이로부터 유래된 생성물을 포함하는, 재생 의학에 사용하기 위한 약제학적, 치료 조성물, 제형, 제제 및 관련 사용 방법이 포함된다.
조성물은 예를 들어 용액, 현탁액, 필름의 형태를 취하고, 약 10% 내지 약 95% 또는 약 25% 내지 약 70%의 세포 또는 이로부터 유래된 생성물을 함유한다. 구현예에서, 조성물은 임의의 다수의 적합한 방식으로 투여된다. 조성물은 정맥 내 및 동맥 내와 같은 수단에 의해 전신적으로, 국소적으로, 척수강내, 뇌실내와 같은 수단에 의해, 또는 Ommaya 저장소에 의해 투여될 수 있다. 경피, 직장, 질, 설하 및 비강을 포함한 기타 수단.
조성물은 치료적으로 효과적이고, 관용적이며 안전한 양과 양립 가능한 방식으로 투여된다. 투여량은 치료 대상체에 따라 다르다. 투여에 필요한 세포의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 달라진다.
많은 경우에, 최대 약 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상(또는 그 안에서 파생 가능한 모든 범위)의 다중 투여를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 투여는 1일부터 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상(또는 그 안에서 파생 가능한 모든 범위)의 여러 주 간격까지의 범위일 수 있다. 투여 과정 후에는 예를 들어, 증상, 통증, 기분, 행동 또는 고통(catastrophizing)에 대한 평가가 이어질 수 있다.
환자에게는 본원에 기술된 조성물 또는 화합물의 조합이 적어도 또는 최대 약 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500 mg/kg/일 (또는 그 안에서 파생 가능한 모든 범위)의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명의 세포는 동물, 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 영장류, 더욱 바람직하게는 인간으로부터의 세포이다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 세포는 포유류 세포이다. 따라서, 달리 명시하지 않는 한, 특정 유전자에 대한 모든 표시는 각 포유류 유전자를 의미한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 세포는 영장류, 더욱 특히 인간으로부터의 세포이다. 따라서, 더욱 바람직하게는, 본 발명의 세포는 인간 세포이다. 따라서, 해당 구현예에서, 특정 유전자에 대한 모든 표시는 각 인간 유전자를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 세포는 형질전환 세포가 아니다. 따라서, 해당 구현예에서, 특정 유전자의 발현에 대한 모든 표시는 각각의 유전자가 게놈으로부터 발현되고, 여기서는 이것이 암호화되고, 보다 구체적으로는 멘델 유전을 통해 암호화된다는 것을 의미한다. 그러나 일부 대안적 구현예에서, 본 발명의 세포는 형질전환 세포이다.
이와 관련하여, 균질하다는 것은 실질적으로 모든 세포가 매우 유사하거나 유사하다는 것을 의미한다.
유전자의 발현은 전형적으로 특정 메신저 RNA(mRNA) 또는 이의 전구체 또는 분해 생성물과 같은 유전자 생성물의 존재 및, 필요하거나 원할 경우 유전자 생성물의 수준의 결정을 포함하는 분자 생물학 방법과 같이 직접적으로 테스트될 수 있거나; 또는 대안적으로, 유전자의 발현은 전형적으로 특정 세포 표면 단백질 또는 이의 전구체 또는 분해 생성물과 같은 특정 유전자에 의해 암호화된 단백질의 존재 및, 필요하거나 원할 경우 특정 유전자에 의해 암호화된 단백질 수준의 결정을 포함하는 생화학적 방법과 같이 간접적으로 테스트될 수 있다. 본 발명의 세포 특성화에 적합한 표면 단백질에는 특히 분화 클러스터(CD: cluster of differentiation)가 포함된다.
유전자의 발현을 테스트하기 위한 임의의 공지된 방법이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 방법에는 유전자 발현 프로파일링, PCR, 예컨대 RT-qPCR을 포함하는 바람직하게는 정량적 PCR(qPCR)과 같은 중합효소 연쇄 반응, 전사 생성물의 시퀀싱, 모든 유형의 전사체 분석 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는 목록에서 선택되는 방법이 포함된다. 핵산 수준에서, 바람직한 방법에는 마이크로어레이와 qPCR이 포함된다.
한 구현예에서, 유전자 발현은 유전자 발현 프로파일링에 의해 결정된다. 분자 생물학 분야에서, 유전자 발현 프로파일링은 세포 유전자 발현의 전체적인 모습을 파악하기 위해 전형적으로 한 번에 여러 개, 때로는 수천 개의 유전자 발현을 측정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 발현 프로파일링은 전형적으로 한 번에 여러 개의, 반드시 수천 개는 아닌 유전자 발현을 측정하여 세포의 전체적인 모습을 파악하는 것이다. 예를 들어, 유전자 발현 프로파일링은 본 발명의 세포와 다른 세포를 구별할 수 있다. 전체 게놈, 즉 특정 세포에 존재하는 모든 유전자의 발현을 동시에 결정하는 것도 가능하다. 이런 종류의 많은 실험은 전체 게놈, 즉 특정 세포에 존재하는 모든 유전자의 발현을 동시에 측정할 수 있다. 여러 전사체학 기술을 사용하여 분석에 필요한 데이터를 생성할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서는 마이크로어레이가 바람직하다.
차세대 시퀀싱(NGS: next generation sequencing)과 같은 고처리량 시퀀싱을 포함하는 서열 기반 기술을 사용하여 본 발명에서 유전자 발현을 결정할 수 있다. 예를 들어, 전체 전사체 샷건 시퀀싱이라고도 불리는 RNA-Seq(RNA 시퀀싱)은 그들의 발현 수준 외에도 유전자 서열에 대한 정보를 제공할 수 있다. RNA-Seq은 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 특정 순간에 생물학적 샘플에서 RNA의 존재와 양을 보여준다. 한 구현예에서, 유전자 발현은 RNA-Seq 또는 PCR 및 그의 임의의 변형과 같은 서열-기반 기술로 결정된다.
마이크로어레이와 같은 유전자 발현 프로파일링을 통해 밝혀진 것과 같은 일부 또는 모든 유전자의 발현은 정량적 RT PCR(qRT PCR)로 확인될 수 있다.
일반적으로 알려진 바와 같이, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR, 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-Time PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction)은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 기반으로 한 실험실 방법으로, 핵산의 양을 결정하는데 적합한 방법이다. 특히, 전사체(예를 들어, mRNA)의 양을 결정하기 위해 선택되는 방법은 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)이다. 노던 블롯과 같은 다른 RNA 정량화 방법과 비교하여, qRT-PCR은 일반적으로 RNA 수준의 검출을 위한 가장 강력하고 민감하며 정량적인 분석으로 간주되므로 본 발명에서 바람직하며, qRTPCR은 또한 예를 들어 형광성 1차 또는 2차 항체를 사용한 면역데코레이션(immunodecoration)과 유세포 분석에 의한 면역검출과 같은, 단백질 수준에서 유전자 발현 생성물을 간접적으로 결정하는 것보다 유전자 발현을 결정하는 데 더 민감하다. qRT PCR은 전형적으로 각 핵산에 대한 특정 프라이머가 필요하지만 그 서열은 일반적으로 예를 들어, 인간 유전자에 대한 서열 데이터베이스를 통해 이용가능하거나, 그러한 정보에 기초하여 당업자에 의해 설계될 수도 있다. qRT-PCR에는 시판되는 키트와 기계가 이용가능하며, 이를 본 발명에 사용할 수 있다. qRT PCR에서 유전자 발현을 결정하기 위한 주형("표적"이라고도 함) 역할을 하는 핵산은 전사 생성물, 전형적으로 mRNA이다.
바람직하게는 본 발명의 세포는 대식세포에 특이적인 적어도 하나의 유전자를 발현한다.
본 발명의 세포는 특히 다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3, MT2A 중 적어도 하나를 발현한다는 점을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 유전자는 기준 세포에서의 발현 비율 또는 상기 적어도 하나의 유전자 대 베타-액틴을 기준으로 하우스키핑 유전자 베타-액틴에 비해 높은 수준으로 발현되거나, M2 대식세포에서 이들의 발현 수준에 비해 상향조절된다.
한 구현예에서, 유전자 발현은 간접적으로, 즉 1차 전사 생성물, mRNA 또는 그의 전구체 또는 그의 분해 생성물의 결정에 의해 결정되는 것이 아니라 추가 하류의 특정 생성물의 결정에 의해 결정된다. 전형적으로, 추가 하류의 특정 생성물은 mRNA에 의해 암호화된 단백질이지만; 이는 특정, 예를 들어 효소적으로 활성인, 단백질의 존재에 특이적인 대사산물과 같은 임의의 다른 특정 생성물일 수도 있다.
바람직하게는, 단백질의 존재가 결정된다. 더욱 바람직하게는, 세포 표면의 단백질 존재가 결정된다. 즉, 세포 표면에 단백질이 발현되는지 여부를 결정하는 것이다.
예를 들어, 특정 항체 및 기타 면역반응성 분자와 같은 면역학적 활성 분자에 의해, 세포 표면에 특정 단백질을 표시하는 세포가 분석될 수 있다. "세포 표면"은 당업계에서의 일반적인 의미에 따라 본원에서 사용되며, 따라서 구체적으로 단백질 및 기타 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 외부를 포함한다. 단백질은 적어도 부분적으로 상기 세포 표면에 위치하고 세포에 첨가된 항원-특이적 항체와 같은 항원-결합 분자에 의해 결합될 수 있는 경우 세포 표면에 표시된다. 한 구현예에서, 세포 표면에 표시되는 단백질은 항체에 의해 인식될 수 있는 세포외 부분을 갖는 내재막 단백질이다. 본 발명과 관련하여, 용어 "세포외 부분" 또는 "엑소도메인"은 세포의 세포외 공간을 향하고 바람직하게는 예를 들어, 세포 외부에 위치한 항체와 같은 결합 분자에 의해, 상기 세포 외부로부터 접근가능한 분자, 특히 단백질의 일부를 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "부분"은 아미노산 서열과 같은 구조의 연속적이거나 불연속적인 요소를 지칭한다. 단백질 서열의 일부 또는 부분은 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 바람직하게는 적어도 5개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개, 또는 적어도 100개의 연속 및/또는 비-연속 아미노산을 포함한다.
항체 또는 기타 면역반응성 분자에 의해 검출 가능한 단백질은 항원으로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 하나 이상의 특정 항원을 표시하거나 표시하지 않는 것에 의해 특성화될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 이러한 항원은 바람직하게는 세포 표면에 표시된다. 이러한 항원은 "표면 항원"이라고도 할 수 있다.
이의 예는 표 5에 제공된다.
엄밀한 의미에서 "발현하다"라는 단어는 유전자가 발현된다는 것을 의미하지만, "발현하다"라는 단어는 단백질, 특히 상기 유전자에 의해 암호화되는 세포 표면 단백질이 세포 상에 표시된다는 것을 기술하는 것을 의미할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 발현 수준이 검출 한계를 초과하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 항원-특이적 항체에 의한 결합을 허용할 만큼 충분히 높은 경우, 항원이 세포에 표시된다. 본 발명에 따르면, 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 너무 낮아 세포에 첨가된 항원-특이적 항체에 의한 결합을 허용하지 않는 경우, 항원은 세포에서 발현되지 않는다고 한다. 바람직하게는, 세포에서 발현되는 항원은 발현되거나 노출되며, 즉 상기 세포의 표면에 존재하여, 따라서 항체 또는 세포에 첨가된 다른 면역 반응 분자와 같은 항원-특이적 분자에 의해 결합이 가능하다. 어떤 경우에는 검출을 돕는 2차 분자, 예컨대 예를 들어 선택적으로 표지된 2차 항체도 첨가된다.
항체 또는 기타 면역 반응성 분자는 세포의 에피토프를 인식할 수 있다. 용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내 항원 결정기, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 즉 결합되는, 예를 들어 항체 또는 기타 면역반응성 분자에 의해 인식되는 분자의 일부 또는 단편을 의미한다. 임의의 특정 항원에 특이적인 에피토프를 검출하면 일반적으로 해당 특정 항원이 분석 중인 세포에서 발현된다는 결론을 내릴 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 세포는 면역표현형 분석에 의해 특성화될 수 있다. "면역표현형 분석"은 일반적으로 항원이 세포에서 발현되는지 결정하기 위해 세포에 첨가되는 항체 또는 기타 면역 반응성 분자와 같은 항원-특이적 분자에 의해 세포가 특성화될 수 있음을 의미한다. 면역표현형 분석에는 유세포 분석을 포함한 다양한 방법을 사용한 세포 분류가 포함된다.
면역표현형 분석을 위한 바람직한 방법은 유세포 분석, 특히 FACS이다. 분석물, 특히 세포 표면 단백질은 일반적으로 항체 또는 기타 면역반응성 분자에 의해 인식된다. 항체 또는 기타 면역반응성 분자는 그 자체로 형광단-표지되거나, 해당 목적을 위해 추가되는 형광단-표지 2차 항체 또는 기타 면역반응성 분자에 의해 인식된다.
본 발명에 따른 세포는 CXCR4, CYTIP, SLC2A3, MT2A 중 적어도 하나를 발현하는 것을 특징으로 한다. 이들의 발현은 바람직하게는 유전자 발현 수준에서, 가장 바람직하게는 RNAseq에 의해 검출된다. 그 예가 도 22에 도시되어 있다.
특정 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, CXCR4, CYTIP, SLC2A3 또는 MT2A는 세포의 화학주성 능력, 세포 부착 조절, 세포 대사 및 항산화 방어에 중요한 것으로 여겨진다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 세포는 특히 CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및/또는 MT2A의 발현에 의해 M2 세포와 구별된다. 따라서, 본 발명에 따른 CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및/또는 MT2A-발현 세포는 선행 기술에 의해 기술된 대식세포와 명백히 다르다.
그러나 본 발명에 따른 세포는 PLXNA2, HSPH1, CYCS 및/또는 TIGAR을 낮은 수준으로 발현하거나 전혀 발현하지 않는다. 이들 유전자는 M2 및/또는 TCM 및/또는 M0 대식세포에 의해 발현된다. 따라서, 본 발명의 세포는 M2, TCM, M0 대식세포가 아니다.
바람직하게는, 세포는 대식세포에 특이적인 적어도 하나의 유전자를 발현한다. 바람직하게는, 세포는 그의 표면에 대식세포에 특이적인 적어도 하나의 표면 마커, 예를 들어 CD45, CD68, CD11b 및 MHCII를 표시한다.
바람직하게는, 본 발명의 세포는 세포 생존, 뉴런 세포 성장을 포함한 세포 성장, 혈관신생, 세포외 기질 리모델링, 면역 세포 조절을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 그것은 전염증성 활성, 항염증성 활성, 면역원성 활성, 식세포 활성, 관용원성 활성, 조직 치유 활성, 이동 활성, 혈관신생 활성, 억제 활성, 항원 제시 활성 또는 식세포 활성, 세포외 기질 리모델링 활성, 세포외 기질 침착 활성, 영양 활성, 줄기/전구 세포 자가-재생, 세포 증식, 세포 분화, 세포 사멸 억제, 세포 생존, 세포 분비, 성장/영양 인자 분비, 축삭 재성장 자극 활성 및/또는 대사 지원 활성을 나타낸다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 인간 운동 뉴런 상에 존재하는 시험관 내 뉴런 재생 기능 및/또는 생체 내 뉴런 재생 기능을 부여한다.
본 발명에 따른 세포는 또한 이를 얻을 수 있는 방법에 의해 특성화될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 세포가 이전에 설명된 방법(실시예 참조)에 따라 얻은 세포와 다른 특성을 갖고, 따라서 본 발명에 따른 세포를 얻는 방법은 세포에 독특한 특성을 부여하기 때문에 가능하다.
한 양태에서, 본 발명은 세포의 집단(세포 집단)에 관한 것이다. 세포 집단은 본 발명의 두 번째 양태에 따른 적어도 하나의 세포를 포함한다.
세포 집단은 CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및/또는 MT2A를 발현하는 적어도 하나의 세포를 포함한다. 이는 일반적으로 세포 집단의 샘플이 상기 유전자(들)의 발현에 대해 양성임을 보여줌으로써 확인될 수 있다. 즉, 세포 집단은 상기 유전자(들) 및/또는 단백질의 발현에 의해 특성화된다. 한 구현예에서, 세포 집단 중 대부분의 세포는 상기 유전자(들) 및/또는 단백질을 발현한다. 바람직하게는 세포 집단에 포함된 세포의 적어도 80%(세포 수 기준), 바람직하게는 적어도 90%(세포 수 기준), 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%(각각 세포 수 기준)는 상기 유전자(들) 및/또는 단백질을 발현한다.
세포 집단은 바람직하게는 모든 세포가 본질적으로 균일한 물리적 특징으로 특성화되는 것을 추가로 특징으로 한다. "본질적으로 균일하다"는 것은 세포의 적어도 90%, 예컨대 세포의 적어도 91%, 예컨대 세포의 적어도 92%, 예컨대 세포의 적어도 93%, 예컨대 세포의 적어도 94%, 예컨대 세포의 적어도 95%, 예컨대 세포의 적어도 96%, 예컨대 세포의 적어도 97%, 예컨대 세포의 적어도 98%, 및 바람직하게는 세포의 적어도 91%가 하나 이상의 원하는 물리적 특성을 준수한다.
바람직하게는, 대식세포는 자가조직이다.
약제학적 조성물은 상기 설명된 형질전환 세포를 유효성분으로 함유한다. 또한, 약제학적으로 허용가능한 부형제도 함유한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간의 약제학적 용도에도 허용가능한 부형제를 포함한다.
이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체 또는 에어로졸 조성물의 경우 기체일 수 있다. 조직 또는 세포 재생용 조성물은 일반적으로 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 실질내, 복강내, 비강내 또는 근육내 투여될 수 있다. 일반적인 투여 경로는 정맥내 또는 실질내 투여이지만, 다른 경로도 동일하게 효과적일 수 있다.
정맥내 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 액체 형태일 것이다.
따라서, 이는 세포 이외에 본 발명의 세포의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 약제학적으로 허용가능한 희석제를 함유할 것이다. 이러한 희석제의 예로는 인산염-완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이 있다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 기타 무독성, 비치료적, 비면역원성 비히클, 아쥬반트 또는 안정제 등을 포함할 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 액체 형태이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 또 다른 약제학적 조성물 또는 또 다른 활성 성분과 조합되어 투여될 수 있다.
특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 동일한 용기에 조합된 본 발명의 세포 조성물뿐만 아니라 또 다른 활성 성분을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합된"은 본 발명의 세포와 다른 활성 성분이 반드시 동시에 투여된다는 것을 의미하지는 않는다.
이는 또한 서로 다른 시간 간격으로 또는 별도의 용기에 투여하는 것을 포함하는 모든 용도 또는 표시로 확장된다.
본 발명의 약제학적 조성물과 상기 활성 성분의 "병용 투여"는 활성 성분 및 본 발명의 조성물 둘 모두가 치료 효과를 갖게 되는 시점에 본 발명의 세포와 함께 투여하는 것을 의미한다.
이러한 동시 투여는 본 발명의 세포 투여와 관련하여 활성 성분의 동시(즉 동시발생), 이전 또는 후속 투여를 포함할 수 있다.
당업자는 본 발명의 특정 약물 및 조성물에 대한 적당한 시기, 순서 및 투여 용량을 결정하는 데 어려움이 없을 것이다.
이를 필요로 하는 대상체에서 본 발명의 세포 조성물의 생체 내 방출은 조직 및 세포를 재생하는 간단하고 효과적인 방식으로 본원에서 제안된다.
일반적으로 상기 대상체는 인간이지만, 비인간 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 말 등과 같은 반려동물, 토끼, 마우스, 랫트 등과 같은 실험용 포유동물 등도 치료될 수 있다.
따라서, 본원에서 이해되는 "치료가 필요한 대상체"는 예를 들어 조직 병변을 갖는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 본 발명의 세포 조성물을 주사에 의해 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 투여하는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 식세포, 바람직하게는 단핵구의 집단을 획득/단리하기 위해 상기 개시된 바와 같은 이들 세포의 인큐베이션 전에, 혈액, 골수 또는 탯줄, 또는 이를 필요로 하는 대상체의 재프로그램된 다능성 체세포 또는 건강한 공여자로부터 단핵 식세포 또는 이의 전구체 또는 줄기세포를 수집하고 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로, 방법은 이렇게 얻은 세포를 포장 및/또는 저장하는 것, 및 환자에게 가능한 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 치료적 실체의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라진다.
치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 이의 제형은 척수내, 뇌내, 경막외, 척수강내, 두개내, 비경구, 복강내, 정맥내, 피내, 기질내, 관절내, 활막내, 병변내, 동맥내, 심장내, 근육내, 비강내, 피부 또는 피하, 안와내, 피막내, 주제별, 안과 또는 안구, 수술용 임플란트, 내부 수술 페인트, 주입 펌프 또는 카테터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 방식들로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 현재 기술 분야에 공지된 다양한 방식으로 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 제제의 예로는 국소 또는 비경구 투여, 바람직하게는 조직내 투여를 위한, 모든 고체 조성물(정제, 알약, 캡슐, 샤세, 바이알, 분말, 과립, 바, 펜슬, 기화기, 에어로졸 등), 반고체(연고, 크림, 컨디셔너, 젤, 하이드로겔, 폼, 로션, 비누, 젤라틴 등), 또는 액체(수성 또는 비수성 용액, 하이드로알코올성 또는 하이드로글리콜성 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 무수 조성물, 수성 분산액, 오일, 우유, 컨디셔너, 도포제, 세럼 등)이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 지속 방출 제형 또는 임의의 다른 통상적인 방출 시스템의 형태일 수 있다. 용어 "지속 방출"은 일정 기간에 걸쳐 상기 세포의 점진적인 방출을 허용하고 바람직하게는 반드시 그런 것은 아니지만 일정 기간에 걸쳐 상대적으로 일정한 세포 방출을 허용하는 세포 전달 화합물 또는 시스템과 관련하여 통상적인 의미로 사용된다. 지속 방출 비히클 또는 시스템의 예시적인 예에는 리포솜, 혼합 리포솜, 올레오솜, 니오솜, 에토솜, 밀리캡슐, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 스폰지, 시클로덱스트린, 블리스터, 미셀, 혼합 계면활성제 미셀, 혼합 계면활성제 인지질 미셀, 밀리구체, 마이크로구체, 나노구체, 지질구체, 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 미니입자, 밀리입자, 마이크로입자, 나노입자, 고체 지질 나노입자, 나노구조 지질 매질, 중합체 물질, 생분해성 또는 비생분해성 패치 또는 임플란트, 또는 생분해성 마이크로입자, 예컨대 생분해성 마이크로입자가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 인용된 각 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 명세서, 지침, 프리젠테이션 등 포함)는 상기 또는 이하에 관계없이 전체 내용이 인용되어 여기에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "약", "ca." 및 "실질적으로"는 모두 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본원에 제시된 수치 또는 범위와 관련하여 바람직하게는 인용되거나 청구된 수치 또는 범위 부근의 +/- 10%, 더 바람직하게는 +/- 5%를 지정한다. 세포의 특성과 관련하여 “실질적으로 아님”, “실질적으로 없음” 등의 용어는 최신 기술에 따라 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 분석 방법으로는 세포에서 해당 특성을 검출할 수 없고/없거나, 이렇게 설명된 집단의 실질적으로 모든 세포가 해당 특성을 갖지 않음을 의미한다.
달리 명시적으로 특정하지 않는 한, "포함하다"라는 단어 또는 "포함하는" 또는 "포함한"과 같은 변형은 본 문서와 관련하여 사용되어 "포함하는"으로 소개된 목록의 구성원 외에 추가 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 본 발명의 특정 구현예로서 "포함하는"이라는 용어는 더 이상의 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함하는 것으로 고려되며, 즉 이 구현예의 목적을 위해 "포함하는"은 "구성되는"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 이제 하기 도면을 참조하여 비제한적인 실시예를 통해 설명될 것이다.
도 1. 수술 당시 동물의 체중.
그래프는 0일차 첫 번째 수술(척추 손상) 당시 실험에 고려된 동물의 체중을 나타낸다.
도 2. 중증도의 척추 손상 모델에서 THEM 및 M2 대식세포 주입 부위의 다이어그램.
중증도의 척추 손상을 입은 동물은 다중 THEM 또는 M2 세포 이식 또는 식염수 주입을 받았다. 검정색 화살표는 주입이 수행된 위치를 나타낸다. 대조군 동물에서 확인된 동일한 점은 식염수 주입을 나타낸다. 점선은 등쪽 영역(주사가 수행된 곳)과 척추 실질의 복부 영역 사이의 분리를 나타낸다.
도 3. 주성분 분석을 통한 전체 전사체 가변성 분석은 혈관신생 및 세포외 기질 리모델링에 관여하는 더 높은 수준의 유전자 발현과 관련된 비치료적 활성 M2 세포와 관련하여 THEM 세포에서 명확하게 구별되는 전사체를 보여준다.
THEM 세포(검정색 점) 및 이전의 M2 대식세포(회색 점)와 관련된 시퀀싱 RNA의 주성분 분석(PCA). 분석 결과 THEM(검정색 점)과 M2 대식세포(회색 점)의 클러스터가 서로 분리되어, 이식 전 세포 간 표현형의 차이가 강조되는 것으로 나타났다.
도 4. 다중 THEM 이식 후 중증도의 척추 손상을 입은 동물의 운동 회복이 향상되었다.
그래프는 골수 병변이 발생한 마우스에서 측정 가능한 운동 능력을 측정하기 위한 척도인 BMS(Basso Mouse Scale)의 점수를 나타내며; 척도는 검증되고 안정적이며 신뢰할 수 있다[14]. 그래프에서, 다중 THEM 세포 이식을 받은 동물(진한 회색 선, 5개 실험 중 n=24), 다중 M2 세포 이식을 받은 동물(연한 회색 선, 4개 실험 중 n=12)의 BMS 및 멸균 식염수 주입을 받은 대조군 동물(검정색 선, 7개 실험 중 n=26)의 BMS. 화살표는 이식이 수행된 시점을 나타낸다. 다중 THEM 이식을 받은 동물의 BMS는 운동 수행능력의 점진적인 개선을 보여주었는데, 이는 다중 M2 이식을 받은 동물(0.375 ± 0.109) 및 대조군 동물(0.712 ± 0.157)에 비해 유의하게 더 높았다(1.792 ± 0.327). 실험 조건 간의 차이는 2wayANOVA 테스트와 사후 Sidak 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 5 다중 THEM 이식 후 중증도의 척추 손상을 입은 동물의 발목 관절의 유연성이 향상되었다.
그래프는 다중 THEM 이식을 받은 동물(진한 회색 선, 총 7개 실험 중 n=24), 다중 M2 세포 이식을 받은 동물(연한 회색 선, 총 3개 실험 중 n=12) 및 15 dpi에서 실험이 끝날 때까지 멸균 식염수 주입을 받은 대조군 동물(검정색 선, 총 7개 실험 중 n=26)의 발목 관절 유연성 점수를 나타낸다. 31 dpi에서 다중 THEM 이식을 받은 동물의 발목 유연성(0.799 ± 0.037)은 다중 M2 이식을 받은 동물(0.659 ± 0.049) 및 대조군(0.612 ± 0.045)보다 상당히 더 컸다. 실험 조건 간의 차이는 2wayANOVA 테스트와 사후 Tukey 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01.
도 6. 중증도의 척추 손상 후 다중 THEM 이식 동물은 근전도 검사를 통해 더 많은 생리학적 근육 활성화 기간 값을 보여준다.
그래프는 대조군 동물(흰색), 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 건강한 동물(회색)에서 외측 비복근 근육의 근전도 활성화 기간을 보여준다. 다중 THEM 이식을 받은 동물에서, 외측 비복근의 근전도 활성화 기간은 대조군 동물(0.593 s ± 0.101 s)에 비해 통계적으로 더 짧았으며(0.338 s ± 0.048 s), 이는 건강한 동물의 근육의 생리적 상태(0.231 s ± 0.038 s)에 가까웠다. 실험 조건 간의 차이는 ONEwayANOVA 테스트와 Tukey 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01.
도 7. 이식 후 THEM 및 M2 세포는 척추 실질에서 방사형 및 세로 방향으로 지속되고 확산한다.
척수를 따라 있는 실질의 THEM 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 다양한 분포 영역(실질, 낭종, 수막)은 다양한 색상으로 표시된다(도면의 범례). 그래프에 나타낸 바와 같이, THEM은 이식 부위에서 척수의 여러 영역으로 세로 방향으로 확산하여, 낭종 영역의 척추 외상에 해당하는 부분에 집중된다. (B) 척수를 따라 실질에 있는 M2의 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 그래프에 나타낸 바와 같이, M2는 이식 부위에서 척수의 여러 영역으로 세로 방향으로 확산하여, 낭종 영역의 척추 외상에 해당하는 부분에 집중된다. (C) 병변 부위의 척추 실질 및 낭종에서 THEM 및 M2의 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 실험 THEM 그룹(진한 회색, 실질 46.46% ± 10.40%, 낭종 53.54% ± 10.40%, n=5), 실험 M2 그룹(연한 회색, 실질 46.90% ± 10.95%, 낭종 53.10% ± 10.95%, n=3). (D) 척수를 따라 있는 THEM의 방사형 및 세로 분포를 나타내는 이미지이다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정(Unpaired t-test)을 통해 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05. M2= 표현형 2 대식세포; THEM=종양-저산소증 학습된 대식세포.
도 8. 중증도의 척추 손상 후 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 병변 부위가 감소한 것으로 나타났다.
(A-D) 대조군 동물 및 정량화를 위해 고려되는 영역이 도시되어 있는 다중 THEM 이식을 받은 동물에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. (A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. (C-D) 대조군 동물 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(D)에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 진한 회색 영역은 신경교 흉터 영역을 나타낸다. 점선 영역은 낭종 영역을 나타낸다. 이 두 영역은 함께 병변의 전체 면적을 나타낸다. (E) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 신경교 흉터 영역에 대한 낭종 영역(연한 회색 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중 THEM 이식은 대조군 동물(33.24% ± 0.87%, n=3)에 비해 치료된 동물(21.38% ± 2.05%, n=3)에서 낭종 영역의 유의미한 감소를 초래했다. (F) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 단면적에 대한 신경교 흉터 영역(점선 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중 THEM 이식을 받은 동물(6.79% ± 0.85%, n=3)과 대조군 동물(6.69% ± 0.53%, n=3) 사이에 섹션의 전체 면적에 대한 신경교 흉터 영역의 백분율 차이가 없었다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물 당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01. GFAP = 신경교 섬유 산 단백질(Glia Fibrillary Acid Protein).
도 9. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 낭종 영역이 감소한 것으로 나타났다.
대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 단면적에 대한 낭종 영역(연한 회색 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중THEM 이식은 대조군 동물(4.73% ± 0.15%, n=3)에 비해 치료된 동물(2.03% ± 0.30%, n=3)에서 낭종 영역의 유의미한 감소를 초래했다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01.
도 10. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 총 뉴런 수가 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 뉴런 세포 특정 마커 NeuN(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)를 사용하여 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 수질 실질에 존재하는 NeuN+ 세포의 백분율 수. 뉴런 세포(NeuN+)의 비율은 총 핵 수에 대해 정규화된다. 도면에 도시된 바와 같이, 총 뉴런의 비율은 대조군 동물(6.81% ± 0.726%, n=4)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(13.13% ± 0.632%, n=5)에서 유의미하게 높았다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. ***P<0.001.
도 11. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 콜린성 뉴런 수가 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 뉴런 세포 특정 마커 ChAT(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 수질 실질에 존재하는 ChAT+ 세포의 백분율 수를 나타내는 그래프이다. 콜린성 뉴런(ChAT+)의 백분율은 총 핵 수에 대해 정규화된다. 도면에 도시된 바와 같이, 콜린성 뉴런의 백분율은 대조군 동물(0.245% ± 0.038%, n=4)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(0.412% ± 0.011%, n=4)에서 유의하게 높았다. 고려된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01. ChAT = 콜린 아세틸트랜스퍼라제.
도 12. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 신경필라멘트 함량이 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 NF200(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색) 신경필라멘트 단백질에 특이적인 마커를 사용하여 면역염색을 받은 척수의 종단면에서 얻은 병변 주위 영역의 확대. (C) NF200 마커 (NF200 + 영역)를 발현하는 영역과 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 분석을 위해 고려된 전체 면적 간의 백분율 비율을 나타내는 그래프. 수초의 백분율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 ROI에 존재하는 NF200-양성 픽셀로 계산되었다. 도시된 바와 같이, NF200의 백분율은 대조군 동물(9.723% ± 0.133%; n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(16.36% ± 2.09%, n=3)에서 유의하게 더 높았다. 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05. NF200 = 신경필라멘트-200, ROI= 관심 영역.
도 13. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 수초의 증가를 나타낸다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 룩솔 패스트 블루(LFB: Luxol Fast Blue) 염색을 받은 척수 단면. LFB를 사용하면 척수 실질, 특히 후부 척수(ROI) 영역에 포함된 수초(진한 회색 영역)을 감지할 수 있다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 ROI에 존재하는 수초의 백분율. 수초의 백분율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 ROI에 존재하는 수초-양성 픽셀로 계산되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 척수의 후부 척수에 포함된 수초의 백분율은 대조군 동물(19.870% ± 1.999%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(26.470% ± 1.075%, n=5)에서 유의하게 높았다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05. ROI=관심 영역.
도 14. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 면역 세포가 집중적으로 동원되는 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 소교세포 및 대식세포 집단 Iba1+(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 속하는 세포에 대한 특정 마커를 사용하여 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질에 존재하는 Iba1+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된, 활성화된 미세아교 세포(Iba1+)의 백분율은, 대조군 동물(3.847% ± 0.597%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.820% ± 0.411%, n=5)에서 유의하게 더 높았다. 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05.
도 15. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 면역 세포가 집중적으로 동원되는 것을 보여준다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 대식세포 집단 CD68(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 속하는 세포에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C-D) 대조군 동물(C) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(D)에서 CD206(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색) 프로-재생 표현형(M2)의 대식세포 집단에 속하는 세포에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (E) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질 내 CD68+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된 대식세포(CD68+)의 비율은, 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.484% ± 0.367%, n=5)에 비해 대조군 동물(6.143% ± 0.554%, n=3)에서 더 높았다. (F) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질 내 CD206+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된 표현형 2 대식세포(CD206+)의 비율은, 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.655% ± 0.497%, n=4)에 비해 대조군 동물(2.320% ± 0.080%, n=3)에서 유의하게 더 높았다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05, **P<0.01.
도 16. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 세포외 기질 침착이 감소한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 세포외 기질 특정 마커 아그리나(Agrina)(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)로 면역염색을 받은 척수 단면. 오렌지색의 점선은 정량화를 위해 고려되는 관심 영역(낭종의 전체 면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 낭종에 존재하는 아그린(Agrin)의 백분율은, 섹션의 전체 면적(흰색 점선)에 대해 표준화되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 고려되는 영역에 함유된 아그린의 비율은 대조군 동물(12.570% ± 2.140%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(3.500% ± 1.112%, n=3)에서 유의하게 더 낮았다. (D) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 낭종에 존재하는 피브로넥틴의 비율은 섹션의 전체 면적(흰색 점선)에 대해 표준화되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 고려되는 영역에 함유된 피브로넥틴의 비율은 대조군 동물(9.625% ± 3.375%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.190% ± 2.019%, n=3)에서 감소하는 경향을 보였다. 세포외 기질의 다양한 성분의 비율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 낭종에 존재하는 세포외 기질의 특정 성분(아그린, 피브로넥틴)에 대한 양의 픽셀로 계산되었다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05.
도 17. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 저산소 영역이 감소한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 유리 티올의 검출을 위해 염색된 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 골수 실질내 저산소 영역의 비율. 저산소 영역의 비율은 전체 단면의 전체 픽셀에 대해 전체 단면에 존재하는 저산소 영역당 양의 픽셀로 계산되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 저산소 영역의 비율은 대조군 동물(5.866% ± 0.745%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(3.173% ± 0.528%, n=3)에서 유의하게 더 낮았다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05.
도 18. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 가지의 수가 증가하고 최대 길이가 더 큰 혈관을 보여준다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 CD31 내피 세포(회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면으로부터 수득된 대표적인 관심 영역(ROI). (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 필드당 평균 혈관 수. 도시된 바와 같이, 다중 THEM 이식을 받은 동물(30.940 ± 3.592, n=3)에 비해 대조군 동물(37.070 ± 0.379, n=3)에서 필드당 평균 혈관 수가 더 많았다. (D) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관 당 평균 가지 수. 도시된 바와 같이, 필드당 평균 혈관 수는 대조군 동물(1.793 ± 0.073, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(2.110 ± 0.165, n=3)에서 더 많았다. (E) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관의 최대 평균 길이. 도시된 바와 같이, 혈관당 평균 가지 수 및 필드당 혈관의 최대 평균 길이는 대조군 동물(43.450 μm ± 0.751 μm)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(55.410 μm ± 2.500 μm)에서 유의하게 더 컸다. (F) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관 비틀림의 평균 값. 비틀림 값은 고려된 실험 그룹 간에 차이가 없음을 보여주었다(1.168 ± 0.005 다중 THEM 이식을 받은 동물, 1.153 ± 0.015 대조군). 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05. ROI=관심 영역.
도 19. iPSC의 인간 배양물에 마우스 THEM을 첨가하면 운동 뉴런 분화가 촉진된다.
A-B) 대조군 배양물(A), THEM과의 공동배양물(B) 및 M2와의 공동배양물(C)에서 뉴런 ßIII 튜불린(Tub3; 연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 대해 특이적인 마커를 사용하여 운동 뉴런으로 분화된 인간 IPSC의 면역염색. (D) 대조군 샘플(흰색), THEM과의 공동배양물(검정색) 및 M2 대식세포와의 공동배양물(회색)에서 분석을 위해 고려되는 전체 면적 값에 대해 표준화된 Tub3의 발현 영역. 도시된 바와 같이, THEM과의 공동배양물에서 Tub3 발현 영역은 대조군 및 M2와의 공동배양물에 비해 유의하게 더 컸다. (6.423% ± 0.494% 대조군, THEM과의 공동배양물 9.097% ± 0.253%, M2와의 공동배양물 7.235% ± 0.492%). 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3명의 공여자, 공여자마다 40개의 필드, 필드마다 4개의 이미지를 분석하였다. *P<0.05, **P<0.01.
도 20: 전체 전사체 프로파일에 대한 PCA는 THEM이 종양 조건화 및 저산소증을 필요로 하는 고유한 분자 특징을 가지고 있음을 보여준다. 미분화된 M0 대식세포(삼각형), M2 극성 대식세포(원), 저산소증 없이 배양된 TCM(십자표시), 및 THEM(사각형)의 전사체의 주요 성분 분석. PCA 분석은 THEM 클러스터가 다른 그룹과 잘 분리되어 THEM 고유의 분자 특징을 강조하고 THEM을 생성하기 위해 저산소증이 필요하다는 것을 보여주었다.
도 21: 저산소증, M0 및 M2 대식세포 없이 배양된 TCM과 비교하여 THEM에서 최고 농축된 유전자 온톨로지의 히트맵.
도 22: THEM 대 저산소증 없이 배양된 M0, M2 및 TCM의 차별적 유전자 발현
A) 저산소증 없이 배양된 M0(왼쪽 패널), M2(중간 패널) 및 TCM(오른쪽 패널)과 비교하여 THEM에 의해 발현된 유전자의 Log2 배수 변화를 보여주는 불케이노(Vulcano) 플롯; B) M2 및 M0와 비교하여 THEM에서 상향조절되고 고도로 발현되는 유전자의 발현 수준을 보여주는 그래프; C) M2 및 M0와 비교하여 THEM에서 낮은 수준 또는 전혀 없는 수준으로 하향조절된 유전자의 발현 수준을 보여주는 그래프.
도 23: 화학유인물질로서 SDF-1을 사용한 THEM, TCM, 및 M2 대식세포에 대한 이동 분석.
트랜스웰(Transwell) 이동 분석은 화학유인물질로서 하부 챔버에서 SDF-1a(100 ng/ml)를 사용하여 24-웰 주화성 챔버(8-μm 공극 크기)에서 수행되었다. 막대는 대조군과 비교하여 이동된 세포 수의 변화된 배수를 나타낸다.
도 24: 인간 운동 뉴런에 대한 뮤린 THEM 뉴런 재생 기능. (A) 공동 배양(CRTL) 없이, 뮤린 THEM 공동 배양과 함께(THEM), 저산소증 공동 배양 없고 M2 공동 배양과 함께 TCM과 함께 특정 뉴런 마커 ßIII 튜불린(Tub3, 녹색) 및 DAPI(청색)로 염색된 운동뉴런으로 분화된 인간 iPSC의 면역염색. (B) 공동 배양 없이, THEM과 함께, 저산소증 및 M2 공동 배양 없이 TCM과 함께, iPSC-유래 운동 뉴런에서 분석을 위해 고려된 전체 면적으로 표준화된 Tub3 발현 영역을 나타내는 그래프. THEM 공동 배양의 Tub3 발현 영역은 다른 모든 그룹보다 통계적으로 더 높으며, 이는 THEM이 더 높은 뉴런 분화 및 뉴런 과정 확장을 유도했음을 나타낸다. 중요하게는, THEM 공동 배양과 함께 관찰된 Tub3의 발현은 저산소증 공동 배양 없는 TCM과 비교하여 더 높으며, 이는 저산소증 치료가 THEM의 효과적인 재생 표현형을 정의하는데 필수적임을 나타낸다.
도 25: 인간 운동 뉴런에 대한 인간 THEM 뉴런 재생 기능.
(A) 대조군, 인간 THEM 공동 배양, 인간 TCM 공동 배양, 인간 M0 공동 배양 및 시험관 내 인간 M2 공동 배양의 분석을 위해 고려된 전체 면적으로 표준화된 Tub3 발현 영역을 나타내는 그래프. 인간 THEM 공동 배양에서 Tub3 발현 영역이 대조군 세포, M0 공동 배양, M2 대식세포 공동 배양 및 인간 TCM 공동 배양보다 유의하게 더 높은 결과를 보인 바와 같이, 이는 더 높은 뉴런 분화 및 뉴런 과정 확장을 시사한다. 또한, TCM 공동 배양보다 THEM 공동 배양에서 Tub3의 더 높은 발현은 저산소증 치료가 THEM의 적절한 효과적인 표현형을 결정하는 데 필수적임을 나타낸다.
도 26: 척수 손상 마우스 운동 회복에 대한 THEM 및 TCM의 생체 내 뉴런 재생 기능.
THEM; TCM 및 비히클(세포 없음) 이식 동물의 BMS 점수를 나타내는 그래프. 검정색 화살표는 이식이 수행된 시점을 나타낸다. THEM 이식 동물은 비히클 점수(0.711 ± 0.068) 및 TCM 점수(0.300 ± 0.200)보다 유의하게 더 높은 점수(2.188 ± 0.195)에 도달하는 운동 능력의 점진적인 향상을 보여주었다. 실험군 간의 통계적 차이는 2wayANOVA 테스트와 Sidak 사후 테스트에 의해 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 1. 수술 당시 동물의 체중.
그래프는 0일차 첫 번째 수술(척추 손상) 당시 실험에 고려된 동물의 체중을 나타낸다.
도 2. 중증도의 척추 손상 모델에서 THEM 및 M2 대식세포 주입 부위의 다이어그램.
중증도의 척추 손상을 입은 동물은 다중 THEM 또는 M2 세포 이식 또는 식염수 주입을 받았다. 검정색 화살표는 주입이 수행된 위치를 나타낸다. 대조군 동물에서 확인된 동일한 점은 식염수 주입을 나타낸다. 점선은 등쪽 영역(주사가 수행된 곳)과 척추 실질의 복부 영역 사이의 분리를 나타낸다.
도 3. 주성분 분석을 통한 전체 전사체 가변성 분석은 혈관신생 및 세포외 기질 리모델링에 관여하는 더 높은 수준의 유전자 발현과 관련된 비치료적 활성 M2 세포와 관련하여 THEM 세포에서 명확하게 구별되는 전사체를 보여준다.
THEM 세포(검정색 점) 및 이전의 M2 대식세포(회색 점)와 관련된 시퀀싱 RNA의 주성분 분석(PCA). 분석 결과 THEM(검정색 점)과 M2 대식세포(회색 점)의 클러스터가 서로 분리되어, 이식 전 세포 간 표현형의 차이가 강조되는 것으로 나타났다.
도 4. 다중 THEM 이식 후 중증도의 척추 손상을 입은 동물의 운동 회복이 향상되었다.
그래프는 골수 병변이 발생한 마우스에서 측정 가능한 운동 능력을 측정하기 위한 척도인 BMS(Basso Mouse Scale)의 점수를 나타내며; 척도는 검증되고 안정적이며 신뢰할 수 있다[14]. 그래프에서, 다중 THEM 세포 이식을 받은 동물(진한 회색 선, 5개 실험 중 n=24), 다중 M2 세포 이식을 받은 동물(연한 회색 선, 4개 실험 중 n=12)의 BMS 및 멸균 식염수 주입을 받은 대조군 동물(검정색 선, 7개 실험 중 n=26)의 BMS. 화살표는 이식이 수행된 시점을 나타낸다. 다중 THEM 이식을 받은 동물의 BMS는 운동 수행능력의 점진적인 개선을 보여주었는데, 이는 다중 M2 이식을 받은 동물(0.375 ± 0.109) 및 대조군 동물(0.712 ± 0.157)에 비해 유의하게 더 높았다(1.792 ± 0.327). 실험 조건 간의 차이는 2wayANOVA 테스트와 사후 Sidak 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 5 다중 THEM 이식 후 중증도의 척추 손상을 입은 동물의 발목 관절의 유연성이 향상되었다.
그래프는 다중 THEM 이식을 받은 동물(진한 회색 선, 총 7개 실험 중 n=24), 다중 M2 세포 이식을 받은 동물(연한 회색 선, 총 3개 실험 중 n=12) 및 15 dpi에서 실험이 끝날 때까지 멸균 식염수 주입을 받은 대조군 동물(검정색 선, 총 7개 실험 중 n=26)의 발목 관절 유연성 점수를 나타낸다. 31 dpi에서 다중 THEM 이식을 받은 동물의 발목 유연성(0.799 ± 0.037)은 다중 M2 이식을 받은 동물(0.659 ± 0.049) 및 대조군(0.612 ± 0.045)보다 상당히 더 컸다. 실험 조건 간의 차이는 2wayANOVA 테스트와 사후 Tukey 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01.
도 6. 중증도의 척추 손상 후 다중 THEM 이식 동물은 근전도 검사를 통해 더 많은 생리학적 근육 활성화 기간 값을 보여준다.
그래프는 대조군 동물(흰색), 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 건강한 동물(회색)에서 외측 비복근 근육의 근전도 활성화 기간을 보여준다. 다중 THEM 이식을 받은 동물에서, 외측 비복근의 근전도 활성화 기간은 대조군 동물(0.593 s ± 0.101 s)에 비해 통계적으로 더 짧았으며(0.338 s ± 0.048 s), 이는 건강한 동물의 근육의 생리적 상태(0.231 s ± 0.038 s)에 가까웠다. 실험 조건 간의 차이는 ONEwayANOVA 테스트와 Tukey 사후 테스트 통계 분석 방법을 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM의 형태로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01.
도 7. 이식 후 THEM 및 M2 세포는 척추 실질에서 방사형 및 세로 방향으로 지속되고 확산한다.
척수를 따라 있는 실질의 THEM 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 다양한 분포 영역(실질, 낭종, 수막)은 다양한 색상으로 표시된다(도면의 범례). 그래프에 나타낸 바와 같이, THEM은 이식 부위에서 척수의 여러 영역으로 세로 방향으로 확산하여, 낭종 영역의 척추 외상에 해당하는 부분에 집중된다. (B) 척수를 따라 실질에 있는 M2의 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 그래프에 나타낸 바와 같이, M2는 이식 부위에서 척수의 여러 영역으로 세로 방향으로 확산하여, 낭종 영역의 척추 외상에 해당하는 부분에 집중된다. (C) 병변 부위의 척추 실질 및 낭종에서 THEM 및 M2의 분포 비율을 나타내는 그래프이다. 실험 THEM 그룹(진한 회색, 실질 46.46% ± 10.40%, 낭종 53.54% ± 10.40%, n=5), 실험 M2 그룹(연한 회색, 실질 46.90% ± 10.95%, 낭종 53.10% ± 10.95%, n=3). (D) 척수를 따라 있는 THEM의 방사형 및 세로 분포를 나타내는 이미지이다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정(Unpaired t-test)을 통해 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05. M2= 표현형 2 대식세포; THEM=종양-저산소증 학습된 대식세포.
도 8. 중증도의 척추 손상 후 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 병변 부위가 감소한 것으로 나타났다.
(A-D) 대조군 동물 및 정량화를 위해 고려되는 영역이 도시되어 있는 다중 THEM 이식을 받은 동물에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. (A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. (C-D) 대조군 동물 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(D)에서 GFAP 성상교세포(연한 회색) 및 TO-PRO3(진한 회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 진한 회색 영역은 신경교 흉터 영역을 나타낸다. 점선 영역은 낭종 영역을 나타낸다. 이 두 영역은 함께 병변의 전체 면적을 나타낸다. (E) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 신경교 흉터 영역에 대한 낭종 영역(연한 회색 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중 THEM 이식은 대조군 동물(33.24% ± 0.87%, n=3)에 비해 치료된 동물(21.38% ± 2.05%, n=3)에서 낭종 영역의 유의미한 감소를 초래했다. (F) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 단면적에 대한 신경교 흉터 영역(점선 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중 THEM 이식을 받은 동물(6.79% ± 0.85%, n=3)과 대조군 동물(6.69% ± 0.53%, n=3) 사이에 섹션의 전체 면적에 대한 신경교 흉터 영역의 백분율 차이가 없었다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물 당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01. GFAP = 신경교 섬유 산 단백질(Glia Fibrillary Acid Protein).
도 9. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 낭종 영역이 감소한 것으로 나타났다.
대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 총 단면적에 대한 낭종 영역(연한 회색 영역)의 백분율 비율을 나타내는 그래프이다. 다중THEM 이식은 대조군 동물(4.73% ± 0.15%, n=3)에 비해 치료된 동물(2.03% ± 0.30%, n=3)에서 낭종 영역의 유의미한 감소를 초래했다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01.
도 10. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 총 뉴런 수가 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 뉴런 세포 특정 마커 NeuN(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)를 사용하여 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 수질 실질에 존재하는 NeuN+ 세포의 백분율 수. 뉴런 세포(NeuN+)의 비율은 총 핵 수에 대해 정규화된다. 도면에 도시된 바와 같이, 총 뉴런의 비율은 대조군 동물(6.81% ± 0.726%, n=4)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(13.13% ± 0.632%, n=5)에서 유의미하게 높았다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. ***P<0.001.
도 11. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 콜린성 뉴런 수가 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 뉴런 세포 특정 마커 ChAT(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 수질 실질에 존재하는 ChAT+ 세포의 백분율 수를 나타내는 그래프이다. 콜린성 뉴런(ChAT+)의 백분율은 총 핵 수에 대해 정규화된다. 도면에 도시된 바와 같이, 콜린성 뉴런의 백분율은 대조군 동물(0.245% ± 0.038%, n=4)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(0.412% ± 0.011%, n=4)에서 유의하게 높았다. 고려된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. **P<0.01. ChAT = 콜린 아세틸트랜스퍼라제.
도 12. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 신경필라멘트 함량이 증가한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 NF200(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색) 신경필라멘트 단백질에 특이적인 마커를 사용하여 면역염색을 받은 척수의 종단면에서 얻은 병변 주위 영역의 확대. (C) NF200 마커 (NF200 + 영역)를 발현하는 영역과 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 분석을 위해 고려된 전체 면적 간의 백분율 비율을 나타내는 그래프. 수초의 백분율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 ROI에 존재하는 NF200-양성 픽셀로 계산되었다. 도시된 바와 같이, NF200의 백분율은 대조군 동물(9.723% ± 0.133%; n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(16.36% ± 2.09%, n=3)에서 유의하게 더 높았다. 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05. NF200 = 신경필라멘트-200, ROI= 관심 영역.
도 13. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 수초의 증가를 나타낸다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 룩솔 패스트 블루(LFB: Luxol Fast Blue) 염색을 받은 척수 단면. LFB를 사용하면 척수 실질, 특히 후부 척수(ROI) 영역에 포함된 수초(진한 회색 영역)을 감지할 수 있다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 ROI에 존재하는 수초의 백분율. 수초의 백분율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 ROI에 존재하는 수초-양성 픽셀로 계산되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 척수의 후부 척수에 포함된 수초의 백분율은 대조군 동물(19.870% ± 1.999%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(26.470% ± 1.075%, n=5)에서 유의하게 높았다. 분석된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05. ROI=관심 영역.
도 14. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 면역 세포가 집중적으로 동원되는 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 소교세포 및 대식세포 집단 Iba1+(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 속하는 세포에 대한 특정 마커를 사용하여 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질에 존재하는 Iba1+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된, 활성화된 미세아교 세포(Iba1+)의 백분율은, 대조군 동물(3.847% ± 0.597%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.820% ± 0.411%, n=5)에서 유의하게 더 높았다. 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05.
도 15. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 면역 세포가 집중적으로 동원되는 것을 보여준다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 대식세포 집단 CD68(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 속하는 세포에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C-D) 대조군 동물(C) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(D)에서 CD206(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색) 프로-재생 표현형(M2)의 대식세포 집단에 속하는 세포에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (E) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질 내 CD68+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된 대식세포(CD68+)의 비율은, 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.484% ± 0.367%, n=5)에 비해 대조군 동물(6.143% ± 0.554%, n=3)에서 더 높았다. (F) 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색) 및 대조군 동물(흰색)에서 골수 실질 내 CD206+ 세포의 백분율. 총 핵 수에 대해 표준화된 표현형 2 대식세포(CD206+)의 비율은, 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.655% ± 0.497%, n=4)에 비해 대조군 동물(2.320% ± 0.080%, n=3)에서 유의하게 더 높았다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05, **P<0.01.
도 16. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 세포외 기질 침착이 감소한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 세포외 기질 특정 마커 아그리나(Agrina)(연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)로 면역염색을 받은 척수 단면. 오렌지색의 점선은 정량화를 위해 고려되는 관심 영역(낭종의 전체 면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 낭종에 존재하는 아그린(Agrin)의 백분율은, 섹션의 전체 면적(흰색 점선)에 대해 표준화되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 고려되는 영역에 함유된 아그린의 비율은 대조군 동물(12.570% ± 2.140%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(3.500% ± 1.112%, n=3)에서 유의하게 더 낮았다. (D) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 낭종에 존재하는 피브로넥틴의 비율은 섹션의 전체 면적(흰색 점선)에 대해 표준화되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 고려되는 영역에 함유된 피브로넥틴의 비율은 대조군 동물(9.625% ± 3.375%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(5.190% ± 2.019%, n=3)에서 감소하는 경향을 보였다. 세포외 기질의 다양한 성분의 비율은 고려된 ROI의 전체 픽셀에 대해 낭종에 존재하는 세포외 기질의 특정 성분(아그린, 피브로넥틴)에 대한 양의 픽셀로 계산되었다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05.
도 17. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 저산소 영역이 감소한 것으로 나타났다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 유리 티올의 검출을 위해 염색된 척수 단면. 점선은 정량화를 위해 고려되는 영역(총 단면적)을 구분한다. (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)의 골수 실질내 저산소 영역의 비율. 저산소 영역의 비율은 전체 단면의 전체 픽셀에 대해 전체 단면에 존재하는 저산소 영역당 양의 픽셀로 계산되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 저산소 영역의 비율은 대조군 동물(5.866% ± 0.745%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(3.173% ± 0.528%, n=3)에서 유의하게 더 낮았다. 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션을 분석했다. *P<0.05.
도 18. 중증도의 척추 손상 후, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물에 비해 가지의 수가 증가하고 최대 길이가 더 큰 혈관을 보여준다.
(A-B) 대조군 동물(A) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(B)에서 CD31 내피 세포(회색)에 대한 특정 마커로 면역염색을 받은 척수 단면으로부터 수득된 대표적인 관심 영역(ROI). (C) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 필드당 평균 혈관 수. 도시된 바와 같이, 다중 THEM 이식을 받은 동물(30.940 ± 3.592, n=3)에 비해 대조군 동물(37.070 ± 0.379, n=3)에서 필드당 평균 혈관 수가 더 많았다. (D) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관 당 평균 가지 수. 도시된 바와 같이, 필드당 평균 혈관 수는 대조군 동물(1.793 ± 0.073, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(2.110 ± 0.165, n=3)에서 더 많았다. (E) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관의 최대 평균 길이. 도시된 바와 같이, 혈관당 평균 가지 수 및 필드당 혈관의 최대 평균 길이는 대조군 동물(43.450 μm ± 0.751 μm)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(55.410 μm ± 2.500 μm)에서 유의하게 더 컸다. (F) 대조군 동물(흰색) 및 다중 THEM 이식을 받은 동물(검정색)에서 고려되는 영역(ROI)의 혈관 비틀림의 평균 값. 비틀림 값은 고려된 실험 그룹 간에 차이가 없음을 보여주었다(1.168 ± 0.005 다중 THEM 이식을 받은 동물, 1.153 ± 0.015 대조군). 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=5마리의 동물, 각 그룹에 대해 동물당 8개의 섹션. *P<0.05. ROI=관심 영역.
도 19. iPSC의 인간 배양물에 마우스 THEM을 첨가하면 운동 뉴런 분화가 촉진된다.
A-B) 대조군 배양물(A), THEM과의 공동배양물(B) 및 M2와의 공동배양물(C)에서 뉴런 ßIII 튜불린(Tub3; 연한 회색) 및 DAPI(진한 회색)에 대해 특이적인 마커를 사용하여 운동 뉴런으로 분화된 인간 IPSC의 면역염색. (D) 대조군 샘플(흰색), THEM과의 공동배양물(검정색) 및 M2 대식세포와의 공동배양물(회색)에서 분석을 위해 고려되는 전체 면적 값에 대해 표준화된 Tub3의 발현 영역. 도시된 바와 같이, THEM과의 공동배양물에서 Tub3 발현 영역은 대조군 및 M2와의 공동배양물에 비해 유의하게 더 컸다. (6.423% ± 0.494% 대조군, THEM과의 공동배양물 9.097% ± 0.253%, M2와의 공동배양물 7.235% ± 0.492%). 연구된 실험 조건 간의 차이는 독립표본 t-검정으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; n=3명의 공여자, 공여자마다 40개의 필드, 필드마다 4개의 이미지를 분석하였다. *P<0.05, **P<0.01.
도 20: 전체 전사체 프로파일에 대한 PCA는 THEM이 종양 조건화 및 저산소증을 필요로 하는 고유한 분자 특징을 가지고 있음을 보여준다. 미분화된 M0 대식세포(삼각형), M2 극성 대식세포(원), 저산소증 없이 배양된 TCM(십자표시), 및 THEM(사각형)의 전사체의 주요 성분 분석. PCA 분석은 THEM 클러스터가 다른 그룹과 잘 분리되어 THEM 고유의 분자 특징을 강조하고 THEM을 생성하기 위해 저산소증이 필요하다는 것을 보여주었다.
도 21: 저산소증, M0 및 M2 대식세포 없이 배양된 TCM과 비교하여 THEM에서 최고 농축된 유전자 온톨로지의 히트맵.
도 22: THEM 대 저산소증 없이 배양된 M0, M2 및 TCM의 차별적 유전자 발현
A) 저산소증 없이 배양된 M0(왼쪽 패널), M2(중간 패널) 및 TCM(오른쪽 패널)과 비교하여 THEM에 의해 발현된 유전자의 Log2 배수 변화를 보여주는 불케이노(Vulcano) 플롯; B) M2 및 M0와 비교하여 THEM에서 상향조절되고 고도로 발현되는 유전자의 발현 수준을 보여주는 그래프; C) M2 및 M0와 비교하여 THEM에서 낮은 수준 또는 전혀 없는 수준으로 하향조절된 유전자의 발현 수준을 보여주는 그래프.
도 23: 화학유인물질로서 SDF-1을 사용한 THEM, TCM, 및 M2 대식세포에 대한 이동 분석.
트랜스웰(Transwell) 이동 분석은 화학유인물질로서 하부 챔버에서 SDF-1a(100 ng/ml)를 사용하여 24-웰 주화성 챔버(8-μm 공극 크기)에서 수행되었다. 막대는 대조군과 비교하여 이동된 세포 수의 변화된 배수를 나타낸다.
도 24: 인간 운동 뉴런에 대한 뮤린 THEM 뉴런 재생 기능. (A) 공동 배양(CRTL) 없이, 뮤린 THEM 공동 배양과 함께(THEM), 저산소증 공동 배양 없고 M2 공동 배양과 함께 TCM과 함께 특정 뉴런 마커 ßIII 튜불린(Tub3, 녹색) 및 DAPI(청색)로 염색된 운동뉴런으로 분화된 인간 iPSC의 면역염색. (B) 공동 배양 없이, THEM과 함께, 저산소증 및 M2 공동 배양 없이 TCM과 함께, iPSC-유래 운동 뉴런에서 분석을 위해 고려된 전체 면적으로 표준화된 Tub3 발현 영역을 나타내는 그래프. THEM 공동 배양의 Tub3 발현 영역은 다른 모든 그룹보다 통계적으로 더 높으며, 이는 THEM이 더 높은 뉴런 분화 및 뉴런 과정 확장을 유도했음을 나타낸다. 중요하게는, THEM 공동 배양과 함께 관찰된 Tub3의 발현은 저산소증 공동 배양 없는 TCM과 비교하여 더 높으며, 이는 저산소증 치료가 THEM의 효과적인 재생 표현형을 정의하는데 필수적임을 나타낸다.
도 25: 인간 운동 뉴런에 대한 인간 THEM 뉴런 재생 기능.
(A) 대조군, 인간 THEM 공동 배양, 인간 TCM 공동 배양, 인간 M0 공동 배양 및 시험관 내 인간 M2 공동 배양의 분석을 위해 고려된 전체 면적으로 표준화된 Tub3 발현 영역을 나타내는 그래프. 인간 THEM 공동 배양에서 Tub3 발현 영역이 대조군 세포, M0 공동 배양, M2 대식세포 공동 배양 및 인간 TCM 공동 배양보다 유의하게 더 높은 결과를 보인 바와 같이, 이는 더 높은 뉴런 분화 및 뉴런 과정 확장을 시사한다. 또한, TCM 공동 배양보다 THEM 공동 배양에서 Tub3의 더 높은 발현은 저산소증 치료가 THEM의 적절한 효과적인 표현형을 결정하는 데 필수적임을 나타낸다.
도 26: 척수 손상 마우스 운동 회복에 대한 THEM 및 TCM의 생체 내 뉴런 재생 기능.
THEM; TCM 및 비히클(세포 없음) 이식 동물의 BMS 점수를 나타내는 그래프. 검정색 화살표는 이식이 수행된 시점을 나타낸다. THEM 이식 동물은 비히클 점수(0.711 ± 0.068) 및 TCM 점수(0.300 ± 0.200)보다 유의하게 더 높은 점수(2.188 ± 0.195)에 도달하는 운동 능력의 점진적인 향상을 보여주었다. 실험군 간의 통계적 차이는 2wayANOVA 테스트와 Sidak 사후 테스트에 의해 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
재료 및 방법
마우스 THEM, M2 및 TCM 대식세포를 얻기 위한 프로토콜
THEM(종양 및 저산소증 학습된 대식세포)을 얻기 위해, dT-Tomato 수컷 마우스 골수로부터 단리된 신선한 단핵구를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 뮤린 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)가 보충된 세포 배양 배지(IMDM)에서 정상산소증 조건 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 접착하여 배양하였다. 그런 다음, 50% 종양 상청액 (고형 섬유육종 및 신경아교종 체외이식편의 배양물로부터 수득됨, 이로부터 종양-풍부 상청액이 선택됨) 및 50% IMDM으로 이루어진 배지로 배지를 변형시키고, 배양물을 저산소 조건(1% O2)에서 마지막 18시간 동안 유지시켰다.
TCM(종양 조건화된 대식세포)을 얻기 위해, dT-Tomato 수컷 마우스 골수로부터 단리된 신선한 단핵구를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 뮤린 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)가 보충된 세포 배양 배지(IMDM)에서 정상산소증 조건 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 접착하여 배양하였다. 그런 다음, 50% 종양 상청액 (고형 섬유육종 및 신경아교종 체외이식편의 배양물로부터 수득됨, 이로부터 종양-풍부 상청액이 선택됨) 및 50% IMDM으로 이루어진 배지로 배지를 변형시키고, 배양물을 정상산소증에서 실험 전 마지막 18시간 동안 유지시켰다.
M2 대식세포를 얻기 위해, dT-Tomato 수컷 마우스 골수로부터 단리된 신선한 단핵구를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 뮤린 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)가 보충된 세포 배양 배지(IMDM)에서 정상산소증 조건 37℃, 5% CO2에서 1주일 동안 접착하여 배양하였다. 그런 다음, 실험 전 마지막 18시간 동안 20 ng/mL의 IL-4가 첨가된 IMDM 배지를 사용하여 정상산소 조건(21% O2)에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
인간 THEM, TCM, M2 및 M0 대식세포를 수득하기 위한 프로토콜
THEM을 얻기 위해, 혈액-유래 CD14+ 단핵구를 70% 배양 배지(RPMI + 10% FBS+ 100 ng/ml M-CSF) 및 30% 종양 조건화된 배지를 사용하여 정상산소 상태에서 6일 동안 시험관 내 배양한 후 18 내지 24시간 동안 저산소 상태에서 배양하였다. 종양 조건화된 배지는 약 12 내지 72시간의 기간 동안 종양 계통의 상청액 또는 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제물의 상청액으로부터 얻는다.
TCM(종양 조건화된 대식세포)을 얻기 위해, 혈액-유래 CD14+ 단핵구를 70% 배양 배지(RPMI + 10% FBS+ 100 ng/ml M-CSF) 및 30% 종양 조건화된 배지를 사용하여 정상산소 상태에서 7일 동안 시험관 내 배양하였다.
극성화되지 않은 M0 대식세포를 얻기 위해, 혈액-유래 CD14+ 단핵구를 100% 배양 배지(RPMI + 10% FBS+ 100 ng/ml M-CSF)를 사용하여 정상산소 상태에서 7일 동안 시험관 내 배양하였다.
M2 대식세포를 얻기 위해, M0 대식세포를 생성한 다음, 마지막 18시간 동안 IL4(20 ng/ml)를 첨가하여 분극화시켰다.
전사체 분석
제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Plus Micro Kit(Qiagen, Cat No. 74034)를 사용하여 마우스 또는 인간 대식세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 단편 분석기(Agilent Technologies)를 사용하여 RNA 무결성을 평가하였다. "TruSeq Stranded mRNA 라이브러리 제조 키트"(Illumina, 미국 샌디에고 소재)를 사용하여 100 ng 고품질 전체 RNA부터 시작하여 RNAseq 라이브러리 제조를 수행하였다. 간략하게 말하면, mRNA 분획을 폴리A 포획에 의해 전체 RNA로부터 정제하고, 단편화하고, cDNA 합성을 실시하였다. 바코드화된 DNA 어댑터를 이중-가닥 cDNA의 양쪽 말단에 결찰시키고 PCR 증폭을 실시하였다. 단편 분석기(Agilent Technologies)를 사용하여 라이브러리 생성물을 평가한 다음, 75 bp 단일-엔드 판독을 사용하여 Illumina NextSeq500 시퀀서에서 시퀀싱하여, 샘플당 약 1,700만 개의 판독을 생성하였다. 소프트웨어 Scythe (v0.991) 및 Sickle (v1.33)을 사용하여 품질 관리를 수행하였다. 그런 다음 마우스 전사체(Gencode M23-GRCm38)의 참조 서열에 대해 컴퓨터 소프트웨어 Salmon v.1.0.0을 실행하여 각 샘플에서 전사체 발현 수준을 정량화하였다.
여러 비교를 위해 p-값을 조정하기 위해 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 R 소프트웨어(https://www.r-project.org/)의 라이브러리 DESeq2에 구현된 음이항 분포 모델(negative binomial distribution model)을 사용하여 서열 수 데이터에 대한 미분 발현 분석을 수행하였다. 모든 비교에서 각 발현된 전사체에 대해 전사체 발현 배수 변화가 추정되었다. 그런 다음, 가장 관련성이 높은 상향조절된 유전자를 R의 라이브러리 dnet에 구현된 유전자 온톨로지에 기반한 농축 분석에 의해 생물학적 과정과 분자 기능으로 요약하였다.
중증 좌상성 척추 손상의 동물 모델
Charles River에서 구입한 수컷 성체(7주령) C57BL/6J 마우스는 추궁절제술을 받은 다음 이전에 설명한 대로 흉추 11번(T11) 수준에서 중증 좌상성 척추 손상을 받았다(15,16). 간략하게 말하면, 7주령 C57BL/6 수컷 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시키고, 추궁절제술을 T11 수준에서 수행하였다. MASCIS 임팩터를 사용하여 5-gr 막대를 6.25 mm 높이에서 떨어뜨린 후 11초 동안 압축 상태로 두었다. 손상 후 첫 7일 동안 매일(dpi) Baytril(25 mg/ml) 및 Rimadyl(50 mg/ml)의 피하 주사를 제공했다. 동물 관리는 모든 실험 기간 동안 매일 수행하였으며, 동물 체중을 하루에 한 번, 방광 비우기를 5 dpi까지 하루에 두 번, 그리고 실험이 끝날 때까지 하루에 한 번 포함시켰다. 수술을 수행하기 전 모든 동물의 체중을 측정하였으며, 체중 17 내지 31 g 범위의 마우스만을 실험 대상으로 하여 수술을 실시하였다. 수술 당시 동물의 체중은 도 1에 도시되어 있다. 수술 병변 및 세포 이식으로 인해 적용된 절차의 심각성 또는 회복 기간 동안의 합병증으로 인해 동물 142마리 중 26마리가 사망했다.
중증도의 척추 손상 모델에서 THEM, M2 및 TCM 대식세포 이식 프로토콜
이식 당일, Acutase를 사용하여 배양물 중 THEM, TCM 및 M2 대식세포를 플레이트로부터 제거하고, 원심분리하여 상청액을 제거하고, 0.5*106개 세포/μl의 농도로 식염수에 재현탁하였다. 각 이식 세션마다, THEM, TCM, M2 또는 비히클 그룹에 속하는 각 실험 동물은 병변을 중심으로 한 척수 부분에 있는 등쪽 기둥에서 서로 2 mm 떨어진 4개의 서로 다른 지점에 4회 주사(1 μl/주사)를 받았다(주사 깊이: 0.5 mm)(도 2). 세포 이식은 마이크로인젝터와 정위장치가 연결된 유리 모세관을 이용하여 0.5 μl/분의 속도로 수행하였다. 각 주입 후, 유리 모세관을 5분 동안 제자리에 유지하여 세포 현탁액의 역류를 최대한 최소화했다. 5분 후, 등쪽 상처를 봉합하고 소독한 후 식염수 1 mL를 피하 투여하였다. 모든 절차가 끝나면, 동물을 가열 매트 위에 놓고, 완전히 깨어날 때까지 모니터링했다.
THEM 효능에 대한 연구 설계 1 평가
중증 좌상성 척추 손상을 입은 동물을 3개의 실험 그룹으로 나누었다: 첫 번째 그룹은 다중 THEM 이식을 받았고, 두 번째 그룹은 다중 M2 대식세포 이식을 받았고, 마지막으로 세 번째 그룹은 멸균 식염수 주사를 받았다. 동물을 3개의 실험군으로 나누기 전에, 첫 번째 이식 당일(척추 좌상 병변 3일 후, 3 dpi)에 동물의 운동 성능을 평가했으며, Basso 마우스 척도 분석(BMS)에서 0 내지 0.5의 값이 나온 중증도의 척추 손상이 있는 동물만 실험 계획의 다음 단계에 사용되었다. 3 또는 4회 이식/식염수 주사를 수행하였다(시점 3 이식: 3 dpi, 10 dpi, 17 dpi; 시점 4 이식: 3 dpi, 10 dpi, 17 dpi, 및 24 dpi). 실험은 척추 손상 후 31일(31 dpi)에 종료되었다. 시험이 끝나면 고려된 실험군에서 기능 회복 값과 조직학적 특징을 평가하였다.
TCM과 비교한 THEM 효능의 연구 설계 2 평가
중증 좌상성 척추 손상을 입은 동물을 3개의 실험 그룹으로 나누었다: 첫 번째 그룹은 다중 THEM 이식을 받았고, 두 번째 그룹은 다중 TCM 대식세포 이식을 받았고, 마지막으로 세 번째 그룹은 멸균 식염수 주사를 받았다. 동물을 3개의 실험군으로 나누기 전에, 첫 번째 이식 당일(척추 좌상 병변 3일 후, 3 dpi)에 동물의 운동 성능을 평가했으며, 중증도의 척추 손상이 있는 동물만, Basso 마우스 척도 분석(BMS)에서 0 내지 0.5의 값이 실험 계획의 다음 단계에 사용되었다. 3회 대식세포 또는 식염수 주사를 수행하였다(시점 3 이식: 3 dpi, 10 dpi, 17 dpi). 실험은 척추 손상 후 31일(31 dpi)에 종료되었다. 시험이 끝나면 고려된 실험군에서 기능 회복 값을 평가하였다.
운동 평가
오픈 필드에서의 운동 평가
THEM-이식, M2-이식 및 비히클 마우스의 운동 기능은 Basso 마우스 척도(BMS)를 사용하여 1, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 14, 17, 18, 21, 24, 28 및 31 dpi에서 평가하였다(14). Basso 마우스 척도는 "0"부터 "9"까지 10 단계로 구성되며, 여기서 "0"은 "움직임 없음"에 해당하고, "9"는 정상적인 운동 기능에 해당한다.
발목 유연성 분석
발목 관절 유연성 분석은 이전에 설명한 대로 발목 배측굴근과 족저굴근에 관련된 근육의 경직성을 평가하기 위해 14 DPI부터 수행되었다(16,17). 다음 점수가 할당되었다: 움직임 부족에 "0"(전경골근과 발 사이의 180°각도에 해당하는 경직 상태), 135° 각도에 "0.25", 90° 각도에 "0.5", 45° 각도에 "0.75", 및 0° 각도에 해당하는 정상적인 움직임에 "1".
근전도검사
자발적인 근육 활동의 생체 내 근전도(EMG) 기록은 전경골근(TA) 및 외측 비복근(LG) 근육에서 수행하였다. 전체적으로, 발명자들은 17마리의 마우스로부터 32개의 TA 근육과 16마리의 마우스로부터 29개의 LA 근육을 기록했다. 각 동물에서, 서로 다른 근육의 기록이 순차적으로 수행되었다(즉, 동시에 수행되지 않음). 마취된(이소플루란 2%) 동물에서 발명자들은 짧은 피부 절개를 통해 근육당 2개의 광택 처리-절연된 125 μm 두께의 스테인레스 스틸 와이어를 삽입했으며, 맨 끝은 근육의 세로 축과 평행하고 증폭기(CyberAmp 320, Axon Instruments(캘리포니아주 포스터 시티 소재))에 연결하였다. 발명자들은 절단된 짧은 20G 스테인리스 스틸 바늘을 동물의 등 피부 아래에 기준 전극으로 삽입하고 이를 접지에 연결했다. EMG 선택성을 최대화하기 위해, 발명자들은 차등적으로 기록했으며, 인접한 근육은 신경이 제거되거나 섬유가 가로로 절단되었다. EMG 신호는 5000배 증폭되고, 100 내지 1200Hz 대역 통과 필터링되었으며, 험 픽업 억제(Hum-Bug, Quest Scientific, 캐나다 벤쿠버 소재)로 더욱 개선되었으며, 10KHz에서 디지털화되었으며, Signal 소프트웨어(6.0.2, Cambridge Electronic Design, 영국 캠브리지 소재)로 획득되었다. 움직임에 따른 인공물을 줄이기 위해, 동물의 몸, 팔다리, 꼬리를 테이프로 감아 위(胃)를 아래로 하고 누워 있는 자세로 두었다. 마취에서 완전히 회복된 후 10분 후에 기록을 시작하여, 각 근육에 대해 3분간 지속하였으며, 이 기간 동안 동물의 수염, 앞다리 및 뒷다리를 10 내지 15초마다 만지면서 자극을 주었다. 그런 다음 좌골 신경을 양측으로 절단하거나 T10(즉, 두개골에서 SCI 수준까지)에서 척수를 절단하기 위해 동물을 다시 마취시켰다. 그런 다음 EMG 기록의 두 번째 세션은 마취에서 완전히 회복된 후 10분 후에 시작하였으며 각 근육에 대해 1분간 지속하였다. 실험이 끝나면 동물은 관류되었다. EMG 분석(Signal and Spike2, 5.0.9, Cambridge Electronic Design)은: i) 제곱평균제곱근(RMS) 값 측정에 의한, 수축 중 전기 신호 전력의 정량화 및 ii) 수축 중 전기 신호 지속 시간의 정량화로 구성된다. RMS를 측정하기 위해, 모든 EMG 추적을 40 ms-길이의 섹션으로 나누고 RMS를 10 ms의 시간 상수로 각 섹션에서 계산하였다. 발명자들은 좌골 신경 또는 척수 단면 후 평균 + 1.9 표준 편차 RMS 값으로 각 근육에서 결정된 컷오프 수준을 넘는 값을 근육 활동과 관련된 RMS로 간주했다. 마지막으로, 발명자들은 궤적상의 위치에 관계없이, 모든 측정 값 중 가장 큰 10개의 RMS를 평균내어 강한 근육 활동 기간에 해당하는 RMS 값을 추출하였다.
조직화학 및 면역형광 분석
척수 고정 및 처리
동물에게 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 4% 수크로스를 심장내 관류시켰다. 척수를 추출하고, 4% PFA, 4% 수크로스에 밤새 담근 후 30% 수크로스에 4℃에서 저장했다. 조직화학적 분석을 위해, 해부된 척수 1.5 cm(병변 부위로부터 앞쪽 0.75 cm 및 꼬리 0.75 cm)를 냉동절편하고(25 μm 두께의 가로 섹션 또는 20 μm 두께의 세로 섹션), 분석 전에 -20℃에 저장했다.
룩솔(Luxol) 패스트 블루 염색
설명된 대로 룩솔(Luxol) 패스트 블루(LFB) 염색(Sigma-Aldrich, Cat#L0294)을 통해 척수 절편에서 수초 함량을 정량화했다(16,18). 간략하게 말하면, 95% 에탄올(EtOH, Carlo Erba) 및 1.22% 빙초산(Carlo Erba)에 LFB(Sigma-Aldrich)를 용해시켜 0.1% LFB 용액을 제조했다. 절편을 EtOH 용액(100, 95, 70, 및 50%)에 수화시킨 후, 0.1% LFB 용액으로 40℃에서 40분 동안 염색했다. 그런 다음 섹션을 수돗물로 헹구고 0.05% Li2CO3 용액(Sigma-Aldrich)에서 분화시켰다. 섹션을 EtOH 용액(50, 70, 95 및 100%)에서 탈수하고, 자일렌(Carlo Erba)에서 투명화한 다음, 수초 함량의 광학 현미경 분석(Zeiss Axioscop 2)을 위해 Entellan(Merck-Millipore)을 장착했다.
티올 염색
먼저 1.85% 요오도아세테이트와 1.25% N-에틸말레이미드가 첨가된 PBS 1X로 구성된 용액과 그 다음 4% PFA, 1.85% 요오도아세테이트 및 1.25% N-에틸말레이미드를 함유한 용액을 마우스에 경심으로(transcardially) 관류시켰다. 척수를 추출하여 4% PFA O/N에 두었다. 동결절편화 후, 샘플을 PBS 1X에서 10분간 세척하고 PBS 1X 중의 4 mM TCEP(Tris(2 카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드) 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 샘플을 PBS 1X 중 0.1% CPM(7-디에틸아미노-3-(4'-말레이미딜페닐)-4-메틸쿠마린) 용액에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS 1X로 세척한 후, 샘플을 DABCO로 장착했다. 염색 후, 형광현미경으로 슬라이스를 얻었고, 저산소 영역은 형광 청색 반점으로 나타났다. 그런 다음, ImageJ 소프트웨어[미국 국립 보건원]를 사용하여 해당 영역을 임계값으로 정량화하였다.
조직 면역형광
면역형광법은 이전에 설명한 대로 수행되었다(16,19). 간략하게 말하면, 저온절편을 0.25%/0.5% Triton X-100, 2% BSA로 투과화하고, 4℃에서 밤새 차단 용액에서 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 차단 용액에서 5분 동안 6회 헹군 후, 적절한 2차 항체를 실온에서 4시간 동안 도포하였다. 차단 용액의 최종 세척 단계 후 PBS 1X에서 세척하고, TOPROTM-3(1:3000, Invitrogen Thermo Fisher Scientific) 또는 4'.6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 1:2000, Thermo Fisher Scientific, Cat#D-1306)에 의한 핵 염색을 수행하고, 1.4-디아자비사이클로(2.2.2) 옥탄(DABCO, Sigma Aldrich, Cat#D-2522)을 사용하여 슬라이드를 장착했다. 이미지는 40x 오일 대물렌즈(Carl Zeiss LSM710 공초점 현미경, 독일 뮌헨 소재), 및 20x 대물렌즈(Nikon Ti Eclipse 형광 현미경)를 사용하여 획득했다. 면역형광 분석에 사용되는 다음과 같은 1차 항체: TOMM20(마우스, 1:200, Abcam, Cat#AB56783), 신경필라멘트-200(토끼, 1:200, Sigma, Cat#N4142), NeuN(마우스, 1:200, Millipore, Cat#MAB377), 항콜린 아세틸트랜스퍼라제 항체 ChAT(염소, 1:200, Millipore, Cat#AB144P), 이온화된-칼슘 결합 어댑터 분자 1 IBA1(토끼, 1:200, WAKO, Cat#019-19741), 분화 클러스터 206 CD206(염소, 1:400, R&D system, Cat#AF2535,), 아그린(마우스, 1:200, Stressgen, Cat#AGR-520), 콜라겐-I 항체(토끼, 1.200, Abcam, Cat#AB34710), 콜라겐-III 항체(마우스, 1.200 GeneTex, Cat#GTX26310), CD31(혈소판 내피 세포 접착 분자, PECAM-1) 항체(랫트, 1:200, BD Biosciences, Cat#557355), 피브로넥틴(토끼, 1:200, Dako, Cat#A0245), CD68(랫트, 1:200, Thermo Fischer Scientific, Cat#14-0681-82), GFAP(염소, 1:200, Abcam, Cat#ab53554). 적절한 2차 항체가 사용되었다: 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor 488(1:500, Thermo Fisher Scientific, Cat#A2120), 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 488(1:500, Thermo Fisher Scientific, Cat#A21206), 당나귀 항-염소 Alexa Fluor 488(1:500, Jackson, Cat#AB - 2340428), 당나귀 항-랫트 Alexa Fluor 488(1:500, Thermo Fischer Scientific, Cat#A11006), 염소 항-마우스 CY3(염소, 1:500, Amersham, Cat#PA43002), 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 546(당나귀, 1:500, Thermo Fisher Scientific, Cat#A10040), 당나귀 항-염소 Alexa Fluor 546(당나귀, 1:500, Invitrogen by Thermo Fisher Scientific, Cat#A-11056), 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor 647(1:500, Thermo Fischer Scientific, Cat#A32787), 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 647(1:500, Thermo Fischer Scientific, Cat#A32795), TO-PROTM-3(1:3000, Thermo Fisher Scientific) 또는 DAPI(1:2000, Thermo Fisher Scientific).
이미지 분석 및 정량화
정량적 분석은 NIH ImageJ 소프트웨어[미국 국립 보건원]를 사용하여 척수의 횡단면과 종단면을 적어도 3 내지 5개의 기술적 복제물(유리 슬라이드)로 분석했다. 총 핵 수로 표준화된 분석을 위해, 약 5115 ± 87개의 핵이 고려되었다. 각 분석에는 3 내지 5마리의 마우스가 고려되었다.
형태측정 혈관(CD31) 분석
척수 횡단면 이미지는 FIJI 1.52p(미국 국립 보건원)로 실행되는 맞춤형 플러그인을 사용하여 분석하였다. 각 섹션에서, 등쪽 왼쪽 뿔, 등쪽 오른쪽 뿔, 복부 오른쪽 뿔 및 복부 왼쪽 뿔에 해당하는 4개의 관심 영역(ROI)이 선택되었다. 이미지의 밝기와 대비를 조정하고, 이미지를 바이너리 이미지로 변환했다. 동일한 용기 내부의 작은 간격을 닫기 위해 "MorphoLibJ"(Legland, Arganda-Carreras & Andrey, 2016)를 사용한 형태학적 필터가 적용되었다. 그런 다음 이미지를 골격화하고, 플러그인 "Analyze Skeleton(2D/3D)"을 사용하여 골격을 분석했다. 분석을 위해 다음 매개변수가 고려되었다: 그룹화된 혈관 수, 평균 가지 수, 단일 혈관 그룹 내부 가지의 평균 길이, 평균 최대 가지 길이(즉, ROI 내부의 각 혈관 그룹의 가장 긴 가지 길이), 각 혈관 그룹의 평균 가지 길이, 유클리드 거리(혈관 길이와 유클리드 거리 사이의 비율은 혈관의 비틀림 측정을 제공함) 및 각 관심 필드 내부의 총 가지 수.
이식된 대식세포 분포 분석
이식된 THEM 또는 M2 분포 분석을 위해 낭종을 중심으로 한 0.5 cm의 조직 부분을 고려했다. 3회의 다중 이식(2×106 세포)을 받은 손상된 마우스의 척수 실질을 분석했다. 다중 이식을 받은 마우스의 척수의 4 내지 9개 횡단면 섹션(25 μm)을 5마리의 동물에 대해 최소 8개의 기술적 복제물(유리 슬라이드)로 분석했다. 세포 핵을 확인하기 위해 슬라이스를 4'.6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Thermo Fisher Scientific, 1:2000)로 염색했다. -tomato 및 DAPI 이중 양성 세포의 수는 FIJI ImageJ 1.52p(미국 국립 보건원)를 사용하여 수동으로 계산하였다.
인간 유도 다능성 줄기세포(iPSC)유래 운동 뉴런과 대식세포의 공동배양
iPSC는 이전에 설명한 대로 참가자로부터 사전 서면 동의를 받아 건강한 공여자 3명의 피부 생검-유래 섬유아세포를 재프로그래밍하여 획득하였다(15,16). 그런 다음, 이전에 설명한 대로 세포를 운동 뉴런으로 분화했다(15). 인간 또는 마우스 대식세포를, 분화하는 iPSC와 2일 동안 공동 배양한 다음, 면역형광 분석을 위해 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 면역형광은 이전에 설명한 대로 항-β3Tubulin(마우스, 1:400, Promega, Cat#G7121), 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor 488(1:1000) 항체로 염색하여 수행하였다(15). 이미지는 20x 대물렌즈(Nikon Ti Eclipse 형광 현미경)를 사용하여 획득하였다. 각 유리 슬라이드에 대해, 5개의 필드가 획득되었으며, 각 필드에 대해 20× 대물렌즈로 2×2 대형 이미지가 획득되었다.
통계적 분석
달리 명시하지 않는 한, 통계 분석에는 n ≥ 3 샘플 또는 복제물이 사용되었다. GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Inc., 캘리포니아 라호이아 소재, 버전 7.0)를 사용하여 독립표본 양면 스튜던트 t-검정, 일반 단방향 또는 양방향 분산 분석(ANOVA)을 반복 측정 후 Tukey 사후 테스트로 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었으며, 통계적 유의성은 p ＜ 0.05로 설정되었다.
****p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05; ns는 통계적으로 유의하지 않음
결과
마우스 THEM 및 M2 대식세포는 완전히 별개의 분자 특징을 나타낸다
마우스 THEM 대식세포의 분자 특징을 특성화하기 위해, 발명자들은 그의 전체 전사체 프로파일을 분석하고 이를 M2 대식세포의 전사체와 비교했다. 각 실험군별로 3개의 샘플을 분석하였다. 주요 성분 분석(PCA)은 THEM과 M2 대식세포가 서로 다른 그룹에 클러스터되어 완전히 별개의 표현형을 가지고 있음을 확인하는 것으로 나타났다(도 3). 예상대로 M2 대식세포는 높은 수준의 CD206, CD163 및 Arg1 유전자를 발현했다. 시크리톰(secretome) 및 레세톰(Recettome) 전사체의 전사체 분석(표 1 및 표 2 참조)은 또한 THEM 집단에서 가장 유의미하게 상향조절된 유전자가 혈관신생(예를 들어, VEGFs 및 VEGFc) 및 세포외 기질 리모델링(Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19)과 관련된 유전자 온톨로지의 기능적 범주와 관련되어 있음을 나타낸다(도 3). 전반적으로 이러한 결과는 THEM이 M2 대식세포와는 다른 특정 분자 정체성을 가지고 있음을 보여주었다.
THEM은 중증 SCI의 마우스 모델에서 운동 능력을 향상시킨다
THEM은 운동 회복을 촉진시킨다
THEM 생체 내 재생 가능성을 평가하기 위해, 재료 및 방법(연구 설계 1)에 설명된 대로 THEM, M2 또는 비히클을 중증 SCI 마우스에 주입하였다. 중증 좌상성 척추 손상 후 운동 기능 회복에 대한 THEM 및 M2 이식의 효과를 평가하기 위해 BMS 평가를 수행하였다. 각 동물의 운동 능력은 손상 후 첫 주 동안 1, 3, 7 dpi로 평가하였고, 이후 실험이 끝날 때까지(31 dpi.) 일주일에 2회(10, 14, 17, 18, 21, 24, 28, 31 dpi)로 평가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 다중 THEM 이식을 받은 동물의 BMS 값(1.792 ± 0.327)은 다중 M2 이식을 받은 동물(0.375 ± 0.109) 및 비히클을 주입한 동물(0.712 ± 0.157)에 비해 유의하게 높았다. 통계 분석은 14, 17, 18, 21, 24, 28 및 31 dpi 시점의 BMS 값에서 다중 THEM 이식을 받은 동물과 비히클 사이에 유의미한 차이를 보여주었다. 이와 유사하게, 다중 THEM 이식을 받은 동물과 다중 M2 대식세포 이식을 받은 동물 사이의 유의한 차이는 17, 18, 21, 24, 28 및 31 dpi의 시점의 BMS 값에서 관찰되었다. 이러한 결과는 오직 THEM만이 비히클에 비해 중증 SCI 마우스의 운동 회복을 유의하게 향상시키는 데 효과적이지만 M2는 아무런 효과도 나타내지 않았음을 시사한다.
THEM은 발목 유연성을 촉진시킨다
여러 연구에 따르면 "경직"은 척추 손상의 결과로 발생하는 가장 흔한 증상 중 하나이며, 이 현상은 척추 손상과 같은 중추 신경계에 영향을 미치는 질환이 있는 개인의 장애를 일으키는 주요 원인 중 하나이다[4]. 세포 이식이 경직 상태의 발병을 예방할 수 있는지 결정하기 위해, 발목 관절에 대한 유연성 성능을 평가하였다. 이 조건은 실험이 끝날 때까지(31 dpi) 15 dpi에서 매일 모니터링하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 다중 M2 이식을 받은 동물(0.659 ± 0.049)과 대조군 동물(0.612 ± 0.045)의 발목 관절 유연성에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(0.799 ± 0.037)에서 발목 관절 유연성이 유의하게 더 우수하였으며, 이는 척추 손상 후 근육 경직의 빠른 회복을 시사한다. 통계 분석에서는 15, 21, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 및 31 dpi 시점의 발목 관절 유연성 값에서 다중 THEM 이식을 받은 동물과 비히클 간에 유의미한 차이가 있음을 보여주었다. 또한, 통계 분석 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 28 dpi 시점에서 다중 THEM 이식을 받은 동물과 다중 M2 대식세포 이식을 받은 동물 사이의 발목 유연성 값에 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다.
THEM은 굴근 운동 뉴런의 정상적인 흥분성을 회복시킨다.
이전 기능 분석에서 얻은 데이터를 확인하기 위해, 전방 경골 및 외측 비복근을 기준으로 생체 내에서 자발적 전위의 근전도(EMG) 기록을 수행하였다. 근육 수축 중 근전도 신호의 진폭과 지속 시간이 모두 고려되었다. 근전도 흔적의 진폭은 활성화된 운동 뉴런의 수에 비례한다: 이식된 동물과 대조군 동물 모두 건강한 동물에 비해 근전도 진폭이 약 50% 감소한 것으로 나타났다. 근전도 흔적의 활성화 기간은 척추 손상 후 증가된 운동 뉴런의 흥분성에 비례한다(특히 대조군 동물의 근전도 흔적의 활성화 기간은 2.5배 증가함).
척추 손상 후 운동 뉴런의 흥분성 증가는 대규모 및 국소 억제 회로의 기능 상실로 인해 발생한다. 다중 THEM 이식을 받은 동물에서, 외측 비복근의 근전도 활성화 기간은 대조군 동물(0.593 s ± 0.101 s)에 비해 통계적으로 더 짧았으며(0.338 s ± 0.048 s), 이는 건강한 동물의 근육의 생리학적 상태(0.231 s ±0.038 s)에 더 가깝다(도 6a). 또한, 전경골근의 경우, 다중 THEM 이식을 받은 동물의 근전도 활성화 기간은 대조군 동물(0.450 s ± 0.077 s)에 비해 더 적었다(0.416 s ± 0.058 s). 건강한 동물은 다른 모든 실험 그룹(0.161 s ± 0.020 s)에 비해 통계적으로 더 짧은 근전도 전경골근 활성화 기간을 가졌다(도 6b). 이러한 데이터는 THEM 치료가 재신경분포 측면에서는 효과가 없지만 굴근 운동 뉴런의 정상적인 흥분성을 회복한다는 것을 나타낸다.
THEM은 중증 SCI 마우스 척수 조직의 재생을 촉진한다
척수 수준에서 발생하는 외상성 이벤트는 기계적 손상과 그에 따른 조직 변성을 유발한다. 이러한 이벤트에는 축삭 세포막의 분해, 혈액뇌관문의 변성, 탈수초화, 면역 세포의 이동, 및 척수 실질 세포의 사멸이 포함된다[2,5]. THEM 이식이 척수의 조직 재생에 어떻게 기여하는지 연구하기 위해, 31 dpi의 척추 실질 세포 분포, 및 낭종 형성, 신경교 흉터, 뉴런 수, 및 특히 콜린성 뉴런(운동 뉴런), 수초 함량, 면역 반응 활성화, 세포외 기질 및 조직 혈관형성과 관련된 조직학적 특징이 처음 연구되었다.
척수 조직에서의 이식된 THEM 분포
이식된 세포의 지속성, 생존력 및 위치를 평가하기 위해, 실험 종료 시 이식된 세포의 분포(31 dpi)를 분석했다. THEM 및 M2의 수는 중증도의 척추 손상 및 척추 손상 부위를 중심으로 한 0.6 cm 길이의 척추 영역(9개 척수/동물 단면)을 나타내는 다중 이식 후 척수 단면에서 정량화되었다. 분석을 위해, 핵 마커 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)과 공존하는 형광 적혈구(dT-Tomato; THEM 또는 M2)의 절대 수를 고려했다. THEM의 분포는 척추 조직(실질, 낭종 영역, 등쪽/복부 수막)의 다양한 위치를 기준으로 분석되었다. 도 7a 내지 7b에 도시된 바와 같이, THEM 및 M2 대식세포는 이식 후 며칠 동안에도 척추 실질에 지속되며, 이들의 존재는 척추 병변 부위뿐만 아니라 인접 부위에서도 검출된다. 따라서 이식된 세포(THEM 및 M2 대식세포)의 확산은 이식 부위에 대해 방사형일 뿐만 아니라 입쪽 및 꼬리 방향의 종방향이기도 하다. 백분율 값은 길이가 0.6 cm인 골수 영역을 나타내는 척수 단면(9개 척수/동물 단면)에 존재하는 총 THEM 또는 M2 세포에 대해 정규화되었다. 척추 외상에 해당하는 부위에서는 낭종 영역에 집중되어 있지만(53.54% ± 10.40% THEM, n=5; 53.10% ± 10.95% M2, n=3), 주변 실질에 상당한 비율이 널리 퍼져 있다(46.46% ± 10.40% THEM, n=5; 46.90% ± 10.95% M2, n=3)(도 7c). 백분율 값은 척추 외상 섹션의 전체 THEM 또는 M2 세포에 대해 정규화되었다. 도 7d는 척추 외상 부위와 관련하여 이식된 세포의 방사형 및 세로 분포 다이어그램을 도시한다. 전반적으로, 이러한 데이터는 이식된 세포(THEM 및 M2 대식세포)가 척추 손상 후 확립된 적대적인 환경에서 며칠 동안 생존할 수 있음을 시사했다.
THEM은 낭종 및 신경교 흉터를 감소시킨다
척추 손상 후, 손상 부위에 신경교 흉터와 낭종이 형성되는 것은 외상으로 인한 2차 손상을 제한하는 데 기여하는 보상 메커니즘을 구성한다[2]. 그럼에도 불구하고, 이들의 존재는 물리적, 분자적 장벽을 구성하기 때문에 축삭 재생을 방해한다[20]. 기능 회복에서 척추 손상 후 신경교 세포 반응의 중요성을 고려하여, 성상교세포-특정 마커인 교질산 섬유성 단백질(GFAP: Glia Acid Fibrillary Protein)을 사용한 면역형광 분석을 수행하여 신경교 흉터 형성 및 성상교세포 반응 활성화에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가했다(도 8a 내지 8d). 척수 손상 부위를 중심으로 한 길이 0.6 cm의 골수 영역(9개 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 분석했다. 신경교 흉터의 전체 면적과 비교한 낭종 영역은 대조군 동물(33.24% ± 0.87%, n=3)에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물(21.38% ± 2.05%, n=3)에서 더 작다(도 8e). 또한, 병변 영역을 구분하는 성상교세포에 의해 생성된 신경교 흉터는 대조군(6.69% ± 0.53%, n=3)에 비해 분석된 실험 그룹(THEM: 6.79% ± 0.85%, n=3)에서 동일한 크기이다(도 8f). 다중 THEM 이식을 받은 동물은 전체 절편의 면적을 기준으로 대조군(4.73% ± 0.15%, n=3)에 비해 낭종 영역(2.03% ± 0.30%, n=3)이 현저히 작았다(도 9). 이러한 데이터는 다중 THEM 이식을 받은 동물의 손상 부위에서 조직 재생 증가/퇴행성 메커니즘의 제한과 일치한다.
THEM은 뉴런 및 수초 함량을 증가시킨다
1차 기계적 손상으로 인한 척수의 조직 변성은 2차 손상으로 이어져 뉴런 세포의 추가 손실을 초래한다[5]. 좌상성 척추 손상 후 뉴런 함량에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 뉴런-특정 마커 NeuN을 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다(도 10a~10b). 척수 손상 부위를 중심으로 한 길이 1.5 cm의 좁은 영역(8개 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 분석했다. NeuN+ 세포의 백분율을 처음에 정량화했다. 도 10c에 도시된 바와 같이, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군 동물(6.81% ± 0.726%, n=4)에 비해 뉴런의 비율이 더 높다(13.13% ± 0.632%, n=5). 척수의 실질에는 여러 뉴런 세포 집단이 존재한다. 특히, 척수의 복부 영역에 있는 IX 판 수준에 특이적으로 위치하는 운동 뉴런이 있다[21]. 좌상성 척추 손상 후 운동 뉴런 함량에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 콜린-아세틸트랜스퍼라제 발현과 상관관계가 있는 특정 콜린성 뉴런 마커인 ChAT를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다(도 11). 척수 손상 부위를 중심으로 한 길이 1.5 cm의 좁은 영역(8개 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 분석했다. 또한 ChAT+ 세포의 비율과 관련하여 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군(0.245% ± 0.038%, n=4)에 비해 운동 뉴런의 비율(0.412% ± 0.011%, n=4)이 더 높다(도 11c).
성숙한 뉴런의 축삭 수준에서 가장 많이 발현되는 구조 단백질은 신경필라멘트(NF)이다. 이들의 발현은 축삭 성장 및 뉴런 항상성 유지와 밀접한 관련이 있다[22]. 척추 손상의 결과로, 신경필라멘트 단백질과 수초의 손실과 함께 회백질 수준에서 뉴런 손실이 관찰된다[22]. 축삭 재생에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 신경막 단백질에 대한 특정 마커 NF200을 사용하여 면역형광 분석을 수행했다(도 12a~12b). 척추 손상 부위를 중심으로 한 3 mm 너비의 골수 영역(동물 골수당 척추의 5개 세로 섹션)을 나타내는 척수의 세로 섹션을 분석했다. 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군(9.723% ± 0.133%; n=3)에 비해 상당히 더 높은 NF200 함량(16.360% ± 2.090%, n=3)을 가졌다(도 12c).
척추 손상으로 인한 탈수초화 현상은 심각한 결과를 초래하여, 신경 조직의 기능적 손실에 기여한다[5]. 척추 실질 재수초화에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 수초 검출을 위한 특정 염료인 룩솔 패스트 블루(LFB)를 사용하여 조직학적 분석을 수행했다(도 13a~13b). 척추 손상 부위를 중심으로 한 길이 0.6 cm의 좁은 영역(8개 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 분석했다. 도 13c에 도시된 바와 같이, 다중 THEM 이식을 받은 동물은 대조군(19.870% ± 1.999%, n=3)에 비해 상당히 더 높은 수초 함량(26.470% ±1.075%, n=5)을 가지고 있다.
THEM은 내인성 프로-재생 면역 반응을 증가시킨다
척추 손상을 초래하는 일련의 이벤트는 척수 기계적 손상 부위에 인접한 조직에서도 염증 반응의 전파를 결정하며, 이는 수질 조직 재생에 부정적 및 긍정적 결과를 가져온다[2,5,6]. 특히, 선천적 면역 반응에서 대식세포의 중요한 역할과 표현형 분극화(M1-전염증성 대식세포, M2-프로-재생 대식세포)에 따른 그들의 다양한 기능을 고려하여, 발명자들은 내인성 대식세포 성분과 이들의 상대적 표현형을 평가하였다. 단핵구/대식세포 하위집단의 미세아교 세포 및 계통에 속하는 세포의 함량을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 마커는 분자 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1(Iba1)이며[23], 특정 마커 CD68 및 CD206은 각각 대식세포와 이들의 M2 표현형의 평가에 사용되었다. 실제로, 마커 CD68은 고도로 글리코실화된 1형 막관통 당단백질의 대식세포 및 기타 단핵 식세포에 의한 발현과 연관되어 있는 반면[24], 마커 CD206은 주로 M2 대식세포 표면에 존재하는 만노스 수용체의 발현과 관련되어 있다[6].
중증의 척추 병변 병태생리학에 연관된 염증성 반응에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 마커 Iba1을 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다(도 14a~14b). 대식세포 성분 및 이의 표현형을 추가로 조사하기 위해, 발명자들은 후속적으로 각각 마커 CD68 및 CD206을 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다(도 15a~15d). 분석에서는 척수손상 부위를 중심으로 한 0.6 cm 길이의 좁은 영역(8개의 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 고려하였다. 도 14c는 중증도의 척추 손상 후 척수 실질에 존재하는 미세아교 세포의 백분율이 대조군에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물의 척추 실질에서 증가하는 방법을 보여준다(5.820% ± 0.411%, n=5 THEM 이식을 받은 동물, 3.847% ± 0.597%, n=3 대조군). 또한, 대식세포 성분 및 그의 표현형에 대한 심층 분석 결과, 다중 THEM 이식을 받은 동물에 비해 대조군에서 총 대식세포의 비율이 더 높은 것으로 나타났으나(5.484% ± 0.367%, n=5 THEM 이식을 받은 동물, 6.143% ± 0.554%, n=3 대조군)(도 15e), M2 성분은 상당히 높았다(5.655% ± 0.497%, n=4 THEM 이식을 받은 동물, 2.320% ± 0.080%, n=3 대조군)(도 15f).
이러한 결과는 THEM 이식이 SCI 마우스 척수의 프로-재생 내인성 M2 대식세포의 비율을 증가시킨다는 것을 시사한다.
THEM은 세포외 기질 리모델링을 유도한다
세포외 환경의 주요 성분들 중 하나는 세포외 기질(ECM)이다. 이는 뉴런 성장을 촉진하거나 억제함으로써 뉴런 성장에 이중 효과를 갖는 분자의 농도로 특성화된다. 척추 외상 후, 피브로넥틴, 아그린, 콜라겐 및 프로테오글리칸을 포함하여 손상된 부위에서 이러한 분자의 용해 농도 증가가 관찰된다[2,5,20,25]. 억제 분자 중에서 콘드로이틴-황산염 프로테오글리칸(CSPG) 슈퍼패밀리가 가장 많이 대표되며, Neurocan 및 Aggrecan과 같은 축삭 발달 및 재생에 영향을 미치는 여러 범주의 분자를 포함한다[20,25]. 생리학적 상황에서는 이러한 분자 중 일부가 억제 현상을 수반하지 않지만, 외상 후 낭종 및 신경교 흉터 수준에 축적되어 축삭 재생을 방지하는 구조의 형성에 기여한다[25]. 이 현상을 억제하기 위해 손상 수준에서 여러 프로세스가 활성화된다. 중요한 역할은 ECM 리모델링에서의 역할로 잘 알려진 분자인 메탈로프로테아제에 의해 수행된다[26].
중증도의 척추 손상 후 ECM 리모델링에 대한 다중 THEM 이식의 효과를 평가하기 위해, 발명자들은 ECM의 주요 성분인 아그린 및 피브로넥틴과 상관된 특정 마커를 사용하여 면역형광 분석을 수행했다(도 16a 내지 16b). 척수 손상 부위를 중심으로 한 척수의 단면 및 종단면(동물당 척수의 적어도 1개의 종단면/횡단면)을 분석했다. 아그린과 피브로넥틴의 함량을 평가하기 위해 형태학적 분석을 수행하여, 낭종의 각 영역과 관련된 양성 영역(픽셀 수)의 정도를 평가하였다. 도 16c 내지 16d는 중증도의 척추 손상 후 어떻게 대조군에 비해 다중 THEM 이식을 받은 동물에서 낭종 수준에 존재하는 아그린 및 피브로넥틴 분자의 백분율이 감소하는지 보여준다(아그린: 3.500% ± 1.112%, n=3 THEM 이식을 받은 동물, 12.570% ± 2.140% 대조군 동물, n=3; 피브로넥틴: 5.190% ± 2.019%, n=3 THEM 이식을 받은 동물, 대조군 동물 9.625% ± 3.375%, n=3).
THEM은 저산소증을 감소시키고 혈관신생을 유도한다
척수는 특히 복잡한 혈관계로 특성화되며, 주요 혈관의 손상이나 혈류 조절의 변화로 인해 조직 관류가 감소되거나 일시적으로 차단될 수 있다. 외상성 척추 손상은 만성 저산소증을 초래하고 생리학 및 세포 대사의 정상적인 기능에 필수적인 조직 산화환원 상태의 변형, 및 결과적으로 신경변성을 초래하는 장기적인 결과로의 조직 관류의 즉각적인 중단으로 이어질 수 있다[5,27]. 전사체 분석 실험에서 얻은 결과, 특히 혈관 형성에 연관된 유전자의 중요한 THEM 상향조절을 고려하여, 발명자들은 THEM 다중 이식을 받은 동물 및 대조군 동물의 척수 실질에서 혈관의 형태와 가능한 산소 결핍(저산소증) 상태를 분석했다.
저산소증의 평가를 위해, 티올의 알킬화를 위한 N-에틸아미드(NEM) 및 요오도아세트산(IAA)의 사용을 기반으로 유리 티올을 분석하였다(도 17a 내지 17b). 실제로, 단백질 시스테인에 결합된 티올은 세포 산화환원 상태의 변동에 가장 민감한 그룹이다. 생리학적 조건 하에서, 세포질은 대부분의 단백질 티올을 환원 상태로 유지할 수 있는 고도의 환원 조건으로 특성화된다. 그러나 과도한 산화 스트레스 조건은 단백질 티올의 비가역적 산화, 글루타티온 고갈 및 세포 사멸을 결정하는 분자 종의 형성으로 이어질 수 있다. 저산소 영역 분석을 위해, 척추 손상 부위를 중심으로 한 1.5 cm 길이의 좁은 영역(적어도 8개 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 고려했다. 도 17c는 중증도의 척추 손상 후 비히클과 관련하여 다중 THEM 이식을 받은 동물의 척수 실질에서 저산소 영역의 비율이 어떻게 감소하는지 보여준다(3.173% ± 0.528%, n=3; THEM 이식을 받은 동물; 5.866% ± 0.745%, n=3 대조군).
혈관의 형태를 평가하기 위해, 발명자들은 내피 세포에 특이적인 마커인 CD31을 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다(Halder et al., 2019)(도 18a 내지 18b). 혈관 형태 분석을 위해, 척수 손상 부위를 중심으로 한 0.5 cm 길이의 척추 영역(적어도 4개의 척수/동물 단면)을 나타내는 척수 단면을 고려했다. 고려된 단면에서, 형태 분석이 수행된 5개의 관심 영역(ROI)을 선택했다(혈관 수/필드, 평균 가지 수/혈관, 혈관의 최대 길이; 혈관의 비틀림). 혈관 비틀림 값은 모든 가지의 유클리드 거리의 전체 평균값에 대한 혈관의 전체 평균 길이의 비율로 계산되었다. 도 18c에 도시된 바와 같이, 형태학적 분석은 다중 THEM 이식을 받은 동물(30.940 ± 3.592, n=3)에 비해 대조군 동물(37.070 ± 0.379, n=3)의 척추 실질 내 혈관 수가 더 많았음을 나타냈으나; 후자는 더 많은 수의 가지(2.110 ± 0.165 THEM 이식을 받는 동물, n=3; 1.793 ± 0.073 대조군, n=3)(도 18d)와 훨씬 더 긴 최대 길이(55.410 ± 2.500 THEM 이식을 받은 동물, n=3, 43.450 ± 0.751 대조군, n=3)를 가진 혈관을 가지고 있다(도 18e). 비틀림 값은 고려된 두 실험 그룹 간에 차이가 없음을 보여준다(1.168 ± 0.005 THEM 이식을 받은 동물, n=3, 1.153 ± 0.015 대조군, n=3), 도 18f. 이 데이터는 혈관 길이와 분기를 증가시켜 혈관계를 복원했음을 시사한다.
인간 운동 뉴런에 대한 마우스 THEM의
시험관 내
재생 효과
표시된 데이터는 생체 내 다중 THEM 이식이 다양한 전선(뉴런 수준, 신경교 흉터, 수초 성분)에서 척추 실질의 프로-재생/보호 효과를 가져옴을 나타내며, 이는 이식된 세포의 효과가 단일 특정 세포 유형에 제한되지 않음을 시사한다. 분석 중인 치료의 번역 가능성을 고려하고, 생체 내에서 관찰된 THEM의 효과가 인간 뉴런 세포에도 적용 가능한지 여부를 평가하기 위해, 발명자들은 운동 뉴런으로 분화된 인간 다능성 줄기세포의 배양물에 대한 THEM 및 M2 대식세포의 효과를 평가하였다. 뉴런 분화의 마지막 단계 동안, THEM 또는 M2를 2일 동안 배양물에 첨가했다. 분화 단계가 완료되면, 뉴런 특정 마커인 ßIII 튜불린(Tub3)의 발현 영역을 수상돌기 수와 그의 확장(40개 필드/공여자, 4개 이미지/필드, n=3)의 지표로 평가하였다(도 19a 내지 19c). 도 19d에 도시된 바와 같이, Tub3의 발현 영역은 M2 대식세포(7.235% ± 0.492%) 및 대조군 비히클 배양물(6.423 ± 0.494)에 비해 THEM(9.097% ± 0.253%)과의 공동 배양에서 유의하게 더 크다. 이러한 결과는 THEM이 M2 대식세포 및 대조군 비히클에 비해 인간 운동 뉴런의 수상돌기의 더 큰 뉴런 분화 및 더 큰 확장을 촉진한다는 것을 시사한다.
인간 THEM은 고유한 분자 정체성을 보여준다
발명자들은 THEM 특이적 분자 특징을 정의하고 THEM 특징 상세에서 저산소증의 역할을 확인하기 위해 전체 전사체 분석을 수행하였다. 그들은 저산소증 상태에서 배양된 THEM의 전체 유전자 발현을 TCM, 저산소증 없이 종양 조건화로 배양한 대식세포, 극성화된 M2 대식세포 및 치료되지 않은 미분화 M0 대식세포의 유전자 발현과 비교했다. 분석은 각 샘플에 대해 4명의 서로 다른 공여자의 전사체에 대해 수행되었다. 주요 성분 분석(PCA)은 저산소증, M2 및 M0 없이 배양된 TCM과 명확하게 분리된 그룹에 THEM이 클러스터되어 있음을 보여주었다(도 20). 이 결과는 i) THEM이 종양-조건화와 저산소증을 모두 요구하는 고유한 분자 특징을 가지고 있고; ii) THEM 분자 특징은 저산소증, M2 및 M0 대식세포 없이 배양된 TCM의 특징과 다름을 나타낸다.
다양한 대식세포 집단의 분자 특징은 다음과 같은 사실을 밝혀냈다:
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THEM은 CYTIP, VEGFA, GLUT1, GLUT3, CXCR4, LFA-1, MMP9, MT2A, MT1G, ANGPTL4, NDRG1, HK2, 및 VCAN의 높은 유전자 발현 수준으로 특성화된다(표 3, 표 6). THEM은 매우 낮은 수준/전혀 없는 수준의 PLXNA2, HSPH1, CYCS, TIGAR(표 4), ALOX15, CCL8, 및 CCL26을 발현한다;
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저산소증 없이 배양된 TCM은 높은 수준의 TGFBI, DAB2, FUCA1, CYP1B1, MAFB, CCL2 및 매우 낮은 수준/전혀 없는 수준의 MT2A 및 MTFP1을 발현한다;
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M2 대식세포는 높은 수준의 CD206, CD163, CD86, TREM2, IL1RN, IL10, STAT3, STAT6, fabp4, sphk1, HOMOX1, IRF4, PPAR-γ, CCL22를 발현한다. M2 대식세포는 매우 낮은 수준/전혀 없는 수준의 CCR7, IL2RA, 및 CXCL11을 발현한다. 전사체 분석을 통해 M2 대식세포에 대한 예상되는 특징이 확인되었다(11,12);
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M0 대식세포는 이전에 설명한 바와 같이, 높은 수준의 NINJ1, F13A1, SCARB1, 및 STAB1, AOAH, TLR7, A2M, FNBP1, CD209, SH3KBP1, 및 ITSN1을 발현한다(13).
저산소증 상태에서 배양된 THEM에서 가장 상향조절되는 유전자는: 상처 치유(Adm, Bnip3, Pdgfb, Vegfa), 혈관신생(Vegfa, Angptl4, Cxcl8, Lep, Rora, Apln), 해독 및 방어 반응 조절(Ndrg1, Mt1e, Mt1f, Mt1g, Mt1h, Mt1x, Mt2a, Mt3, Ddit4, Nupr1), 저산소증에 대한 반응(Hk2, Pfkfb3, Slc2a1, Slc2a3, Cxcr4, Plin2, Adm, Bnip3, Lep, Rora, Ndrg1, Egln3, Mt3, Plod2, Hilpda, Angptl4), 세포외 기질 리모델링(Mmp9, Vcan, Fgf11, Cxcl8, Lep, Pdgfb, Plod2, Vegfa, Angptl4, Sulf2, Egln3), 및 뉴런 생존 및 수초화(Mt3, Jam2, Vldlr, Nupr1, Egln3)와 관련된 유전자 온톨로지와 연관되어 있다.(도 21, 표 3 및 표 6).
저산소증 상태에서 배양된 THEM은 저산소증 없이 배양된 TCM(4012개 유전자), M2 대식세포(6786개 유전자) 및 M0 대식세포(4097개 유전자)와 비교하여 통계적으로(p<0.05) 많은 수의 유전자를 차별적으로 발현했으며, 여기에는 PLXNA2, HSPH1, CYCS, TIGAR의 상향 조절 및 PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR의 하향조절이 포함된다. (도 22).
THEM 고유한 정체성은 TCM, M2, M0 대식세포와 비교하여 23개 유전자의 특정 상향조절 및 24개 유전자의 하향조절로 특성화된다(표 3 및 표 4).
인간 THEM 화학주성 특성
발명자들은 트랜스웰 분석을 사용하여 SDF-1(100 ng/ml)에 대한 저산소증 없이 배양된 THEM, TCM 및 M2 대식세포의 화학주성 특성을 평가했다. 결과는 THEM이 TCM 및 M2 대식세포보다 SDF-1에 대해 통계적으로 유의미하게 더 높은 화학주성 반응을 가짐을 보여주었다(도 23 참조). 이러한 데이터는 다른 대식세포와 비교하여 THEM에서 SDF-1 수용체 CXCR4 유전자 발현의 상향조절과 일치한다. 이러한 데이터는 THEM에만 존재하는 저산소증 치료가 SDF-1에 대한 증가된 화학주성 반응에 필요함을 시사한다.
저산소증 유도는 인간과 마우스의 THEM
시험관 내
뉴런 재생 기능을 인간 운동 뉴런에 부여하는 데 필요하다.
발명자들은 인간과 마우스 THEM 모두의 인간 운동 뉴런에 대한 뉴런 재생 기능을 평가하였다.
척수에서, 운동 뉴런은 중추신경계를 말초에 연결하는 과정을 확장한다. 다음 SCI 운동 뉴런은 손상되어 뉴런 과정을 재생할 수 없다. THEM의 운동 뉴런 재생 가능성을 평가하고 THEM 뉴런 재생 기능에 저산소증 치료가 필요하다는 것을 검증하기 위해, 발명자들은 인간 유도 다능성 줄기세포(iPSC)에서 유래된 운동 뉴런의 뉴런 과정 생성을 촉진하는 THEM 능력을 테스트하였다. 발명자들은 저산소증 상태에서 배양된 뮤린 THEM의 효과를 iPSC-유래 운동 신경 뉴런의 확장에 대한 TCM 및 마우스 M2 대식세포와 비교하였다. 발명자들은 뉴런 분화의 최종 단계 동안 2일 동안 iPSC 유래 운동 뉴런과 대식세포를 공동 배양했다. 특정 뉴런 마커 βIII-튜불린(Tub3)과 뉴런 세포골격 사이의 상관관계를 고려하여(S S Easter Jr et al., J Neurosci, Initial tract formation in the mouse brain, 1993), 발명자들은 뉴런 프로세스의 수와 그의 확장의 지표로서 Tub3의 발현을 정량화했다. Tub3 발현 면적은 고려된 전체 면적에 대한 임계값 정규화로 정량화되었다. 도 24에 도시된 바와 같이, Tub3 발현은 대조군(세포 없음, CTRL, 4,83% ± 0,162%), M2 대식세포 공동 배양(4,779% ± 0,284%) 및 TCM(3,937% ± 0,192%)과 비교하여 THEM 공동배양(6,502% ± 0,204%)에서 상당히 더 높은 결과를 가져왔다. 이러한 결과는 저산소증 상태에서 배양된 THEM만이 뉴런 과정의 증가와 인간 운동 뉴런의 확장을 촉진하여 고유한 신경 재생 잠재력을 확인할 수 있음을 보여주었다. 중요하게는, 저산소증 없이 종양 조건화로 얻은 TCM 대식세포가 저산소증의 근본적인 기여를 확인하여 THEM의 재생 표현형을 결정하는 뉴런 과정을 증가시킬 수 없었다.
발명자들은 또한 인간 대식세포를 사용하여 마우스 대식세포에서 관찰된 인간 운동 뉴런에 대한 재생 효과를 추가로 평가하였다. 발명자들은 저산소증 상태에서 배양된 인간 THEM, 저산소증 없이 종양 조건화로 배양된 TCM, 미분화된 M0 인간 대식세포 및 인간 iPSC에서 유래된 운동 뉴런을 갖는 극성화된 M2 인간 대식세포를 공동 배양했다. (분화 프로토콜 종료 시) 2일간의 공동 배양 후, 발명자들은 뉴런 과정 수 및 이들의 확장의 지표로서 Tub3의 발현을 정량화하였다. Tub3 발현 영역은 전체 면적에 대한 임계값 정규화를 통해 정량화되었다. 뮤린 THEM에서 관찰된 것과 유사하게, 이 분석은 저산소증-처리된 인간 THEM만이 대조군(세포 없음, CTRL, 3,55% ± 0,409%; p<0.001), TCM (2,873% ± 0,184%), M0(1,94% ± 0,358%, P<0.01), M2(2,89% ± 0,258%, P<0.01)와 비교하여 뉴런 분화 및 뉴런 과정 확장(인간 THEM: 5,96% ± 0,360%)을 증가시키는 것으로 나타났다(도 25). 이러한 결과는 뉴런 분화를 유도하고 뉴런 과정 확장을 증가시키는 인간 THEM의 고유한 특성을 확인했으며, THEM 재생 특성을 얻기 위해 저산소증의 필수 역할을 추가로 뒷받침했다.
생체 내
에서 효과적인 THEM을 얻기 위해서는 저산소증 유도가 필요하다
발명자들은 i) THEM의 존재가 SCI 후 그의 재생을 촉진하는 척수 뉴런 조직에 유익한 효과를 발휘하고 ii) 저산소증의 역할이 THEM의 재생 잠재력을 달성하는 데 기본이라는 것을 확인하기 위해 추가적인 생체 내 실험을 수행했다.
발명자들은 중증 좌상성 척추 손상(SCI) 후 운동 기능에 대한 저산소증-처리된 THEM의 생체 내 효과를 테스트했다. 발명자들은 저산소증-처리된 THEM의 재생 효과를 종양 조건화와 함께, 그리고 저산소증 없이 배양된 TCM 대식세포의 재생 효과와 비교하여 Basso 마우스 척도(BMS)를 사용하여 운동 회복을 분석하였다. 다양한 대식세포를 손상 후 3일, 14일, 17일째에 주입하였다. 1 dpi에서 BMS 점수가 0.5 미만인 마우스만 분석에 고려되었으며, BMS 점수가 더 높은 동물은 폐기하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 저산소증 없이 배양된 저산소증-처리된 THEM과 저산소증 없이 배양된 TCM은 SCI 마우스 이후 운동 회복에 영향을 미쳤다. 특히, 도 26에 표시된 대로 다중 THEM 이식은 TCM(0.300 ± 0.200) 또는 비히클(세포 없음, 0.711 ± 0.068)의 다중 이식에 비해 운동 회복의 상당한 개선을 보여주었다. 통계 분석에서는 14, 17, 18, 21, 24 및 28 dpi에서 THEM 이식 마우스와 비히클 주입 마우스 사이의 BMS 점수에 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 이와 유사하게, 통계 분석에서는 17, 18, 21, 24 및 28 dpi에서 TCM과 비교하여 THEM 이식 마우스 사이의 BMS 점수에 유의미한 차이가 있음을 보여주었다. 이러한 데이터는 THEM 재생 기능을 얻기 위해서는 저산소증 유도가 필요하다는 것을 확인시켜 주었다.
참고문헌
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Claims (15)
- 종양 배양물 또는 체외이식편으로부터 방출된 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 집단을 인큐베이션하는 단계를 포함하는,
생물학적 샘플로부터 단리된 단핵 식세포 집단의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법으로서,
상기 인큐베이션은 저산소 조건 하에서 일어나고,
상기 인큐베이션은 집단의 단핵 식세포의 표현형 및/또는 기능적 변화를 유도하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단핵 식세포가 단핵구이고/이거나, 인큐베이션된 단핵 식세포 집단은 생물학적 샘플로부터 단리된 단핵구의 시험관 내 배양물이고/이거나, 배양 배지는 단핵구를 대식세포, 예를 들어 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)로 분화할 수 있는 인자를 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 집단이 6시간 또는 12시간 내지 20일, 더욱 바람직하게는 6시간 내지 10일 또는 바람직하게는 6시간 내지 72시간 또는 3 내지 8일, 더욱 더 바람직하게는 18시간 내지 24시간 또는 6일, 더욱 더 바람직하게는 18시간 또는 7일 동안 인큐베이션되는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
표현형 및/또는 기능적 변화로 유도된 단핵 식세포가 대식세포인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 배지는 종양 상청액을 포함하고, 상기 상청액은 바람직하게는 고형 종양, 종양 체외이식편 또는 종양 세포주의 배양물로부터, 바람직하게는 섬유육종 또는 신경아교종으로부터 수득되거나, 또는 바람직하게는 약 6시간 내지 20일, 더욱 바람직하게는 약 12시간 내지 72시간의 기간 동안 바람직하게는 종양 세포주, 종양 체외이식편, 또는 고형 종양으로부터 생성된, 또는 해리되고 플레이팅된 시험관 내 종양의 절제로부터 생성된, 바람직하게는 종양으로부터 조건화된 배지(CTM)인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
배양 배지가 세포 배양 배지, 이글(Eagle)의 최소 필수 배지 또는 이의 유도체, 및/또는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640, 및/또는 Media 199 및/또는 피셔(Fischer) 배지 및/또는 또는 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM), 및 1 내지 99%, 바람직하게는 10 내지 90%, 더욱 바람직하게는 30 내지 50%, 더욱 더 바람직하게는 30% 또는 50%, 종양으로부터 조건화된 배지(CTM) 또는 종양 상청액으로 이루어진, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포로서, 바람직하게는 상기 식세포는:
i) 다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A 중 적어도 하나를 발현하고/하거나;
ii) 낮은 수준/전혀 없는 수준의 다음 유전자: PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR 중 적어도 하나를 발현하는, 단핵 식세포. - 단리된 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포로서:
i) 다음 유전자: CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A 중 적어도 하나를 발현하고/하거나;
ii) 낮은 수준/전혀 없는 수준의 다음 유전자: PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR 중 적어도 하나를 발현하는, 단핵 식세포. - 제7항 또는 제8항의 단핵 식세포, 바람직하게는 대식세포로서,
상기 식세포는:
i) CXCR4, CYTIP, SLC2A3 및 MT2A를 발현하고;
ii) 낮은 수준/전혀 없는 수준의 PLXNA2, HSPH1, CYCS 및 TIGAR을 발현하는, 단핵 식세포. - 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 단핵 식세포를 포함하는 단핵 식세포 집단.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단핵 식세포 또는 제10항의 단리된 단핵 식세포 집단으로서, 바람직하게는 상기 단핵 식세포는 대식세포이고, 표 1 및/또는 표 2 및/또는 표 3, 및/또는 표 6의 유전자 중 적어도 하나의 발현에 의해, 및/또는 표 2의 분자들 중 적어도 하나의 분비에 의해, 바람직하게는 메탈로프로테아제(예를 들어 Mmp8, Mmp9, Mmp10, Mmp12, Mmp14, Mmp19, Mmp27)의 발현에 의해, 및/또는 영양 인자(예를 들어. VEGF, FGF, IGF) 및/또는 세포 접촉 및 부착 분자(예를 들어 Rap2A, Ninj1, Antxr2, Itga1, Itga6, Itga9, ItgaM, Adamtsl4, Adamtsl6), 및/또는 생존을 촉진하는 매개체(예를 들어 Rtn4rl2) 및/또는 면역조절을 촉진하는 매개체(예를 들어 Arg1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl16, Fcgr1, Fcgr4, Ltb4r1, Jmjd1) 및/또는 획득된 재생 특성들을 갖는 매개체의 발현에 의해 특성화되고/되거나, 상처 치유에 대한 반응과 관련된 유전자(예를 들어 Adm, Bnip3, Pdgfb, Vegfa) 및/또는 혈관신생과 관련된 유전자(예를 들어 Vegfa, Angptl4, Cxcl8, Lep, Rora, Apln) 및/또는 해독 및 방어 반응의 조절과 관련된 유전자(예를 들어 Ndrg1, Mt1e, Mt1f, Mt1g, Mt1h, Mt1x, Mt2a, Mt3, Ddit4, Nupr1) 및/또는 저산소증에 대한 반응과 관련된 유전자(예를 들어 Hk2, Pfkfb3, Slc2a1, Slc2a3, Cxcr4, Plin2, Adm, Bnip3, Lep, Rora, Ndrg1, Egln3, Mt3, Plod2, Hilpda, Angptl4) 및/또는 세포외 기질 리모델링과 관련된 유전자(예를 들어 Mmp9, Vcan, Fgf11, Cxcl8, Lep, Pdgfb, Plod2, Vegfa, Angptl4, Sulf2, Egln3) 및/또는 및 뉴런 생존 및 수초화와 관련된 유전자(예를 들어 Mt3, Jam2, Vldlr, Nupr1, Egln3) 중 적어도 하나의 발현에 의해 특성화되는, 단핵 식세포 또는 단핵 식세포 집단.
- 제7항 내지 제9항 또는 제11항 중 어느 한 항의 단핵 식세포 또는 제10항 또는 제11항의 단리된 단핵 식세포 집단으로서, 바람직하게는 상기 단핵 식세포는 의학적 용도를 위한 대식세포인, 단핵 식세포 또는 단핵 식세포 집단.
- 제7항 내지 제9항 또는 제11항 중 어느 한 항의 단핵 식세포 또는 제10항 또는 제11항의 단리된 단핵 식세포 집단으로서, 바람직하게는 상기 단핵 식세포는 세포 치료법 및/또는 재생 의학, 바람직하게는 조직 또는 세포 복구, 조직 또는 세포 재생, 조직 리모델링, 치료 및/또는 복구 및/또는 상처 치유, 상처의 조직 손실, 외과적 궤양, 당뇨병성 상처, 신경변성, 망막 변성, 유전 질환 (예컨대 ALS), 자가면역 질환(관절염, 교원병증) 또는 심지어 췌장섬의 퇴행이 일어나는 당뇨병으로 인한 변성을 포함하는 변성 질환의 치료, 염증, 조직 염증의 치료 및/또는 해결, 손상, 손상된 조직 등의 치료, 바람직하게는 중추 신경계 포매 조직의 손실로 특성화되는 병변의 치료, 바람직하게는 척추 병변 또는 손상, 예컨대 중증도의 척추 손상, 또는 척추 손상, 바람직하게는 중증 또는 좌상성 척추 손상의 치료에 사용하기 위한, 대식세포인, 단핵 식세포 또는 단핵 식세포 집단.
- 제12항 또는 제13항에 따라 사용하기 위한 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단으로서, 바람직하게는 상기 단핵 식세포는 제11항 또는 제12항에 따른 대식세포이고, 상기 식세포는 2일 내지 60일 또는 병변 후 1년까지, 바람직하게는 병변 후 4 내지 21일 또는 15 내지 60일 투여되는, 단핵 식세포 또는 단리된 단핵 식세포 집단.
- 제7항 내지 제9항 또는 제11항 중 어느 한 항의 단핵 식세포 또는 제10항 또는 제11항의 단리된 단핵 식세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물로서, 바람직하게는 상기 단핵 식세포는 대식세포, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제인, 약제학적 조성물.
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