KR20190042684A - 세포 제제 및 세포 제제의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈관신생 또는 축삭 신장을 촉진하기 위한, 특히 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료를 위한 세포 배양물의 제조 방법으로서, 미세교세포 및/또는 단구를 함유한 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양하여 배양물을 생산하는 단계를 포함하는, 세포 배양물의 제조 방법, 그 방법에 의해 얻어진 세포 제제 및 그 세포 제제를 사용하여 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌척수 신경장애를 치료하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은, 예를 들어 뇌경색 등에 의해 손상을 받은 조직의 회복 및 재생에 효과적인 세포 제제 및 그 제조 방법 등에 관한 것이다.
뇌경색은 뇌 국소의 허혈성 괴사에 의한 뇌 기능장애를 말하며 응급 치료가 필요한 질환이고 암 및 심장질환과 함께 3대 사망 원인 중 하나이다. 뇌경색은 작용 기전의 관점에서 혈전성, 색전성 또는 혈행역학성으로 분류되며 임상 소견의 측면에서는 죽상혈전성 뇌경색, 심인성 뇌 색전증 또는 라쿠나 경색으로 분류된다.
허혈은 동맥경화 또는 심인성 혈전과 같은 뇌혈관 병변으로 인해 국소적인 뇌 혈류의 차단에 의해 초래되고 신경 세포 사멸은 허혈 중심에서의 에너지 고갈로 초래된다. 허혈 후, 신경 재생은 부족하고 만성기에서 증상의 회복이 현재로서는 어려우며 환자들의 절반은 후유증으로 고통받는다. 혈관재생이 허혈 중심의 변연부위에서 신경재생 과정을 유발할 것으로 예상된다. 이러한 신경 재생 과정을 타겟으로 하는 치료방법의 개발이 요구되고 있다.
뇌경색의 치료와 관련된 다양한 시도들이 있어왔다. 그러나 그것들은 충분하지 않고 생체 세포를 이용한 치료 방법이 최근 수년간 시도되어왔다.(특허 문헌 1 및 2, 및 비특허 문헌 1)
특허 문헌 1은 헤파린과 같은 항응고제를 사용하지 않고, 골수 또는 혈액으로 부터 채취된 중간엽 줄기 세포를 함유하는 세포들을 얻고, 뇌경색 등과 같은 질병을 치료하기 위해 그 세포들을 사용하는 방법을 기술한다. 특허 문헌 2는 MUSE 세포들을 이용한 뇌경색 치료 방법을 기술한다.
추가로, 마우스 뇌경색 모델에의 골수 유래 단구(CD115 양성 세포)의 정맥 내 투여는 그 세포들이 경색 부위에 이동을 초래하는 것이 확인되었고 그 효과들은 확인되었다; 그러나, 그 효과는 충분하지 않았다.(비특허 문헌 1)
비특허 문헌 1 : Somsak Wattananit "Monocyte-Derived Macrophages Contribute to Spontaneous Long-Term Functional Recovery after Stroke in Mice" The Journal of Neuroscience， 13 April 2016，36(15): 4182-4195; doi: 10．1523/JNEUROSCI．4317-15．2016
그러나, 그 전술한 특허 문헌 1 및 2에 기술된 세포 제제는 골수액 채취를 요구하고, 이는 환자에게 큰 부담이 있다. 또한 중간엽 줄기세포를 얻는 것는 장기간 배양을 요구하는 문제가 있다. 비특허 문헌 1에 기술된 바와 같은 골수 유래 단구의 투여로, 더욱이, 경색 부위로의 이동이 확인될 수 있었지만 뇌경색 등에 치료적 효과는 불충분한 문제가 발생했다.
본 발명의 문제는 전술한 종래 문제들을 해결하고 다음의 목적을 달성하는 것이다. 즉, 본 발명은 세포 제제와 그것의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 이는 환자들에게 부담이 더 적고 높은 안전성을 가지며 뇌경색을 치료하는데 대단히 효과적이다.
본 발명자들은 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation : OGD)으로 처리된 단구를 함유하는 미세교세포 또는 단핵 세포들의 투여가 뇌경색의 발병 후 악화를 방지하고 혈관신생 및 축삭 신장을 촉진하는 것으로 뇌경색이 치료되는 것을 발견하여, 본 발명의 완성하는 결과가 되었다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다.
<1>본 발명은 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌혈관질환, 심근 경색, 뇌출혈 및 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로부터 선택된 질병의 치료하기 위한 세포 배양물을 제조하기 위한 방법이다.
<1a> 본 발명은 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 혈관신생 또는 축삭 신장의 촉진을 위한 세포 배양물을 제조하기 위한 방법이다.
<2> 전술한 방법들 중 어느 것에서도, 세포군은 바람직하게는 적어도 낮은 당 농도의 조건에서 배양된다.
<3> 전술한 방법들 중 어느 것에서도, 세포군은 바람직하게는 기본 배지에서 배양된다.
<4> 예를 들면, 단구를 함유하는 전술한 세포군은 말초혈 세포 또는 그것의 분획이다.
<4a> 대안으로, 단구를 함유한 전술한 세포군은 말초혈로부터 채취된 단핵 세포를 함유하는 분획이다.
<5> 추가로, 낮은 산소 농도는 1% 미만의 산소 농도일 수 있다.
<6> 추가로, 낮은 당 농도는 1.0 g/L 이하의 당 농도일 수 있다.
<7> 추가로, 배양물의 전술한 제조에서, 전술한 세포군은 낮은 산소 농도 및 낮은 당 농도 조건 하에서 24시간 미만동안 배양될 수 있다.
<8> 세포 제제의 전술한 제조에서, 전술한 제조된 배양물은 더 세척되고 세척된 배양물은 용기에 봉입될 수 있다.
<9> 본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환, 심근 경색, 뇌출혈 및 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로부터 선택된 질병의 치료를 위한 세포 제제이며, 제제는 허혈성 뇌혈관 질환, 심근 경색, 뇌출혈 및 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로부터 선택된 질병의 치료에 충분한, 혈관신생 및/또는 축삭 신장을 촉진하기 위한 능력을 가진 미세교세포 및/또는 단구를 포함한다.
<9a> 본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환, 심근 경색, 뇌출혈 및 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로부터 선택된 질병의 치료를 위한 세포 제제이며, 제제는 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양함으로써 제조된 배양물을 포함한다.
<10> 본 발명은 혈관신생 또는 축삭 신장을 촉진하기 위한 세포 제제이며, 제제는 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양함으로써 제조된 배양물을 포함한다.
<11> 본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환, 심근 경색, 뇌출혈 및 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로부터 선택된 질병의 치료 방법이며, 방법은, 치료적으로 효과적인 양의 미세교세포 및/또는 단구를 함유하고 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양함으로써 제조된 배양물을, 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 미세교세포 또는 단구를 매우 단기간의 시간동안 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양하는 것만으로, 혈관신생 및 축삭 신장을 촉진하는 능력이 세포에 부여될 수 있고, 따라서, 허혈성 심혈관 질환 및 심근 경색은 발병의 초기 단계로부터 치료될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 일반적인 의료 기관들에서도 폭넓게 이용가능한데, 중간엽 줄기 세포 또는 골수 줄기 세포의 경우와 같은 세포 조절 시설(Cell processing centers : CPC)에서의 실시에 제한이 없기 때문이다. 추가로, 혈청 또는 증식 인자등은 배양에 요구되지 않아 세포 제제는 낮은 가격에 안전하게 제공될 수 있다.
더 나아가서, 말초혈에서 유래된 단구를 함유하는 세포군이 사용될 때, 골수액 채취가 불필요하므로, 뇌경색 치료에서 환자의 부담이 경감될 수 있으며 안정성이 높아질수 있다.
뇌출혈 또는 뇌척수 외상 환자의 경우, 미세교세포는 혈종 제거 수술 후 혈종 주변의 파괴된 백질로부터 쉽게 채취될 수 있고, 따라서, 환자의 뇌 또는 척수로부터 직접 채취된 미세교세포에 본 발명을 적용함으로써 전술한 질병이 치료될 수 있다.
추가로, 배양이 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 수행되기 때문에, 혈관신생 및 축삭 신장이 더욱 촉진될 수 있으며, 치료 효과가 높아질 수 있다.
도 1은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식 후 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에서 신경학적 결과물의 개선된 결과의 한 예시를 나타낸다.
도 2는 OGD 전처리된 미세교세포 이식 후 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에서 신경학적 결과물의 개선된 결과의 다른 예시를 나타낸다.
도 3은 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양물의 특성을 나타낸다.
도 4는 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양물의 다른 특성을 나타낸다.
도 5는 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 VEGF의 강도를 나타낸다.
도 6은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 MMP-9의 강도를 나타낸다.
도 7은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 TGF-β의 강도를 나타낸다.
도 8은 CD31에 대한 면역 반응성을 나타낸다.(단위부피당 부피)
도 9는 SMI 31에 대한 면역 반응성을 나타낸다.(단위부피당 부피)
도 10은 뇌 허혈 후 제28일 및 허혈 전의 래트에서 대뇌 피질로부터의 콘드로이틴 설페이트 프로테오글라이칸/뉴런 글라이얼 항원 2(chondroitin sulfate proteoglycan/neuron glial antigen 2 : CSPG/NG2)의 상대적 강도를 나타낸다.
도 11은 뇌 허혈 후, OGD 전처리된 미세교세포의 이식에서의 메커니즘을 나타낸다.
도 12는 세포 제제의 제조 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 13은 OGD 전처리된 말초혈 단핵 세포들(peripheral blood mononuclear cells : PMNC) 의 이식 후 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델의 신경학적 결과물의 개선된 효과의 한 예시를 나타낸다. 여기서 #은 컨트롤에 대해 p<0.05임을 나타낸다.
도 14는 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에서의 신경학적 결과물의 개선에서 OGD 전처리된 PMNC의 이식된 세포 수에의 의존성을 나타낸다. 여기서 #은 컨트롤에 대해 p<0.05 임을 나타낸다.
도 15는 OGD 전처리된 PMNC를 이식한 일시적 국소 뇌 허혈의 래트 모델의 뇌 허혈 병변에서 혈관신생의 촉진을 나타낸다. 상부 패널은 혈관신생 마커 CD31의 면역 염색 및 DAPI에 의한 핵염색의 이중 염색상을 나타내고, 하부 패널은 염색 결과로 부터 계산된 혈관 부피를 나타내는 그래프이다.
도 16은 OGD 전처리된 PMNC가 이식된 일시적 국소 뇌 허혈의 래트 모델의 뇌 허혈 병변에서 신경 축삭 신장의 촉진을 나타낸다. 상부 패널은 신경 축삭 마커 SMI 31의 면역 염색과 DAPI에 의한 핵 염색의 이중 염색상을 나타내고 하부 패널은 염색 결과로부터 계산된 신경 축삭 부피를 나타내는 그래프이다.
도 17은 인간 PMNC에서의 VEGF의 생산(A) 및 분비(B)에서 산소 결핍(OD)에 의한 자극, 당 결핍(GD)에 의한 자극 또는 산소-당 결핍(OGD)에 의한 자극의 효과를 나타낸다. (A) 각 자극(왼쪽) 후 세포 추출물(상부 패널) 및 배양물 상청액(하부 패널)의 웨스턴 블럿 이미지 및 VEGF의 상대적인 밴드 강도의 그래프(오른쪽). (B) 각 자극 후 배양물 상청액에 대한 ELISA의 결과를 나타내는 그래프. 각 그림에서 "**"는 p<0.01 을 나타내고 "*"는 p<0.05를 나타낸다.
도 2는 OGD 전처리된 미세교세포 이식 후 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에서 신경학적 결과물의 개선된 결과의 다른 예시를 나타낸다.
도 3은 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양물의 특성을 나타낸다.
도 4는 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양물의 다른 특성을 나타낸다.
도 5는 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 VEGF의 강도를 나타낸다.
도 6은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 MMP-9의 강도를 나타낸다.
도 7은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식으로 촉진된, 뇌 허혈 후 제28일의 TGF-β의 강도를 나타낸다.
도 8은 CD31에 대한 면역 반응성을 나타낸다.(단위부피당 부피)
도 9는 SMI 31에 대한 면역 반응성을 나타낸다.(단위부피당 부피)
도 10은 뇌 허혈 후 제28일 및 허혈 전의 래트에서 대뇌 피질로부터의 콘드로이틴 설페이트 프로테오글라이칸/뉴런 글라이얼 항원 2(chondroitin sulfate proteoglycan/neuron glial antigen 2 : CSPG/NG2)의 상대적 강도를 나타낸다.
도 11은 뇌 허혈 후, OGD 전처리된 미세교세포의 이식에서의 메커니즘을 나타낸다.
도 12는 세포 제제의 제조 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 13은 OGD 전처리된 말초혈 단핵 세포들(peripheral blood mononuclear cells : PMNC) 의 이식 후 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델의 신경학적 결과물의 개선된 효과의 한 예시를 나타낸다. 여기서 #은 컨트롤에 대해 p<0.05임을 나타낸다.
도 14는 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에서의 신경학적 결과물의 개선에서 OGD 전처리된 PMNC의 이식된 세포 수에의 의존성을 나타낸다. 여기서 #은 컨트롤에 대해 p<0.05 임을 나타낸다.
도 15는 OGD 전처리된 PMNC를 이식한 일시적 국소 뇌 허혈의 래트 모델의 뇌 허혈 병변에서 혈관신생의 촉진을 나타낸다. 상부 패널은 혈관신생 마커 CD31의 면역 염색 및 DAPI에 의한 핵염색의 이중 염색상을 나타내고, 하부 패널은 염색 결과로 부터 계산된 혈관 부피를 나타내는 그래프이다.
도 16은 OGD 전처리된 PMNC가 이식된 일시적 국소 뇌 허혈의 래트 모델의 뇌 허혈 병변에서 신경 축삭 신장의 촉진을 나타낸다. 상부 패널은 신경 축삭 마커 SMI 31의 면역 염색과 DAPI에 의한 핵 염색의 이중 염색상을 나타내고 하부 패널은 염색 결과로부터 계산된 신경 축삭 부피를 나타내는 그래프이다.
도 17은 인간 PMNC에서의 VEGF의 생산(A) 및 분비(B)에서 산소 결핍(OD)에 의한 자극, 당 결핍(GD)에 의한 자극 또는 산소-당 결핍(OGD)에 의한 자극의 효과를 나타낸다. (A) 각 자극(왼쪽) 후 세포 추출물(상부 패널) 및 배양물 상청액(하부 패널)의 웨스턴 블럿 이미지 및 VEGF의 상대적인 밴드 강도의 그래프(오른쪽). (B) 각 자극 후 배양물 상청액에 대한 ELISA의 결과를 나타내는 그래프. 각 그림에서 "**"는 p<0.01 을 나타내고 "*"는 p<0.05를 나타낸다.
(본 발명의 기초가 된 발견)
허혈성 뇌졸중 환자들의 생존자 중 절반 이상은 운동 기능 장애로 고통 받는다. 따라서 아급성 및 만성기의 뇌졸중 환자들에서 기능 회복을 촉진하는 방법을 확립할 필요가 있다. 치료약을 개발하기 위한 다양한 접근들이 있어왔음에도 불구하고, 충분한 치료약이 현재 이용가능하지는 않으며, 물리적 재활만이 허혈성 뇌졸증 환자들에서 기능 회복을 촉진하기 위해 유일한 치료적 선택으로 남아있다.
골수 단핵 세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포/기질세포를 사용하는 세포 치료는 아급성 및 만성기의 뇌졸중 환자들에서 기능 회복을 촉진하는 또다른 치료 방법일 수도 있다. 신경 전구 세포, 골수 기질 세포 및 중간엽 줄기 세포를 사용한 세포-기반 치료의 메커니즘 중 하나는 VEGF 또는 뇌 유래 신경영양성 인자(brain-derived neurotrophic factor : BDNF)의 분비를 통해 혈관신생을 유도한다. 세포 치료 후 축삭 신장 또한 보고되어 있다. 그러나, 최근의, 다무작위화 비교 시험은 허혈성 뇌졸중에서 골수 단핵 줄기 세포의 정맥 내 투여의 유익한 효과는 없었음을 입증했다. 또한, 허혈성 뇌졸중 환자들은 재발을 방지하기 위해 항응고제 또는 항혈소판 요법을 받기 때문에, 골수로부터 줄기 세포를 채취하는 것은 기술적으로 어렵다. 골수 유래 세포들은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier : BBB)을 투과하지 못할 수도 있고 뇌로 이주하지 못할 수도 있다.
따라서, 본 발명자들은 미세교세포가 중추 신경계(CNS)에서 전술한 증식 인자의 주요 공급원이기 때문에, 미세교세포를 사용한 세포 요법이 또다른 유망한 치료 방법이 될 수도 있다고 생각하였다. 이전의 여러 연구들은 급성기에서 미세교세포가 뇌경색 부피를 확장시킨다는 것을 증명하지만, 반면에 아급성 및 만성기의 뇌허혈 후 미세교세포는 조직과 혈관 리모델링을 통해 보호 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이러한 보호하는 미세교세포는 M2 미세교세포로 불리고, 뇌 허혈 후 혈관신생 및 축삭 신장을 촉진할 수 있는 VEGF 및 BDNF, 매트릭스 메탈로프로티네이즈-9(MMP-9), 형질전환 증식 인자 β(TGF-β) 등과 같은 리모델링 인자의 분비에 의해 그것의 보호 효과가 유발되는 것으로 여겨진다. 게다가, 특히 뇌 허혈 상태에서, 이식된 미세교세포는 BBB를 통해 뇌로 이주할 수 있다.
또한 혈액 내 단구는 뇌로 이주하고 미세교세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.
전술한 발견들에 기초하여, 본 발명자들은 OGD 전처리되고 말초로 투여된 미세교세포 또는 단구가 BBB를 통해 뇌 유조직으로 이주하고, 리모델링 인자들을 분비하며, 아급성기에서 국소적 뇌 허혈을 위한 혈관신생 및 축삭 신장의 촉진을 통해 다각적 치료 효과를 발휘할 수 있게 됨을 예상했다.
그 예상을 검증하기 위해, 본 발명자들은 일시적 국소 뇌 허혈 래트 모델에 OGD 처리된 미세교세포 또는 말초혈 단핵 세포(PMNC)를 투여했고 미세교세포 또는 단구가 BBB를 통해 뇌로 이주하며 혈관신생과 축삭 신장의 촉진을 통해 뇌의 기능 회복을 촉진하는 것을 발견했다.
본 발명자들은 또한 OGD로 인간 PMNC를 처리한 경우 및 산소결핍(OD) 또는 당 결핍(GD)으로 자극한 경우간에 세포군에서 혈관신생을 위한 체액성 인자인 VEGF의 생산량과 분비량을 비교했다. 결과적으로, VEGF의 생산량은 자극이 없는 경우보다 OGD처리, GD처리, OD처리 순으로 더 높았으며 VEGF 분비량은 OD처리에 비해 OGD 처리 또는 GD처리시 현저히 높은 것이 밝혀졌다.
본 발명은 혈관신생의 촉진 또는 축삭 신장의 촉진을 위해 세포 배양물, 특히, 뇌 혈전, 뇌경색등과 같은 허혈성 뇌혈관 질환(뇌경색) 또는 뇌 내 출혈 및 지주막하 출혈등과 같은 출혈성 뇌 장애(뇌출혈), 심근 경색등과 같은 허혈성 심장 질환, 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료를 위한, 전술한 배양물의 제조 방법을 제공한다.(이하 "본 발명의 제조 방법"으로도 언급됨) 이 방법은 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양함으로써 전술한 배양물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제조 방법에 사용되는 세포군은 그것이 미세교세포 또는 단구를 함유하는 한 이것의 유래에 특별히 한정되지 않고, 인간 혹은 다른 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 개, 고양이, 원숭이, 소, 돼지 등)로부터 적절하게 채취된다. 미세교세포를 함유하는 세포에 대해서는, 예를 들면, 대뇌 등과 같은 신경 조직을 분산시키고, 접착성의 세포 배양 용기에서 혈청-첨가 배양액을 사용해 배양한다. 결과적으로, 교세포(glial cells), 주로 아스트로사이트(astrocytes)가 배양 용기의 표면에 증식하여 단층을 형성한다. 이후, 미세교세포의 증식 상태는 쉽게 인식된다. 미세교세포 배양 테스트 시스템은 미세교세포를 채취하고 배양하여 만들어질 수 있다. 세포들을 채취할 때, 배양 용기를 진탕하는 방법이 종종 사용된다. 이것은 단층 아스트로사이트 배양 세포에 부착된 미세교세포를 유리시키기 위한 물리적 자극의 부가를 포함하고, 더 많은 세포들이 채취될 수 있다. 미세교세포는 또한 대뇌등과 같은 신경 조직의 분산액으로부터 직접적으로 정제될 수 있고 또는 전술한 방법으로부터 얻어진 미세교세포 분획 또한 CD115를 지표로 항-CD115항체를 사용한 MACS 또는 FACS에 의해 정제될 수 있다. 그것은 또한 전구세포 또는, 단구, 조혈 줄기 세포등과 같은 줄기세포로부터의 분화로도 얻어질 수 있다.
인간에게 적용하면, 예를 들어, 뇌출혈 또는 뇌 외상으로 외과적 수술을 요구하는 환자에서, 혈종 제거 후, 혈종 주변의 파괴된 백질은 신경내시경을 사용하여 절제될 수 있고, 백질로 이주했던 미세교세포는 분리되고 사용될 수 있다. 인간으로부터 미세교세포의 채취는 고도로 침습성이고 본래 어려움에도 불구하고, 상기의 경우에서 수술로 필연적으로 얻어지는 파괴된 백질이 공급원으로 사용되기 때문에 충분히 허용된다.
단구를 함유하는 세포군으로는, 공지된 방법으로 얻어진 골수-유래 단핵 세포 분획 또는 말초혈-유래 단핵 세포 분획이 사용될 수 있다. 최소한의 침습성을 고려하고, 허혈성 질병의 경우에서, 항응고/항혈전 요법이 일반적으로 재발 방지를 위해 수행되므로 오는 골수액 채취의 어려움을 고려하여, 말초혈-유래 단핵 세포 분획이 더 바람직하다. 단핵 세포 분핵은 골수액 또는 말초혈로부터, 예를 들면, 공지된 방법 그 자체에 의해 피콜 밀도 구배 원심에 의해서 분리되고 정제될 수 있다. 더 나아가서, 예를 들어, 단구는 또한 항-CD14 항체를 사용하여 MACS 또는 FACS에 의해 생성되고 사용될 수 있다. 단구는 또한 조혈 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포로부터 분화시킴으로써 사용될 수 있다.
본 발명에서 산소-당 결핍 처리(OGD처리)는 전술한 세포군을 보통의 배양 조건에 비해 낮은 산소 및 낮은 당 조건 하의 배지에서 배양하는 처리를 말한다. OGD 처리 조건들이 본 발명에서 사용된 미세교세포 또는 단구를 함유하는 세포군의 종류에 따라 적절하게 선택되지만, 그것들은 지표로 VEGF, TGF-β, MMP-9의 생산량을 사용하고 그것의 발현 수준이 최대화된 조건 전후에서 선택될 수 있다. 예를 들면, CD115-양성 래트 미세교세포 분획에서, 본 실시예들에서 사용된 조건 하에서, 즉, 배양 챔버가 밀폐되고 분획이 무산소 환경하 1.0 g/L 당을 함유하는 DMEM 배지에서 배양되었을 때, 낮은 산소 챔버 내의 산소 농도는 1시간에 1%미만 그리고 4시간에는 0.1 - 0.4%으로 감소했으며 실험을 통해 유지되었다. 24시간동안 OGD하의 배양은 세포 사멸을 초래했고, 18시간동안 OGD하의 배양은 프로피듐 아이오다이드 어세이(assay)와 젖산 탈수소효소 어세이에 기초한 평가에 의해 세포 사멸을 초래하지 않았다. M2 미세교세포의 검출은 OGD 배양 시작 후 12시간에 시작했으며, 24시간에 최대로 증가했고 그이후는 현저히 감소했다. 따라서 전술한 조건 하에서의 약 18시간(예를 들면, 18 ± 6 시간)동안의 OGD 처리가 바람직하다.
본 발명에서, "낮은 산소 농도"는 바람직하게는 국소적 뇌경색에서의 산소 농도를 모방한 농도를 의미하고 예를 들면 1%미만, 보다 바람직하게는 0.1 - 0.4%이다. 1%를 초과하는 낮은 산소 농도(예를 들면, 2 - 10%)에서 배양하는 것은 배아줄기세포(ES cells)의 미분화 상태 유지 및 iPS 세포 수립 효율성 개선에 효과적이라고 보고되었다. 그러나, 본 발명에서 바람직한 산소 결핍(OD)처리는 24시간 후 미세교세포 및 단구의 세포 사멸을 초래하는, 가혹한 낮은 산소 조건 하에서 수행된다. "낮은 산소 농도"는, 예를 들면, 배양 챔버 내 분위기를 5% CO2-함유 질소 가스 등과 같은 무산소 불활성 가스로 대체함으로써 창출될 수 있다.
본 발명에서, "낮은 당 농도"는 바람직하게는 국소적 뇌경색에서 당 농도를 모방한 당 농도를 의미한다, 예를 들면 1.0 g/L이하이다. 본 발명의 효과를 제공하기 위해, 1.0 g/L이하의 당 농도는 충분하고, 필요 이상으로 당 농도를 낮추는 것은 때때로 세포 생존을 위해 바람직하지 않은 경우가 있다. 낮은 당 조건은, 예를 들면, 미세교세포 또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 당 농도를 갖는 배지에서 배양함으로써 창출될 수 있다. 배지로서, 잘 알려진 관용의 기본 배지, 예를 들면 이글스 배지(Eagle's medium), 최소 필수 배지(Minimum esssential medium : DMEM), Dulbecco의 수정 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium : DMEM), RPMI 배지(예를 들면, RPMI1630, RPMI1640), 피셔 배지(Fisher's medium), 햄 배지(ham medium)(예를 들면, F10, F12), 및 MCDB 배지(예를 들면, MCDB104, MCDB107) 등 또는 이들의 혼합 배지가 사용될 수 있다. 각 기본 배지의 당 농도에 따라, 본 발명에서는 낮은 당 농도를 충족시킬 만큼 적절하도록 첨가될 당의 양을 줄인 후 배지가 사용된다. DMEM의 경우에서, 예를 들면, 낮은 당 배지 (1.0 g/L) 및 높은 당 배지 (4.5 g/L)는 시판되고 있다. 낮은 당 배지가 사용을 위해 선택될 수 있다. 무당 배지도 또한 시판되고 있고, 당은 바람직한 낮은 당 농도로 첨가될 수도 있다. 미세교세포 및 단구가 이용될 수 있는 한, 당은 특정하게 한정되지 않고, 글루코스, 갈락토오스, 프룩토스 등, 일반적으로는 글루코스가 사용될 수 있다.
전술한 기본 배지는 추가로, 5 - 20%의 혈청(예를 들면, 소 태아 혈청) 또는 혈청 대체물(예를 들면, 넉아웃 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement)), 증식 인자(예를 들면, EGF, PDGF, IGF-I, IGF-II, 인슐린, IL-1, IL-6), 알부민, 트랜스페린, 프로테아제 저해제(예를 들면, α1-안티트립신), 세포 접착 인자(예를 들면, 피브로넥틴, 라미닌), 지질(예를 들면, 콜레스테롤, 리놀레산(linoleic acid), 스테로이드), 미량 원소(철, 아연, 아셀렌산(selenous acid), 망간, 구리) 등과 같이, 잘 알려진 관용의 배지 첨가물을 함유할 수 있다. 본 발명은 충분한 혈관신생 및/또는 축삭 신장 촉진 능력을 미세교세포 및 단구에 혈청, 증식 인자등과 같은 동물-유래 구성요소 부가 없이도 부여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배지로서, 혈청 또는 증식 인자 없이 기본 배지만으로 실질적으로 구성되는 배지가 사용될 수 있다. 배지는 바이러스 등에 의한 오염의 위험이 있는 동물로부터 유래한 비싼 구성요소를 함유하지 않기 때문에, 비싸지 않고 안전한 세포 제제가 제공될 수 있다.
이러한 OGD의 조건을 요약하면, 낮은 산소 농도는 1% 미만의 산소 농도, 낮은 당 농도는 1.0 g/L이하의 당 농도이며 배양 기간은 24시간 미만이다. 단구 또는 말초혈 단핵 세포 분획이 사용될 때, 배양 기간은 바람직하게는 18시간 혹은 그 미만으로 하게 된다.
전술한 바와 같이 얻어진 세포 배양물은 그대로 사용되거나 의약상 허용되는 담체와 함께 제제화될 수 있다. 의약상 허용되는 담체의 예시는 식염수, 포도당이나 다른 보조제를 함유한 등장액(예를 들면, D-소르비톨, D-만니톨, 염화 나트륨 등) 등과 같이 주사용 수성 액을 포함한다. 본 발명의 세포 배양물을 함유하는 세포 제제는, 예를 들면, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액), 안정제(예를 들면, 벤잘코늄 클로라이드, 프로카인 하이드로클로라이드 등), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글라이콜 등), 보존제, 산화방지제 등을 함유할 수도 있다.
아래 언급된 예시에서 나타낸 바와 같이, 미세교세포 또는 단구를 함유한 세포군의 OGD처리에 의해 얻어진 배양물은 특징적으로 보통의 산소 농도 및 당 농도 조건 하에서 처리된 배양물(또는 OGD 처리 전의 세포군)과 비교하여
(a) 상당히 높은 분비량의 VEGF
(b) 상당히 높은 분비량의 MMP-9, 및
(c) 상당히 높은 분비량의 TGF-β
의 성질을 갖는다. VEGF, MMP-9 및 TGF-β는 혈관신생 및 축삭 신장 촉진 작용을 갖기 때문에, OGD 처리에 의해 얻어진 배양물의 투여는 허혈 또는 출혈에 의해 손상되거나 파괴된 신경 조직의 재생을 유도할 수 있다.
게다가, 미세교세포 또는 단구를 함유하는 세포군의 OGD 처리에 의해 얻어진 배양물은 또한 보통의 산소 농도 및 당 농도 조건(혹은 OGD 처리 전의 세포군) 하에서 처리된 배양물과 비교하여
(d) 상당히 높은 비율의 TNF-α의 분비량에 대한 TGF-β의 분비량
및/또는
(e) 상당히 낮은 IL-6 분비량
의 성질을 갖는다. 즉, 염증성 사이토카인 보다 항염증성 사이토카인의 우선적인 분비가 허혈/출혈 부위에서 염증 억제 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 미세교세포 또는 단구를 함유한 세포군의 OGD 처리에 의해 얻어진 배양물을 함유하는 세포 제제는 허혈성 뇌혈관 질환 또는 허혈성 심장질환의 치료를 위해 사용될 수 있고, 혈관신생을 촉진하고 항염증 작용을 제공하는 것이 기대된다. 본 발명에서 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌혈관질환으로 불리는 것들을 말하고 출혈성 뇌 장애(뇌 내 출혈, 지주막하 출혈) 뿐만 아니라, 뇌 경색(뇌 혈전, 뇌 색전증)을 포함한다. 바람직한 적용은 뇌경색을 포함한다. 게다가, 단구를 함유하는 세포군의 OGD처리에 의해 얻어진 배양물을 함유하는 세포 제제도 또한 허혈성 심장 질환(예를 들면, 심근 경색)과 같은 허혈성 질환 등을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 그것은 또한 외상성 뇌척수 신경장애를 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 제제를 환부에 송달하기 위한 방법으로, 예를 들면, 수술적 수단에 의한 국소적 이식, 정맥 내 투여, 국소적 주사 투여, 피하투여, 피내투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 뇌 내 투여, 뇌실 내 투여 및 동맥 내 투여 등이 고려된다.
환자에게 세포의 주사에 의한 이식이, 예를 들면, 신경계 회복을 위해 사용될 때, 인공 뇌척수액 또는 식염수등을 사용하여 부유 상태에서 주사기에 이식을 위한 세포들을 저장하는 것, 수술에 의해 손상된 신경 조직을 노출하는 것 및 주사 바늘로 손상 부위로 직접 세포들을 주입하는 것을 포함한다. 세포들은 손상 부위 근처로 이식될 수도 있고 효과는 뇌척수액으로의 주입에 의해 또한 기대될 수 있다. 더 나아가서, 효과는 정맥내 주사로 또한 기대될 수 있다. 따라서 보통의 수혈 방식으로 이식이 가능하게 되었고, 병동에서 이식 조작이 가능하다는 점에서 바람직하다.
본 발명의 세포 제제의 투여량은, 예를 들면, PMNC가 정맥 내로 뇌경색 환자에게 투여될 때, 단핵 세포들의 수에서 105 - 108 세포들이고, 바람직하게는 5×105 - 107 세포들이다. 단핵 세포에서 단구 비율은 약 1/3 내지 1/15로 추정된다. 따라서, 단구의 수에 대해서는, 전술한 단핵 세포의 수를 그 비율에 곱하여 얻어진 수가 투여되는 것으로 고려된다. 미세교세포의 투여량 또한 단구의 투여량에 상응하는 세포 수를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 실시예를 들어 이하에서 상세하게 설명된다. 본 발명은 어떠한 방식으로도 실시예에 의해 한정되지 않는다. 다음의 실시예는 실험 동물의 관리와 사용에 대한, 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지침의 권고에 따라 엄격하게 수행되었고, 니가타대학교 동물 실험 윤리 위원회(Animal Experimentation Ethics Committee)에 의한 승인 후 수행되었다.
(국소 뇌 허혈)
일시적 국소 뇌 허혈은 수컷 Sprague-Dawley 래트(체중 290 - 320 g) 및 실리콘 코팅된 나일론 모노필라멘트를 사용해 유도하였다.
구체적으로, 래트는 70% 아산화질소 및 30% 산소의 혼합물중의 1.5% 할로테인의 흡입으로 마취하였다. 직경 0.148 mm의 나일론 모노필라멘트는 혈관 폐색을 위해 사용했다. 나일론 모노필라멘트의 끝은 열로 둥글게 하였다. 봉합 실의 말단(11mm)은 실리콘으로 코팅하였다.(직경 0.350 mm) 중간 대뇌 동맥(middle cerebral artery : MCA)은 외경동맥(external carotid artery)을 통해 내경동맥(internal carotid artery)으로 색전 실을 삽입하여 폐색하였다. 허혈 90분 후에, 색전 실은 혈류 회복을 위해 꺼내었다.
이것은 미소관-결합 단백질 2(microtubule-associated protein 2 : MAP2)의 존재에 의해 결정된 허혈 중심 및 반음영(penumbra) 영역을 형성하는 결과가 되었다. 게다가, 재관류로 반음영의 조직을 구조하기 위한 치료시간 범위는 90분이었다.
(면역형광 염색 및 공초점 현미경)
뇌 허혈 후 제1일, 제3일, 제4\7일, 제14일 및 제28일에 생존한 래트들을 심장내에서 식염수로 관류하고, 냉 0.1 M 인산 완충 식염수(PBS; pH 7.4)중의 냉 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류되며, 할로테인(halothane)의 과잉투여로 안락사시켰다.
뇌를 제거하고 파라핀 왁스에 포매하였다. 파라핀 블록으로부터 연속적인 절편 (4 μm 두께)을 잘라내고 항체를 이용해 염색하였다. 자유롭게 부유하는 절편들을 준비하고(50 μm 두께) 염색하였다. 핵염색은 벡타쉴드(vectashield) 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 수행되었다. 절편은 공초점 레이저 주사 현미경 하에서 검사하였다. 허혈 중심 및 반음영에 상응하는 대뇌 피질 조직을 MAP2 염색에 의해 결정하였다.
(면역염색에 의한 뇌 조직 구조의 정량 분석)
뇌 조직 구조의 분석을 위한 정량 분석을 수행하기 위해, 조직 절편은 분화 클러스터(cluster of differentiation : CD) 31 (내피세포 및 혈관신생을 위한 마커), MAP2 (뉴런의 수상돌기의 마커), SMI 31 및 성장 관련 단백질 43(GAP43)(뉴런의 축삭 마커), VEGF, TGF-β 및 MMP-9에 대한 항체로 면역염색하고 카운트하였다.
(미세교세포의 일차 배양 세포)
일차 마우스 미세교세포를 채취하였다. 구체적으로, 파파인(papain)으로 대뇌 피질을 소화시킨 후, 출생후 C57BL/6 마우스의 대뇌 피질로부터 혼합 미세교세포를 분리하기 위해 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 Dulbecco의 수정 이글 배지(DMEM)에서 10일간 세포 현탁액을 배양하였다. 10일 후, 미세교세포를 단리하기 위해 그 배양액 플라스크를 15분동안 진탕하였다. 유동 세포 계측법(flow cytometry)에서 Mac-1 (CD11b/CD18) 면역 반응성에 의한 평가는 이러한 미세교세포 배양물의 순도가 99%임을 나타냈다.
(말초혈 단핵 세포)
래트 또는 인간 말초혈을 PBS와 총 부피 35mL까지 혼합하고, 50mL 원뿔형 튜브에서 15mL의 피콜(ficoll)(GE Healthcare Japan Ficoll-Paque Premium 1.084)에 중층하고, 400 x g에서 30분동안 원심분리하고 피콜층 위에 떠오른 PMNC 층을 분리하였다.
(OGD: 산소-당 결핍 자극, OD: 산소 결핍 자극, GD: 당 결핍 자극)
OGD의 유도를 위해, 첫번째로, 혈청-함유 배지는 PBS로 두번 충분히 세척하여 혈청 성분을 제거하였다. 다음에, 배지를 낮은 당 배지로 대체하였고, 낮은 산소 챔버를 1시간동안 95% N2 및 5% CO2의 혼합 가스로 대체하고 챔버를 그후 18시간동안 폐쇄하였다. 낮은 당 배지로, DMEM(Dulbecco의 수정 이글 배지)을 사용하였고 그것의 당 농도는 1.0 g/L로 하였다.
낮은 산소 챔버 내의 산소 농도는 1시간에 1%미만으로 감소했고, 4시간에 0.1 ~ 0.4%로 감소했고 실험을 통해 유지되었다.
무혈청 고 글루코스(4.5 g/L) DMEM을 낮은 당 배지 대신 사용한 것을 제외하고 OD는 OGD와 마찬가지로 수행하였다. 챔버 내 분위기가 5% CO2, 95% 대기인 것을 제외하고 GD는 OGD와 마찬가지로 수행되었다.
OGD하의 24시간동안의 배양은 세포 사멸을 초래했으나, OGD하의 18시간동안의 배양은 프로피듐 아이오다이드 어세이 및 락테이트 탈수소효소 어세이에 기초한 평가에 의해 세포 사멸을 초래하지 않았다. M2 미세교세포의 검출은 OGD 배양 개시 후 12시간에 시작되었고, 24시간에 최대로 증가했으며 그 후 현저히 감소했다. 따라서, 이 실시예에서는, OGD 18시간이 선택되었다.
OGD하에 배양된 미세교세포는 이하 OGD 전처리 미세교세포로 언급된다. 또한 OGD 전처리 미세교세포와 비교하기 위해, 정상의 산소 농도(예를 들어, 약 20%) 하에 배양된 미세교세포는 정상의 산소 미세교세포로 언급된다.
(세포 이식)
이 실시예에서, 동일한 생리적 조건을 창출하기 위해, 뇌 허혈 후 제7일에 평균 체중-2SD 이하의 래트는 제외시켰다. 1×106 미세교세포 또는 1×105 또는 1×106 래트 PMNC를 PBS 300μL로 희석시켰다. 뇌 허혈 후 제7일에, 일시적 MCAO(middlecerebral artery occlusion)(중간 대뇌 동맥 폐색)의 대상이 되었던 래트를 다음 군들에 무작위로 할당하였다. 이 군들은 미세교세포 또는 PMNC가 외경동맥(ECA)의 절단 단부를 통해 3분동안 서서히 이식된 래트로 구성된 세포 처리군 및 같은 부피의 PBS가 주입된 래트로 구성된 무세포 대조군이다. 세포 처리군은 OGD 전처리된 미세교세포 또는 PMNC이식된 래트로 구성된 OGD 전처리 미세교세포- 또는 PMNC-이식군 및 정상의 산소 미세교세포 또는 PMNC가 이식된 래트로 구성된 정상의 산소 미세교세포- 또는 PMNC-이식군을 포함한다. OGD 전처리된 PMNC 이식군은 1×105 PMNC-이식군 및 1×106 PMNC 이식군을 이식 세포수에 따라 포함한다.
(감각 운동 평가)
감각 운동 평가는 뇌 허혈 전, 뇌 허혈 후 제1일, 제4일, 제7일, 제10일(이식 후 제3일), 제14일(이식 후 제7일), 제21일(이식 후 제14일) 및 제28일(이식 후 제21일)에 코너 테스트로 수행한다. 코너 테스트에서, 테스트는 20회 행하며 래트가 왼쪽 또는 오른쪽으로 돌아 코너로부터 탈출하고 오른쪽에서 탈출하는 횟수를 카운트한다.
(녹색 형광 단백질(green fluorescent protein : GFP) 마우스)
이식된 미세교세포가 동맥 내 투여된 후 그것의 유익한 효과를 발휘하도록 혈액으로부터 뇌 실질(parenchyma)로 이동할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 이 실시예에서는 GFP 마우스로부터의 일차 미세교세포를 사용하였다. GFP 마우스로부터의 일차 미세교세포는 OGD로 전처리하였고, 세포들을 동맥내로 투여하였다. 그 후, 뇌 허혈 후 제7일에 수행된 이식으로부터 제3일 및 제21일에 공초점 현미경 검사를 수행하였다.
(ELISA 및 웨스턴 블럿)
인간 PMNC를 OGD, GD 또는 OD로 18시간동안 자극되었으며, 세포와 배양 상청액을 분리하였다. 세포 추출물과 배양 상청액은 각각 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 행하였고, 마우스 항-인간 VEGF 항체 및 표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 웨스턴 블럿으로 VEGF를 정량하였다. 내부 표준으로서, β-액틴(세포 추출물) 또는 트랜스페린(배양 상청액)이 각각 사용되었다. 배양 상청액에 대해 ELISA에 의한 VEGF의 정량화도 또한 수행하였다.
(결과)
국소 뇌 허혈에 대한 OGD 전처리된 미세교세포 이식의 치료 효과를 설명한다.
국소 뇌 허혈에 대한 OGD 전처리된 미세교세포의 이식의 치료 효과를 비교하기 위해, 국소 뇌 허혈 후의 감각 운동 평가에 의해 무세포 대조군 및 OGD 전처리된 미세교세포-이식군간의 신경학적 결과물을 분석하였다.
도1은 OGD 전처리된 미세교세포 이식 후 신경학적 결과물의 개선된 결과의 한 예시를 나타낸다.
OGD 전처리된 미세교세포-이식군의 래트에서, 20회 행해진 코너 테스트에서 무세포 대조군과 비교하여 기능 회복이 크게 개선되었다. 즉, 뇌 허혈 후 제28일에 20회 행해진 코너 테스트에서. OGD 전처리 미세교세포-이식군의 래트들은 약 50%의 비율로 오른쪽으로 돌았고 무세포 대조군의 래트들은 약 10%의 비율로 오른쪽으로 돌았다. 이것은 무세포 대조군에서보다 OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서 신경 장애의 개선이 상당히 더 좋은 것을 보여준다. 이 군들간에, 뇌허혈 전 및 뇌허혈 후 제7, 14, 21 및 28일에 체중에서 유의한 차이는 발견되지 않았다.
다음에, 미세교세포에 대한 OGD 전처리의 유무의 치료 효과를 국소 뇌 허혈 후의 감각 운동 평가에 의해 비교하였다.
도 2는 OGD 전처리된 미세교세포의 이식 후의 신경학적 결과물의 개선된 결과의 한 예시를 나타낸다.
20회 행해진 코너 테스트에서 정상의 산소 미세교세포(norm)의 이식 후의 래트들과 비교하여 OGD 전처리된 미세교세포 이식 후의 래트들은 급격하게 개선된 기능 회복을 나타내었다. 즉, 뇌 허혈 후 제28일에 20회 행해진 코너 테스트에서, OGD 전처리된 미세교세포-이식군의 래트들은 약 40%의 비율로 오른쪽으로 돌았고, 정상의 산소 미세교세포-이식군의 래트들은 약 10%의 비율로 오른쪽으로 돌았다. 이것은 정상의 산소 미세교세포-이식군에서보다 OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서 신경 장애의 개선이 상당히 더 좋은 것을 보여준다. 이 군들간에, 뇌허혈 전 및 뇌허혈 후 제7, 14, 21 및 제28일에 체중에서 유의한 차이는 발견되지 않았다.
여기서, 공초점 전자현미경 시험에 의해, GFP 마우스로부터의 미세교세포의 동맥내 투여 후, 즉, 이식 후 제21일에, 그 미세교세포는 관찰되지 않았지만, 그 미세교세포가 허혈 중심 및 반음영간 경계 영역에서 이식 후 제3일에 관찰되었다. 즉, 미세교세포가 혈액에서 뇌 실질로 이주한 것이 공초점 전자 현미경 시험에 의해 확인되었다.
도 3은 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양의 특성을 나타낸다. 구체적으로, 도 3은 정상의 산소 조건(norm) 또는 OGD 하에서 마우스 미세교세포의 일차 배양으로부터의 배지로의 분비 수준을 나타낸다. 도 3(a)는 혈관 내피 증식 인자(VEGF)의 분비 수준를 나타내고, (b)는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)의 분비 수준을 나타내며, (c)는 MMP-9의 분비 수준을 나타낸다.
도 3(a)에서 나타낸 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포의 배지에서의 VEGF 분비 수준는 정상의 산소 미세교세포 배지에서의 분비 수준보다 현저히 더 높은 것으로 발견되었다.
반면에, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, OGD 및 정상의 산소 상태에서 미세교세포 배지간에 BDNF 분비 수준에 차이가 없었다. 그러나, 도 3(c)에 나타난 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포의 배지에서의 MMP-9 분비 수준는 정상 산소 미세교세포 배지에서의 분비 수준보다 높은 것으로 발견되었다.
도 4는 OGD 전처리된 마우스 미세교세포의 일차 배양의 다른 특성들을 나타낸다. 구체적으로, 도 4는, 도 3과 유사하게, 정상 산소 상태(norm) 또는 OGD 하에서 마우스 미세교세포의 일차 배양 배지에서의 분비 수준을 나타낸다. 도 4 (a) 및 (b)는 형질전환 증식 인자 β(TGF-β) 및 인터루킨 10(IL-10)과 같은 항염증성 사이토카인(cytokine)들의 분비 수준을 나타낸다. 도 4(c), (d) 및 (e)는 IL-6, 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인들의 분비 수준을 나타낸다. 도 4(f)는 TNF-α에 대한 TGF-β의 비율을 나타낸다.
OGD 전처리된 미세교세포의 사이토카인 프로필 변화를 결정하기 위해, 도 4에 나타난 바와 같이, 미세교세포의 여러 사이토카인의 수준을 정상 산소 상태 및 OGD간 비교했다. 일반적으로, M1 미세교세포는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 분비하고, 뇌 보호적인 M2 미세교세포는 IL-10 및 TGF-β를 분비한다.
도 4(a)에서 나타낸 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포에 의한 항염증 사이토카인 TGF-β의 분비 수준은 정상 산소 미세교세포에 의한 것에 비해 25배 더 높다. 도 4(c)에 나타낸 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포에 의한 염증성 사이토카인 IL-6의 분비 수준은 정상 산소 미세교세포에 의한 것보다 절반인 것으로 발견되었다.
이와 반대로, 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포 및 정상 산소 미세교세포로부터의 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비 수준은 차이가 없었다. 반면에, 도 4(d) 및 (e)에 나타낸 바와 같이, OGD 전처리된 미세교세포에 의한 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-1β의 분비 수준은 정상 산소 미세교세포로부터의 분비 수준보다 3 또는 4배 더 높았다.
도 4(f)에 나타낸 바와 같이, TNF-α에 대한 TGF-β의 비율은, M1 미세교세포 및 M2 미세교세포간의 편향을 나타내는데, OGD 전처리 미세교세포가 정상 산소 미세교세포 보다 6배 더 높았다. TNF-α에 대한 TGF-β의 비율의 증가는 OGD 전처리 후 M2 미세교세포로의 편향을 보여준다. 즉, 이런 결과가 OGD를 이용한 최적의 전처리는 미세교세포가 항-염증 M2 아형을 우세하게 하는 결과가 됨을 입증했다.
다음에, OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의한 VEGF, MMP-9 및 TGF-β의 발현을 설명한다.
OGD 전처리된 미세교세포의 이식 후 개선된 결과들이 뇌 실질에서 리모델링 인자들(VEGF, MMP-9 및 TGF-β)의 상승에 의한 것인지를 확인하기 위해 분석이 수행되었다. 즉, VEGF, MMP-9 및 TGF-β에 대한 항체들을 사용하여, 허혈 후 제28일에 이식한 래트의 뇌의 면역조직화학적 분석이 수행되었다. VEGF, MMP-9 및 TGF-β의 발현이 허혈 후 래트 뇌에서는 검출될 수 없었다. 그것의 발현은 뇌 허혈 후 제28일(이식 후 제21일)에 허혈 중심 및 반음영 내 경계 영역에서 관찰되었다.
도 5 - 도 7은 뇌 허혈 후 제28일에 리모델링을 촉진하는 다양한 인자들의 발현을 나타내고, 이는 OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의해 촉진된다. 도 5는 VEGF의 강도를 나타내고, 도 6은 MMP-9의 강도를 나타내며, 도 7은 TGF-β의 강도를 나타낸다.
도 5 - 7에 나타난 면역반응성의 강도의 분석은 이러한 리모델링 인자들의 발현이 무세포 대조군에서보다 OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서 더 뚜렷했음을 입증했다.
VEGF 및 MMP-9의 발현은 미세교세포 뿐만 아니라 허혈 래트 내 원주 상피 세포, 내피 세포 및 신경 세포에서도 관찰되었다. TGF-β의 발현은 미세교세포 뿐만 아니라 허혈 래트 내 원주상피세포 및 및 신경 세포에서도 관찰되었다.
다음에, 뇌 허혈 후 제28일에 OGD 전처리된 미세교세포의 이식이 허혈 중심내 경계 영역에서의 혈관신생 및 허혈성 반음영에서의 축삭 신장을 촉진하는 것으로 확인되었다.
먼저, OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의한 혈관신생의 촉진을 설명한다.
본 발명자들은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의한 VEGF, MMP-9 및 TGF-β의 발현이 혈관신생을 촉진한다고 예상했다. 따라서, 본 발명자들은 OGD 전처리된 미세교세포의 이식이 혈관신생에 미치는 효과를 혈관신생 마커인 항-CD31 항체를 사용하여 대뇌 피질의 면역 형광 염색에 의해 뇌 허혈 후 제28일에 시험했다.
도 8은 단위 부피당 CD31에 대한 면역반응성을 나타낸다. 구체적으로, 그 CD31 면역반응성은 허혈 후 제28일에 무세포 대조군 및 OGD 전처리된 미세교세포-이식군 각각의 허혈 중심의 1μm3 당 부피(μm3)로, 즉, 부피 비율로서 표시하였다.
공초점 전자현미경에 의한 평가에서, 도 8에 나타낸 바와 같이, 뇌 허혈 후 제28일(이식 후 제21일)에 OGD 전처리된 미세교세포-이식군의 CD31에 대한 면역반응성은 무세포 대조군의 CD31 면역반응성보다 훨씬 뚜렷함이 밝혀졌다. CD31에 대한 면역 반응성은 허혈 중심을 함유하는 경계 영역에서 단위 부피당 CD31에 대한 면역 반응성이다. 이 군들간에, 허혈성 반음영에서의 단위 부피당 CD31에 대한 면역반응성에서 상당한 차이점은 발견되지 않았다.
다음에, OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의한 축삭 신장의 촉진을 설명한다.
본 발명자들은 허혈 후 제28일에 뉴로필라멘트(neurofilament)의 단백질 마커에 대한 항-SMI 31 항체를 사용한 허혈성 피질의 면역형광 염색에 의해 축삭 신장에 미치는 OGD 전처리된 미세교세포 이식의 효과를 조사했다.
도 9는 단위 부피당 SMI 31에 대한 면역반응성을 나타낸다. 구체적으로, CD31 면역반응성은 허혈 후 제28일에 무세포 대조군 및 OGD-미세교세포-이식군 각각의 허혈성 반음영의 1 μm3당 부피(μm3)로 즉, 비율로서 표현된다.
OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서 허혈 반음영내 SMI 31의 발현은 무세포 대조군에서의 발현보다 더 현저했다.
OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서, 허혈성 반음영에서의 다른 축삭 신장 마커 GAP43의 발현은 무세포 대조군에서의 발현보다 더 현저했다. 반대로, 두 군간, 허혈성 반음영에서의 MAP2의 발현에는 상당한 차이점은 없었다.
본 발명자들은 OGD 전처리된 미세교세포 이식이 축삭 신장을 촉진하는 메커니즘을 결정하기 위해, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글라이칸(chondroitin sulfate proteoglycan : CSPG)의 발현을 평가했다. 그것은 축삭 신장을 저해하며 MMP-9에 의해 절단되고 분해되기 때문이다.
OGD 전처리된 미세교세포의 이식에 의해 발현되는 MMP-9의 증가가 CSPG 발현의 감소를 유도하고 축삭 신장을 일으킨다는 예상을 확인하기 위해, 본 발명자들은 항-CSPG/NG2(NG2는 CSPG의 주성분이다) 항체를 사용한 면역 형광 염색을 수행했다.
도 10은 허혈 후 제28일에 가짜 수술 래트에 대한 대뇌 피질에서의 콘드로이틴 설페이트 프로테오글라이칸/뉴런 글라이얼 항원2(CSPG/NG2)의 상대적 강도를 나타낸다. 대뇌 피질은 무세포 대조군 및 OGD 전처리된 미세교세포-이식군의 피질을 포함한다.
도 10에 나타낸 바와 같이, CSPG/NG2 수준을 뇌 허혈 후 제28일에 이식 래트 및 가짜 수술군의 래트 간에 비교하였다. 공초점 현미경에 의한 평가에서, 이식 후 제21일에(뇌 허혈 후 제28일) OGD 전처리된 미세교세포-이식군에서 허혈 반음영에서의 CSPG/NG2의 발현이 가짜 수술군 및 무세포 대조군의 그것보다 훨씬 더 낮은 것으로 밝혀졌다.
도 11은 뇌 허혈 후 OGD 전처리된 미세교세포의 이식 메커니즘을 나타낸다.
OGD 전처리된 미세교세포의 이식은 VEGF, TGF-β 및 MMP-9의 직접 분비를 초래한다. 이러한 인자들은 OGD 전처리된 미세교세포에 의해 분비된 리모델링 인자들을 통해 상주하는 세포가 분비한 파라크라인에 기인할 수도 있다. 이러한 인자들은 허혈 중심에서 직접적으로 혈관신생을 촉진시킨다. 허혈 중심은 MAP2-면역학적 음성 부위로 정의되며, 비가역적 혈관신생-음성 허혈 중심 및 혈관신생을 나타내는 혈관신생-양성 허혈 중심으로 구성된다.
미세교세포로부터의 MMP-9은 축삭 신장 저해 인자 CSPG의 발현을 저하시킨다. 따라서 축삭 신장은 쉽게 유도될 수 있다. VEGF, TGF-β 및 MMP-9은 직접적으로 축삭 신장을 유도한다.
단구는 뇌 혈관으로부터 BBB를 통해 뇌 실질로 지나가고 미세교세포로 분화한다. 단구는 용이하게 말초혈로부터 채취될 수 있으므로, 그들은 미세교세포보다 덜 침습적으로 얻어질 수 있다. 그러므로, 단구를 함유하는 말초혈 단핵 세포(PMNC) 분획을 OGD처리하여 미세교세포와 동일한 결과가 얻어질 수 있는지 여부는 래트 PMNC(1×106)를 이식한 국소 뇌 허혈 래트 모델에서 감각 운동 평가로 검증되었다.
결과를 도 13에 나타낸다. OGD 자극이 없는 PMNC 투여군(normoxia)은 세포 비투여군(PBS 대조군)과 상당한 차이점이 발견되지 않았지만, OGD-자극된 PMNC 투여군(OGD)에서 허혈 처리 후 제28일에 상당한 증상적 개선이 관찰되었다.
다음에, 세포 수에 미치는 OGD 자극의 효과의 의존성을 이식되는 PMNC의 수를 변동시켜 조사하였다.
결과를 도 14에 나타낸다. OGD-자극 PMNC 투여군에서, 허혈 처리 후 제28일에 세포 수-의존적으로 유의한 증상의 개선이 관찰되었다.
다음에, OGD-자극 PMNC의 이식에 의한 뇌 허혈 병변에서 혈관신생 및 신경 축삭 신장을 평가하기 위해, 병변 및 그것의 부근 조직 절편의 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 항-CD31 항체가 혈관신생 평가에 사용되었고, 항-SMI 31 항체가 축삭신장 평가에, 각각, 1차 항체로서, 사용되었다.
결과를 도 15 및 16에 나타낸다. 1×106 OGD-자극 PMNC 투여군(OGD-PMNC 10^6)은 OGD 자극 없는 PMNC 투여군(norm)과 비교하여 유의하게 촉진된 혈관신생 및 축삭 신장을 나타내었다.
다음에, 산소 결핍 자극(OD)만 및 당 결핍 자극(GD)만에 대한 OGD 자극의 우수성이 VEGF 생산 및 분비량을 지표로 인간 PMNC를 사용하여 평가되었다. 인간 PMNC는 18시간동안 OD, GD 또는 OGD로 자극되었고, 세포 내의 VEGF 양 및 배양 상청액 내 VEGF 양(분비량)을 웨스턴 블럿에 의해 정량하였다. 배양 상청액에 대해서는, VEGF를 또한 ELISA에 의해 정량하였다.
결과를 도 17에 나타낸다. 세포의 VEGF 생산량은, OGD 자극 없는 PMNC 투여군(norm)과 비교하여, OD 자극만에 의해서도 증가하는 경향이 있었다. 수준은 GD 자극만에 의해서도 높아졌고, OGD 자극은 더 높은 수준을 나타냈으며 OGD 자극 없는 PMNC 투여군(norm)에 비해 VEGF 생산량은 상당히 증가했다. 반면에, 배지로의 분비량은 OD자극만에 의한 대조군과 현저한 차이점을 나타내지 않은 한편, GD 자극만에 의해서도 대조군에 대해 증가하는 경향이 발견되었다. VEGF 분비량은 OGD 자극에 의해 더 증가되었고, 그것은 대조군뿐만 아니라 OD 자극만에 의한 것과도 유의한 차이점을 나타냈다.
다음에, 뇌출혈에 대한 치료 프로토콜의 한 예를 나타내며, 이때 뇌출혈 환자의 혈종 제거 수술동안 제거된 혈종을 둘러싼 파괴된 백질로부터 미세교세포를 단리하고, 미세교세포를 OGD로 자극하여 환자에게 재이식한다.
신경내시경 관찰 하 혈종을 흡인 제거 후, 출혈하는 혈관을 식별하여 지혈을 수행한다. 혈종 강(hematoma cavity)을 세척하고, 파괴된 백질을 집게로 회수한다. 백질의 세포들을 해리시킨 후, 항-CD 115 항체를 사용하여 MACS 또는 FACS에 의해 미세교세포를 단리한다. 얻어진 미세교세포를 OGD로 18시간동안 자극하고, 1×106 미세교세포를 PBS에 현탁시키고 환자에게 정맥내로 투여한다.
(요약)
위에 기술한 바와 같이, 전술한 예시에서, 뇌경색 치료, 혈관신생 촉진, 또는 축삭 신장 촉진을 위한 배양물을 함유하는 세포제제가 미세교세포 또는 단구를 함유하는 세포군을 OGD 조건 하에서 배양함으로써 제조될 수 있다. 게다가, 치료 효과는 OGD에 의해 개선될 수 있다.
인간 PMNC를 사용하는 실시예에서 분명한 바와 같이, 미세교세포 또는 단구에 혈관신생 및/또는 축삭 신장을 촉진하는 능력을 부여하기 위해서는, 세포군을 허혈상태에 가깝게 하기 위한 자극을 세포군에 주는 것만이 필요하다. 이를 위해, 세포군을 낮은 산소 농도 또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양할 수도 있다. 적어도 낮은 당 농도 조건 하에서 세포군을 배양하는 것이 바람직하고, OGD 조건 하에서, 즉, 낮은 산소 농도 및 낮은 당 농도 조건 하에서, 세포군을 배양하는 것이 더 바람직하다.
래트 및 인간 PMNC를 사용한 실시예에서 분명한 바와 같이, 혈관으로부터 뇌 실질으로 이동한 단구는 미세교세포가 되기 때문에, 미세교세포를 함께 또는 대신해서 단구를 함유하는 세포군을 OGD 조건 하에서 배양할 수도 있다. 세포군이 단구를 함유할 때, 세포군은 말초혈 세포 또는 그것의 세포 분획, 예를 들면, 말초혈로부터 채취된 단핵 세포를 함유하는 분획일 수도 있다. 세포 제제의 제조를 위한 골수액 채취는 불필요하므로, 뇌경색을 치료하는 데 환자의 부담을 경감하고 안전성을 높일 수 있다. 전술한 특허 문헌 1의 경우에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 회수하기 때문에, 충분한 수의 세포들이 얻어질 수 없고 세포들을 증식시킬 필요가 있는데, 이는 배양 기간을 늘릴 뿐만 아니라 세포 조절 시설(CPC)등과 같은 특별한 시설을 요구한다. 그러나, 본 발명에서는, 단구는 말초혈로부터 쉽게 채취될 수 있으므로, 증식은 불필요하고, 배양시간은 단축될 수 있으며, 이식 세포들은 CPC 없이 이식을 수행하는 의료 시설에서 준비될 수 있다.
전술한 실시예에서, OGD에서, 낮은 산소 챔버에서의 산소 농도를 1시간에 1%미만, 4시간에 0.1 - 0.4%로 감소시키고 그 농도를 유지함으로써, 래트 뇌 허혈 모델에서 뇌 기능 회복에 충분한 활성을 촉진시키는 혈관신생 및 축삭 신장을 미세교세포 및 PMNC에 부여할 수 있었다. 이는 배양 분위 중의 1% 내지 0.4%미만의 평균 산소 농도가 본 발명의 효과를 달성하기에 충분함을 의미한다. 유사하게, 전술한 실시예에서, 당 농도를 1.0 g/L로 함으로써 전술한 활성을 미세교세포 및 PMNC에 부여할 수 있었다. 이것은 1.0 g/L이하의 배지 중의 당 농도가 본 발명의 효과를 제공하기에 충분함을 의미한다.
전술한 실시예에서, 세포군은 OGD 조건하에서 18시간동안 배양되었다. 그러나, 이와 같은 배양 기간은 하나의 실시 양태이고 24시간 미만이 될 수도 있다. 위에 서술한 바와 같이, 이것은 M2 미세교세포가 24시간에 최대로 증가하고, 그 다음 현저히 감소하며, 더욱이 24시간에 세포 사멸을 초래하기 때문이다.
전술한 실시예에 따라 준비된 그 세포 제제는 전형적으로 뇌경색을 치료하기 위한 세포 제제이다. 이 세포 제제는 미세교세포 또는 단구가 허혈 부위에 도달할 수 있는 한 뇌경색 뿐만 아니라 어떠한 허혈 질환에도 치료 효과를 나타낸다. 예를 들면, 심근 경색, 폐경색, 및 신장 경색 등에 대해서도 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 한 실시 양태에 따른 세포 제제의 제조 방법은 배양물 등의 세척단계를 포함할 수도 있다.
도 12는 세포 제제의 제조 방법을 나타내는 순서도이다.
배양물은 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 조건 및/또는 낮은 당 조건에서 배양함으로써 제조된다.(단계 S1) 그리고 나서, 배양물을 세척한다(단계 S2). 구체적으로, OGD에 의해 사멸된 과립구 또는 파편들을 원심력에 의해 배양물로부터 분리하고 배양물을 세척한다. 그리고 나서, 배양물을 백에 봉입하여 세포 제제를 제조한다.(단계 S3)
본 발명은 또한 도 12의 순서도에 의하여 제조된 세포 제제를 환자들에게 투여함으로써 허혈성 질환(예를 들면, 뇌경색)을 치료하는 방법이 될 수도 있다. 이 경우에, 도 12의 단계 S3에서, 예를 들면, 약 1×108 세포를 40 mL 백에 봉입한다. 세포 제제를 정맥 내 투여함으로써, 예를 들면 30분에서 1시간동안, 이식이 수행된다. 세포 제제는 정맥 내 뿐만 아니라 동맥 내, 또는 뇌 내 등으로 투여될 수도 있다. 또한, 요추 천자 투여, 뇌 내 투여, 뇌실 내 투여 또는 국소 투여가 사용될 수도 있다.
인간을 치료하는 방법에 있어서, 도 12에 나타낸 단계 S1 전에 말초혈을 환자로부터 채취하고, 단구를 함유하는 세포군을 말초혈로부터 분리한다. 즉, 세포군은 말초혈로부터 채취된 단구를 함유하는 분획이다. 대안으로, 세포군은 말초혈로부터 채취된 단핵 세포들을 함유하는 분획이다. 그리고 나서, 세포 제제는 세포군을 OGD 조건 하에서 배양함으로써 제조되고 환자에게 투여된다. 이 경우에, 환자로서 개인에 대한 부담은 극도로 적고, 높은 안전성의 효과가 주어진다. 또한 단구를 성장시킬 필요가 없고 약물의 첨가는 필요하지 않다. 더 나아가서, 배양 기간이 짧기 때문에, 발병의 초기부터 치료가 가능하다. 게다가, 발병으로부터 시간이 얼마간 지나갔을 때에 조차 치료 효과가 기대된다. 더욱이, 이 치료는 낮은 비용으로 행해지며, 정맥내 투여에 의해서도 또한 효과적이다.
인간 이외의 동물을 치료하는 방법에서는, 도 12에 나타낸 단계 S1 이전에, 전술한 실시예에서 나타낸 바와 같이(일차 세포 배양), 예를 들면, 미세교세포는 인간 이외의 동물의 뇌로부터 채취되고 그 미세교세포를 함유하는 세포군을 OGD 조건 하에서 배양한다. 세포 제제는 배양에 의해 제조되고, 환자로서 인간 이외의 동물에게 투여된다. 본 명세서에서는, 단순하게 환자로 기재된 경우, 환자는 인간 및 비-인간 동물을 의미한다.
전술한 실시예에 따라 제조된 세포 제제에 함유된 배양물은 OGD 조건 하에서 배양된 미세교세포 및/또는 단구이다. 이런 방식으로 배양된 미세교세포 또는 단구는 구조로서 특정될 수 없거나 출원시 통상의 기술을 고려하여도 적어도 구조로서 특정하는 것은 현실적이지 않다. 첨부된 청구범위에서는, 따라서, 미세교세포 또는 단구는 제조 방법에 의해 특정될 수도 있다.
본 발명의 한 실시 양태에 따른 세포 제제, 세포 제제의 제조 방법 및 그것의 치료 방법이 실시예에 기초해 기술되었으나, 본 발명은 실시예에 한정되지 않는다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않는한, 당업자에 의해 다양하게 수정된 실시예는 본 발명에 포함될 수도 있다. 또한, 본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌들은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 채용되었다.
본 발명의 세포 제제는 허혈성 질환의 기능적 회복을 위해 현저하게 효과적이고 질병을 위한 약재로서 유용하다.
Claims (13)
- 혈관신생 또는 축삭 신장의 촉진을 위한 세포 배양물의 제조 방법으로서, 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건에서 배양하여 이로써 상기 배양물을 제조하는 단계를 포함하는, 배양물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양물은 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료에 사용되는, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
단구를 함유하는 상기 세포군은 말초혈 세포 또는 그것의 세포 분획인, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단구를 함유하는 상기 세포군은 말초혈로부터 채취된 단핵 세포를 함유하는 분획인, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 낮은 산소 농도는 1% 미만의 산소 농도인, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 낮은 당 농도는 1.0 g/L이하의 당 농도인, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포군은 낮은 산소 농도와 낮은 당 농도 조건 하에서 24시간 미만동안 배양되는, 배양물의 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양물을 세척하는 단계 및 그것을 용기에 봉입하는 단계를 더 포함하는, 배양물의 제조 방법.
- 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상을 치료하기에 충분한, 혈관형성 및/또는 축삭 신장을 촉진하는 능력을 가진 미세교세포 및/또는 단구를 포함하는, 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료를 위한 세포 제제.
- 제9항에 있어서,
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 배양물을 포함하는 세포 제제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 배양물을 포함하는, 혈관신생 또는 축삭 신장의 촉진을 위한 세포 제제.
- 치료적으로 효과적인 양의 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 배양물을 대상에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 배양물은 미세교세포 및/또는 단구를 함유하는 세포군을 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양하여 제조되는, 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료 방법.
- 뇌혈관질환, 허혈성 심장 질환 또는 외상성 뇌 손상 및 척수 손상의 치료에서의 사용을 위한, 낮은 산소 농도 및/또는 낮은 당 농도 조건 하에서 배양된 미세교세포 및/또는 단구.
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