CN117425724A - 肿瘤缺氧驯化的再生巨噬细胞的获得方法及其在再生医学中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在从生物样品中分离的单核吞噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，该方法包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，其中孵育在缺氧条件下进行并且其中所述孵育诱导群体的单核吞噬细胞的表型和/或功能变化。由此获得的巨噬细胞呈现出在其他极化表型(包括M2巨噬细胞)中不存在独特的再生表型。此外，本发明涉及如此生产的生物反应器用于组织(包括神经组织)再生的用途。

Description

肿瘤缺氧驯化的再生巨噬细胞的获得方法及其在再生医学中 的用途
技术领域
本发明涉及一种制备用作用于再生医学的再生生物反应器的巨噬细胞的方法。本发明公开的方法特别涉及通过由肿瘤细胞系或从肿瘤块解离的肿瘤细胞、或解离的肿瘤外植体或肿瘤切除物和特定氧分压调节的培养基体外活化巨噬细胞。由此获得的巨噬细胞呈现出在其他极化表型(包括M2巨噬细胞)中不存在的独特再生表型。
本文定义的小鼠来源细胞的再生生物反应器表型包括广泛表达:金属蛋白酶(包括Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)、营养因子(包括VEGF、FGF、IGF)、以及细胞接触和粘附分子(包括Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)、促进存活(包括Rtn4rl2)和免疫调节的介导物(包括Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd6)。本文定义的人源细胞的表型包括广泛表达与以下有关的基因：伤口愈合(包括Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、血管生成(包括Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、解毒和防御反应调节(包括Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、对缺氧的反应(包括Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、胞外基质重塑(包括Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)以及神经元存活和髓鞘形成(包括Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。
此外，本发明涉及如此生产的生物反应器用于组织(包括神经组织)再生的用途。
背景技术
中枢神经系统(CNS)包括协调高级功能(认知)的大脑和主要充当大脑与外周(外感受和运动)之间的沟通通路的脊髓。与其他人体组织不同，神经组织的再生能力较差，神经组织病变不能自发愈合[1]。神经组织病变不会自发愈合。在CNS中，丧失的组织被具有神经胶质、纤维化成分并由炎症免疫细胞构成的疤痕组织取代[2]。病变的演变涉及由疤痕组织替代神经组织，从而导致神经元连接的连续性及其功能的丧失以及出现失能。CNS损伤导致的失能取决于损伤的方式、严重程度和解剖位置。
全球每年约有250-500,000人遭受脊柱损伤，导致高昂的医疗费用(估计约为1-400万欧元/患者)[3,4]。尽管社会和经济成本很高，但目前针对脊柱损伤护理开发的可能治疗方法很少。此外，目前可用的疗法只能限制脊柱创伤引起的继发性损伤，并保留病变部位完整的少数轴突连接。在过去的30年里，科学界开发了许多方法，使脊髓损伤(SCI)后的存活率大大提高，但仍然没有有效的疗法来治疗脊髓损伤，从而达到最佳的完全活动康复效果。在病理层面上，脊柱损伤导致损伤部位的神经元成分丧失，从而导致CNS和周围(肌肉)之间的脉冲传递中断。神经组织变性是组织缺血、细胞死亡和炎症等复杂现象的结果。
CNS病变的病理微环境，诱导神经损伤进展并阻止神经组织再生(生物需要)
除了神经组织损伤造成的原发性损伤外，还有由于血液灌注减少而造成的继发性损伤，包括维持神经细胞新陈代谢的底物(O2和营养物质)供应不足，血管通透性增加，引起水肿和炎症浸润，进一步压迫病灶周围的神经组织，加重病变。这些复杂的情况增加了主要相关区域周围神经组织细胞的死亡。为了限制损伤区域，会产生强烈的炎症，星形胶质细胞的反应性激活界定了病变范围。形成胶质瘢痕的星形胶质细胞与炎症免疫细胞，特别是炎症巨噬细胞(称为M1)和基质细胞一起产生一种特征性的胞外基质，其填充病变区域但抑制轴突生长和神经细胞分化。此外，炎症成分被细胞死亡慢性激活，并导致病灶微环境损伤和神经组织损伤的慢性进展。因此，病理-生理过程表明多种因素的复杂参与导致神经组织病变的形成、进展和慢性化[4-6]。目前，针对以神经组织丧失为特征的疾病的再生医学方法主要基于使用干细胞来替代(细胞替代)丧失的神经组织。为此，已经测试了胚胎干细胞(ESC)和/或胎儿神经干细胞(NSC)及其神经分化衍生物(例如少突胶质细胞前体)或神经分化诱导多能细胞(iPSC)(iPSC-NSC)[7,8]。这些疗法尚未在本发明人使用的以完全挫伤性脊髓损伤为特征的严重神经变性模型中显示出临床功效。
在寻找可以由患者本人直接获取然后移植用于再生目的(自体环境)的细胞来源的过程中，还测试了许多其他成体干细胞群。然而，这些研究显示了这些治疗的部分益处，不是通过注射到神经细胞中的细胞的直接分化来支持，而是通过“旁观者(bystander)”效应，即营养和炎症调节来支持。显示这些特性的干细胞包括成体神经干细胞(aNSC，仅存在于小鼠中)、造血干细胞(HSC)和源自骨髓(BM-)或脂肪组织(A-)的间充质干细胞(MSC)[7]。这些细胞类型具有不同的功效，表现出一定的再生能力，为受损组织提供营养因子并减少炎症。然而，这些方法在治疗严重的慢性神经退行性疾病方面还不够有效。作为最后一类细胞，最近还测试了包括巨噬细胞在内的免疫细胞的再生能力。静脉内注射或神经组织损伤部位诱导的M2表型巨噬细胞已显示出部分再生功效，尽管所使用的模型并不对应于严重和慢性神经退行性疾病[9]。M2巨噬细胞移植的治疗效果在一项针对脊髓损伤患者的II期临床试验中进行了测试。尽管M2移植没有显示任何显著的不良事件，但该研究未能证明接受M2治疗的患者与未接受治疗的对照患者的主要结果存在显著差异[10]。因此Lammertse等的研究不支持自体M2巨噬细胞治疗急性完全性SCI的疗效。
总之，现有技术分析表明仍然需要能够治疗以神经组织严重丧失为特征的疾病的疗法，因为对于这些病症没有有效的疗法。
发明详述
本发明人基于使用复杂的生物反应器“肿瘤缺氧驯化(educated)的巨噬细胞”(THEM)(也可以定义为“肿瘤驯化的巨噬细胞”(TEM))开发了一种针对以神经组织严重丧失为特征的疾病的疗法，其已被证明能够部分再生严重丧失的神经组织并促进运动恢复。作为神经组织丧失的范例，作者在严重(完全)挫伤性脊髓损伤的实验动物模型中测试了治疗效果(SCI)。
肿瘤的特性被认为是自然界中存在的“再生”的最佳例子，它被用来将免疫细胞转化为有效的生物反应器，以再生以神经组织严重丧失为特征的退行性疾病。具体地，如下文将描述的，用肿瘤调节和缺氧来“驯化”免疫细胞。
然后将THEM(肿瘤和缺氧驯化的巨噬细胞)注射到SCI动物的病变部位。THEM的给予是治疗性的，即在损伤后几天注射细胞。在7个独立实验中对200多只动物测试了THEM，并使用多学科方法评估了其效果。
关于本方法有两个主要发现：
1-相对于发明人用当前提出的疗法(包括各种类型的移植干细胞)发现的，在运动恢复水平和阳性病例频率方面，有效性水平更高；
2-与在病变之前或之后立即(24小时)给予治疗的其他治疗干预模型不同，在本例中，细胞治疗在病变后4天开始，即在与人类治疗的实际状况相对应的阶段。
为了评估缺氧对THEM再生效应的作用，发明人进行了体外和体内实验，旨在表征缺氧诱导的对THEM分子表型和功能表型的特定影响。
具体地，发明人通过分析THEM(缺氧培养)的全转录组并将其与无缺氧培养的THEM(肿瘤调节的巨噬细胞，TCM)和向M0和M2表型极化的巨噬细胞的全转录组进行比较，定义了具有缺氧特异性特征的THEM。
他们还进行了迁移测定，比较了THEM(缺氧培养)、TCM(无缺氧培养)和M2巨噬细胞，以验证缺氧增加了THEM对SDF-1的趋化反应。他们用iPSC衍生的人运动神经元进行了共培养实验，比较了缺氧培养的鼠和人THEM、无缺氧培养的TCM和M2巨噬细胞对神经元过程生成和伸长的影响，以验证缺氧处理赋予THEM对人运动神经元的体外神经元再生功能。此外，发明人比较了THEM(缺氧培养)和TCM对脊髓损伤小鼠运动恢复的体内效果，并验证了缺氧处理赋予THEM体内神经元再生功能。
因此，本发明的一个目的是一种用于在从生物样品中分离的单核吞噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，该方法包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，其中孵育在缺氧条件下进行，并且其中所述孵育诱导群体的单核吞噬细胞的表型和/或功能变化。
优选地，孵育的单核吞噬细胞群是从生物样品中分离的单核细胞(其可以定义为巨噬细胞的循环前体)的体外培养物。
例如，可以通过梯度离心从外周血中提取单核细胞，或者从先前从外周血中分离的单核细胞中解冻单核细胞。
优选地，单核吞噬细胞是单核细胞。
培养基优选包括能够将单核细胞分化成巨噬细胞的因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或IL34或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
优选地，单核吞噬细胞是巨噬细胞，优选地是鼠或人的，优选地从取自骨髓或源自血液(例如通过重复梯度离心)的细胞获得。
优选地，孵育在缺氧条件下进行。缺氧条件是指使用的氧气浓度低于大气浓度。
优选将群体孵育6小时或12小时至15或20天，更优选6小时-10天或优选3-8天或6小时-72小时，甚至更优选18小时-24小时或6天，甚至更优选7天或18小时。
由表型和/或功能改变诱导的单核吞噬细胞优选是巨噬细胞。因此，在一个优选的实施方式中，获得的细胞是巨噬细胞。
优选地，培养基包含肿瘤上清液，所述上清液优选获自实体瘤、肿瘤外植体或肿瘤细胞系的培养物，优选获自纤维肉瘤或神经胶质瘤。
优选地，肿瘤上清液是来自肿瘤的调节培养基(本文中也定义为调节的肿瘤培养基，CTM)，优选地从肿瘤细胞系、肿瘤外植体或实体瘤产生，或者从解离的并铺板的体外肿瘤的切除物产生，优选持续约12小时-20天的一段时间，更优选约12-72小时。
优选该培养基由以下组成：细胞培养基，例如伊氏最低必需培养基或其衍生物和/或洛斯维公园纪念研究所培养基(RPMI)1640和/或培养基199和/或费氏培养基，以及1-99％、优选10-90％、更优选30-50％、甚至更优选30％或50％肿瘤调节培养基(CTM)或肿瘤上清液。
优选将巨噬细胞分化在包含M-CSF或GM-CSF和任选的杜氏改良伊氏培养基(D-MEM)和/或热灭活胎牛血清和/或青霉素/链霉素和/或谷氨酰胺的培养基中，优选持续6天。
优选分化的巨噬细胞优选在1:9-9:1比率、优选1:1比率的肿瘤调节培养基(CTM)和D-MEM中培养，并且优选在缺氧条件下生长(例如，1％O2)优选持续18小时。
在一个优选的方面，巨噬细胞优选在体外培养6天，优选在含有10％热灭活胎牛血清和100ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和任选的100U/mL青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺，30％ CTM的RPMI 1640培养基中。
将单核细胞培养物在缺氧条件(0.5-20％ O2，优选1％ O2)下孵育整个培养期7天，或最后6-96小时，优选最后18-24小时，更优选最后18小时。
本发明的另一个目的是可通过根据本发明的方法获得的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞。
优选地，所述吞噬细胞：
i)表达至少一种以下基因：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；和/或
ii)低表达/不表达至少一种以下基因：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
M2细胞确实表达非常低水平/不表达CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A并且表达PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR(参见图22b和c)。
本发明的另一个目的是分离的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其：
i)表达至少一种以下基因：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；和/或
ii)低表达/不表达至少一种以下基因：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
优选地，本发明的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，表达：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；并表达低水平/不表达：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
本发明的另一个目的是包含至少一种如本文所定义的单核吞噬细胞的单核吞噬细胞群体。
本发明的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，优选其特征在于表1和/或表2和/或表3，和/或表6的基因中的至少一种的表达和/或在于表2的至少一种分子的分泌。
本发明的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，优选地其特征在于表达：金属蛋白酶(例如Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)和/或营养因子(例如VEGF、FGF、IGF)和/或细胞接触和粘附分子(例如Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)，和/或促进存活(例如Rtn4rl2)和免疫调节的介导物(例如Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd1)和/或来自具有获得性再生特性。
本发明的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，优选地其特征在于表达至少一种与以下相关的基因：伤口愈合(例如Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)和/或血管生成(例如Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)和/或解毒和防御反应调节(例如Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)和/或对缺氧的反应(例如Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)和/或胞外基质重塑(例如Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)，和/或神经元存活和髓鞘形成(例如Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。
根据本发明或如本文所述的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选巨噬细胞，优选用于医疗用途，更优选用于细胞治疗和/或再生医学。
根据本发明或本文所述的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选巨噬细胞，优选用于组织或细胞修复、组织或细胞再生、组织重塑、预防和/或治疗和/或伤口的修复和/或愈合，伤口组织丧失，手术溃疡，糖尿病伤口，变性病症，包括神经变性，视网膜变性，遗传性疾病(例如ALS)引起的变性，自身免疫性疾病(例如关节炎、胶原蛋白病)或甚至是出现胰岛变性的糖尿病；用于预防和/或治疗和/或解决炎症、组织炎症、损伤、受损组织等。
根据本发明或本文所述的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选巨噬细胞，优选用于预防和/或治疗以中枢神经系统嵌入组织丧失为特征的病变。
根据本发明或本文所述的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选巨噬细胞，优选用于预防和/或治疗脊柱病变或损伤，例如严重脊柱损伤或脊髓损伤，优选是严重或挫伤性脊髓损伤。
吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群，优选巨噬细胞，优选在病变(或损伤)后2天至60天或至1年给予，优选在病变(或损伤)后4-21或15-60天给予。
本发明的另一个目的是药物组合物，其包含根据本发明的至少一种单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选巨噬细胞，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的方法还可以包括验证单核吞噬细胞培养物在除去培养基之后已经经历了表型和/或功能变化。这种验证可以通过量化表征表型的基因的表达以及在一组功能测试中进行，这些测试预测来源于iPSC的人神经元培养物中存活率增加、神经元分化以及重塑胞外基质的能力。
如本文所用，术语“巨噬细胞”具有其在本领域中的一般含义，并且是指哺乳动物免疫系统中具有吞噬活性的一类抗原呈递细胞。这些细胞特征在于其独特的形态和高水平的表面MHC-II类、CD68、CD11b表达。巨噬细胞是单核细胞来源的吞噬细胞，其不是树突状细胞或通过局部增殖源自组织巨噬细胞的细胞。在体内，这些细胞是组织特异性的，指的是，例如，肝脏中的库普弗(Kupffer)细胞、肺中的肺泡巨噬细胞、脑中的小胶质细胞、骨中的破骨细胞等。本领域技术人员知道如何鉴定巨噬细胞、如何从人或动物的身体中分离巨噬细胞，以及如何表征巨噬细胞的亚类和亚群。
巨噬细胞历史上被分为两个表型不同的群体，即M1极化或“经典性活化”群体，和巨噬细胞M2极化或“替代性活化”群体。
表现出M1表型的巨噬细胞是促炎性的，并且能够直接(病原体模式识别受体)或间接(Fc受体、补体受体)识别病原体和肿瘤抗原(即，它们表现出抗肿瘤活性)。M1巨噬细胞产生活性氧物质并分泌促炎细胞因子和趋化因子，例如但不限于TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-18、IL-23和iNOS。M1巨噬细胞还表达高水平的MHC、共刺激分子和FCyR。Ml表型由GM-CSF触发，并进一步受到干扰素-γ(IFN-γ)、细菌脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子a(TNFα)的刺激，并由涉及信号转导子和转录激活子(STAT)、活化B细胞的核因子κ-轻-链-增强子(NFKB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的多种信号转导途径介导。这些事件增强了物质的产生，例如活性氧物质和一氧化氮，并通过增加抗原呈递能力和通过产生细胞因子(例如IL-12)诱导Th1免疫来促进随后的炎症免疫反应。
相比之下，表现出M2表型的巨噬细胞通常表征为具有抗炎和免疫抑制作用，因为它们抑制T细胞反应并参与Th2型免疫反应。M2巨噬细胞表型有利于组织修复、伤口愈合，并且是促纤维化的。M2巨噬细胞其特征在于表面高表达I1-4R、FcsR、Dectin-1、CD136、CD206和CD209A。M2巨噬细胞包括IL-4/IL-13刺激的巨噬细胞、IL-10诱导的巨噬细胞和免疫复合物触发的巨噬细胞。
因此，本发明的方法适合于在巨噬细胞群体中诱导一种或多种表型变化，以调节巨噬细胞群体以具有期望的表型。
如本文所用，短语“表型和/或功能变化”涵盖群体中单核吞噬细胞或巨噬细胞的特征、性质、属性或功能的可观察或可检测的变化。例如，可以根据本发明的方法修饰或调节的巨噬细胞的表型特征/性质/功能包括但不限于促炎活性、抗炎活性、免疫原性活性、吞噬活性、耐受原性活性、组织愈合活性、迁移活性、血管生成活性、抑制活性、抗原呈递活性或吞噬活性、胞外基质重塑活性、胞外基质沉积活性、营养活性、干/祖细胞自我更新、细胞增殖、细胞分化、抑制细胞死亡、细胞存活、细胞分泌、生长/营养因子分泌、轴突再生刺激活性、髓鞘形成刺激活性、代谢支持活性。
巨噬细胞的表型和/或功能变化可以通过多种方式观察或检测。例如，可以通过对巨噬细胞本身进行测试、观察或测量，或者通过对其他能够受到巨噬细胞的影响的细胞、组织、器官等进行测试、观察或测量，或通过对含有表型修饰的巨噬细胞的对象进行测试、观察或测量来观察或检测表型和/或功能变化。
表型和/或功能变化或调整可以通过检测或测量以下来评估，例如，(i)以下的表达改变：一个或多个基因(金属蛋白酶，包括Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)；营养因子(包括VEGF、FGF、IGF)和细胞接触和粘附分子(包括Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaL、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)促进存活(Rtn4rl2)和免疫调节的介导物(Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd6)；(ii)以下的分泌改变：一个或多个分子(例如，细胞因子TGFb3、Il16、Cxcl16、Isg15、Cxcl3、Cxcl1)，生长因子(VEGF、FGF、IGF)炎症介导物(Ptgs2、Ptges、Nos2、Arg1等)；(iii)调节免疫细胞的炎症表型(M1型)，优选巨噬细胞，和诱导这些细胞的修复表型(M2型)的能力；(iv)诱导人和/或鼠神经干细胞或诱导型多能人细胞的神经元分化并提高营养缺乏(氧和葡萄糖)条件下存活的能力和/或(v)诱导血管生成的能力和(vi)重塑胞外基质的能力和/或(vii)对SDF1的趋化反应。
表型和/或功能变化或调整也可以通过检测或测量以下来评估，例如，与以下有关的一个或多个基因的表达改变：伤口愈合(例如Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)和/或血管生成(例如Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)和/或解毒和防御反应调节(例如Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)和/或对缺氧的反应(例如Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)和/或胞外基质重塑(例如Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)以及神经元存活和髓鞘形成(Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。
如本文所用，术语CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A、PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR具有其在本领域中的一般含义。示例性且非限制性的人序列由分别以NCBI登录号(基因ID)：7852、9595、6515、4502、5362、10808、54205、57103公开的序列表示。
如本文所用，本文提及的基因具有其在本领域中的一般含义。示例性和限制性序列由表中所示的NCBI登录号(基因ID)公开的序列表示。
在本发明的方法中，可以使用本领域技术人员已知的用于产生/培养巨噬细胞的任何方法，例如从骨髓或血液或任何衍生物(例如白细胞分离术、血沉棕黄层)分离单核细胞和/或通过在存在M-CSF或GM-CSF或此类细胞因子的任何生物来源(包括转染的细胞系)的情况下体外进行培养，使它们分化为巨噬细胞。
在本发明的一个优选的方面，单核吞噬细胞是从骨髓中分离的。优选地，单核吞噬细胞分化为巨噬细胞，例如通过在包含M-CSF的培养基中培养它们，例如持续6天。巨噬细胞优选在缺氧条件下在CTM中培养，例如持续18小时。
在本发明的一个优选的方面，从外周血中分离单核吞噬细胞并分选CD14+单核细胞。优选地用CTM培养单核细胞，例如30％，在常氧下，例如持续6天，和在缺氧下，例如持续18-24小时。
或者，用CTM培养可以首先在缺氧条件下进行，然后在常氧条件下进行。
在本发明的一个优选的方面，从在含有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和100ng/ml M-CSF的高葡萄糖的杜氏改良伊氏培养基(D-MEM)或Iscove改良杜氏培养基(IMDM)中分化6天的骨髓细胞中获取小鼠巨噬细胞。为了产生再生生物反应器并通过肿瘤调节“驯化”巨噬细胞，分化的细胞优选在含有CTM和D-MEM(优选以1:1的比例)的培养基中培养，并在缺氧条件(例如0.5-20％ O2，优选1％ O2)下培养持续6-96小时，优选18小时。人巨噬细胞优选来源于循环单核细胞。优选通过重复梯度离心(例如Lympholyte,Cederlane,#CL5020和Percoll,Cytiva,#17089101)和/或CD14+单核细胞的免疫磁性富集(例如Milteniy Biotec)从外周血中分离(循环)单核细胞。获得的单核细胞优选在含有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和100ng/mL M-CSF，含有20-50％(优选30％)CTM的RPMI 1640培养基中体外培养6小时-15天，优选7天。单核细胞培养物可以在缺氧条件(例如0.5-20％O2，优选1％ O2)下孵育整个培养期7天或最后6-96小时，优选最后18小时。CTM优选地从肿瘤细胞系或肿瘤外植体、或实体瘤、或从解离的并铺板的体外肿瘤的切除物产生，持续约6小时至20天的一段时间，优选12-72小时。
本发明的细胞优选来源于单核细胞，优选来源于血液来源的CD14+单核细胞。在一个实施方式中，本发明的细胞通过用包含肿瘤调节培养基的培养基(例如含70％培养基(优选RPMI+10％FBS+100ng/ml M-CSF)和30％肿瘤调节培养基)体外培养血液来源的CD14+单核细胞来获得。优选地，在常氧下培养1-15天，优选6天，随后缺氧6小时-5天，优选18-24小时。肿瘤调节培养基优选获自肿瘤系的上清液或解离并铺板的体外肿瘤的切除物的上清液，优选持续约6小时-20天的一段时间，优选12-72小时。
本发明的细胞优选源自新鲜单核细胞，例如分离自骨髓，优选分离自dT-Tomato雄性小鼠骨髓。在一个实施方式中，本发明的细胞通过在细胞培养基(例如IMDM)中培养获得，优选补充有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，优选粘附1-15天，优选持续6天，在常氧下，优选37℃，5％ CO2。然后优选用由50％肿瘤上清液(例如从实体纤维肉瘤和神经胶质瘤外植体的培养物获得，从中选择富肿瘤的上清液)和50％ IMDM组成的培养基进行改良，并且将培养物维持在缺氧条件下(1％ O2)持续6-72小时，优选18小时。
在本发明的方法中，可以在用CTM的整个孵育或部分孵育(例如6-96小时，优选18小时)中给予缺氧条件。
优选地，本发明的方法包括另外的步骤(其可以在与包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基一起孵育的同时或之前或之后进行)，其中单核细胞被诱导分化为巨噬细胞，例如通过用M-CSF培养它们。
因此，本发明还提供了在从生物样品(例如血液样品)中分离的单核细胞(优选CD14+)来源的巨噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，其中孵育在缺氧条件下进行，并且其中所述孵育诱导群体的单核吞噬细胞的表型和/或功能变化。
由表型和/或功能改变诱导的单核吞噬细胞优选是巨噬细胞。
通过本发明的方法可获得的巨噬细胞或细胞或者本发明的巨噬细胞或细胞优选地特征在于表达表1、2、3、5和/或6中所示的一个或多个基因，事实上，这些表格显示了THEM细胞中上调的基因。
通过本发明的方法可获得的巨噬细胞或细胞，或者本发明的巨噬细胞(或细胞)优选地特征在于低表达/不表达表4中所示的一个或多个基因，该表报告了以下基因：其在THEM细胞中不表达或表达非常低和/或以下一个或多个：ALOX15、CCL8和CCL26。
通过本发明的方法可获得的巨噬细胞(或细胞)或本发明的巨噬细胞(或细胞)优选地特征在于分泌一种或多种表2所示的分子。
用于观察、检测和测量这些表型和/或功能变化的方法是本领域已知的并在本文中描述。
例如，可以使用cDNA或寡核苷酸的微阵列分析、Northern印迹、RT-PCR、测序等在RNA水平评估基因表达谱。
可以使用例如免疫印迹、免疫组织化学、蛋白质微阵列等来测量蛋白质表达。
还可以使用本领域容易已知和使用的基于细胞和动物模型的多种测试。
本发明的组合物的细胞可以来自患者本人(因此该组合物含有自体细胞)或来自供者(因此该组合物含有同种异体细胞)。
对于同种异体细胞，供者和接受细胞的患者之间需要HLA相容性和匹配。
在本发明的上下文中，“肿瘤上清液”优选地指在其中体外培养肿瘤来源的细胞的培养基，并且包括术语“富(含)肿瘤的上清液”、“肿瘤调节的培养基”、“从肿瘤培养物或外植体释放的因子”。肿瘤上清液优选获自实体瘤(例如纤维肉瘤)或肿瘤外植体(例如神经胶质瘤)的培养物，或优选解离并体外培养的肿瘤细胞系或肿瘤切除物的培养物。培养优选进行6h-20天，优选12-72小时。
在本发明的上下文中，“常氧/含氧量正常”优选表示正常大气压(21％，160mmHg)下空气中的氧(O2)水平，例如它表明存在5％CO2，优选37℃的温度下。
在本发明的上下文中，“缺氧”或“缺氧条件”优选表示空气中的氧(O2)水平低于正常大气压(21％，160mmHg)，例如它表明存在0.5-20％ O2，优选1％ O2。
在本发明的上下文中，M2可以定义为替代性活化的巨噬细胞、表达高水平CD206、CD163和Argl基因的极化小鼠巨噬细胞(如前所述)，或表达高水平CD206、CD163、CD86、TREM2、IL1RN、IL10、STAT3、STAT6、fabp4、sphk1、HOMOX1、IRF4、PPAR-CCL22以及极低/无至低水平的CCR7、IL2RA和CXCL11的人巨噬细胞，如前所述(11,12)。
在本发明的上下文中，TCM可以定义为与CTM孵育(无缺氧)的小鼠或人巨噬细胞，表达高水平的TGFBI、DAB2、FUCA1、CYP1B1、MAFB、CCL2和极低水平的/不表达MT2A和MTFP1。
在本发明的上下文中，M0可以定义为分化的非极化巨噬细胞，表达高水平的NINJ1、F13A1、SCARB1和STAB1、AOAH、TLR7、A2M、FNBP1、CD209、SH3KBP1和ITSN1，如先前所述(13)。
在本发明的上下文中，THEM可以定义为通过本发明的方法获得的细胞，或一种细胞，其特征在于本文公开的本发明的细胞的表型或功能或表型和/或功能改变中的至少一种。
在本发明的优选方面，该方法还包括在缺氧条件下孵育之前，将群在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育。这意味着，例如，将细胞或细胞群与包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基一起在常氧下孵育一段时间，例如1-15天，优选6天。随后将细胞或细胞群在缺氧条件下维持或培养，例如持续6小时至15天，优选18-96小时。
培养基优选地包括肿瘤上清液，所述上清液优选获自肿瘤实体外植体或肿瘤细胞系的培养物，优选获自纤维肉瘤或神经胶质瘤，或优选是肿瘤调节培养基(CTM)，优选从肿瘤细胞系或肿瘤外植体或实体瘤产生，或来自解离并铺板的体外肿瘤的切除物，优选持续约6小时至20天的一段时间，更优选约12小时至72小时。
在本发明的上下文中，术语“与……孵育”优选意指细胞在其中培养、生长或处理。如本文所用，术语“治疗有效量”是指以必要的剂量和持续时间段以有效实现期望的治疗结果的量。本发明的试剂的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本发明的试剂在个体中引发期望的反应的能力等因素而变化。本发明的试剂的有效剂量和给药方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术的医师可容易地确定并开出所需药物组合物的有效量。例如，医师可以以低于实现期望的治疗效果所需水平剂量起始在药物组合物中使用的本发明试剂的剂量，并逐渐增加剂量直至获得期望的效果。通常，本发明组合物的合适剂量应为根据特定剂量方案有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量通常将取决于上述因素。在特别优选的实施方式中，本发明的细胞在特别适合本发明的方法的特定生长培养基中扩增，任选地具有补充物。这样的生长培养基可以包含调节单核细胞的增殖、分化和/或功能活化的造血生长因子，例如M-CSF。
本发明的方法产生具有特定性质的细胞，这也在本文中进行了描述。因此，特别优选的是，可通过本发明的方法获得的细胞是本文所述的细胞。
本发明还涉及巨噬细胞。本发明的巨噬细胞也可以称为“本发明的细胞”，或者简称为“细胞”。本发明的细胞或巨噬细胞优选其特征在于其(a)表达以下基因中的至少一个：CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A基因和/或(b)不表达以下基因中的至少一个：PLXNA2、HSPH1、CYCS、TIGAR。优选地，细胞是分离的细胞。更优选地，细胞来源于CD14+单核细胞，优选来源于血液。优选地，该细胞是灵长类细胞。优选地，该细胞是人细胞。
在人细胞的情况下，优选人细胞表达表3和/或6中公开的至少一个，优选至少两个的任何组合，最优选所有基因。进一步地，在人细胞的情况下，优选该细胞不展示或表达表4公开的至少一个，优选至少两个的任何组合，最优选所有基因。
在一个优选的实施方式中，该细胞是巨噬细胞。
根据本发明的细胞是可通过根据本发明的方法获得的细胞。
本发明还涉及细胞群。该群体包含至少一种根据本发明的细胞。更优选地，细胞群包含大量细胞，其中至少70％(按细胞数量计)、优选80％(按细胞数量计)、优选至少90％(按细胞数量计)、更优选至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％(各自按细胞数量计)是根据本发明的细胞。第二方面的所有优选实施方式也适用于本发明的第三方面。优选至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％，最优选100％细胞总数中的细胞是本文定义的细胞，以及任选地一个或多个其优选实施方式，单独或组合。细胞群优选CXCR4和/或CYTIP和/或SLC2A3和/或MT2A基因表达呈阳性和/或PLXNA2和/或HSPH1和/或CYCS和/或TIGAR表达呈阴性。细胞群优选地对于表1和/或2和/或3和/或4和/或6的至少一种基因的表达呈阳性。细胞群优选地对于表4的至少一个基因的表达呈阴性。
优选地，群体是分离的细胞群。
术语“同种异体”在本文中用于描述源自同一物种的不同个体的任何事物。当一个或多个基因座处的基因不相同时，将两个或更多个个体称为彼此之间为同种异体的。
术语“自体”在本文中用于描述源自同一对象的任何事物。例如，“自体细胞”是指来源于同一对象的细胞。自体细胞移植有时被认为是有利的，因为它克服了免疫屏障，否则会导致排斥反应。
术语“细胞群”和“细胞群体”可互换地指多个细胞的集合。在最窄的实施方式中，细胞群包含两个细胞，但更典型地包含多个细胞。
如本文所用，术语“扩增”或“增殖”通常指细胞或细胞群的增殖。通常，本发明上下文中的扩增发生在体外或离体。通常，扩增是细胞分离之后的活动或过程。通常，在扩增过程中，细胞总数会增加。它还可以包括术语“培养”。
如本文所使用的术语“表达”、“表达的”和“表达”、“基因表达”等涉及来自基因的信息在功能性基因产物的合成中的使用。基因表达至少包括转录，并且任选地包括一个或多个附加特征，任选地选自包括RNA编辑、翻译和翻译后修饰的开放列表。当确定基因表达时，就确定了表达产物的存在，例如未编辑或编辑的RNA，甚至编码的蛋白质。上述术语与特定基因或基因座结合使用，旨在指定该基因或基因座的遗传信息的表达；例如，当说表达CXCR4，意味着表达CXCR4基因。
对于低水平表达，优选地，预期的基因表达水平比管家基因例如β-肌动蛋白的表达水平低至少五倍。
术语“不表达”还包括术语低水平表达/无表达或可能意味着特定基因被下调，例如与M2细胞相比。
在某个方面，术语“低水平表达/无表达”可以具有与“不表达”相同的含义。
术语“表达”还意味着特定基因被上调，例如与M2细胞相比。
“分离的”是指基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的细胞”是指已从细胞和胞外环境(例如以天然存在的状态包围它的组织或液体)中纯化出来的细胞。在替代性描述中，本文所用的“分离的细胞”等是指从其天然细胞环境以及与细胞通常驻留的组织的其他成分的缔合中体外分离和/或纯化细胞。除非上下文另有说明，“分离的细胞”不一定是没有任何其他细胞的单个细胞；相反地，甚至两个或更多细胞的群，例如大量细胞，当所述细胞群在基本上或本质上不含通常伴随处于自然状态的此类细胞的组分的意义上分离时，也可以被称为“分离的”。根据“分离”一词的定义，如本文所用，“以分离”是描述获得“分离的”材料的活动的动词，例如，“分离的”材料，例如，分离的细胞。
如本文所用，术语“培养基”意指适合于培养细胞、特别是哺乳动物细胞的水性混合物。水性混合物通常是溶液，但也包括悬浮液和胶体混合物。培养基通常是液体，但某些培养基也可以暂时冷冻，例如用于存储目的；在任何情况下，当培养基是液体时用于细胞培养。培养基可以是“基础培养基”，其是确定的水性混合物，或“生长培养基”，其是包含基础培养基和至少一种补充物的水性混合物，并且通常具有维持离体细胞活力，以及任选地还有离体细胞的扩增的能力。基础培养基优选是化学成分确定的培养基。生长培养基优选包含基础培养基(通常85％至99.5％体积/体积)加上至少一种人源性、动物源性或植物源性补充物，例如血清、细胞裂解物。
当本文与细胞结合使用时，术语“分泌”或“释放”通常指从细胞外化到外部环境中的任何物质。所述物质通常已由细胞产生和/或修饰，但这不是必需的。例如，一些细胞将蛋白质和/或调节分子例如激素、前列腺素和神经递质和/或微泡和/或外泌体分泌到它们各自的外部环境中。例如，细胞产生的前列腺素可以外化到细胞环境中。如本文所使用的，所述术语既不限于体内分泌/体内环境，也不限于体外环境中的体外分泌，除非上下文另外指出。
任选地但优选地包括附加步骤，特别是扩增步骤，其在下文详细描述。
根据本发明的方法的第一步是步骤(a)，其特征在于从生物样品中分离单核吞噬细胞(群体)。
因此，根据本发明，细胞优选从血液或骨髓中分离。
根据本发明的生长或培养基通常包含基础培养基和一种或多种补充物。从广义上讲，所使用的基础培养基的类型没有具体限制。
优选地，基础培养基是化学成分确定的。化学成分确定的基础培养基是适合于人或动物细胞的体外细胞培养的基础培养基，其中所有化学成分都是已知的，具体地，化学成分确定的培养基要求所有成分必须被鉴定并具有已知的确切的浓度。因此，化学成分确定的培养基必须完全不含动物源性成分，并且不能含有血清或血清源性蛋白质，例如胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。化学成分确定的基础培养基不仅仅不包含重组蛋白和/或激素。为了实现这一点，化学成分确定的培养基不包含来自人或动物来源的成分，例如蛋白质和/或生长因子；具体地，它不包含来自人或动物来源的白蛋白，也不包含来自人或动物来源的生长因子。优选地，其包含重组白蛋白和/或重组生长因子，通常来源于非人、非动物来源，例如植物细胞和细菌，和/或合成化学品，例如聚乙烯醇。
基础培养基可以例如选自包括但不限于伊氏最低必需培养基(EMEM)、杜氏改良伊氏培养基(DMEM)、α-MEM、RPMI-1640、IMDM等的列表。如果需要，可以将一种或多种血清替代成分添加到这些培养基中。由此，获得无血清基础培养基。
细胞可以被冷冻，例如根据标准程序，在液氮中速冻。很可能对这些冷冻细胞进行解冻，例如，解冻后将其进行进一步的培养。冷冻可以整批或等分进行。在一个实施方式中，细胞的特征在于至少一种在巨噬细胞中通常不存在的特征——结构特征或功能特征。例如，这样的特征可以是可获得本发明的细胞的方法特有的特征。这种结构或功能特征可以选自本公开中明确描述的特征，和/或选自本公开中未明确描述但本发明的细胞固有的特征，例如，是通过本发明的方法可获得的细胞所固有的。根据本发明的细胞可以通过培养在体外扩增。由此可以获得衍生细胞。衍生细胞也是本发明的细胞，只要其符合限定本发明细胞的要求保护的特征。因此，由于本发明的细胞的特性，本发明可以覆盖多代细胞。通过如本文所述的扩增可以获得多代。事实上，根据本发明的细胞的具体实施方式包括细胞离体扩增。因此，尽管细胞是分离的，但它能够产生相同或相似细胞的后代，从而产生细胞群。
一般而言，本发明的细胞可以来源于各种组织，例如骨髓，和流体例如血液。优选地，根据本发明的细胞来源于或起源于骨髓或血液。
在一个实施方式中，本发明的细胞是新鲜分离的细胞。新鲜分离的细胞是通过例如本文所述的方法从其来源的组织分离而直接获得的细胞。然而，更优选地，本发明的细胞是起源于新鲜分离的细胞的细胞，最通常通过体外扩增或培养。
本发明的细胞的特征可以在于基因表达模式。如本文所用，“基因表达模式”是指至少一种基因表达、或不表达、或以某一水平表达，视情况而定。因此，该特定基因表达、或不表达、或以一定水平表达的事实表征了本发明的细胞，例如，为了与参考细胞区分开来。这同样适用于多个基因的表达，例如两个基因、三个基因、四个基因、五个基因、六个基因、七个基因、八个基因、九个基因、十个基因等。当本发明的细胞的特征在于表达一个或多个基因时，不期望对上下文中未提及的任何其他基因的表达做出具体说明。作为说明性实例，无论本文何处说本发明的细胞表达CXCR4，这不应被视为任何特定其他基因也被表达、或不表达、或以某一水平表达的说明，除非上下文另有规定。
一般地，可以通过多种方法在核酸水平和蛋白质水平上测试基因的表达。基因表达可以在分子生物学、生物化学和细胞生物学中相对普遍地进行测试，并且任何已知的或适合的方法都可以在本发明的上下文中使用。下面描述了一些方法。与基因表达相关的方法也可以称为转录组学方法。因此，细胞的基因表达谱也可以称为转录组。在一个实施方式中，本发明的细胞的特征在于其基因表达谱。
可以使用不同的术语来描述正在分析基因表达：例如，表达可以说是被测试、分析、评估、测定、测量、确定等。这些术语包括定性确定，即问题是各个基因是否表达，以及定量确定，即问题是各个基因的表达水平如何。
通常，为了确定基因表达，从细胞群中取出一个细胞或(优选的)多个细胞的样品，随后分析该样品中的基因表达，其中可以破坏或不破坏该样品中的细胞，视情况而定。由于本发明的细胞群通常是均质的，意味着其中包含的基本上所有个体细胞都非常相像或相似，因此对取自细胞群(代表性样品)的样品中包含的细胞中的基因表达的发现通常将也适用于该群体中的其余细胞，除非上下文另有规定和/或该细胞群体似乎不是基本上同质的。
任何相应基因表达的测定可以是非定向测定，即一般分析基因表达(例如通过广泛的方法，如微阵列)而不是集中于一个基因，也可以是定向测定，其中特异性测试相应的基因是否被表达。特别是在第二种情况下，相应的基因也可以被称为“感兴趣的基因”。
多种转录组技术可用于生成基因表达分析的数据。例如，DNA微阵列测量先前鉴定的靶基因的相对活性。基于序列的技术，如RNA-Seq，除了表达水平之外，还提供基因序列的信息。
本发明的一种或多种细胞可以表达一种或多种标志物或基因，并且它们可以缺乏一种或多种标志物或基因的表达。在具体情况下，它们表达至少一种选自表1和/或2和/或3和/或5和/或6的标志物或基因及其组合；和/或它们可以缺乏选自表4的至少一种标志物或基因及其组合的表达。
本文或表中提供的NCBI或Ensembl参考文献是对其序列的示例性而非限制性参考文献。事实上，本文所示的各个基因/标志物/蛋白质可以通过其登录号(即Ensembl或NCBI基因ID)来表征，但也包括所有同种型、变体、类似物、直系同源物、片段、衍生物
在本公开的上下文中，提及本文公开的基因是指这些分子的所有形式及其功能性片段、突变体或变体。此外，指可能由其mRNA的可变剪接或这些分子的异构体或多晶型形式产生的任何同种型。
提及“表型谱/表型概况”或“表型”，应理解为提及编码主题标志物的基因的转录和/或由其翻译的表达产物的细胞表面表达的存在或不存在。应理解，尽管落入所要求保护的细胞群体范围内的大多数细胞的特征在于是否存在作为细胞表面锚定表达产物的主题标志物，但落入所定义群体的一些细胞最初可能仅在以下情况下表现出变化：转录组水平，例如当给定标志物的转录已被上调但可能尚未产生细胞表面锚定的表达产物时。通常，进展到新的分化阶段的细胞将瞬时地表现出基因表达变化，这些变化在表达产物水平变化的背景下尚不明显。然而，这些细胞仍然落入所要求保护的细胞群的范围内。
“调节培养基(conditioned medium)”是例如一种培养基，其中培养了特定细胞或细胞群，然后将其除去。当细胞在培养基中培养时，它们可能会分泌细胞因子，为其他细胞提供营养支持。营养因子是促进或至少支持细胞的存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞活性增加的物质。此类营养因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。含有细胞因子的培养基是调节培养基。在本发明组合物或方法的一些实施方式中，使用营养因子。
预期本公开的任何组合物或方法包含细胞包封。在一些实施方式中，细胞被单独包封。在一些实施方式中，许多细胞被包封在同一膜内。在植入后去除细胞的一些实施方式中，可以采用相对大尺寸的结构(例如在单个膜内)包封许多细胞，以提供方便的回收手段。在多种实施方式中可以使用多种材料用于干细胞的微胶囊化。这种材料包括，例如，聚合物胶囊、藻酸盐-聚-F-赖氨酸-藻酸盐微胶囊、聚-F-赖氨酸藻酸钡胶囊、藻酸钡胶囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纤维和聚醚砜(PES)中空纤维。可用于给予干细胞的细胞微囊化技术是本领域技术人员已知的，且描述于例如Chang,P.,等,1999；Matthew,H.W.,等,1991；Yanagi,K.,等,1989；Cai Z.H.,等,1988；Chang,T.M.,1992和在美国专利号5,639,275中(例如，其描述了一种生物相容性胶囊，用于长期维持稳定表达生物活性分子的细胞。其他包封方法参见欧洲专利公开号301,777和美国专利号4,353,888；4,744,933；4,749,620；4,814,274；5,084,350；5,089,272；5,578,442；5,639,275；和5,676,943。所有上述内容中与细胞包封相关的部分通过引用纳入本文。
本公开的某些实施方式将本发明的细胞纳入聚合物中，例如生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的例子包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白和蛋白聚糖。其他因子，例如细胞因子，也可以纳入聚合物中。在本公开的其他实施方式中，细胞可以纳入三维凝胶的间隙中。通常，将通过手术植入大的聚合物或凝胶。可以配制为足够小的颗粒或纤维的聚合物或凝胶可以通过其他常见的、更方便的非手术途径给予。
在本公开的一些实施方式中，利用标准生长条件。如本文所用，术语“标准生长条件”是指细胞的培养，例如在37℃下，在包含5％ CO2的标准大气中。保持相对湿度，例如约100％。虽然前述条件适用于培养，但应理解，此类条件能够由本领域技术人员改变，本领域技术人员将理解本领域可用于培养细胞的选项，例如，改变温度、CO2、相对湿度、氧气、生长培养基等。
实施方式包括用于再生医学的包含本发明的细胞或其衍生的产品的药物、治疗组合物、制剂、制备物及相关方法。
组合物采用例如溶液、悬浮液、膜的形式，并且含有约10％至约95％或约25％至约70％的细胞或其衍生的产物。在实施方式中，组合物以多种合适方式中的任一种给予。组合物可以通过诸如静脉内和动脉内的方式全身给予，通过诸如鞘内、心室内的方式或通过Ommaya储库的方式局部给予。其他方式包括透皮、直肠、阴道、舌下和鼻内。
以相容的方式和治疗有效、可耐受且安全的量给予组合物。给予的量取决于待治疗的对象。需要给予的细胞的精确量取决于从业者的判断。
在许多情况下，可能需要多次给予，至多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多(或其中可衍生的任何范围)次。给予范围可以是1天至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周(或其中可衍生的任何范围)的多周间隔。给予过程之后可以评估例如症状、疼痛、情绪、行为或灾难化。
可以以至少或至多约0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500mg/kg/天(或其中可衍生的任何范围)的量给予患者本文所述的组合物或化合物的组合。
本发明的细胞是来自动物、优选哺乳动物、优选灵长类动物、更优选人的细胞。因此，在一个实施方式中，本发明的细胞是哺乳动物细胞。因此，除非另有说明，所有对特定基因的指示均指相应的哺乳动物基因。
更优选地，本发明的细胞是来自灵长类动物、更具体地来自人的细胞。因此，更优选地，本发明的细胞是人细胞。因此，在该实施方式中，所有对特定基因的指示均指相应的人的基因。
优选地，本发明的细胞不是转基因细胞。因此，在该实施方式中，所有关于特定基因的表达的指示意味着相应的基因从其编码的基因组表达，更具体地，其通过孟德尔遗传编码。然而，在一些替代性实施方式中，本发明的细胞是转基因细胞。
在本文中，均质意味着基本上所有细胞都非常相像或相似。
基因的表达可以直接测试，例如通常通过分子生物学方法，包括测定基因产物(例如特定信使RNA(mRNA)或其前体或其降解产物)的存在以及(如果需要或期望的话)其水平；或者，替代性地，基因的表达可以间接测试，例如通常通过生物化学方法，包括测定由特定基因编码的蛋白质的存在和(如果需要或期望的话)其水平，所述蛋白质例如特定的细胞表面蛋白质或其前体或其降解产物。特别地，用于表征本发明的细胞的合适的表面蛋白包括分化簇(CD)。
用于测试基因表达的任何已知方法也可用于本发明。合适的方法包括选自以下的那些，包括但不限于：基因表达谱分析、聚合酶链式反应(例如PCR，例如优选定量PCR(qPCR)，包括RT-qPCR)、转录产物测序、任何类型的转录组分析等方法。在核酸水平上，优选的方法包括微阵列和qPCR。
在一个实施方式中，通过基因表达谱分析测定基因表达。在分子生物学领域，基因表达谱分析是指通常同时测量几个(通常是数千个)基因的表达，以创建细胞基因表达的全局图。例如，基因表达谱分析是同时测量几个(通常但不一定是数千个)基因的表达，以创建细胞的全局图。基因表达谱分析能够，例如，区分本发明的细胞和其他细胞。甚至可以同时确定全基因组的表达，即特定细胞中存在的每个基因。许多此类实验同时测量整个基因组，即特定细胞中存在的每个基因。多种转录组学技术可用于生成分析所需的数据。在本发明的一些实施方式中优选微阵列
基于序列的技术，包括高通量测序，如下一代测序(NGS)，可用于确定本发明中的基因表达。例如，RNA-Seq(RNA测序)，也称为全转录组鸟枪测序，除了表达水平之外，还可以提供基因的序列信息。RNA-Seq使用下一代测序(NGS)来揭示给定时刻生物样品中RNA的存在和量。在一个实施方式中，基因表达通过基于序列的技术测定，如RNA-Seq或PCR及其任何变体。
可以通过定量RT PCR(qRT PCR)验证一些或全部基因的表达，例如，通过基因表达谱分析(例如在微阵列中)所揭示的结果。
众所周知，定量聚合酶链式反应(qPCR，又称实时聚合酶链式反应(实时PCR))是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的实验室方法，适用于测定核酸的量。具体地，为了确定转录物(例如mRNA)的量，首选方法是定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。与其他RNA定量方法(例如Northern印迹)相比，qRT-PCR通常被认为是用于检测RNA水平的最强大、最灵敏且定量的测定，因此在本发明中是优选的，对于基因表达的测定，qRTPCR也比间接测定基因表达产物蛋白质水平(例如通过免疫检测，例如通过荧光一抗或二抗的免疫修饰以及流式细胞术)灵敏得多。qRT PCR通常需要相应核酸的特异性引物，然而，其序列通常可通过序列数据库获得，例如，对于人基因，或者可以由技术人员基于此类信息来设计。市售试剂盒和机器可用于qRT-PCR，并且这些可用于本发明。在qRT PCR中用作测定基因表达的模板(也称为“靶标”)的核酸是转录产物，通常是mRNA。
优选地，本发明的细胞表达至少一种巨噬细胞特异性基因。
本发明的细胞的特征尤其在于其表达以下基因中的至少一种：CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A。更优选地，与管家基因β-肌动蛋白比较，相对于参考细胞中所述至少一种基因相对于β-肌动蛋白的表达比，所述至少一种基因以高水平表达，或者与其在M2巨噬细胞中的表达水平相比上调。
在一个实施方式中，基因表达是间接测定的，即不是通过测定初级转录产物、mRNA或其前体或其降解产物，而是通过测定更下游的特定产物。通常，更下游的特定产物是由mRNA编码的蛋白质；然而，它也可以是任何其他特定产物，例如特定于特定物质存在的代谢物，例如酶活性，蛋白质。
优选地，确定蛋白质的存在。更优选地，确定细胞表面上蛋白质的存在。换言之，确定蛋白质是否展示在细胞表面上。
例如可以通过免疫活性分子，例如特异性抗体和其他免疫反应分子分析在细胞表面展示特定蛋白质的细胞。“细胞表面”在本文中根据其在本领域中的正常含义使用，并且因此具体地包括蛋白质和其他分子结合可及的细胞外部。如果蛋白质至少部分位于所述细胞的表面并且是抗原结合分子(例如添加到细胞中的抗原特异性抗体)结合可及的，则蛋白质展示在细胞表面上。在一个实施方式中，展示在细胞表面上的蛋白质是具有可以被抗体识别的胞外部分的整合膜蛋白。在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指分子、特别是蛋白质的一部分，其面向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部可及，例如通过结合分子，例如位于细胞外的抗体。优选地，该术语指一个或多个胞外环或结构域或其片段。本文使用的术语“部分”是指结构(例如氨基酸序列)的连续或不连续元件。蛋白质序列的一部分或部分优选包含组成蛋白质的氨基酸序列的至少5个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续和/或非连续的氨基酸。
可通过抗体或其他免疫反应性分子检测的蛋白质也可称为抗原。在一些实施方式中，本发明的细胞其特征可以在于展示-或不展示-一种或多种特异性抗原。在本发明的上下文中，这种抗原优选地展示在细胞的表面上。这种抗原也可以称为“表面抗原”。
表5示出了其示例。
尽管“表达”一词在严格意义上是指基因被表达，但“表达”一词也可以意在描述由所述基因编码的蛋白质(特别是细胞表面蛋白质)在细胞上展示。
根据本发明，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则抗原在细胞上展示。根据本发明，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低以至于不允许添加到细胞中的抗原特异性抗体结合，则称抗原被称为在细胞上不表达。优选地，细胞中表达的抗原被表达或暴露，即存在于所述细胞的表面上，并且因此可被添加至细胞的抗原特异性分子例如抗体或其他免疫反应性分子结合。在一些情况下，添加辅助检测的二级分子，例如任选地添加标记的二抗。
抗体或其他免疫反应分子可以识别细胞上的表位。术语“表位”是指分子例如抗原中的抗原决定簇，即被免疫系统识别(即结合)的分子的部分或片段，例如被抗体或其他免疫反应分子识别的部分或片段。对任何特定抗原具有特异型的表位的检测通常可以得出结论：该特定抗原在经分析的细胞上表达。
在一个实施方式中，可以通过免疫分型表征本发明的细胞。“免疫分型”通常是指可以通过抗原特异性分子(例如抗体或其他免疫反应性分子)来表征细胞，所述抗原特异性分子被添加到细胞中以确定抗原是否在细胞上表达。免疫分型包括使用各种方法(包括流式细胞术)进行细胞分选。
免疫分型的优选方法是流式细胞术，特别是FACS。常用抗体或其他免疫反应分子来识别分析物，特别是细胞表面蛋白。抗体或其他免疫反应分子本身被荧光团标记，或者被为此目的添加的荧光团标记的二抗或其他免疫反应分子识别。
根据本发明的细胞的特征在于其表达以下至少一种：CXCR4、CYTIP、SLC2A3、MT2A。优选在基因表达水平上检测它们的表达，最优选通过RNAseq。图22示出了其示例。
不希望囿于任何特定理论，据信CXCR4、CYTIP、SLC2A3或MT2A对于细胞的趋化能力、细胞粘附的调节、细胞代谢和抗氧化防御是重要的。如实施例中所示，根据本发明的细胞与M2细胞的区别尤其在于CXCR4、CYTIP、SLC2A3和/或MT2A的表达。因此，根据本发明的表达CXCR4、CYTIP、SLC2A3和/或MT2A的细胞明显不同于现有技术描述的巨噬细胞。
然而，根据本发明的细胞低水平表达或不表达PLXNA2、HSPH1、CYCS和/或TIGAR。这些基因由M2和/或TCM和/或M0巨噬细胞表达。因此，本发明的细胞不是M2、TCM、M0巨噬细胞。
优选地，细胞表达至少一种巨噬细胞特异性基因。优选地，细胞在其表面上展示至少一种对巨噬细胞具有特异性的表面标志物，例如，CD45、CD68、CD11b和MHCII。
优选地，本发明的细胞能够促进细胞存活、细胞生长，包括神经元细胞生长、血管生成、胞外基质重塑、免疫细胞调节。例如，其呈现促炎活性、抗炎活性、免疫原性活性、吞噬活性、耐受活性、组织愈合活性、迁移活性、血管生成活性、抑制活性、抗原呈递活性或吞噬活性、胞外基质重塑活性、胞外基质沉积活性、营养活性、干/祖细胞自我更新、细胞增殖、细胞分化、细胞死亡抑制、细胞存活、细胞分泌、生长/营养因子分泌、轴突再生刺激活性和/或代谢支持活性。
本发明的细胞优选赋予人运动神经元上存在的体外神经元再生功能和/或体内神经元再生功能。
本发明的细胞还可以通过获得它的方法来表征。这是可能的，因为根据本发明的细胞具有与根据先前描述的方法(参见实施例)获得的细胞不同的性质，因此，用于获得根据本发明的细胞的方法使细胞具有独特的性质。
在一方面，本发明涉及细胞的群体(细胞群)。该细胞群包含至少一种根据本发明第二方面的细胞。
该细胞群包含至少一种表达CXCR4、CYTIP、SLC2A3和/或MT2A的细胞。这通常可以通过显示细胞群样品对于所述一个或多个基因的表达呈阳性来证实。换言之，细胞群的特征在于上述一个或多个基因和/或蛋白质的表达。在一个实施方式中，细胞群中的大多数细胞表达上述一个或多个基因和/或蛋白质。优选地，细胞群中包含的至少80％(按细胞数量计)，优选至少90％(按细胞数量计)，更优选至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％(各自按细胞数计)的细胞表达上述一个或多个基因和/或蛋白质。
优选地，细胞群的进一步特征在于所有细胞的物理特征基本一致。“基本一致”是指至少90％的细胞，例如至少91％的细胞，例如至少92％的细胞，例如至少93％的细胞，例如至少94％的细胞，例如至少95％的细胞，例如至少96％的细胞，例如至少97％的细胞，例如至少98％的细胞，优选至少91％的细胞，符合一种或多种所需的物理特征。
优选地，巨噬细胞是自体的。
该药物组合物含有上述转化的细胞作为活性成分。其还含有药学上可接受的赋形剂。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备通常安全、无毒且理想的药物组合物的赋形剂，并且包括兽医用途以及人药学用途可接受的赋形剂。
这些赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下可以是气体。用于组织或细胞再生的组合物通常可以肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、实质内、腹膜内、鼻内或肌内给予。典型的给予途径是静脉内或实质内，但其他途径也同样有效。
对于静脉内给予，本发明的组合物将是液体形式。
因此，除了细胞之外，其还含有不影响本发明细胞的生物活性的药学上可接受的稀释剂。此类稀释剂的实例是磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他无毒、非治疗性、非免疫原性载剂、佐剂或稳定剂等。
在一个优选的实施方式中，本发明的组合物是液体形式。
本发明的药物组合物可以单独给予或与另一种药物组合物或另一种活性成分组合给予。
具体地，本发明的药物组合物可以含有组合在同一容器中的本发明的细胞组合物以及另一种活性成分。
如本文所用，术语“组合”并不意味着本发明的细胞和其他活性成分必须同时给予。
其还扩展到任何使用或呈现，包括在单独的容器中或以不同的时间间隔给予。
所述活性成分与本发明的药物组合物的“同时给予”是指与本发明的细胞在某段时间内给予，使得活性成分和本发明的组合物均将具有治疗效果。
这种同时给予可以包括与本发明的细胞的同时(即同期)、之前或之后给予活性成分。
本领域普通技术人员不难确定本发明的特定药物和组合物的适当给予时机、顺序和给予剂量。
本文提出将本发明的细胞组合物在有需要的对象体内释放作为再生组织和细胞的简单且有效的方式。
通常，上述对象是人，但也可以治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物如狗、猫、马等，实验室哺乳动物如兔、小鼠、大鼠等。
因此，本文理解的“有需要的对象”是具有例如组织病变的哺乳动物，优选人。
本发明包括治疗方法，其中通过注射将本发明的细胞组合物给予有需要的所述对象。
本发明的方法还可包括在孵育之前从血液、骨髓或脐带、或从有需要的对象的重编程多能体细胞或从健康供体收集和分离单核吞噬细胞或其前体或干细胞，如上所述，以获得/分离吞噬细胞(优选单核细胞)群体。
任选地，该方法包括包装和/或储存由此获得的细胞，以及可能的给予患者。
本发明的治疗实体的有效剂量根据许多不同的因素而变化，包括给予方式、目标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。
可以对治疗剂量进行滴定，以优化安全性和疗效。
本发明的组合物和/或其制剂可以多种方式给予，包括但不限于脊柱内、脑内、硬膜外、鞘内、颅内、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮内、基质内、关节内、滑膜内、病灶内、动脉内、心内、肌肉内、鼻内、皮肤或皮下、眶内、囊内、主体的、眼科或眼部，通过手术植入物、内部手术涂料、输液泵或通过导管。
本发明的组合物可以配制用于以本领域已知的多种方式给予动物，优选哺乳动物，包括人。制剂的实例可包括任何固体组合物(片剂、丸剂、胶囊、袋剂、小瓶、粉剂、颗粒剂、棒剂、笔剂、蒸发器、气雾剂等)、半固体(软膏剂、霜剂、调理剂、凝胶、水凝胶、泡沫、乳液(lotion)、肥皂、明胶等)或液体(水或非水溶液、水醇或水乙醇酸(hydroglycolic)溶液、悬浮液、乳液、糖浆、无水组合物、水分散体、油、乳、调理剂、搽剂、浆液(serum)等)用于局部或肠胃外给予，优选组织内给予。本发明的组合物还可以是持续释放制剂或任何其他常规释放系统的形式。术语“持续释放”以常规意义使用，涉及细胞递送化合物或系统，其允许所述细胞在一段时间内逐渐释放，并且优选地，尽管不是必需的，在一段时间内具有相对恒定的细胞释放。持续释放载剂或系统的说明性示例包括但不限于脂质体、混合脂质体、油质体、泡囊(niosome)、醇质体、毫胶囊(millicapsule)、微胶囊、纳米胶囊、海绵、环糊精、泡罩、胶束、混合表面活性剂胶束、混合表面活性剂磷脂胶束、毫球、微球、纳米球、脂球、微乳液、纳米乳液、小粒、毫粒、微粒、纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、纳米结构脂质介质、聚合物材料、可生物降解或不可生物降解的贴片或植入物、或可生物降解的微粒(例如可生物降解的微粒)。
本文引用的各个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明、介绍等)，无论是上文还是下文，均通过引用其全文纳入本文。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”、“大约”和“基本上”都表示大约或接近，并且在本文中给出的数值或范围的上下文中优选指所叙述或要求的数值或范围的+/-10％，更优选+/-5％。关于细胞的特征的诸如“基本上没有”、“基本上不存在”等的术语是指根据现有技术在相应领域中通常使用的分析方法无法在细胞上检测到相应的特征，和/或如此描述的群体中的基本上所有细胞不具有相应的特征。
除非另有明确说明，本文中使用的"包含"一词，或变体例如"包含"或"包括"，表示除了由"包括"引入的列表中的成员外，还可选择地存在其他成员。然而，作为本发明的一个具体实施方式，术语“包括”涵盖没有其他成员存在的可能性，即为了本实施方式的目的，“包括”应理解为具有由“……组成”的含义。
现通过参考下图通过非限制性实施例阐述本发明。
图1.手术时动物的重量。
此图描绘了第0天第一次外科手术(脊柱损伤)时实验中考虑的动物的重量。
图2.严重脊柱损伤模型中THEM和M2巨噬细胞注射部位图。
遭受严重脊柱损伤的动物接受了多次THEM或M2细胞移植或盐水输注。黑色箭头指示进行注射的位置。在对照动物中定相同点盐水输注。虚线表示脊髓实质的背侧区域(进行注射的地方)和腹侧区域之间的分离。
图3.通过主成分分析对全局转录本变异性进行分析显示，THEM细胞中相对于非治疗活性M2细胞具有明显不同的转录组，与参与血管生成和胞外基质重塑的基因的较高水平表达相关
与之前的THEM细胞(黑点)和M2巨噬细胞(灰点)相关联的测序RNA的主成分分析(PCA)。分析显示，THEM(黑点)和M2巨噬细胞(灰点)簇彼此分开，突出显示了移植前细胞之间表型的差异。
图4.多次THEM移植后遭受严重脊柱损伤的动物的活动恢复得到改善。
该图描绘了BMS(Basso小鼠量表)的分数，该量表用于测量遭受骨髓病变的小鼠的可测量的活动能力；该量表经过验证，稳定可靠[14]。图中，接受多次THEM细胞移植的动物的BMS(深灰线，5个实验中n＝24)、接受多次M2细胞移植的动物的BMS(浅灰线，4个实验中n＝12)和接受无菌盐水输注的对照动物的BMS(黑线，7个实验中n＝26)。箭头指示进行移植的时间点。接受多次THEM移植的动物的BMS显示出活动表现逐渐改善(1.792±0.327)，显著高于接受多次M2移植的动物(0.375±0.109)和对照动物(0.712±0.157)。采用双向ANOVA检验和事后Sidak测试后统计分析方法分析实验条件之间的差异。数据以平均值±SEM的形式显示。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001,****p≤0.0001。
图5多次THEM移植后遭受严重脊柱损伤的动物的踝关节灵活性得到改善。
该图描绘了从15dpi直到实验结束接受多次THEM细胞移植的动物的踝关节灵活性评分(深灰线，7个实验中n＝24)、接受多次M2细胞移植的动物的踝关节灵活性评分(浅灰线，3个实验中n＝12)和接受无菌盐水输注的对照动物的踝关节灵活性评分(黑线，7个实验中n＝26)。31dpi时，接受多次THEM移植的动物的踝关节灵活性(0.799±0.037)显著高于接受多次M2移植的动物(0.659±0.049)和对照组(0.612±0.045)。采用双向ANOVA检验和事后Tukey测试后统计分析方法分析实验条件之间的差异。数据以平均值±SEM的形式显示。*p≤0.05,**p≤0.01。
图6.严重脊柱损伤后的多个THEM移植动物通过肌电图显示出更多的生理性肌肉激活持续时间值。
该图显示了对照动物(白色)、接受多次THEM移植的动物(黑色)和健康动物(灰色)中腓肠肌外侧肌的肌电图激活持续时间。在接受多次THEM移植的动物中，腓肠肌外侧肌的肌电图激活持续时间(0.338s±0.048s)在统计上比对照动物(0.593s±0.101s)更短，更接近于健康动物肌肉的生理状况(0.231s±0.038s)。采用单向ANOVA检验和Tukey事后检验统计分析方法分析实验条件之间的差异。数据以平均值±SEM的形式显示。*p≤0.05,**p≤0.01。
图7.移植后，THEM和M2细胞在脊髓实质中持续存在并沿径向和纵向扩散。
图表描绘了沿脊髓的实质中THEM分布的百分比。不同的分布区域(实质、囊肿、脑膜)用不同的颜色表示(图中的图例)。如图所示，THEM从移植部位纵向扩散到脊髓的不同区域，集中在囊肿区域中与脊柱创伤相对应的部分。(B)图表描绘了沿脊髓的实质中M2分布的百分比。如图所示，M2从移植部位纵向扩散到脊髓的不同区域，集中在囊肿区域中与脊柱创伤相对应的部分。(C)图表描绘了病变部位脊髓实质和囊肿中THEM和M2的分布百分比。实验THEM组(深灰色，实质46.46％±10.40％，囊肿53.54％±10.40％，n＝5)，实验M2组(浅灰色，实质46.90％±10.95％，囊肿53.10％±10.95％，n＝3)。(D)表示THEM沿脊髓径向和纵向分布的图像。通过非配对t检验分析所分析的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝3只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05。M2＝2表型巨噬细胞；THEM＝肿瘤缺氧驯化的巨噬细胞。
图8.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物病变的面积减少。
(A-D)在对照动物和接受多次THEM移植的动物中，用GFAP星形胶质细胞(浅灰色)和TO-PRO3(深灰色)的特异性标志物对脊髓横截面进行免疫染色，其中描绘了考虑量化的面积。(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用GFAP星形胶质细胞(浅灰色)和TO-PRO3(深灰色)的特异性标志物对脊髓横截面进行免疫染色。(C-D)在对照动物和接受多次THEM移植的动物(D)中，用GFAP星形胶质细胞(浅灰色)和TO-PRO3(深灰色)的特异性标志物对脊髓横截面进行免疫染色。深灰色面积表示胶质瘢痕的面积。虚线面积表示囊肿面积。这两个区域共同表示病变的总面积。(E)图表描绘了对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中囊肿面积(浅灰色面积)与总胶质瘢痕面积的百分比。相对于对照动物(33.24％±0.87％,n＝3)，多次THEM移植使得治疗动物的囊肿面积显著减少(21.38％±2.05％,n＝3)。(F)图表描绘了对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中胶质瘢痕面积(虚线面积)与总截面面积的百分比。接受多次THEM移植的动物(6.79％±0.85％,n＝3)和对照动物(6.69％±0.53％,n＝3)之间胶质瘢痕面积占总截面面积的百分比没有差异。通过非配对t检验分析实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；每组分析8个截面/动物。**P<0.01.GFAP＝胶质纤维酸性蛋白。
图9.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物囊肿面积减少。
图表描绘了对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中囊肿面积(浅灰色面积)与总截面面积的百分比。相对于对照动物(4.73％±0.15％,n＝3)，多次THEM移植使得治疗动物的囊肿面积显著减少(2.03％±0.30％,n＝3)。通过非配对t检验分析所分析的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；每组分析8个截面/动物。**P<0.01。
图10.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物神经元总数增加。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用神经元细胞特异性标志物NeuN(浅灰色)和DAPI(深灰色)对脊髓横截面进行免疫染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(C)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的髓质实质(medullary parenchyma)中存在的NeuN+细胞的百分比数量。神经元细胞(NeuN+)的百分比以总细胞核数量进行标准化。如图所示，接受多次THEM移植的动物中总神经元的百分比(13.13％±0.632％,n＝5)显著高于对照动物(6.81％±0.726％,n＝4)。通过非配对t检验分析所分析的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝5只动物，每组分析8个截面/动物。***P<0.001。
图11.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物胆碱能神经元数量增加。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用神经元细胞特异性标志物ChAT(浅灰色)和DAPI(深灰色)对脊髓横截面进行免疫染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(C)图表描绘了对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的髓质实质中存在的ChAT+细胞的百分比数量。胆碱能神经元(ChAT+)的百分比以总细胞核数量进行标准化。如图所示，接受多次THEM移植的动物中胆碱能神经元的百分比(0.412％±0.011％,n＝4)显著高于对照动物(0.245％±0.038％,n＝4)。通过非配对t检验分析所考虑的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；每组分析8个截面/动物。**P<0.01。ChAT＝胆碱乙酰转移酶。
图12.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物的神经丝含量增加。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，从脊髓纵向截面中获得的病灶周围区域的放大图，使用针对NF200(浅灰色)和DAPI(深灰色)神经丝蛋白特异性标志物进行免疫染色。(C)图表描绘了表达NF200标志物的面积(NF200+面积)与对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中考虑分析的总面积之间的百分比。髓磷脂(myelin)的百分比计算为：ROI中存在的NF200阳性像素相比于所考虑的ROI的总像素。如图所示，相对于对照动物(9.723％±0.133％；n＝3)，接受多次THEM移植的动物中NF200的百分比显著更高(16.36％±2.09％,n＝3)。通过非配对t检验分析所研究的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；每组分析8个截面/动物。*P<0.05.NF200＝神经丝-200，ROI＝感兴趣的区域。
图13.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物的髓磷脂增加。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用劳克坚牢蓝(LuxolFast Blue)(LFB)对脊髓横截面染色。LFB可以检测脊髓实质中，特别是后束(posteriorcord)(ROI)的面积中包含的髓磷脂(深灰色面积)。(C)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的ROI中存在髓磷脂的百分比。髓磷脂的百分比计算为:ROI中存在的髓磷脂阳性像素相比于所考虑的ROI的总像素。如图所示，接受多次THEM移植的动物中脊髓后束中所含髓磷脂的百分比(26.470％±1.075％,n＝5)显著高于对照动物(19.870％±1.999％,n＝3)。通过非配对t检验分析所分析的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝5只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05.ROI＝感兴趣的区域。
图14.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物显示出免疫细胞的密集招募。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用属于小胶质细胞和巨噬细胞群的细胞的特异性标志物Iba1+(浅灰色)和DAPI(深灰色)对脊髓横截面进行免疫染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(C)接受多次THEM移植的动物(黑色)与对照动物(白色)的骨髓实质中存在Iba1+细胞的百分比。接受多次THEM移植的动物中，活化小胶质细胞(Iba1+)的百分比(以总细胞核数量标准化)(5.820％±0.411％,n＝5)显著高于对照动物(3.847％±0.597％,n＝3)。通过非配对t检验分析所研究的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝5只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05。
图15.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物显示出免疫细胞的密集招募。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用属于巨噬细胞群的细胞的特异性标志物CD68(浅灰色)和DAPI(深灰色)对脊髓横截面进行免疫染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(C-D)在对照动物(C)和接受多次THEM移植的动物(D)中，用属于巨噬细胞群的细胞的特异性标志物CD206(浅灰色)和DAPI(深灰色)促再生表型(M2)对脊髓横截面进行免疫染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(E)接受多次THEM移植的动物(黑色)与对照动物(白色)的骨髓实质中CD68+细胞的百分比。对照动物中巨噬细胞(CD68+)的百分比(以总细胞核数量标准化)(6.143％±0.554％,n＝3)高于接受多次THEM移植的动物(5.484％±0.367％,n＝5)。(F)接受多次THEM移植的动物(黑色)与对照动物(白色)的骨髓实质中CD206+细胞的百分比。对照动物中2型巨噬细胞(CD206+)的百分比(以总细胞核数量标准化)(2.320％±0.080％,n＝3)显著高于接受多次THEM移植的动物(5.655％±0.497％,n＝4)。通过非配对t检验分析实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝5只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05,**P<0.01。
图16.严重脊柱损伤后，接受多次THEM移植的动物显示胞外基质沉积减少。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，用胞外基质特异性标志物集聚蛋白(Agrina)(浅灰色)和DAPI(深灰色)对脊髓横截面进行免疫染色。橙色虚线界定了考虑量化的感兴趣的面积(总囊肿面积)。(C)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的囊肿中存在集聚蛋白的百分比，以总横截面积(白色虚线)标准化。如图所示，接受多次THEM移植的动物中，所考虑的区域中包含的集聚蛋白的百分比(3.500％±1.112％,n＝3)显著低于对照动物(12.570％±2.140％,n＝3)。(D)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的囊肿中存在纤连蛋白的百分比，以总横截面积(白色虚线)标准化。如图所示，与对照动物(9.625％±3.375％,n＝3)相比，接受多次THEM移植的动物中所考虑的区域中包含的纤连蛋白的百分比(5.190％±2.019％,n＝3)呈现减少趋势。胞外基质的各种成分的百分比被计算为囊肿中存在的胞外基质的特定成分(集聚蛋白、纤连蛋白)相对于所考虑的ROI的总像素的阳性像素。通过非配对t检验分析实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝3只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05。
图17.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物显示出缺氧面积减少。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中，脊髓横截面用游离硫醇检测进行染色。虚线界定了考虑量化的面积(总横截面积)。(C)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的骨髓实质缺氧面积的百分比。缺氧面积百分比计算为总截面中存在的每个缺氧面积的阳性像素相比于总截面的总像素。如图所示，接受多次THEM移植的动物的缺氧面积百分比(3.173％±0.528％,n＝3)显著低于对照动物(5.866％±0.745％,n＝3)。通过非配对t检验分析实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；每组分析8个截面/动物。*P<0.05。
图18.严重脊柱损伤后，与对照动物相比，接受多次THEM移植的动物血管分支数量增加，最大长度更大。
(A-B)在对照动物(A)和接受多次THEM移植的动物(B)中使用CD31内皮细胞(灰色)的特异性标志物对脊髓横截面获得的代表性感兴趣区域(ROI)进行免疫染色。(C)在所考虑的面积(ROI)中，对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的平均血管数量/视野。如图所示，相对于接受多次THEM移植的动物(30.940±3.592,n＝3)，对照动物的平均血管数量/视野的更高(37.070±0.379,n＝3)。(D)在所考虑的面积(ROI)中，对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)的平均分支数/血管。如图所示，相对于对照动物(1.793±0.073,n＝3)，接受多次THEM移植的动物的平均血管数量/视野更高(2.110±0.165,n＝3)。(E)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中所考虑的面积(ROI)中血管的最大平均长度。如图所示，接受多次THEM移植的动物的平均分支数/血管和血管最大平均长度/视野(55.410μm±2.500μm)显著大于对照动物(43.450μm±0.751μm)。(F)对照动物(白色)和接受多次THEM移植的动物(黑色)中所考虑的面积(ROI)中血管弯曲度的平均值。弯曲度值显示所考虑的实验组之间没有差异(接受多次THEM移植的动物为1.168±0.005，对照为1.153±0.015)。通过非配对t检验分析实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝5只动物，每组分析8个截面/动物。*P<0.05.ROI＝感兴趣的区域。
图19.将小鼠THEM添加到人iPSC培养物中促进运动神经元分化。
A-B)在对照培养物(A)、与THEM共培养物(B)和与M2共培养物(C)中，使用神经元βIII微管蛋白(Tub3；浅灰色)和DAPI(深灰色)特异性标志物对分化为运动神经元的人IPSC的免疫染色。(D)在对照样品(白色)、与THEM共培养物(黑色)和与M2巨噬细胞共培养物(灰色)中，Tub3的表达面积以考虑分析的总面积值标准化。如图所示，与对照和与M2共培养物相比，与THEM共培养物中Tub3表达的面积显著更大。(6.423％±0.494％对照，与THEM共培养物9.097％±0.253％，与M2共培养物7.235％±0.492％)。通过非配对t检验分析所研究的实验条件之间的差异。数据表示为平均值±SEM；n＝3个供者，分析40个视野/供者，4个图像/视野。*P<0.05,**P<0.01。
图20：全转录组谱的PCA显示THEM具有需要肿瘤调节和缺氧的独特的分子特征。未分化的M0巨噬细胞(三角形)、M2极化巨噬细胞(圆形)、无缺氧培养的TCM(十字)和THEM(方形)的转录组的主成分分析。PCA分析表明THEM簇与其他组良好地分离，突出了THEM独特的分子特征，并证明了需要缺氧来生成THEM。
图21：与无缺氧培养的TCM，M0和M2巨噬细胞相比，THEM中基因本体论最富集的热图。
图22：THEM对比M0、M2和TCM(无缺氧培养)的差异基因表达。
A)火山(Vulcano)图显示，与M0(左图)、M2(中图)和无缺氧培养的TCM(右图)相比，THEM表达的基因的Log2倍数变化；B)与M2和M0相比，THEM中基因表达水平上调和高表达的图；C)与M2和M0相比，THEM中基因表达水平下调，低或不表达的图。
图23：使用SDF-1作为化学引诱剂对THEM、TCM和M2巨噬细胞进行迁移测定。
跨孔迁移测定在24孔趋化室(8μm孔径)中进行，下室中使用SDF-1a(100ng/ml)作为化学引诱剂。条形表示与迁移细胞数量的对照相比变化的倍数。
图24：鼠THEM对人运动神经元的神经元再生功能。(A)分化为运动神经元的人iPSC的免疫染色，用特异性神经元标志物βIII微管蛋白(Tub3，绿色)和DAPI(蓝色)染色，在无共培养(CRTL)，与鼠THEM共培养(THEM)，在无缺氧的情况下与TCM共培养和与M2共培养(M2)。(B)在iPSC衍生运动神经元中(无共培养、与THEM共培养、TCM无缺氧共培养和M2共培养)，以考虑用于分析的总面积标准化的表示Tub3表达面积的图。THEM共培养物中的Tub3表达面积结果统计上高于所有其他组，表明THEM诱导更高的神经元分化和神经元突(neuronalprocess)延伸。重要的是，与无缺氧共培养的TCM相比，使用THEM共培养观察到的Tub3表达更高，表明缺氧处理对于定义THEM的有效再生表型至关重要。
图25：人THEM对人运动神经元的神经元再生功能。
(A)在体外，对照、人THEM共培养物、人TCM共培养物、人M0共培养物和人M2共培养物中，表示Tub3表达面积的图，其以分析所考虑的总面积标准化。如图所示，人THEM共培养物中的Tub3表达面积结果显著高于对照细胞、M0共培养物、M2巨噬细胞共培养物和人TCM共培养物中的表达面积，表明更高的神经元分化和神经元突延伸。此外，Tub3在THEM共培养物中的表达高于在TCM共培养物中的表达，表明缺氧处理对于确定THEM的恰当有效表型至关重要。
图26：THEM和TCM体内神经元再生功能对脊髓损伤小鼠运动恢复的影响。
表示THEM；TCM和载剂(无细胞)移植的动物的BMS评分的图。黑色箭头指示进行移植的时间点。THEM的移植动物的活动表现逐渐改善，评分(2.188±0.195)显著高于载剂评分(0.711±0.068)和TCM评分(0.300±0.200)。通过双向ANOVA检验和事后Sidak检验分析实验组之间的统计差异。数据显示为平均值±SEM。*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001,****p≤0.0001。
表1.基因表达。表格包含通过信使RNA测序(RNAseq)获得的小鼠THEM对比小鼠M2巨噬细胞中上调基因的列表。
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表2.分泌蛋白组。表格包含与分泌组特异性转录物(分泌蛋白质)相比，通过信使RNA测序(RNAseq)获得的小鼠THEM对比小鼠M2巨噬细胞中上调基因的列表。
表3.THEM鉴定基因表达。表格包含通过信使RNA测序(RNAseq)获得的人THEM对比人TCM、M2、M0中单一上调的基因的列表。
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表4.THEM鉴定基因表达。表格包含通过信使RNA测序(RNAseq)获得的人THEM对比人TCM、M2、M0中单一下调的基因的列表。
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表5.THEM鉴定抗原表达。包含THEM表达的表面抗原列表的表格
表面抗原
基因 蛋白质
PTPRC CD45
CD68 CD68
ITGAM CD11b
CD163 CD163
CD206 CD206
CD80 CD80
CD86 CD86
CD184 CXCR4
CD192 CCR2
CD36 CD36
SLC2A1 GLUT1
SLC2A3 GLUT3
表6.人THEM上调与伤口愈合、血管生成、解毒和防御反应调控、对缺氧的反应、胞外基质重塑神经元存活和髓鞘形成相关的基因的基因本体论术语。
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材料和方法
获得小鼠THEM、M2和TCM巨噬细胞的方案
为了获得THEM(肿瘤和缺氧驯化的巨噬细胞)，将从dT-Tomato雄性小鼠骨髓中分离的新鲜单核细胞培养在补充有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞培养基(IMDM)中，在常氧条件下37℃、5％CO2粘附培养6天。然后用由50％肿瘤上清液(从实体纤维肉瘤和神经胶质瘤外植体的培养物中获得，从中选择富含肿瘤的上清液)和50％ IMDM组成的培养基进行培养基改良，并且将培养物维持在缺氧条件下(1％ O2)持续最后18小时。
为了获得TCM(肿瘤调节的巨噬细胞)，将从dT-Tomato雄性小鼠骨髓中分离的新鲜单核细胞培养在补充有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞培养基(IMDM)中，在常氧条件下37℃、5％CO2粘附培养6天。然后用由50％肿瘤上清液(从实体纤维肉瘤和神经胶质瘤外植体的培养物中获得，从中选择富含肿瘤的上清液)和50％ IMDM组成的培养基进行培养基改良，并且在实验之前将培养物维持在常氧条件下持续最后18小时。
为了获得M2巨噬细胞，将从dT-Tomato雄性小鼠骨髓中分离的新鲜单核细胞培养在补充有10％热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的细胞培养基(IMDM)中，在常氧条件下37℃、5％CO2粘附培养1周。然后在实验前的最后18小时，将它们在37℃、5％ CO2、常氧条件(21％ O2)下用添加有20ng/mLIL-4的IMDM培养基孵育。
获得人THEM、TCM、M2和M0巨噬细胞的方案
为了获得THEM，将血液来源的CD14+单核细胞用70％培养基(RPMI+10％FBS+100ng/ml M-CSF)和30％肿瘤调节培养基在常氧条件下体外培养6天，然后缺氧18-24小时。肿瘤调节培养基获自肿瘤系的上清液或解离并铺板的体外肿瘤的切除物的上清液，持续约12-72小时。
为了获得TCM(肿瘤调节巨噬细胞)，将血液来源的CD14+单核细胞用70％培养基(RPMI+10％FBS+100ng/ml M-CSF)和30％肿瘤调节培养基在常氧条件下体外培养7天。
为了获得M0未极化的巨噬细胞，将血液来源的CD14+单核细胞用100％培养基(RPMI+10％FBS+100ng/ml M-CSF)在常氧下体外培养7天。
为了获得M2巨噬细胞，生成M0巨噬细胞，然后在最后18小时内添加IL4(20ng/ml)进行极化。
转录组分析
根据制造商的方案，使用RNeasy Plus Micro试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，货号74034)从小鼠或人巨噬细胞中提取总RNA，并使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))评估RNA完整性。使用“TruSeq Stranded mRNA文库制备试剂盒”(亿明达公司(Illumina)，美国圣地亚哥)从100ng高质量总RNA开始进行RNAseq文库制备。简言之，通过多聚A捕获从总RNA中纯化mRNA部分，片段化并进行cDNA合成。将条形码化的DNA衔接子连接到双链cDNA的两端并进行PCR扩增。使用片段分析仪(安捷伦科技公司)对文库产物进行评估，然后在Illumina NextSeq500测序仪上使用75bp单端读数进行测序，每个样品生成约1700万个读数。使用软件Scythe(v0.991)和Sickle(v1.33)进行质量控制。然后通过针对小鼠转录组的参考序列(Gencode M23-GRCm38)运行计算机软件Salmon v.1.0.0对每个样品中的转录本表达水平进行定量。
使用R软件(https://www.r-project.org/)的文库DESeq2中实施的负二项分布模型对序列计数数据进行差异表达分析，使用Benjamini-Hochberg方法调整p值以进行多重比较。在每次比较中估计每个表达的转录本的转录表达倍数变化。然后，通过基于基因本体论的富集分析，将最相关的上调基因总结为生物过程和分子功能，如在R的文库dnet中实施的那样。
严重挫伤性脊髓损伤的动物模型
从查尔斯河实验室(Charles River)购买的雄性成年(7周龄)C57BL/6J小鼠接受椎板切除术(laminectomy)，然后在胸椎11(T11)水平进行严重挫伤性脊髓损伤，如前所述(15,16)。简言之，用2％异氟烷麻醉7周龄的C57BL/6雄性小鼠，并在T11水平进行椎板切除术。使用MASCIS冲击器将5-gr的杆从6,25毫米的高度落下，并保持压缩11秒。损伤后前7天(dpi)每天皮下注射拜有利(Baytril)(25mg/ml)和瑞莫迪(Rimadyl)(50mg/ml)。在整个实验期间每天进行动物护理，包括每天一次称重动物体重和每天两次排空膀胱直到5dpi，然后每天一次直到实验结束。在进行手术之前，对所有动物进行称重，并且仅考虑体重在17至31g之间的小鼠进行实验并进行手术。手术时动物的体重如图1所示。由于手术的严重性或恢复期间的并发症，手术病变和细胞移植导致142只动物中的26只死亡。
严重脊柱损伤模型中THEM、M2和TCM巨噬细胞移植方案
移植当天，使用Acutase从平板中取出培养物中的THEM、TCM和M2巨噬细胞，离心除去上清液并以0.5*106个细胞/μl的浓度重悬于盐水中。对于每个移植部分，属于THEM、TCM、M2或载剂组的每只实验动物在4个不同的点接受4次注射(1μl/注射)，在位于以病变为中心的脊髓截面中(图2)在背柱中彼此间隔2mm(注射深度：0.5mm))。使用连接显微注射器和立体定位装置的玻璃毛细管以0.5μl/分钟的速率进行细胞移植。每次注射后，玻璃毛细管保持原位5分钟，以尽可能减少细胞悬浮液的回流。5分钟后，缝合背侧伤口并消毒，并皮下注射1mL盐水。在所有程序结束时，将动物放在加热垫上并进行监测直至完全苏醒。
研究设计1评估THEM效力
一旦经受严重挫伤性脊柱损伤，将动物分为3个实验组：第一组接受多次THEM移植，第二组接受多次M2巨噬细胞移植，最后第三组接受无菌盐水注射。在将动物细分为三个实验组之前，在第一次移植当天(挫伤性脊柱损伤后3天，3dpi)，评估动物的活动表现，并且仅将严重脊柱损伤导致Basso小鼠量表分析(BMS)为0到0.5之间的值的动物用于实验计划的下一阶段。进行3或4次移植/盐水注射(3次移植的时间点：3dpi、10dpi、17dpi；4次移植的时间点：3dpi、10dpi、17dpi和24dpi)。实验在脊柱损伤后31天(31dpi)结束。试验结束时，评估所考虑的实验组的功能恢复值和组织学特征。
研究设计2评估THEM效力，与TCM相比
一旦经受严重挫伤性脊柱损伤，将动物分为3个实验组：第一组接受多次THEM移植，第二组接受多次TCM巨噬细胞移植，最后第三组接受无菌盐水注射。在将动物细分为三个实验组之前，在第一次移植当天(挫伤性脊柱损伤后3天，3dpi)，评估动物的活动表现，并且仅将严重脊柱损伤导致Basso小鼠量表分析(BMS)为0到0.5之间的值的动物用于实验计划的下一阶段。进行3次巨噬细胞或盐水注射(3次移植的时间点：3dpi、10dpi、17dpi)。实验在脊柱损伤后31天(31dpi)结束。试验结束时，评估所考虑的实验组的功能恢复值。
活动评估
在开放场中的活动评估
使用Basso小鼠量表(BMS)，在1、3、4、5、7、10、11、14、17、18、21、24、28和31dpi时评估移植THEM的、移植M2的和载剂的小鼠的活动功能(14)。Basso小鼠量表包括从“0”到“9”的10个阶段，其中“0”对应“无移动”，“9”对应活动功能正常。
踝关节灵活性分析
如前所述，从14DPI开始进行踝关节灵活性分析，以评估踝背屈肌(dorsiflexor)和跖屈肌(plantarflexor)所涉及的肌肉的痉挛状态(16,17)。分配以下分数：“0”表示缺乏移动(痉挛状态，对应于胫骨前肌和爪之间的180°角度)，“0.25”表示135°角度，“0.5”表示90°角度，“0.75”表示45°角度，“1”表示0°角度对应的正常移动。
肌电图
在胫骨前肌(TA)和腓肠肌外侧肌(LG)肌肉中进行自发肌肉活动的体内肌电图(EMG)记录。发明人总共记录了17只小鼠的32块TA肌肉和16只小鼠的29块LA肌肉。在每只动物中，不同肌肉的记录是按顺序进行的(即不同时)。在麻醉(异氟烷2％)的动物中，发明人通过短皮肤切口在每块肌肉中插入两根涂漆绝缘的125μm厚的不锈钢丝，裸露尖端平行于肌肉的纵轴并连接到放大器(CyberAmp 320，轴突仪器公司(Axon Instruments)，加利福尼亚州福斯特城)。作为参比电极，发明人将一根剪短的20G不锈钢针插入动物背部的皮下并将其接地。为了最大限度地提高EMG的选择性，发明人进行了差异记录，并且相邻的肌肉要么被去神经，要么其纤维被横向切割。EMG信号放大5000倍，经过100-1200Hz带通滤波，用嘈杂声拾取抑制器(Hum-Bug,Quest Scientific，加拿大温哥华)进一步改善，以10KHz数字化并使用信号软件(6.0.2,剑桥电子设计公司(Cambridge Electronic Design)，英国剑桥)获取。为了减少运动伪影，将动物置于腹侧卧位，并在身体、四肢和尾巴上缠上带。麻醉完全恢复后10分钟开始记录，每块肌肉持续3分钟，在此期间，每10-15秒刺激动物触摸其胡须、前肢和后肢。然后将动物重新麻醉，以便在T10(即颅骨至SCI水平)处切断双侧坐骨神经或脊髓。从麻醉中完全恢复10分钟后开始第二部分EMG记录，每块肌肉持续1分钟。实验结束时，对动物进行灌注。EMG分析(Signal和Spike2，5.0.9，剑桥电子设计公司)由以下组成：i)通过测量均方根(RMS)值来量化收缩期间电信号的功率，以及ii)量化收缩期间电信号的持续时间。为了测量RMS，每个EMG迹线被分为40ms长的部分，并以10ms的时间常数计算每个部分的RMS。在坐骨神经或脊髓切面后，发明人将那些高于截止水平的值视为与肌肉活动相关的RMS，该截止水平在每块肌肉中确定为平均值+1.9标准差RMS值。最后，发明人通过对所有测量值中10个最大的RMS进行平均化，提取了与强肌肉活动时期相对应的RMS值，而无关它们沿迹线的位置如何。
组织化学和免疫荧光分析
脊髓固定和处理
动物心内灌注4％多聚甲醛(PFA)和4％蔗糖。提取脊髓，在4％PFA、4％蔗糖中浸泡过夜，并在4℃下储存在30％蔗糖中。为了进行组织化学分析，将1.5cm的切下的脊髓(距病变部位的喙侧0.75cm和尾侧0.75cm)进行冷冻切片(25μm厚的横向切片或20μm厚的纵向切片)，并在-20℃下保存直到分析。
劳克坚牢蓝染色
如所述(16,18)，通过劳克坚牢蓝(LFB)染色(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，目录号L0294)对脊髓切片中的髓磷脂含量进行定量。简言之，将LFB(西格玛奥德里奇)溶解在95％乙醇(EtOH，Carlo Erba)和1.22％冰醋酸(Carlo Erba)中制备0.1％ LFB溶液。将切片在EtOH溶液(100、95、70和50％)中水合，然后用0.1％ LFB溶液在40℃下染色40分钟。然后用自来水冲洗切片并在0.05％ Li2CO3溶液(西格玛奥德里奇)中分化。切片在EtOH溶液(50％、70％、95％和100％)中脱水，在二甲苯(Carlo Erba)中透明，并用Entellan(默克密理博公司(Merck-Millipore))封片，用于髓磷脂含量的光学显微镜分析(Zeiss Axioscop2)。
硫醇染色
首先用PBS1X添加1.85％碘乙酸盐和1.25％N-乙基马来酰亚胺构成的溶液经心灌注，然后用含有4％PFA、1.85％碘乙酸盐和1.25％N-乙基马来酰亚胺的溶液经心灌注。提取脊髓并留在4％ PFA中过夜。冷冻切片后，将样品在PBS1X中洗涤10分钟，并在4mM TCEP(三(2羧基乙基)膦盐酸盐)的PBS1X溶液中孵育1小时。然后将样品在0.1％ CPM(7-二乙氨基-3-(4’-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素)的PBS1X溶液中孵育30分钟。在PBS1X中清洗后，用DABCO封固样品。染色后，用荧光显微镜获取切片，缺氧区域为荧光蓝色斑点。然后使用ImageJ软件[美国国立卫生研究院]通过阈值对面积进行量化。
组织免疫荧光
如前所述进行免疫荧光分析(16,19)。简言之，用0.25％/0.5％ Triton X-100、2％ BSA透化冷冻切片，并与封闭溶液中的一抗在4℃下孵育过夜。在封闭液中冲洗6次5分钟后，应用适当的二抗在室温下4小时。进行最终洗涤步骤，在封闭溶液中，然后在PBS1X中，之后使用TOPROTM-3(1:3000，英杰公司赛默飞世尔科技公司(Invitrogen Thermo FisherScientific))或4'.6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1:2000，赛默飞世尔科技公司，目录号D-1306)进行核染色，并使用1.4-二氮杂双环(2.2.2)辛烷(DABCO,西格玛奥德里奇,目录号D-2522)封片。使用40倍油物镜(Carl Zeiss LSM710共焦显微镜，德国慕尼黑)和20倍物镜(Nikon)Ti Eclipse荧光显微镜)获取图像。以下一抗用于免疫荧光分析：TOMM20(小鼠，1:200，Abcam，目录号AB56783)，神经丝-200(兔，1:200，西格玛，目录号N4142)，NeuN(小鼠，1:200，密理博，目录号MAB377)，抗-胆碱乙酰转移酶抗体ChAT(山羊，1:200，密理博，目录号AB144P)，离子钙结合衔接分子1IBA1(兔，1:200，WAKO，目录号019-19741)，分化簇206CD206(山羊，1:400，R&D系统，目录号AF2535,)，集聚蛋白(小鼠，1:200，Stressgen，目录号AGR-520)，胶原-I抗体(兔，1.200，Abcam，目录号AB34710)，胶原-III抗体(小鼠，1.200GeneTex，目录号GTX26310)，CD31(血小板内皮细胞粘附分子，PECAM-1)抗体(大鼠，1:200，BD生物科技公司(BD Biosciences)，目录号557355)，纤连蛋白(兔，1:200，Dako，目录号A0245)，CD68(大鼠，1:200，赛默飞世尔科技公司，目录号14-0681-82)，GFAP(山羊，1:200，Abcam，目录号ab53554)。使用适当的二抗：驴抗-小鼠Alexa Fluor 488(1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A2120)，驴抗-兔Alexa Fluor 488(1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A21206)，驴抗-山羊Alexa Fluor 488(1:500，Jackson，目录号AB-2340428)，驴抗-大鼠Alexa Fluor488(1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A11006)，山羊抗-小鼠CY3(山羊，1:500，Amersham，目录号PA43002)，驴抗-兔Alexa Fluor 546(驴，1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A10040)，驴抗-山羊Alexa Fluor 546(驴，1:500，英杰公司赛默飞世尔科技公司，目录号A-11056)，驴抗-小鼠Alexa Fluor 647(1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A32787)，驴抗-兔Alexa Fluor 647(1:500，赛默飞世尔科技公司，目录号A32795)，TO-PROTM-3(1:3000，赛默飞世尔科技公司)或DAPI(1:2000，赛默飞世尔科技公司)。
图像分析和量化
使用NIH ImageJ软件[美国国立卫生研究院]进行量化分析，对脊髓的横向切片和纵向切片进行至少3-5次技术重复(载玻片)分析。对于以总细胞核数量标准化的分析，考虑了大约5115±87个细胞核。每次分析考虑三到五只小鼠。
形态计量学血管(CD31)分析
使用与FIJI 1.52p(美国国立卫生研究院)运行的定制设计插件分析脊髓横截面图像。在每个截面中，选择对应于背侧左角、背侧右角、腹侧右角和腹侧左角的四个感兴趣的区域(ROI)。调整图像的亮度和对比度，并将图像转换为二元图像。应用使用“MorphoLibJ”(Legland,Arganda-Carreras&Andrey,2016)的形态过滤器来封闭同一容器内的小间隙。然后对图像进行骨架化，并使用插件“分析骨架(2D/3D)”对骨架进行分析。为了进行分析，考虑了以下参数：分组血管的数量、平均分支数量、单组血管内分支的平均长度、平均最大分支长度(即ROI内每组血管的最长分支的长度)、每组血管的平均分支长度、欧几里德距离(血管长度与欧几里德距离之间的比率给出了血管弯曲度的度量)以及每个感兴趣的视野内的总分支数量。
移植的巨噬细胞分布分析
以囊肿为中心的0.5cm组织的一部分被考虑用于移植的THEM或M2分布分析。分析了接受3次多次移植(2x106个细胞)的损伤小鼠的脊髓实质。对接受多次移植的小鼠脊髓的四到九个横向切片(25μm)进行了分析，对五只动物进行了至少八次技术重复(载玻片)。用4'.6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，赛默飞世尔科技公司，1:2000)染色切片，以鉴定细胞核。使用FIJI ImageJ 1.52p(美国国立卫生研究院)手动计数α-tomato和DAPI双阳性细胞的数量。
人诱导多能干细胞(iPSC)来源的运动神经元与巨噬细胞共培养
iPSC是通过对三名健康供者的皮肤活检衍生的成纤维细胞进行重编程而获得的，并且事先获得了参与者的书面知情同意书，如前所述(15,16)。然后，如前所述，细胞分化为运动神经元(15)。将人或小鼠巨噬细胞与分化的iPSC共培养2天，然后用4％多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光分析。如前所述(15)，通过用抗β3-微管蛋白(小鼠，1:400，普洛麦格公司(Promega)，目录号G7121)、驴抗-小鼠Alexa Fluor 488(1:1000)抗体进行免疫荧光染色，使用20倍物镜获取图像(尼康(Nikon)Ti Eclipse荧光显微镜)。对于每个载玻片，采集了5个视野，并且对于每个视野，采集了20倍物镜的2x2大图像。
统计学分析
除非另有说明，n≥3个样品或重复用于统计分析。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Inc.，加利福尼亚州拉荷拉，版本7.0)执行双侧非配对斯氏t检验、普通单向或双向方差分析(ANOVA)，重复测量，然后进行Tukey事后检验。数据显示为平均值±SEM，统计学显著性设定为p＜0.05。
****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns不具有统计学显著性
结果
小鼠THEM和M2巨噬细胞显示出完全不同的分子特征
为了表征小鼠THEM巨噬细胞的分子特征，发明人分析了它们的整个转录组谱，并将其与M2巨噬细胞的转录组进行比较。每个实验组分析3个样品。主成分分析(PCA)显示THEM和M2巨噬细胞聚集在不同的组中，证实它们具有完全不同的表型(图3)。正如预期的那样，M2巨噬细胞表达高水平的CD206、CD163和Arg1基因。对分泌蛋白质组(secretome)和反应组学(recettome)转录物的转录组分析(见表1和表2)也表明THEM群体中最显著上调的基因与与血管生成(例如VEGF和VEGFc)和胞外基质重塑(Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19)相关的基因本体论的功能类别有关(图3)。总的来说，这些结果表明THEM具有不同于M2巨噬细胞的特定分子特性。
THEM改善了严重SCI小鼠模型的运动能力
THEM促进运动恢复
为了评估THEM体内再生潜力，将THEM、M2或载剂注射到严重SCI小鼠中，如材料和方法中所述(研究设计1)。BMS评估旨在评估THEM和M2移植对严重挫伤性脊髓损伤后活动功能恢复的影响。在受伤后的第一周内，在1、3、7dpi时评估每只动物的活动表现，然后每周两次(10、14、17、18、21、24、28、31dpi)，直到实验结束(31dpi.)。如图4所示，多次THEM移植的动物的BMS值(1.792±0.327)显著高于多次M2移植的动物(0.375±0.109)和注射载剂的动物(0.712±0.157)。统计分析显示，在14、17、18、21、24、28和31dpi时间点的BMS值中，接受多次THEM移植和载剂的动物之间存在显著差异。类似地，在接受多次THEM移植的动物和接受多次M2巨噬细胞移植的动物之间在时间点17、18、21、24、28和31dpi的BMS值中观察到显著差异。这些结果表明，与载剂相比，只有THEM能够有效显著改善严重SCI小鼠的运动恢复，而M2没有表现出任何效果。
THEM促进踝关节灵活性
多项研究表明，“痉挛”是脊髓损伤引起的最常见症状之一，这种现象是患有影响中枢神经系统疾病(例如脊髓损伤)的个体残疾的主要原因之一[4]。为了确定细胞移植是否能够预防痉挛状态的发生，评估了相对于踝关节的灵活性表现。从15dpi到实验结束(31dpi)，每天监测这一情况。
如图5所示，接受多次THEM移植动物的踝关节灵活性(0.799±0.037)显著优于接受多次M2移植动物(0.659±0.049)和对照动物(0.612±0.045)，表明脊柱损伤后肌肉痉挛恢复更快。统计分析显示，接受多次THEM移植和载剂的动物在15、21、22、26、27、28、29、30和31dpi时间点的踝关节灵活性值存在显著差异。此外，如图5所示，统计分析显示，在28dpi的时间点，接受多次THEM移植的动物和接受多次M2巨噬细胞移植的动物之间的踝关节灵活性值存在显著差异。
THEM恢复屈肌运动神经元的正常兴奋性
为了验证从之前的功能分析中获得的数据，在体内进行了相对于胫骨前肌和腓肠肌外侧肌的自发电位的肌电图(EMG)记录。肌肉收缩期间肌电信号的幅度和持续时间都被考虑在内。肌电图迹线的幅度与激活的运动神经元的数量成正比：移植动物和对照动物均显示肌电图幅度相对于健康动物降低了约50％。肌电图迹线的激活持续时间与脊髓损伤后增加的运动神经元的兴奋性成正比(特别是对照动物的肌电图迹线的激活持续时间增加2.5倍)。
脊柱损伤后运动神经元兴奋性增加是由于大规模和局部抑制回路功能丧失所致。在接受多次THEM移植的动物中，腓肠肌外侧肌的肌电图激活持续时间(0.338s±0.048s)在统计上比对照动物(0.593s±0.101s)更短，更接近于健康动物肌肉的生理状况(0.231s±0.038s)(图6A)。同样地，对于胫骨前肌，接受多次THEM移植的动物的肌电图激活持续时间(0.416s±0.058s)比对照动物(0.450s±0.077s)更短。相对于所有其他实验组，健康动物的肌电图胫骨前肌激活持续时间在统计上更短(0.161s±0.020s)(图6B)。这些数据表明，用THEM治疗可以恢复屈肌运动神经元的正常兴奋性，尽管它在重新神经支配方面没有效果。
THEM促进严重SCI小鼠脊髓组织的再生
发生在脊髓水平的创伤事件会导致机械损伤和随后的组织退化。这些事件包括：轴突细胞膜降解、血脑屏障变性、脱髓鞘、免疫细胞迁移和脊髓实质细胞死亡[2,5]。为了研究THEM移植如何促进脊髓组织再生，首先研究了31dpi时脊髓实质中细胞的分布以及与囊肿形成、胶质瘢痕、神经元数量(特别是胆碱能神经元(运动神经元))、髓磷脂含量、免疫反应的激活、胞外基质和组织血管化相关的组织学特征。
移植的THEM在脊髓组织中的分布
为了评估移植细胞的持久性、其活力和位置，分析了实验结束时(31dpi)移植细胞的分布。在严重脊髓损伤和多重移植后，对以脊柱损伤部位为中心的0.6cm长的脊柱区域(9个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面中THEM和M2的数量进行量化。在分析中，考虑了与核标志物4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)共定位的荧光红细胞(dT-Tomato；THEM或M2)的绝对数量。根据它们在脊柱组织中的不同位置(实质、囊肿区域、背侧/腹侧脑膜)对THEM的分布进行分析。如图7A-B所示，即使在移植后的几天内，THEM和M2巨噬细胞仍然存在于脊髓实质中，并且不仅在脊柱病变截面而且在邻近截面中也检测到它们的存在。因此，移植细胞(THEM和M2巨噬细胞)的扩散不仅相对于移植部位呈径向，而且在喙侧和尾侧方向上是纵向的。百分比值根据长度等于0.6cm的骨髓区域(9个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面中存在的总THEM或M2细胞进行标准化。在脊柱创伤对应的截面中，虽然它们集中在囊肿区域(53.54％±10.40％ THEM,n＝5；53.10％±10.95％ M2,n＝3)，但相当百分比广泛分布在周围的实质中(46.46％±10.40％ THEM,n＝5；46.90％±10.95％ M2,n＝3)(图7C)。百分比值相对于脊柱创伤截面中的总THEM或M2细胞进行标准化。图7D描绘了移植细胞相对于脊柱创伤部位的径向和纵向分布图。总体而言，这些数据表明移植细胞(THEM和M2巨噬细胞)能够在脊柱损伤后建立的恶劣环境中存活数天。
THEM减少囊肿和胶质瘢痕
脊柱损伤后，损伤部位形成的胶质瘢痕和囊肿构成了一种代偿机制，有助于限制创伤造成的继发性损伤[2]。然而，它们的存在阻碍了轴突再生，因为它们构成了物理和分子屏障[20]。考虑到脊柱损伤后神经胶质细胞反应在功能恢复中的重要性，使用星形胶质细胞特异性标志物胶质酸性纤维蛋白(GFAP)进行免疫荧光分析，以评估多次THEM移植对胶质瘢痕形成和星形胶质细胞反应激活的影响(图8A-D)。分析了以脊柱损伤部位为中心的长度为0.6cm的骨髓区域(9个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。与对照动物(33.24％±0.87％,n＝3)相比，接受多次THEM移植的动物(21.38％±2.05％,n＝3)中囊肿面积与胶质瘢痕总面积相比更小(图8E)。此外，相对于对照组(6.69％±0.53％,n＝3)，由星形胶质细胞产生的界定病变区域的胶质瘢痕在分析的实验组中具有相同的大小(THEM:6.79％±0.85％,n＝3)(图8F)。就总截面面积而言，接受多次THEM移植的动物的囊肿面积(2.03％±0.30％,n＝3)与对照动物(4.73％±0.15％,n＝3)相比显著更小(图9)。这些数据与接受多次THEM移植的动物损伤部位处的组织再生增加/退行性机制限制是一致的。
THEM增加神经元和髓磷脂的含量
由于原发性机械损伤导致脊髓组织退行，随后继发性损伤导致神经元细胞进一步丧失[5]。为了评估挫伤性脊柱损伤后多次THEM移植对神经元含量的影响，使用神经元特异性标志物NeuN进行免疫荧光分析(图10A-B)。分析了以脊柱损伤部位为中心的长度为1.5cm的狭窄区域(8个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。最初对NeuN+细胞的百分比进行量化。如图10C所示，相对于对照动物(6.81％±0.726％,n＝4)，接受多次THEM移植的动物具有更高的神经元百分比(13.13％±0.632％,n＝5)。脊髓实质中存在几个神经元群。具体地，运动神经元专门位于脊髓腹侧区域的IX层水平[21]。为了评估多重THEM移植对挫伤性脊髓损伤后运动神经元含量的影响，使用与胆碱乙酰转移酶表达相关的特异性胆碱能神经元标志物ChAT进行免疫荧光分析(图11)。分析了以脊柱损伤部位为中心的长度为1.5cm的狭窄区域(8个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。此外，就ChAT+细胞的百分比而言，接受多次THEM移植的动物相对于对照组(0.245％±0.038％,n＝4)具有更高的运动神经元百分比(0.412％±0.011％,n＝4)(图11C)。
在成熟神经元的轴突水平上表达最多的结构蛋白是神经丝(NF)。它们的表达与轴突生长和神经元内稳态的维持密切相关[22]。由于脊髓损伤，在灰质水平观察到神经元丧失，并伴有神经丝蛋白和髓磷脂的丧失[22]。为了评估多次THEM移植对轴突再生的影响，使用神经丝蛋白的特异性标志物NF200进行免疫荧光分析(图12A-B)。分析了表示以脊柱损伤部位为中心的3mm宽的骨髓区域(脊柱的5个纵向截面/动物骨髓)代表的脊髓纵向截面。相对于对照(9.723％±0.133％；n＝3)，接受多次THEM移植的动物具有显著更高的NF200含量(16.360％±2.090％,n＝3)(图12C)。
脊柱损伤引起的脱髓鞘现象会造成严重后果，导致神经组织功能丧失[5]。为了评估多次THEM移植对脊髓实质髓鞘再生的影响，用劳克坚牢蓝(LFB)(一种用于髓磷脂检测的特定染料)进行组织学分析(图13A-B)。分析了以脊柱损伤部位为中心的长度为0.6cm的狭窄区域(8个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。如图13C所示，相对于对照(19.870％±1.999％,n＝3)，接受多次THEM移植的动物具有显著更高的髓磷脂含量(26.470％±1.075％,n＝5)。
THEM增加内源性促再生免疫反应
导致脊柱损伤的级联事件决定了炎症反应在邻近脊柱机械损伤部位的组织中的传播，对髓质(medullary tissue)组织的再生产生消极和积极的影响[2,5,6]。特别地，考虑到巨噬细胞在先天免疫反应中的关键作用及其取决于其表型极化(M1-促炎性巨噬细胞；M2-促再生巨噬细胞)的不同功能，发明人评估了内源性巨噬细胞成分及其相对表型。用于评估属于小胶质细胞和单核细胞/巨噬细胞亚群谱系的细胞中含量的最常用标志物是分子离子钙结合接头分子1(Iba1)[23]，而特异性标志物CD68和CD206分别用于评估巨噬细胞及其M2表型。事实上，标志物CD68与巨噬细胞和其他单核吞噬细胞的高度糖基化1型跨膜糖蛋白的表达有关[24]，而标志物CD206与主要存在于M2巨噬细胞表面的甘露糖受体的表达有关[6]。
为了评估多次THEM移植对涉及严重脊柱病变病理生理学的炎症反应的影响，发明人随后使用标志物Iba1进行免疫荧光分析(图14A-B)。为了进一步研究巨噬细胞成分及其表型，发明人随后分别使用标志物CD68和CD206进行免疫荧光分析(图15A-D)。在分析中，考虑了以脊柱损伤部位为中心的0.6cm长的狭窄区域(8个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。图14C显示了在严重脊柱损伤后，接受多次THEM移植的动物的脊髓实质中存在的小胶质细胞的百分比相对于对照组如何增加(5.820％±0.411％,n＝5个接受THEM移植的动物，3.847％±0.597％,n＝3个对照)。此外，对巨噬细胞成分及其表型的深入分析表明，与接受多次THEM移植的动物相比，对照组中总巨噬细胞的百分比更高(5.484％±0.367％,n＝5个接受THEM移植的动物，6.143％±0.554％,n＝3个对照)(图15E)，但是M2成分显著更高(5.655％±0.497％,n＝4个接受THEM移植的动物，2.320％±0.080％,n＝3个对照)(图15F)。
这些结果表明THEM移植增加了SCI小鼠脊髓中促再生内源性M2巨噬细胞的百分比。
THEM诱导胞外基质重塑
细胞外环境的主要成分之一是胞外基质(ECM)。其特征在于分子的浓度通过促进或抑制神经元生长对神经元生长具有双重作用。脊柱创伤后，观察到受损区域中这些分子的溶解浓度增加，包括纤连蛋白、集聚蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖[2,5,20,25]。在抑制分子中，硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)超家族最具代表性，包含几类影响轴突发育和再生的分子，例如神经蛋白聚糖(Neurocan)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)[20,25]。尽管在生理情况下，其中一些分子不涉及任何抑制现象，但在创伤后，它们在囊肿和胶质瘢痕水平上的积累有助于形成阻止轴突再生的结构[25]。在受伤处激活了几个过程，以试图遏制这种现象。金属蛋白酶发挥着关键作用，这些分子以其在ECM重塑中的作用而闻名[26]。
为了评估严重脊柱损伤后多重THEM移植对ECM重塑的影响，发明人使用与ECM的主要成分(集聚蛋白和纤连蛋白)相关的特异性标志物进行了免疫荧光分析(图16A-B)。分析以脊柱损伤部位为中心的脊髓横截面和纵向截面(至少1个脊髓的纵向/横向切片/动物)。进行形态计量学分析以评估集聚蛋白和纤连蛋白的含量，评估与囊肿各面积相关的阳性面积的范围(像素数)。图16C-D显示了在严重脊柱损伤后，相对于对照，接受多次THEM移植的动物中囊肿水平存在的集聚蛋白和纤连蛋白分子的百分比如何降低(集聚蛋白：3.500％±1.112％，n＝3个接受THEM移植的动物，12.570％±2.140％对照动物，n＝3；纤连蛋白：5.190％±2.019％，n＝3个接受THEM移植的动物，对照动物9.625％±3.375％，n＝3)。
THEM减少缺氧并诱导血管生成
脊髓的特征在于血管系统特别复杂，因此主要血管的损伤或血流调节的改变可能导致组织灌注减少或暂时阻塞。创伤性脊柱损伤可导致组织灌注立即停止，从而产生长期后果，导致慢性缺氧并导致组织氧化还原状态的改变，这对于生理和细胞代谢的正常功能至关重要，从而导致神经退行性变[5,27]。考虑到从转录组分析实验获得的结果，特别是涉及血管发生的基因的显著THEM上调，发明人分析了接受THEM多次移植的动物和对照动物中的血管形态和脊髓实质中可能缺氧(低氧)的状态。
为了评估缺氧，基于使用N-乙胺(NEM)和碘乙酸(IAA)对硫醇进行烷基化来分析游离硫醇(图17A-B)。事实上，与蛋白质半胱氨酸结合的硫醇是对细胞氧化还原状态波动最敏感的基团。在生理状况下，细胞质的特征在于高度还原条件，能够使大多数蛋白质硫醇保持在还原状态。然而，过度氧化应激的条件可能导致决定蛋白质硫醇的不可逆氧化、谷胱甘肽耗竭和细胞死亡的分子物质的形成。为了分析缺氧面积，考虑了以脊柱损伤部位为中心的1.5cm长的狭窄区域(至少8个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。图17C显示了在严重脊柱损伤后，相对于载剂，接受多次THEM移植的动物的脊髓实质中缺氧面积的百分比如何减少。(3.173％±0.528％，n＝3；接受THEM移植的动物；5.866％±0.745％，n＝3对照)。
为了评估血管的形态，发明人使用内皮细胞特异性标志物CD31进行免疫荧光分析(Halder等人，2019)(图18A-B)。为了分析血管形态，考虑了以脊柱损伤部位为中心的0.5cm长的脊柱区域(至少4个脊髓/动物横截面)代表的脊髓横截面。然后，在所考虑的横截面上，选择5个感兴趣区域(ROI)，对其进行形态分析(血管的数量/视野、平均分支数量/血管、血管的最大长度；血管的弯曲度)。血管弯曲度值计算为血管的总平均长度与所有分支的欧几里德距离的总平均值的比率。如图18C所示，相对于接受多次THEM移植的动物(30.940±3.592,n＝3)，形态学分析表明对照动物的脊髓实质中的血管数量(37.070±0.379,n＝3)更多；然而，接受多次THEM移植的动物的血管具有更多的分支(接受多次THEM移植的动物为2.110±0.165，n＝3；对照为1.793±0.073，n＝3)(图18D)，并且最大长度显著更长(接受多次THEM移植的动物为55.410±2.500，n＝3，对照为43.450±0.751，n＝3)(图18E)。弯曲度值显示所考虑的两个实验组之间没有差异(接受多次THEM移植的动物为1.168±0.005，n＝3，对照为1.153±0.015，n＝3)，图18F。这些数据表明THEM通过增加血管长度和分支来恢复脉管系统。
小鼠THEM对人运动神经元的体外再生作用
所示的数据表明，体内多次THEM移植导致脊髓实质在各个方面(在神经元水平、胶质瘢痕、髓磷脂成分)产生促再生/保护作用，这表明移植细胞的作用是不限于单一特定细胞类型。考虑到所分析的治疗的转化潜力，并且为了评估体内观察到的THEM的效果是否也适用于人神经元细胞，发明人评估了THEM和M2巨噬细胞对人多能干细胞培养物分化成运动神经元的影响。在神经元分化的最后阶段，将THEM或M2添加到培养物中2天。分化阶段完成后，神经元特异性标志物βIII微管蛋白(Tub3)的表达面积被评估为树突数量及其延伸的指标(40个视野/供体，4个图像/视野，n＝3)(图19A-C)。如图19D所示，与M2巨噬细胞共培养物(7.235％±0.492％)和对照载剂培养物(6.423±0.494)相比，Tub3的表达面积在与THEM共培养物中显著更大(9.097％±0.253％)。这些结果表明，与M2巨噬细胞和对照载剂相比，THEM促进人运动神经元更大的神经元分化和更大的树突延伸。
人THEM显示出独特的分子标识
发明人进行了全转录组分析以定义THEM特异性分子特征并鉴定缺氧在THEM特征规范中的作用。他们比较了缺氧培养的THEM相比TCM、无缺氧的肿瘤调节培养的巨噬细胞、极化的M2巨噬细胞和未处理的未分化M0巨噬细胞的全基因表达。对每个样品的4个不同供体的转录组进行了分析。主成分分析(PCA)显示，THEM聚集在一个与无缺氧培养的TCM、M2和M0明显分开的组中(图20)。该结果表明i)THEM具有独特的分子特征，需要肿瘤调节和缺氧；ii)THEM的分子特征不同于无缺氧培养的TCM、M2和M0巨噬细胞。
不同巨噬细胞群的分子特征表明：
-THEM特征在于以下基因高表达：CYTIP、VEGFA、GLUT1、GLUT3、CXCR4、LFA-1、MMP9、MT2A、MT1G、ANGPTL4、NDRG1、HK2和VCAN(表3，表6)。THEM表达极低水平的/不表达：PLXNA2、HSPH1、CYCS、TIGAR(表4)、ALOX15、CCL8和CCL26；
-无缺氧培养的TCM高表达：TGFBI、DAB2、FUCA1、CYP1B1、MAFB、CCL2且低表达/不表达MT2A和MTFP1；
-M2巨噬细胞高水平表达：CD206、CD163、CD86、TREM2、IL1RN、IL10、STAT3、STAT6、fabp4、sphk1、HOMOX1、IRF4、PPAR-γ，CCL22。M2巨噬细胞极低水平表达/不表达CCR7、IL2RA和CXCL11。转录组分析证实了M2巨噬细胞的预期特征(11,12)；
-M0巨噬细胞高水平表达：NINJ1、F13A1、SCARB1和STAB1、AOAH、TLR7、A2M、FNBP1、CD209、SH3KBP1和ITSN1如前所述(13)。
缺氧培养的THEM中上调最多的基因与以下基因本体论相关：伤口愈合(Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)、血管生成(Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)、解毒和防御反应调节(Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)、缺氧反应(Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)、胞外基质重塑(Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)以及神经元存活和髓鞘形成(Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。(图21、表3及表6)。
与无缺氧培养的TCM(4012个基因)、M2巨噬细胞(6786个基因)和M0巨噬细胞(4097个基因)相比，缺氧培养的THEM统计上(p<0.05)差异表达大量基因，包括PLXNA2，HSPH1、CYCS、TIGAR的上调，以及PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR的下调。(图22)。
与TCM、M2、M0巨噬细胞相比，THEM独特标识的特征在于23个基因的特异性上调和24个基因的下调(表3和表4)。
人THEM趋化特性
发明人通过使用跨孔(transwell)试验评估了THEM、无缺氧培养的TCM和M2巨噬细胞对SDF-1(100ng/ml)的趋化特性。结果显示，与TCM和M2巨噬细胞相比，THEM对SDF-1的趋化反应具有统计学上显著更高的效果(见图23)。与其他巨噬细胞相比，这些数据与THEM中SDF-1受体CXCR4基因表达的上调一致。这些数据表明，缺氧处理(仅在THEM中)是增强对SDF-1的趋化反应所需要的。
需要缺氧诱导才能赋予人和小鼠THEM对人运动神经元的体外神经元再生功能
发明人评估了人和小鼠THEM对人运动神经元的神经元再生功能。
在脊髓中，运动神经元延伸其突(process)以将中枢神经系统与周围神经系统连接。SCI后运动神经元受损，并且无法再生神经元突。为了评估THEM的运动神经元再生潜力，并验证THEM神经元再生功能需要缺氧处理，发明人测试了THEM促进人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的运动神经元神经元突生成的能力。发明人比较了缺氧培养的鼠THEM、TCM和鼠M2巨噬细胞对iPSC衍生的运动神经元神经元突延伸的影响。发明人在神经元分化的最后阶段将巨噬细胞与iPSC衍生的运动神经元共培养两天。考虑到特异性神经元标志物βIII-微管蛋白(Tub3)和神经元细胞骨架之间的相关性(S SEaster Jr等人，J Neurosci，小鼠大脑中的初始束形成(Initial tract formation in the mouse brain)，1993)，发明人量化了Tub3的表达，作为神经元突的数量及其延伸的指标。Tub3表达面积通过对所考虑的总面积进行阈值标准化来量化。如图24所示，与对照(无细胞，CTRL，4,83％±0,162％)、M2巨噬细胞共培养物(4,779％±0,284％)和TCM(3,937％±0,192％)相比，Tub3表达在THEM共培养物中显著更高(6,502％±0,204％)。这些结果表明，只有在缺氧条件下培养的THEM才能促进神经元突的增加及其人运动神经元的延伸，证实了它们独特的神经再生潜力。重要的是，在没有缺氧的情况下通过肿瘤调节获得的TCM巨噬细胞不能增加神经元突，这证实了缺氧对决定THEM的再生表型的基本贡献。
发明人还使用人巨噬细胞进一步评估了用小鼠巨噬细胞观察到的对人运动神经元的再生作用。发明人将缺氧培养的人THEM、无缺氧的肿瘤调节培养的TCM、未分化的M0人巨噬细胞和极化的M2人巨噬细胞与来源于人iPSC的运动神经元共培养。共培养两天后(在分化方案结束时)，发明人量化了Tub3的表达，作为神经元突数量及其延伸的指标。Tub3表达面积通过对总面积进行阈值标准化来量化。与鼠THEM观察到的结果类似，该分析表明，与对照(无细胞，CTRL，3,55％±0,409％；p<0.001)、TCM(2,873％±0,184％)、M0(1,94％±0,358％,P<0.01)、M2(2,89％±0,258％,P<0.01)相比，仅缺氧处理的人THEM增加了神经元分化和神经元突延伸(人THEM:5,96％±0,360％)(图25)。这些结果证实了人THEM具有诱导神经元分化和增加神经元突延伸的独特特性，并进一步支持了缺氧对获得THEM再生特征所需的作用。
需要缺氧诱导才能获得有效的体内THEM
发明人进行了额外的体内实验以证实：i)THEM的存在对脊髓神经元组织产生有益影响，促进SCI后的再生；ii)缺氧是让THEM实现其再生潜力的基础。
发明人测试了缺氧处理的THEM对严重挫伤性脊髓损伤(SCI)后活动功能的体内影响。发明人将缺氧处理的THEM的再生效果与用肿瘤调节和无缺氧培养的TCM巨噬细胞的再生效果进行了比较，并用Basso小鼠量表(BMS)分析了活动恢复。在损伤后第3、14、17天注射不同的巨噬细胞。分析中仅考虑1dpi时显示BMS评分低于0.5的小鼠，弃去BMS评分较高的动物。如图26所示，缺氧处理的THEM而非无缺氧培养的TCM对SCI小鼠后的运动恢复有影响。特别地，如图26所示，与TCM(0.300±0.200)或载剂(无细胞，0.711±0.068)的多次移植相比，多次THEM移植显示出活动恢复的显著改善。统计分析显示，THEM移植小鼠和载剂注射小鼠之间在14、17、18、21、24和28dpi时的BMS评分存在显著差异。类似地，统计分析显示，与TCM相比，THEM移植小鼠在17、18、21、24和28dpi时的BMS评分存在显著差异。这些数据证实，需要缺氧诱导来获得THEM的再生功能。
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Claims (15)

1.一种用于在从生物样品中分离的单核吞噬细胞群体中诱导表型和/或功能变化的体外或离体方法，包括在包含从肿瘤培养物或外植体释放的因子的培养基中孵育所述群体，
其中所述孵育在缺氧条件下进行，
并且其中所述孵育诱导所述群体的单核吞噬细胞的表型和/或功能变化。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单核吞噬细胞是单核细胞和/或所述孵育的单核吞噬细胞群体是从生物样品分离的单核细胞的体外培养物和/或其中所述培养基包含能够将单核细胞分化为巨噬细胞的因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述群体孵育6小时或12小时至20天，更优选6小时至10天或优选6小时至72小时或3-8天，甚至更优选18小时至24小时或6天，甚至更优选18小时或7天。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诱导表型和/或功能变化的单核吞噬细胞是巨噬细胞。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包括肿瘤上清液，所述上清液优选获自实体瘤、肿瘤外植体或肿瘤细胞系的培养物，优选获自纤维肉瘤或神经胶质瘤或优选是肿瘤调节培养基(CTM)，优选从肿瘤细胞系、肿瘤外植体或实体瘤产生，或来自解离并铺板的体外肿瘤的切除物，优选持续约6小时至20天，更优选约12小时至72小时的一段时间。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基由细胞培养基、伊氏最低必需培养基或其衍生物和/或洛斯维公园纪念研究所培养基(RPMI)1640和/或培养基199和/或费氏培养基和/或Iscove改良杜氏培养基(IMDM)，以及1-99％、优选10-90％、更优选30-50％、甚至更优选30％或50％肿瘤调节培养基(CTM)或肿瘤上清液组成。
7.能通过如权利要求1-6中任一项所述的方法获得的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，优选地所述吞噬细胞：
i)表达至少一种以下基因：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；和/或
ii)低表达/不表达至少一种以下基因：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
8.一种分离的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其：
i)表达至少一种以下基因：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；和/或
ii)低表达/不表达至少一种以下基因：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
9.如权利要求7或8所述的单核吞噬细胞，优选巨噬细胞，其中所述吞噬细胞：
i)表达：CXCR4、CYTIP、SLC2A3和MT2A；和
ii)低表达/不表达：PLXNA2、HSPH1、CYCS和TIGAR。
10.一种单核吞噬细胞群体，其包含至少一种如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞。
11.如权利要求7-9中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，其特征在于：表达表1和/或表2和/或表3，和/或表6中的至少一种基因和/或分泌表2的至少一种分子，优选其特征在于表达金属蛋白酶(例如Mmp8、Mmp9、Mmp10、Mmp12、Mmp14、Mmp19、Mmp27)和/或营养因子(例如VEGF、FGF、IGF)和/或细胞接触和粘附分子(例如Rap2A、Ninj1、Antxr2、Itga1、Itga6、Itga9、ItgaM、Adamtsl4、Adamtsl6)，和/或促进存活(例如Rtn4rl2)和/或免疫调节的介导物(例如Arg1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl16、Fcgr1、Fcgr4、Ltb4r1、Jmjd1)和/或来自具有获得性再生特性和/或其特征在于表达至少一种与以下有关的基因：伤口愈合反应(例如Adm、Bnip3、Pdgfb、Vegfa)和/或血管生成(例如Vegfa、Angptl4、Cxcl8、Lep、Rora、Apln)和/或解毒作用和防御反应调节(例如Ndrg1、Mt1e、Mt1f、Mt1g、Mt1h、Mt1x、Mt2a、Mt3、Ddit4、Nupr1)和/或对缺氧的反应(例如Hk2、Pfkfb3、Slc2a1、Slc2a3、Cxcr4、Plin2、Adm、Bnip3、Lep、Rora、Ndrg1、Egln3、Mt3、Plod2、Hilpda、Angptl4)和/或胞外基质重塑(例如Mmp9、Vcan、Fgf11、Cxcl8、Lep、Pdgfb、Plod2、Vegfa、Angptl4、Sulf2、Egln3)和/或和神经元存活和髓鞘形成(例如Mt3、Jam2、Vldlr、Nupr1、Egln3)。
12.如权利要求7-9或11中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10或11所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，用于医疗用途。
13.如权利要求7-9或11中任一项所述的单核吞噬细胞或根据权利要求10或11所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，用于细胞治疗和/或再生医学，优选地用于组织或细胞修复、组织或细胞再生、组织重塑、伤口的治疗和/或修复和/或愈合、伤口组织损失、手术溃疡、糖尿病伤口，用于治疗变性病症，包括神经变性)、视网膜变性、遗传性疾病(如ALS)引起的变性、自身免疫性疾病(关节炎、胶原蛋白病)或甚至发生胰岛变性的糖尿病，用于治疗和/或解决炎症、组织炎症，用于治疗损伤、受损组织等，优选地用于治疗以中枢神经系统嵌入组织丧失为特征的病变，优选用于治疗脊柱病变或损伤，例如严重脊柱损伤或脊髓损伤，优选严重或挫伤性脊髓损伤。
14.用于如权利要求12或13所述用途的单核吞噬细胞或分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，用于如权利要求11或12所述用途，其中在损伤后2天至60天或至1年，优选在损伤后4-21或15-60天给予所述吞噬细胞。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求7-9或11中任一项所述的单核吞噬细胞或如权利要求10或11所述的分离的单核吞噬细胞群体，优选地所述单核吞噬细胞是巨噬细胞，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
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