CN117500915A - 细胞制剂的制造方法及用于其的低氧刺激用容器 - Google Patents

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Abstract

提供一种能够对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激而简易地制造有效的细胞制剂的细胞制剂的制造方法及其制造方法中使用的低氧刺激用容器。在对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激来制造细胞制剂的方法中，在被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁(11)包围的第一室(10)中，容纳接种有外周血单核细胞的糖浓度1.0g/L以下的低糖液体培养基并密封，利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁(21)至少覆盖第一壁(11)中具有透氧性的部位，在形成于第一壁(11)与第二壁(21)之间的第二室(20)中容纳脱氧剂(50)，由此经由第一壁(11)吸引低糖液体培养基中的溶解氧，将低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％并维持，由此对外周血单核细胞给予24小时以下的低氧低糖刺激。

Description

细胞制剂的制造方法及用于其的低氧刺激用容器
技术领域
本发明涉及细胞制剂的制造方法和能够用于该细胞制剂的制造方法的、用于对培养细胞给予低氧刺激的低氧刺激用容器。
背景技术
以往，脑梗塞发病后数日以后从亚急性期至慢性期的治疗法限于复发的预防，作为使功能恢复的治疗也仅有康复训练疗法。作为脑梗塞慢性期的治疗，进行了使用生长因子的临床试验(血管内皮生长因子、促红细胞生成素等)，但未显示有效性。没有发现有效性的理由之一是，在脑组织中存在血脑屏障(也称为BBB)，由于该屏障机构，迄今为止几乎所有的脑梗塞治疗的药剂几乎不到达脑实质。
正在研究针对脑梗塞的干细胞疗法。使用骨髓间充质干细胞的细胞疗法有望。然而，作为妨碍其普及的缺点，可举出所得到的细胞数少、在专用的细胞处理中心(称为CPC)中培养需要2周以上，因此只能在极少一部分的专业医院进行。另外，iPS(inducedpluripotent stem，诱导性多能干)细胞有癌变的危险性，此外举出在中枢神经疾病的治疗中难以越过成为问题的BBB的屏障机构，它们妨碍临床应用。即，现状是干细胞对脑梗塞的治疗应用仍是困难的。
本发明人在下述专利文献1中提出了一种用于促进血管新生或促进轴索伸展的细胞制剂的制造方法，其示出了通过在慢性期对由低氧低糖刺激转换为保护型的脑内炎性细胞小胶质细胞进行动脉给药，来促进抗炎、血管新生、神经轴索伸展而使功能恢复的再生疗法的可能性。
临床上不容易得到小胶质细胞，因此着眼于性质与小胶质细胞类似的外周血单核细胞进行了研究。这是因为单核细胞容易越过BBB集中于病变部，通过刺激来分泌保护性生长因子，因此具有作为细胞疗法有利的性质。其结果，专利文献1中提出了基于能够更简便地获取的外周血单核细胞通过低氧低糖刺激后的给药使功能恢复。
在先技术文献
专利文献：
专利文献1：国际公开第WO2018/043596A1号公报。
发明内容
发明要解决的问题
然而，如专利文献1记载的方法那样，为了在不具备特殊的设备的一般医院等中实施从患者的外周血收集单核细胞并实施低氧低糖刺激来变化为保护型、由此作为细胞制剂向患者给药的治疗方法，需要进一步的改良。例如，从自体外周血中分离收集单核细胞的方法可以使用已经在临床上利用的单采术(apheresis)设备来实施。然而，对于从自体外周血收集的单核细胞，即使是没有CPC那样的特别设备的一般医院也并不知晓实施适当的低氧低糖刺激的方法。
因此，本发明的目的在于提供一种能够对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激而简易地制造有效的细胞制剂的细胞制剂的制造方法和适用于该细胞制剂的制造方法的低氧刺激用容器。
解决问题的手段
实现上述目的的本发明的细胞制剂的制造方法是一种通过对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激并将该外周血单核细胞转换为保护型来制造用于促进血管新生或轴索伸展的细胞制剂的方法，其特征在于，在被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围的第一室中，容纳接种有所述外周血单核细胞的糖浓度1.0g/L以下的低糖液体培养基并密封；利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位，在形成于所述第一壁与所述第二壁之间的第二室中容纳脱氧剂，由此经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；将所述低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％并维持，由此对所述外周血单核细胞给予24小时以下的所述低氧低糖刺激。
在本发明的细胞制剂的制造方法中，优选在低糖液体培养基中接种外周血单核细胞后，将溶解氧在1小时以内降低至小于1％，然后将低糖液体培养基的溶解氧维持在小于1％。优选在第一室内与低糖液体培养基一起容纳氮气，并降低低糖液体培养基的溶解氧。在该情况下，更优选将二氧化碳与氮气一起容纳于第一室内。
进而，在本发明的细胞制剂的制造方法中，也可以在第二室内容纳氮气而降低低糖液体培养基的溶解氧。也可以利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁覆盖第二壁的外周和/或第一壁，并在形成于第三壁与第二壁之间和/或第三壁与第一壁之间的第三室中容纳氮气来降低低糖液体培养基的溶解氧。
另外，在本发明的细胞制剂的制造方法中，也可以在由第一壁构成的第一室的内壁面使用含有细胞固着促进材料的涂布材料实施涂布后，将播种有外周血单核细胞的低糖液体培养基容纳于第一室并进行密封。
实现上述目的的本发明的低氧刺激用容器的第一方式的特征在于，在用于对培养细胞给予低氧刺激的低氧刺激用容器中，包括：第一室，其被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围，容纳有低糖液体培养基和所述培养细胞并被密封；第二室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位而形成于所述第一壁与所述第二壁之间并被密封；脱氧剂，其容纳于所述第二室，经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；第一通路，以连通所述第一室和外部的方式设置，能够气密地闭塞；以及第二通路，以连通所述第二室和外部的方式设置，能够气密地闭塞。
本发明的低氧刺激用容器的第二方式的特征在于，在用于对培养细胞给予低氧刺激的低氧刺激用容器中，包括：第一室，其被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围，容纳有包含低糖液体培养基和所述培养细胞的细胞悬浮液并被密封；第二室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位而形成于所述第一壁与所述第二壁之间并被密封；脱氧剂，其容纳于所述第二室，经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；第三室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁覆盖所述第二壁的外周和/或第一壁而形成于所述第三壁与所述第二壁之间和/或所述第三壁与第一壁之间并被密封；第一通路，以连通所述第一室和外部的方式设置，能够气密地闭塞；以及第三通路，以连通所述第三室和外部的方式设置，能够气密地闭塞。
在第二方式中，优选地还设置有第四室，所述第四室能够容纳第一通路、第二通路和/或第三通路，具有氧遮蔽性和可挠性并能够开口和密封。
在这些低氧刺激用容器中，第一通路、第二通路或第三通路也可以从第一室、第二室或第三室向外侧突出地设置，分别具有用于取放各室内容物的氧遮蔽性的阻气性管。另外，在第一通路、第二通路或第三通路与第一室之间也可以具备能够气密地闭塞的遮蔽单元。在这些低氧刺激用容器中，也可以在由所述第一壁构成的所述第一室的内壁面涂布含有细胞固着促进材料的涂布材料。
发明效果
根据本发明的细胞制剂的制造方法，包围第一室的第一壁和覆盖第一壁的第二壁具有可挠性，因此第一壁和第二壁能够变形。因此，在将低糖液体培养基、外周血单核细胞容纳于第一室或从第一室取出时，第一壁和第二壁变形，从而不会向第一室内吸引周围的气体等，能够将第一室保持为无菌状态。
通过在确保第一壁的透氧性、第二壁的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁与第二壁之间的第二室中容纳足够量的脱氧剂，能够在将第一室保持为无菌状态的同时，经由第一壁吸引第一室内低糖液体培养基中的溶解氧，第一壁和第二壁具有可挠性，因此不产生负压，也没有氧返回，能够将溶解氧降低至小于1％并维持。因此，能够在24小时以下的时间对外周血单核细胞给予充分的低氧低糖刺激，能够将外周血单核细胞转换为保护型。
因此，在本发明的细胞制剂的制造方法中，能够以简易的结构在闭塞系统中对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激来制造有效的细胞制剂。即，无需为了将液体培养基处于低氧状态、并维持低氧状态而在脱氧气氛(氮气气氛)中进行作业，因此不需要例如CPC等大型装置。因此，即使在没有特别设备的设施等中，也能够使外周血单核细胞变化为保护型，制造用于促进血管新生或轴索伸展的细胞制剂、用于脑血管障碍、缺血性心脏病或外伤性脑脊髓神经障碍细胞制剂等。
在本发明的细胞制剂的制造方法中，通过在第一室内与低糖液体培养基一起容纳氮气并利用氮气充满第一室内的气相，能够使氮气与低糖液体培养基接触，使低糖液体培养基中的溶解氧从低糖液体培养基向气相中释放，关于该释放的氧气，从第一室的气相经由第一壁的透氧部位利用氧吸收剂吸引吸收氧气。因此，能够使低糖液体培养基中的溶解氧在短时间内小于1％，另外，能够将溶解氧维持在小于1％，能够高效地给予低氧刺激。
在本发明的细胞制剂的制造方法中，如果在第二室内容纳氮气而降低低糖液体培养基的溶解氧，则能够通过第二室的氮气来提高阻隔性并防止氧从外部透过。由于能够利用第二室的氮气压力对第一室内进行加压，因此能够提高与第一室低糖液体培养基接触的氮气的接触压力，能够将溶解氧进一步向气相释放，能够更高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。
通过向第二室封入氮气，能够抑制脱氧剂的表面与第一壁和第二壁紧贴，能够确保脱氧剂与气相的接触面积。由此，从第一室透过第一壁透氧部位而来的氧气与脱氧剂接触的机会增加。通过在培养时加热容器，第二室内的气体膨胀并能够对第一室进行加压，能够使第一室的低糖液体培养基与氮气的接触压力上升并进一步促进低糖液体培养基的脱氧。
在本发明的细胞制剂的制造方法中，若利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁覆盖第二壁的外周和/或第一壁，并且在形成于第三壁与第二壁之间和/或第三壁与第一壁之间的第三室中容纳氮气，则能够利用第三室的氮气提高阻隔性并防止氧从外部透过。由于能够利用第三室的氮气压力对第一室内进行加压，因此能够提高与第一室低糖液体培养基接触的氮气的接触压力，能够使溶解氧更容易地向气相释放。由此，能够更高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。通过在培养时加热，第三室内的气体膨胀，能够对第一室进行加压。在该情况下，由于第三室独立于第一室和第二室，因此能够自由地设定封入于第三室的氮气的填充量，能够自由地控制第一室的内压，能够高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。
在本发明的细胞制剂的制造方法中，如果在由第一壁构成的第一室的内壁面由含有细胞固着促进材料的涂布材料实施了涂布后，将接种有外周血单核细胞的低糖液体培养基容纳于第一室进行密封，则能够进一步增加在给予低氧低糖刺激后能够回收的细胞。
根据本发明的第一方式的低氧刺激用容器，设置有能够以连通第一室和外部的方式闭塞的第一通路，包围第一室的第一壁和覆盖第一壁的第二壁具有可挠性，因此能够从第一通路向第一室容纳或排出低糖液体培养基、细胞悬浮液，另外，能够从第一通路向第一室内填充氮气等气体。此时，第一壁和第二壁变形，从而不会向第一室内吸引周围的气体等。由于能够在将第一室内保持为无菌状态的同时经由第一壁吸引第一室内低糖液体培养基中的溶解氧，而且第一壁和第二壁具有可挠性，因此不产生负压而不发生氧返回。
由于设置有能够以连通第二室与外部的方式闭塞的第二通路，因此能够使用第二通路使第二室内的气体排出，或者向第二室内填充氮气。通过向第二室封入氮气，能够抑制脱氧剂与第一壁和第二壁的紧贴，能够确保脱氧剂的表面与气相的接触面积。由此，从第一室透过第一壁透氧部位而来的氧气与脱氧剂接触的机会增加。另外，通过在培养时加热容器，第二室内的气体膨胀，能够对第一室进行加压，能够使第一室的低糖液体培养基与氮气的接触压力上升并进一步促进低糖液体培养基的脱氧。
通过在确保第一壁的透氧性、第二壁的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁与第二壁之间的第二室中容纳足够量的脱氧剂，能够在将第一室内保持为无菌状态的同时，经由第一壁吸引第一室内低糖液体培养基中的溶解氧，而且第一壁和第二壁具有可挠性，因此不会产生负压，因此也没有氧返回，能够高度地降低溶解氧，能够对培养细胞给予充分的低氧刺激。因此，本发明的第一低氧刺激用容器特别适用于用于对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激而得到有效的细胞制剂的制造方法。
根据本发明的第二方式的低氧刺激用容器，由于设置有能够以连通第一室与外部的方式闭塞的第一通路，因此能够从第一通路向第一室内容纳或排出低糖液体培养基和细胞悬浮液，另外，能够从第一通路向第一室内填充氮气等气体。由于包围第一室的第一壁和覆盖第一壁的第二壁和第三壁具有可挠性，因此在从第一通路向第一室容纳或排出低糖液体培养基或细胞悬浮液时，第一壁至第三壁能够变形。在低糖液体培养基、细胞悬浮液向第一室容纳、排出时，第一壁至第三壁变形，从而不会向第一室内吸引周围的气体等，能够将第一室内维持为无菌状态。
若设置能够以连通第三室与外部的方式闭塞的第三通路，则能够使第三室内的气体从第三通路排出，或者能够向第三室内填充氮气，由于第三室的存在而更可靠地遮蔽氧从外部向第二室的侵入。通过在培养时加热容器，第三室内的气体膨胀，能够对第一室进行加压。在该情况下，由于第三室独立于第一室和第二室，因此能够自由地设定封入于第三室的氮气的填充量，能够自由地控制第一室的内压，高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。
通过在确保第一壁的透氧性、第二壁和第三壁的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁与第二壁之间的第二室中容纳足够量的脱氧剂，能够将第一室内保持为无菌状态的同时，经由第一壁吸引第一室内低糖液体培养基中的溶解氧，第一壁和第二壁具有可挠性，因此不产生负压而不发生氧返回，因此对培养细胞给予充分的低氧刺激。因此，根据本发明，能够提供一种特别适用于在对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激而制造有效的细胞制剂的方法中使用的低氧刺激用容器。
在本发明的第二方式的低氧刺激用容器中，若还设置有能够容纳第一通路、第二通路和/或第三通路且具有氧遮蔽性和可挠性且能够开口和密封的第四室，则能够在培养中将第一通路和第三通路容纳于第四室内并密封。由此，能够防止在培养中外部的氧从第一通路和第三通路侵入而到达第一室、第二室的内部，能够维持细胞悬浮液的低氧状态。
在本发明的低氧刺激用容器中，只要第一通路、第二通路或第三通路从第一室、第二室或第三室向外侧突出地设置，分别具有用于取放各室内容物的氧遮蔽性的阻气性管，则能够防止外部的氧向外部突出而从使用且被闭塞的第一通路、第二通路或第三通路侵入第一室、第二室的内部，能够维持细胞悬浮液的低氧状态。
在本发明的第一或第二低氧刺激用容器中，如果具备能够将第一通路、第二通路或第三通路与第一室之间气密地闭塞的遮蔽单元，则能够利用遮蔽单元可靠地防止外部的氧从第一通路、第二通路微量侵入第一室，维持第一室内细胞悬浮液的高度低氧条件。
在本发明的第一或第二低氧刺激用容器中，如果在由第一壁构成的第一室的内壁面涂布含有细胞固着促进材料的涂布材料，则能够进一步增加培养后能够回收的细胞。
附图说明
图1是本发明的第一实施方式涉及的低氧刺激用容器的主视图，在图中，由于重叠多个的容器壁是透明的，因此内部因透过而被视觉辨认。
图2是图1的A-A剖视图。
图3是示出在第一实施方式涉及的低氧刺激用容器中容纳有第一通路和第三通路的状态的主视图。
图4是第二实施方式涉及的低氧刺激用容器的主视图。
图5是图4的B-B剖视图。
图6是第三实施方式涉及的低氧刺激用容器的主视图。
图7是第四实施方式涉及的低氧刺激用容器的主视图。
图8是示出本发明的实施例的结果的图表。
具体实施方式
以下，使用附图详细说明本发明的实施方式。
[第一实施方式]
图1至图3示出第一实施方式的低氧刺激用容器。第一实施方式的低氧刺激用容器1是用于容纳包含低糖液体培养基和培养细胞的细胞悬浮液并对培养细胞给予低氧刺激的容器，由可挠性的袋构成。
该低氧刺激用容器1包括：第一室10，其由第一壁11包围；第二室20，其通过由第二壁21覆盖第一壁11的外周而形成于第一壁11与第二壁21之间；第三室30，其通过由第三壁31覆盖第二壁21的外周而形成于第二壁21与第三壁31之间；以及第四室40，其以与第三室30的一端侧邻接的方式由作为第四壁的延长壁41形成。在第一室10和第二室的一端侧设置有将第一室10与低氧刺激用容器1的外部连通的第一通路12，在第三室30的一端侧设置有将第三室30与低氧刺激用容器1的外部连通的第三通路33。
第一室10至第四室40形成为扁平形状，各壁11、21、31、41分别以成对的方式对置配置。配置于最内侧的一对第一壁11被一对第二壁21从两面侧覆盖，该一对第二壁21被一对第三壁31从两外侧覆盖。一对延长壁41从一对第三壁31的一端侧分别延长而相互对置。一对第一壁11和一对第二壁21形成为大致相同的大小，配置在比它们大的一对第三壁31之间。
第一壁11具有透氧性和可挠性，例如由聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等树脂片构成。这些树脂片在25℃环境下也可以具有2000cc/m2·天·ATM以上那样的透氧度。第一壁11的形状不受到特别限定，但需要周围被密封，在一端部，在相互对置的第一壁11间以内外连通的方式气密地连接有第一通路12。
在该低氧刺激用容器1中，由于细胞悬浮液被容纳在由第一壁11包围的第一室10中，因此第一室10的内壁面成为实施低氧低糖刺激时的培养面。因此，在第一壁11不具有充分的细胞粘附性的情况下，优选至少在实施低氧低糖刺激时，在由第一壁11构成的内壁面涂布包含细胞固着促进材料的涂布材料。
作为细胞固着促进材料，例如可举出聚-D-赖氨酸(PDL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺、胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、聚-L-鸟氨酸、温度响应性材料、光响应性材料、pH响应性聚合物、光响应性聚合物基质凝胶(注册商标、康宁公司(Corning))、Geltrex(注册商标，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))等。
作为温度响应性材料，例如可举出(甲基)丙烯酰胺化合物，N-乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物，N,N-二乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺等N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷酮、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷酮、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等具有环状基的(甲基)丙烯酰胺衍生物等。
作为光响应性材料，例如可举出具有偶氮苯基的光吸收性高分子、三苯基甲烷无色氢氧化物的乙烯基衍生物与丙烯酰胺类单体的共聚物、包含螺苯并吡喃的N-异丙基丙烯酰胺凝胶等。
从临床上的安全性的观点来看，这样的涂层优选为未涂布处理，但可以考虑仅在需要提高细胞粘附性的情况下使用。在该情况下，从容易确保安全性的观点来看，优选使用胶原蛋白、明胶等生物体物质作为涂布材料中所含的细胞固着促进材料。
第二壁21具有氧遮蔽性和可挠性，例如由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)膜或者由铝箔、二氧化硅蒸镀膜、或铝蒸镀膜等形成的阻隔性膜层和由热塑性树脂形成的密封剂层构成的多层膜等树脂片构成。作为这些树脂片，可举出在25℃、80％RH环境下透氧度为5cc/m2·天·ATM以下的树脂片，更优选具有1cc/m2·天·ATM以下那样的透氧度。第二壁21的形状不受到特别限定，在本实施方式中，形成为与第一壁11相同的形状，在整个周围与第一壁11气密地接合，在第一室10的两面侧分别形成有第二室20。各第二室20、20需要将整个周围密封，在一端部以与第一壁11一体化的状态气密地连接有第一通路12。
第三壁31具有氧遮蔽性和可挠性，例如由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)、或者由铝箔、二氧化硅蒸镀膜或铝蒸镀膜等形成的阻隔性膜层和由热塑性树脂形成的密封剂层构成的多层膜等树脂片构成。作为这些树脂片，可举出在25℃、80％RH环境下透氧度为5cc/m2·天·ATM以下的树脂片，更优选为1cc/m2·天·ATM以下的透氧度。第三壁31的形状形成为比第一壁11和第二壁21大。通过密封彼此对置的第三壁31的整个周围而形成第三室30，在第三室30内容纳第一壁11和第二壁21。
在本实施方式中，密封第三室30的一端部的密封部32横穿一对第三壁31的中间位置而设置。在该密封部32中，在一对第三壁31之间配置有第一壁11和第二壁21的一端部的状态下，对置的第三壁31间被接合为密封状态。在该密封部32，在相互对置的第三壁31间以内外连通的方式气密地连接有第三通路33。
第四室40由与第三壁31同样的树脂片构成的第四壁形成，在本实施方式中，在第三壁31的一端侧形成有一对第三壁31经由密封部32而延长设置的延长壁41。即，相互对置的一对延长壁41是一对第三壁31的一部分，由同一树脂片一体地形成。该延长壁41具有氧遮蔽性和可挠性，例如由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)膜或者由铝箔、二氧化硅蒸镀膜或铝蒸镀膜等形成的阻隔性膜层和由热塑性树脂形成的密封剂层构成的多层膜等树脂片构成。作为这些树脂片，可举出在25℃、80％RH环境下透氧度为5cc/m2·天·ATM以下的树脂片，更优选为1cc/m2·天·ATM以下的透氧度。
关于延长壁41，密封部32以及两侧缘被密封，并设置有前端部能够开闭的卡盘部42。卡盘部42以将两侧缘间连续的方式设置，通过关闭能够密封前端部，在密封部32与卡盘部42之间形成有从外部气密地隔离的第四室40。在本实施方式中，在该第四室40内能够容纳配置于比密封部32靠外侧的第一通路12和第三通路33整体。另一方面，当打开卡盘部42时，能够使对置的延长壁41之间开口，能够使第一通路12和第三通路33的前端侧露出到外部。该卡盘部42优选在由加热引起的内压上升时也能够维持密封性。
设置于第一室10的一端侧的第一通路12设置为能够以连通第一室10与低氧刺激用容器1的外部的方式气密地闭塞，在中途位置分支为第一通气路13和第一通液路14。本实施方式的第一通路12包括：第一端口部15，其由密封熔接于一对第一壁11的一端部之间的成形体构成，在第一室10的内部与外部的突出部15a、15b之间设置有贯通流路；分支部16，其以使贯通流路分支的方式设置于第一端口部15的外部的突出部15b；两个可挠性管17，其构成与分支部16连接的第一通气路13和第一通液路14；以及成形端部18，其以能够闭塞的方式设置于各可挠性管17的前端。
如图3所示，以贯通第三壁31的密封部32并将第三室30与外部连通的方式设置的第三通路33包括：第三端口部35，其由密封熔接于密封部32中一对第三壁31之间的成形体构成，具有向第三室30的内部和外部突出地设置的突出部35a、35b以及在两个突出部35a、35b之间贯通设置的贯通流路；可挠性管37，其与第三端口部35连接；以及成形端部38，其以能够闭塞的方式设置于可挠性管37的前端。
这些第一通气路13、第一通液路14和第三通路33分别成为成形端部18、38能够气密地闭塞的通液口或者通气口，在向第一室10或者第三室30容纳或取出培养细胞、液体培养基、细胞悬浮液、氮气等时，能够将注射器等无菌地连接于各成形端部18、38。
根据上述低氧刺激用容器1，由于设置有以连通第一室10与外部的方式从第三室30向外侧突出并能够闭塞的第一通路12，因此能够从第一通路12向第一室10内容纳包含低糖液体培养基和培养细胞的细胞悬浮液。另外，能够从第一通路12向第一室10内填充氮、二氧化碳等气体，例如，优选填充95％N2和5％CO2的气体。
包围第一室10的第一壁11和覆盖第一壁11的第二壁21和第三壁31具有可挠性，因此在从第一通路12向第一室10的低糖液体培养基、培养细胞的容纳、取出时，第一壁11至第三壁31变形，由于第一壁11至第三壁31变形，在第一室10内不产生负压而不会吸引周围的气体等，能够将第一室10内保持为无菌状态。
由于设置有能够以连通第三室30与外部的方式闭塞的第三通路33，因此能够从第三通路33向第三室30内填充氮气等气体。填充于第三室的气体期望不含氧，优选为氮气。因此，除了能够高度地遮蔽通过第三室30从外部透过第二室20而侵入的氧之外，还能够通过被填充于第三室30内的气体的压力而对第一室10内进行加压。由此，容易在第一室10内增加与低糖液体培养基接触的气相的气压而使溶解氧向气相释放，促进第一壁11的气体交换，更高效地降低液体培养基中的溶解氧。通过在确保第一壁11的透氧性、第二壁21和第三壁31的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁11与第二壁21之间的第二室20中容纳足够量的脱氧剂50，能够将第一室10内保持为无菌状态并经由第一壁11吸引第一室内的低糖液体培养基中的溶解氧，因此能够对培养细胞给予充分的低氧刺激。
在该实施方式的低氧刺激用容器1中，具有第四室40，其具有氧遮蔽性和可挠性，能够利用与第三壁31连续的延长壁41而与第三室30相邻地开口和密封，第一通路12和第三通路33设置为能够容纳在第四室40内。因此，在对培养细胞给予低氧刺激的期间，能够将向外部突出使用的第一通路12和第三通路33容纳于由具有氧遮蔽性和可挠性的延长壁41形成的第四室40内并密封。由此，能够防止外部的氧透过第一通路12和第三通路33的管壁而侵入并到达第一室10、第二室20的内部，能够维持细胞悬浮液的低氧状态。该实施方式中的延长壁41以延长第三壁31的形式设置，但并不限定于此，也可以与第三壁31分开准备氧遮蔽性的膜，通过热熔接等将该氧遮蔽性的膜连接而形成第四室。
接着，对使用这样的低氧刺激用容器1来制造细胞制剂的方法进行说明。在本实施方式中，通过对包含单核细胞的细胞群给予低氧低糖刺激而将该外周血单核细胞转换为保护型，由此能够制造用于促进血管新生或促进轴索伸展的细胞制剂、用于脑血管障碍、缺血性心脏病或外伤性脑脊髓神经障碍的细胞制剂。
作为本实施方式的制造方法中使用的包含单核细胞的细胞群，使用由公知的方法得到的源自骨髓的单核细胞级分或源自外周血的单核细胞级分。在缺血性疾病的情况下，通常为了防止复发而实施抗凝固、抗血栓疗法，因此若考虑到骨髓液采集困难，则优选来自侵袭性低的外周血的单核细胞级分。单核细胞级分可以从骨髓液、外周血中例如使用聚蔗糖密度梯度离心分离(Ficoll density gradient centrifugation)通过公知的方法进行分离纯化。此外，例如，可以使用抗CD14抗体通过MACS、FACS生成单核细胞。
本实施方式的制造方法中的低氧低糖处理(OGD)是指，与通常的培养条件相比，在低氧浓度且低糖浓度的液体培养基中培养细胞群的处理。低氧浓度优选意味着模仿脑梗塞局部的氧浓度的浓度，低糖液体培养基的溶解氧小于1％，例如在37℃的培养状态下，使由探针型氧传感器测定的氧浓度小于1％。作为探针型氧传感器，例如可以使用BAS公司制造、型号01357FiresingGo2和型号012995OXROB3-OI遮光不锈钢O2微探头。
在本实施方式的低氧处理中，如果超过24小时，则是引起单核细胞细胞死亡的严苛氧浓度。优选的低氧条件根据包含单核细胞的细胞群的种类适当选择，能够以VEGF、TGF-β、MMP-9的生产量为指标，在其表达量极大化的条件前后进行选择。
低糖浓度优选意味着模仿脑梗塞局部的糖浓度的浓度，糖浓度为0.2g/L以上且1.0g/L以下的范围。为了发挥低氧低糖处理效果，糖浓度为1.0g/L以下是足够的，若必要以上降低糖浓度，则有时对于细胞的生存而言反而不优选。
作为液体培养基，例如可以使用伊格尔培养基、最少必需培养基(MEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI培养基(例如，RPMI 1630、RPMI 1640)、Fischer's培养基、Ham's培养基(例如F10、F12)、MCDB培养基(例如，MCDB 104、MCDB 107)等公知惯用的基础培养基和它们的混合培养基，可以根据各基础培养基的糖浓度，以成为低糖浓度的方式适当降低糖的添加量来使用。作为糖，只要单核细胞能够同化就不受到特别限制，可以使用葡萄糖、半乳糖、果糖等，通常可以使用葡萄糖。
在液体培养基中，除了上述的基础培养基以外，还可以含有5～20％的血清(例如，胎牛血清)或血清替代物(例如，Knockout Serum Replacement)、生长因子(例如，EGF、PDGF、IGF-I、IGF-II、胰岛素、IL-1、IL-6)、白蛋白、转铁蛋白、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)、细胞粘附因子(例如，纤连蛋白、层粘连蛋白)、脂质(例如，胆固醇、亚油酸、类固醇)、微量元素(铁、锌、亚硒酸、锰、铜)等公知常用的培养基添加物。
在本实施方式中，即使不添加血清、生长因子等源自动物的成分，也能够对单核细胞给予足够的血管新生和/或轴索伸展促进能力，因此在优选的实施方式中，作为培养基，能够使用不包含血清、生长因子的实质上仅由基础培养基构成的培养基。通过不含有高价且具有病毒等夹杂风险的源自动物的成分，能够提供廉价且安全的细胞制剂。
在通过本实施方式制造细胞制剂时，如下方式进行：首先，在由低氧刺激用容器1的第一壁11包围的第一室10中容纳低糖液体培养基的同时，播种外周血单核细胞并进行密封，接着，利用容纳在第一壁11与第二壁21之间的第二室20中的脱氧剂50，经由第一壁11吸引低糖液体培养基中的溶解氧，将低糖液体培养基降低至低氧浓度并维持。
此时，在构成成为细胞培养面的第一室10的内壁面的第一壁11不具有充分的细胞粘附性的情况下，优选在第一室10的内壁面涂布包含细胞固着促进材料的涂布材料。涂布方法可以采用与涂布材料相应的适当方法，例如如果是溶液状的涂布材料，则可以在向第一室10填充规定量并静置后，用磷酸缓冲生理盐水清洗。
低氧刺激用容器1是预先对整体进行了灭菌处理的容器，使用在第一室10至第四室40以及第一通路12和第三通路33的内部尽可能地除去了空气的容器。也可以预先使用第一通气路13和第三通路33对第一室10的内部和第三室30的内部进行氮气置换。另外，优选在第二室20中预先容纳脱氧剂50，将脱氧剂50容纳到第二室20中，至少直到将细胞悬浮液容纳到第一室10为止。
为了在低氧刺激用容器1的第一室10中容纳低糖液体培养基并且播种外周血单核细胞并密封，使第四室40的卡盘部42开口而使第一通路12和第三通路33的前端侧向外部引出而露出，将注射器等填充器具无菌地连接于第一通液路14的成形端部18。此时，可以将外周血单核细胞接种于低糖液体培养基之后容纳于第一室10，也可以在第一室10容纳低糖液体培养基之后，通过将外周血单核细胞的悬浮液投入第一室10来播种。在第一室10内容纳有包含液体培养基和外周血单核细胞的细胞悬浮液。在容纳后将第一通液路14密封。在将外周血单核细胞和低糖液体培养基从第一通路12向第一室10容纳时，优选在氮气氛下操作低氧刺激用容器1。
在容纳低糖液体培养基和外周血单核细胞之前或之后，从第一通气路13向第一室10内容纳氮气。关于与低糖液体培养基和外周血单核细胞一起混入到第一室10中的空气，可以在之后吹入氮气来进行置换，也可以先在第一室10中填充氮气，通过追加填充低糖液体培养基来从第一室10排出低糖液体培养基组分的氮气。在从第一通液路14注入低糖液体培养基和外周血单核细胞时它们的一部分残留于第一通液路14的情况下，也可以进行从第一通液路14填充氮而将低糖液体培养基和/或外周血单核细胞压入第一室10内这样的操作。
通过在第一室10中容纳氮气，使低糖液体培养基的溶解氧暂时向气相释放后使其透过第一壁11。由此，容易使低糖液体培养基的溶解氧向第二室20释放。在容纳后将第一通气路13闭塞而密封。可适当选择容纳于第一室10的氮气量，例如，在比培养温度低的室温下，也可以相对于第一室10的体积的填充率设为95％～100％，之后设为培养温度时，以氮气相对于细胞悬浮液的压力成为加压状态的方式进行填充。若第一室10的氮气的体积比过少，则无法充分得到充分的由氮气引起的溶解氧的释放效果。由此，在第一室10内形成由包含低糖液体培养基和外周血单核细胞的细胞悬浮液构成的液相和由氮气构成的气相这两相。
在容纳低糖液体培养基和外周血单核细胞后，从第三通路33向第三室30容纳氮气。通过向该第三室30容纳氮气，覆盖第二室20的第二壁21的外周围由氮气的层来覆盖，防止外部的空气与第二壁21的外表面直接接触。同时，通过第三室30的氮气压力对第一室10内进行加压，第一室10的气相的氧容易透过第一壁11向第二室20释放。在容纳后将第三通路33密封。第三室30的氮气的气压例如也可以在比培养温度低的室温下，以相对于第三室30的体积的填充率设为95％～100％。若氮气压过低，则难以得到向第三室30填充氮气的效果。在该状态下，将第一通路12的第一通液路14和第一通气路径13以及第三通路33从第四室40的开口容纳到第四室40内，关闭卡盘部42。由此，消除使第一通路12和第三通路33向外部露出的部位，避免与外气的氧的接触。
接着，将该低氧刺激用容器1，即，将第一室10中容纳细胞悬浮液和氮气、第二室20中容纳脱氧剂50、第三室30中容纳氮气、第四室40的开口被卡盘部42闭塞的状态的低氧刺激用容器1，配置在能够保持在规定的培养温度的恒温箱、恒温室等适当的场所进行培养。在该培养中，使低糖液体培养基中的溶解氧向容纳于第二室20的脱氧剂50吸引，高度地降低溶解氧浓度，由此给予低氧低糖刺激。具体而言，通过将低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％并维持，对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激。对低氧刺激用容器1的培养条件不要求特殊的设定，可以是在一般医院等环境下能够实施的条件。例如，配置低氧刺激用容器1的部位的气氛可以是通常的大气，培养温度可以适当选择，例如也可以设为36.6℃～37.5℃。
为了利用第二室20的脱氧剂50吸引第一室10的低糖液体培养基的溶解氧，在高度地遮蔽从外部侵入第二室20的氧的状态下，通过容纳于第二室20的足够量的脱氧剂50实施高度脱氧处理来进行。在本实施方式中，通过向第三室30容纳氮气来防止透过第二壁21而侵入第二室20的氧，另外，通过将第一通路12和第三通路33容纳并密封于第四室40，防止透过第一通路12的两个可挠性管17和第三通路33的可挠性管37的各管壁而侵入的氧，在该状态下利用第二室20的足够的脱氧剂50吸引脱氧。虽然不受到特别限定，但作为脱氧剂50，例如可以使用铁类氧吸收材料，也可以以相对于第一室10和第二室20内的氧量成为同等以上的氧吸收量的方式将脱氧剂50容纳于第二室20。
通过将低糖液体培养基降低至低氧浓度并维持，对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激而将单核细胞转换为保护型。将外周血单核细胞转换为保护型可以是包含干细胞并转换为分泌细胞生长因子的类型。
在本实施方式中，这样的利用脱氧剂50吸引低糖液体培养基的溶解氧的培养时间可为从播种起进行12小时以上且小于24小时、例如18小时左右。此时，优选将低糖液体培养基的溶解氧在播种后1小时以内降低至小于1％，然后将低糖液体培养基的溶解氧维持在小于1％。在低糖液体培养基的溶解氧过多的情况下，无法将外周血单核细胞转换为保护型，无法期望得到的细胞制剂的充分效果。虽然培养时间短不能得到充分的效果，但由于外周血单核细胞置于低糖低氧的条件下，因此如果培养时间超过24小时，则有可能引起单核细胞的细胞死亡，不优选。在将低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％的时间过长的情况下，低氧低糖刺激不足，并且外周血单核细胞的活性容易降低。
如上所述得到的细胞培养物可以直接或与药学上可接受的载体一起制剂化。作为药学上可接受的载体，例如可以举出生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助药的等渗液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)等注射用的水性液。包含本发明的细胞培养物的细胞制剂例如也可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、无痛化剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂、抗氧化剂等。
作为将所制造的细胞制剂送达患部的方法，例如可以考虑利用外科手段的局部移植、静脉内给药、局部注入给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌肉内给药、脑内给药、脑室内给药、髓腔给药、或动脉内给药等。基于向患者的细胞注射的移植例如在用于神经系统的修复的情况下，在使用人工脑脊髓液、生理盐水等来将移植的细胞悬浮的状态下积存于注射器，露出因手术而损伤的神经组织，利用注射针直接注入至该损伤部位。可以向损伤部位的附近移植，通过向脑脊髓液中的注入也能够期待效果。通过向静脉内的注入也能够期待效果。因此，能够以通常的输血的要领移植，能够进行病房中的移植操作，在这一点上是优选的。
根据以上所述的本实施方式的制造方法，包围第一室10的第一壁11和覆盖第一壁11的第二壁21具有可挠性，第一壁11和第二壁21能够变形。因此，在将低糖液体培养基、外周血单核细胞容纳于第一室10或从第一室10取出时，第一壁11和第二壁21变形，从而不会向第一室内吸引周围的气体等，能够将第一室10保持为无菌状态。通过在确保第一壁11的透氧性、第二壁21的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁11与第二壁21之间的第二室20中容纳足够量的脱氧剂50，能够在将第一室10保持为无菌状态的同时经由第一壁11吸引第一室10内低糖液体培养基中的溶解氧。第一壁11和第二壁21具有可挠性，在第一室10内、第二室20内不产生负压，因此不会发生氧返回。因此，能够将溶解氧在播种后1小时以内降低至小于1％并维持，由此在24小时以下的时间对外周血单核细胞给予充分的低氧低糖刺激，能够将外周血单核细胞转换为保护型。
因此，能够通过简易的结构在闭塞系统中对外周血单核细胞实施适当的低氧低糖刺激来制造有效的细胞制剂。即，无需为了将液体培养基处于低氧状态、并维持低氧状态而在脱氧气氛(氮气气氛)中进行作业，因此不需要例如CPC等大型装置。因此，即使在没有特别设备的医院等设施中，也能够使外周血单核细胞变化为保护型，制造用于促进血管新生或轴索伸展的细胞制剂、用于脑血管障碍、缺血性心脏病或外伤性脑脊髓神经障碍的细胞制剂等。
在该第一实施方式的制造方法中，通过在第一室10内与低糖液体培养基一起容纳氮气而降低低糖液体培养基的溶解氧，能够使氮气与低糖液体培养基接触，使溶解氧从低糖液体培养基向气相中释放，从第一室10的气相经由第一壁11通过脱氧剂50吸收氧。因此，能够使低糖液体培养基中的溶解氧在短时间内小于1％，能够将溶解氧维持为小于1％，能够高效地给予低氧刺激。
在第一实施方式的制造方法中，利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁31包围第二壁21的外周，并且在形成于第二壁21与第三壁31之间的第三室30中容纳氮气，因此能够利用第三室30的氮气提高阻隔性而防止氧从外部透过，能够利用第三室30的氮气压力对第一室10内进行加压，因此能够防止氧从外部侵入第一室10内。同时，容易在第一室10内增加与液体培养基接触的气相的气压而使溶解氧向气相释放，促进第一壁11的气体交换，能够高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。由于在第三室30中容纳氮气，因此在培养时，通过对低氧刺激用容器1整体进行加温，第三室30内的气体也膨胀，能够利用第三室30内的气体对第一室10进行加压。因此，能够通过氮气的填充量来调整第一室10的加压力，第一室10内的压力的控制自由度提高，低糖液体培养基中的溶解氧更高效地降低。
[第二实施方式]
接着，对第二实施方式进行说明。图4和图5示出第二实施方式涉及的低氧刺激用容器1。
低氧刺激用容器1与第一实施方式同样地是用于容纳包含低糖液体培养基和培养细胞的细胞悬浮液并对培养细胞给予低氧刺激的可挠性袋。低氧刺激用容器1包括：第一室10，其由第一壁11包围；以及第二室20，其通过由第二壁21覆盖第一壁11的外周而形成于第一壁11与第二壁21之间。在第一室10和第二室的一端侧设置有将第一室10与外部连通的第一通路12，在第二室20的一端侧设置有将第二室20与外部连通的第二通路23。
第一室10和第二室20形成为扁平形状，各壁11、12分别以成对的方式对置配置。配置于最内侧的一对第一壁11被一对第二壁21从两面侧覆盖。一对第一壁11和一对第二壁21形成为大致相同的大小。
第一壁11具有透氧性和可挠性，由与第一实施方式的第一壁11同样的树脂片形成。第一壁11的形状不受到特别限定，但需要周围被密封，在一端部，在相互对置的第一壁11间以内外连通的方式气密地连接有第一通路12。
第二壁21具有氧遮蔽性和可挠性，例如由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)膜或者由铝箔、二氧化硅蒸镀膜、或铝蒸镀膜等形成的阻隔性膜层和由热塑性树脂形成的密封剂层构成的多层膜等树脂片构成。作为这些树脂片，可举出在25℃、80％RH环境下透氧度为5cc/m2·天·ATM以下的树脂片，更优选期望为1cc/m2·天·ATM以下的透氧度。第二壁21的形状不受到特别限定，在本实施方式中，形成为与第一壁11相同的形状，在整个周围与第一壁11气密地接合，在第一室10的两面侧分别形成有第二室20。各第二室20需要将整个周围密封，在一端部以与第一壁11一体化的状态气密地连接有第一通路12。
设置于第一室10的一端侧的第一通路12设置为能够以连通第一室10与低氧刺激用容器1的外部的方式气密地闭塞，在中途位置分支为第一通气路13和第一通液路14。本实施方式的第一通路12包括：第一端口部15，其由密封熔接于一对第一壁11的一端部之间的成形体构成，在第一室10的内部与外部的突出部15a、15b之间设置有贯通流路；分支部16，其以使贯通流路分支的方式设置于第一端口部15的外部的突出部15b；两个阻气管19，其构成与分支部16连接的第一通气路13和第一通液路14；以及成形端部18，其设置于各阻气管19的前端。阻气管19例如由不锈钢管、内插有气体屏蔽膜的树脂管等构成。
设置于第二壁21的一端侧的第二通路23设置为将第二室20的内部与低氧刺激用容器1的外部连通。第二通路23包括：第二端口部25，其由密封熔接于一对第二壁21的一端部之间的成形体构成，在第一壁11与第二壁21之间的第二室20的内部与外部的突出部25a、25b之间设置有贯通流路；以及成形端部28，其以能够闭塞贯通流路的方式设置于第二端口部25的外部的前端。
第一通气路13、第一通液路14和第二通路23分别成为成形端部18、28能够气密地闭塞的通液口或者通气口，在向第一室10或者第二室20容纳或取出培养细胞、液体培养基、细胞悬浮液、氮气等时，能够将注射器等无菌地连接于各成形端部18、28。
在使用本实施方式的低氧刺激用容器1时，从第一通液路14向第一室10容纳包含液体培养基和培养细胞的细胞悬浮液并进行密封，并且从第一通气路径13向第一室10填充氮气并密封。在第二室20中容纳有用于经由第一壁11吸引液体培养基中的溶解氧的脱氧剂50并密封。在本实施方式中，在第一室10的两面分别独立地设置有第二室20，在各第二室20中容纳有脱氧剂50。从第二通路23向该第二室20填充氮气并密封。
在使用低氧刺激用容器1与第一实施方式同样地通过对包含单核细胞的细胞群给予低氧低糖刺激而将外周血单核细胞转换为保护型来制造细胞制剂时，在第一室10中容纳低糖液体培养基的同时播种外周血单核细胞并密封，接着，利用容纳在第一壁11与第二壁21之间的第二室20中的脱氧剂50，经由第一壁11吸引低糖液体培养基中的溶解氧，然后将低糖液体培养基降低至低氧浓度并维持，由此对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激而将单核细胞转换为保护型。
为了在第一室10中容纳低糖液体培养基的同时播种外周血单核细胞并进行密封，将第一通液路14的前端侧的注射器等填充器具无菌地连接来进行，在第一室10内容纳包含液体培养基和外周血单核细胞的细胞悬浮液而将第一通液路14密封。
在容纳细胞悬浮液的前后，从第一通气路13向第一室10内容纳氮气，密封第一通气路13。在从第一通液路14注入低糖液体培养基和外周血单核细胞时它们的一部分残留于第一通液路14的情况下，也可以进行从第一通液路14填充氮而将低糖液体培养基和/或外周血单核细胞压入第一室10内这样的操作。由此，在第一室10内形成由包含液体培养基和外周血单核细胞的细胞悬浮液构成的液相和由氮气构成的气相这两相。
在将细胞悬浮液容纳于第一室10内之后，从第二通路23向第二室20容纳氮气。通过向该第二室20容纳氮气，使包围第一室10的第二室20的氧浓度降低，并且利用第二室20的氮气压力对第一室10内进行加压，第一室10的气相的氧容易透过第一壁11而向第二室20释放。在容纳后对第二通路23进行密封。
在该状态下，将低氧刺激用容器1配置于能够保持于规定的培养温度的恒温箱、恒温室等而进行培养。培养条件与第一实施方式相同。由此，利用容纳于第二室20的脱氧剂50经由第一壁11吸引低糖液体培养基中的溶解氧，高度降低溶解氧浓度，将低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％并维持，由此对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激。通过将低糖液体培养基降低至低氧浓度并维持，对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激，将单核细胞转换为保护型，制造细胞制剂。
即使是使用了第二实施方式的低氧刺激用容器1的细胞制剂的制造方法，也能够得到与第一实施方式相同的作用效果。
例如，由于设置有以连通第一室10与外部的方式比第二室20向外侧突出并能够闭塞的第一通路12，包围第一室10的第一壁11和覆盖第一壁11的第二壁21具有可挠性，因此能够从第一通路12向第一室10容纳或取出液体培养基、培养细胞，此时第一壁11和第二壁21能够变形。在将液体培养基、培养细胞容纳或取出到第一室10时，第一壁11和第二壁21变形，从而不会向第一室内吸引周围的气体等，能够将第一室10内保持为无菌状态。
由于设置有以连通第二室20与外部的方式并能够闭塞的第二通路23，因此能够使用第二通路23排出第二室20内的气体，或者向第二室20内填充氮气。因此，能够降低第二室20内的氧分压，防止氧透过第一壁11而侵入第一室10内。
通过在确保第一壁11的透氧性、第二壁21的氧遮蔽性、与外部的遮蔽性等的同时在第一壁11与第二壁21之间的第二室20中容纳足够量的脱氧剂50，能够在将第一室10内保持为无菌状态的同时经由第一壁11吸引第一室10内的低糖液体培养基中的溶解氧，能够对培养细胞给予充分的低氧刺激。
由于在第二室20内容纳氮气而降低低糖液体培养基的溶解氧，因此能够利用第二室20的氮气提高阻隔性而防止氧从外部透过，而且能够利用第二室20的氮气压力对第一室10内进行加压，因此能够防止氧从外部侵入第一室10内。同时，容易在第一室10内增加与液体培养基接触的气相的气压而使溶解氧向气相释放，促进第一壁11的气体交换，能够更高效地降低低糖液体培养基中的溶解氧。通过向第二室20封入氮气，能够抑制脱氧剂50与第一壁11和第二壁12的密合，确保脱氧剂50与气相的接触面积。因此，从第一室10透过第一壁11而来的氧气与脱氧剂50接触的机会增加，脱氧剂50的脱氧作用提高。培养时，通过加热低氧刺激用容器1，第二室20内的气体膨胀，第一室10的内压增加，第一室10的低糖液体培养基与氮气的接触压力上升，低糖液体培养基的脱氧进一步促进。
由于第一通路12和第二通路23由氧遮蔽性的阻气管形成，因此能够防止氧透过向外部突出的第一通路12和第二通路23的管壁而侵入到达第一室10和第二室20的内部，充分降低细胞悬浮液的溶解氧。
[第三实施方式]
进而，对第三实施方式进行说明。图6示出第三实施方式涉及的低氧刺激用容器1。第三实施方式涉及的低氧刺激用容器1中，第一通路12的部分结构不同，并具备能够将第一通路12和第二通路23与第一室10气密地闭塞的遮蔽单元51。其他与第二实施方式的低氧刺激用容器1相同。
第三实施方式的第一通路12通过在第一室10的内部的一端侧将彼此相对的一对第一壁11以条状熔接而形成通路延长部11a，配置于第一端口部15的第一室10内部的突出部15a在通路延长部11a的中途位置开口。
能够将第一通路12和第二通路23与第一室10气密地闭塞的遮蔽单元51由夹持构件构成，该夹持构件具备一对杆，该一对杆从一对第二壁21的两外侧夹入并遮蔽，以使得将相互对置的一对第一壁11和第二壁21的整个宽度横截。该遮蔽单元51通过夹入第一室10的通路延长部11a的位置，将容纳有细胞悬浮液的第一室10与第一通路12的第一端口部15之间闭塞。通过利用该遮蔽单元51从外侧夹入具有氧遮蔽性的一对第二壁21，也能够气密地遮蔽与容纳有细胞悬浮液的第一室10对应的第二室20和第二通路23的配置有第二端口部25的部位。
因此，即使外部的氧从第一通路12、第二通气通路23微量侵入第一室10、第二室20，也能够通过遮蔽单元51抑制在第一室10和第二室20的一端侧，侵入的氧不会到达容纳有细胞悬浮液的第一室10内，维持第一室10内的细胞悬浮液的高度低氧条件。
根据第三实施方式的低氧刺激用容器1，除了能够得到与第二实施方式相同的作用效果之外，还具备能够将第一通路12和第二通路23与第一室10气密地闭塞的遮蔽单元51，因此能够更可靠地给予低氧低糖刺激。
[第四实施方式]
进而，对第四实施方式进行说明。图7示出第四实施方式涉及的低氧刺激用容器1。该低氧刺激用容器1除了第一通路12的部分结构不同以外，与第二实施方式的低氧刺激用容器1相同。
第四实施方式的第一通路12设置有遮蔽单元51，其由用于对设置于第一端口部15中的第一室10的内部与外部的突出部15a、15b之间的贯通流路进行开闭的阀构成。通过该遮蔽单元51，第一通路12与第一室10之间连通或气密地闭塞。其他与第二实施方式的低氧刺激用容器1相同。
根据第四实施方式的低氧刺激用容器1，除了能够得到与第二实施方式同样的作用效果以外，还具备能够将第一通路12和第二通路23与第一室10气密地闭塞的遮蔽单元51，因此即使外部的氧微量侵入第一通路12，也能够可靠地防止由遮蔽单元51侵入的氧到达容纳有细胞悬浮液的第一室10内，维持第一室10内的细胞悬浮液的高度低氧条件，更可靠地给予低氧低糖刺激。
上述各实施方式能够在本发明的范围内适当变更。例如，在上述中，对在第一室10中与细胞悬浮液一起容纳氮气的例子进行了说明，但并不受到特别限定，也可以仅在第一室10中容纳细胞悬浮液。
对上述低氧刺激用容器1的每个面说明了利用第二壁21包围第一壁11、或利用第三壁31包围第二壁21来形成第二室20、第三室30的示例，但并不受到特别限定。例如，也可以将形成第一室10的第一壁11整体容纳于由第二壁21形成的第二室20内，或者将形成第二室20的第二壁21整体容纳于由第三壁31形成的第三室30内。
在上述实施方式中，作为第一壁11而说明了整体由具有透氧性的树脂片构成的示例，但不受到特别限定，只要是在第一壁11的至少一部分具有透氧性的片即可。另外，在上述实施方式中，对由第二壁21包围第一壁11的外周全部的示例进行了说明，但并不受到特别限定，也可以通过利用第二壁21至少覆盖第一壁11中具有透氧性的部位而在第一壁11与第二壁21之间形成容纳有脱氧剂50的第二室20。
在该情况下，例如，也可以使用氧遮蔽性片和透氧性片作为第一壁11，使氧遮蔽性片与透氧性片相互对置而将周围密封，由此形成第一室10，也可以仅将第一壁11中的透氧性片利用氧遮蔽性的第二壁21覆盖，由此仅在第一室10的一方的侧面侧形成第二室20，在该第二室20中容纳脱氧剂50。
也可以使由氧遮蔽性片构成的第一壁11对置而形成第一室10的同时，在第一壁11的一部分设置开口，利用透氧性片封堵该开口，由此在第一壁11的一部分形成具有透氧性的部位，进而，也可以仅利用氧遮蔽性的第二壁21覆盖第一壁11中具有透氧性的部位，从而仅在第一室10的侧面侧的一部分形成第二室20，在该第二室20中容纳脱氧剂50。
实施例
以下举出实施例对本发明进行具体说明，但本发明完全不限定于实施例。以下实施例严格按照美国卫生研究所实验动物管理和使用相关的指导原则进行，在新泻大学动物实验伦理委员会批准后实施。
[实施例1]
(局部脑缺血)
短暂性局部脑缺血使用体重290～320克的雄性的斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠，用有机硅涂布尼龙单丝进行诱导。具体而言，通过吸入70％一氧化二氮和30％氧的混合物中的1.5％异氟烷(isoflurane)，对大鼠进行麻醉。将直径0.148mm的尼龙单丝用于血管堵塞。用热将尼龙单丝的前端弄圆。将缝合线的末端11mm用直径0.350mm的有机硅涂布。通过经由外颈动脉将栓塞线插入内颈动脉，闭塞中大脑动脉(MCA)。在缺血的90分钟后，为了恢复血流而抽出栓塞线。
由此，形成了因微小管结合蛋白质2(MAP2)的存在而决定的缺血中心和半暗带(penumbra)的区域。为了通过再灌注来救出半暗带组织的治疗时间范围为90分钟。
(外周血单核细胞)
将大鼠或人外周血与磷酸缓冲生理盐水(PBS)混合，总量为35mL，层叠在50mL锥形管中的聚蔗糖(GE Healthcare Japan Ficoll-Paque Premium1.084)15mL上，以400×g离心30分钟，分离了出现在聚蔗糖层上的外周血单核细胞(PBMC)层。
(低氧低糖刺激)
使用图1至图3所示的低氧刺激用容器1进行低氧低糖刺激。
关于低氧刺激用容器1，以成为与第一室10和第二室20内的氧量同等以上的氧吸收量的方式，预先将由铁类的氧吸收材料构成的脱氧剂50容纳于第二室20。
另外，由于低氧刺激用容器1的第一壁11不显示对外周血单核细胞的足够的细胞粘附性，因此使用聚-D-赖氨酸(PDL)溶液对第一室10的内壁面实施了涂布。关于涂布，将10μg/ml聚-D-赖氨酸(PDL)溶液填充到第一室10中，37℃下静置1小时，然后以磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤来进行。
进而，在将第一室10至第三室30密封的状态下，分别在氮气置换后进行脱气，由此准备低氧刺激用容器1。
关于低糖液体培养基，低糖培养基中使用DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基，Dulbecco’s modified Eagles medium)，其糖浓度为1.0g/L。进一步添加N1补充剂(supplement)来制备。
使如上所述得到的外周血单核细胞和低糖液体培养基存在于50ml的悬浮液中，从第一通液路14向第一室10容纳，密封第一通液路14。从第一通气路13向第一室10以残留氧气被完全置换的量填充氮气，密封第一通气路13。进而，从第三通路33向第三室30以完全置换的量填充氮气，密封第三通路33。
将该低氧刺激用容器1配置在37℃细胞培养装置内，培养18小时。培养开始后，将外周血单核细胞容纳于第一室10后大约1小时，低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％，之后整个培养期间维持低于1％的溶解氧。培养期间结束后，在第一室10的细胞悬浮液中加入5％胰蛋白酶液，剥离细胞，得到已OGD前处理后的外周血单核细胞(大鼠和人PBMC)。
(细胞移植)
在本实施例中，为了成为相同的生理学状态，在脑缺血后第七天排除平均-2SD以下体重的大鼠。另外，用PBS 300μL稀释1×106个的人PBMC。在脑缺血后第七天，随机选择用于短暂性MCAO(中大脑动脉闭塞手术)的大鼠，缓慢地经过3分钟经由外颈动脉(ECA)的断端移植PBMC。
(感官运动评价)
感官运动评价在脑缺血前和后、第1天、第4天、第7天、第10天(移植后第3天)、第14天(移植后第7天)、第21天(移植后第14天)和第28天(移植后第21天)通过拐角测试(cornertest)进行。在拐角测试中，实施20次老鼠从拐角到左右某一个逃脱的测试，计数从右侧脱逃的次数。将结果示于图8的图表。横轴为天数，纵轴为从右侧脱逃的次数。
[比较例1]
脑梗塞后，除了对大鼠给药PBS以外，全部与实施例1同样地移植到大鼠，通过拐角测试进行感官运动评价。将结果示于图8的图表。
[比较例2]
按照上述专利文献1中记载的方法，不用OGD刺激袋，而用PBS 300μL稀释了由细胞培养用6孔板进行了OGD前处理的5×105个的人PBMC。其他全部与实施例1同样地移植到大鼠，通过拐角测试进行感官运动评价。将结果示于图8的图表。
[比较例3]
按照上述专利文献1中记载的方法，不用OGD刺激袋，而用PBS 300μL稀释了由细胞培养用6孔板进行了OGD前处理的1×106个的人PBMC。其他全部与实施例1同样地移植到大鼠，通过拐角测试进行感官运动评价。将结果示于图8的图表。
[比较例4]
按照上述专利文献1中记载的方法，不用OGD刺激袋，不用细胞培养用6孔板进行低氧刺激，用PBS 300μL稀释进行了培养基糖浓度4.5g/L的前处理的1×106个的人PBMC(normoxia，常氧)。其他全部与实施例1同样地移植到大鼠，通过拐角测试进行感官运动评价。将结果示于图8的图表。
(低氧低糖刺激)
为了诱导比较例2的低氧低糖刺激(OGD)，用PBS两次充分清洗含血清培养基，除去血清成分。接着，置换为低糖培养基，用95％N2和5％CO2的混合气体，在低氧腔室中置换1小时，之后闭塞18小时。低糖培养基使用DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基，Dulbecco’smodified Eagles medium)，其糖浓度为1.0g/L。低氧腔室内的氧浓度在1小时内降低至小于1％，在4小时内降低至0.1～0.4％，通过实验维持。
由以上的实施例1和比较例1、2的比较可知，移植了使用低氧刺激用容器1的已OGD前处理后的外周血单核细胞的实施例1的PBMC给药组的大鼠，通过实施20次的拐角测试，与不给药的比较例1的大鼠相比，发现了显著性差异，大幅改善了功能恢复的效果。另外，移植了使用低氧刺激用容器1的已OGD前处理后的外周血单核细胞的实施例1的PBMC给药组的大鼠与移植了使用细胞培养6孔板的已OGD前处理后的外周血单核细胞的比较例2的PBMC给药组的大鼠相比，功能恢复的效果显著。
与此相对，移植了没有OGD刺激的PBMC给药组(normoxia，常氧)的比较例4、移植了使用细胞培养6孔板的已OGD前处理后的外周血单核细胞的比较例3中，对于不给药细胞的比较例的大鼠没有发现显著的改善。
[实施例2和实施例3]
通过与上述实施例1同样的方法，准备用聚-D-赖氨酸(PDL)溶液涂布的有PDL的低氧刺激用容器1(实施例2，N＝6)和未实施涂布的无PDL的低氧刺激用容器(实施例3，N＝1)，与实施例1同样地进行了外周血单核细胞的低氧低糖刺激方法的培养。
然后，向低氧刺激用容器1的第一室10的细胞悬浮液中加入5％胰蛋白酶液，剥离细胞，回收已OGD前处理后的外周血单核细胞(大鼠和人PBMC)，在300×G下实施10分钟离心分离。抽吸上清液，用1ml的PBS将细胞块悬浮后，混合细胞悬浮液10μl和台盼蓝(TrypanBlue)溶液10μl，用自动细胞计数器(Countss II FL Automated Cell Counter，赛默飞世尔科技有限公司)测定细胞数。
将结果示于表1。
[表1]
实施例2 实施例3
PDL涂层 有 无
活细胞 3.9±1.5×105 2.0×105
死细胞 1.8±1.1×106 1.1×106
细胞总数 2.3±1.1×106 1.3×106
如表1所示，在使用了有PDL涂层的低氧刺激用容器1的实施例2中，生存的细胞数和整体的细胞数多，能够回收给予了低氧低糖刺激的足够量的细胞。
另一方面，在使用无PDL涂层的低氧刺激用容器1的实施例3中，虽然比实施例2少，但能够回收给予低氧低糖刺激的细胞。即使是通过没有该PDL涂层的实施例3的低氧刺激用容器进行低氧低糖刺激的PBMC，在感官运动评价试验中也能够确认低氧低糖刺激的PBMC给药组与PBS给药组相比显示出显著的改善。
[符号说明]
1：低氧刺激用容器；
10：第一室；
11：第一壁；
11a：通路延长部；
12：第一通路；
13：第一通气路；
14：第一通液路；
15：第一端口部；
15a、15b：突出部；
16：分支部；
17：可挠性管；
18：成形端部；
19：阻气管；
20：第二室；
21：第二壁；
23：第二通路；
25：第二端口部；
25a、25b：突出部；
28：成形端部；
30：第三室；
31：第三壁；
32：密封部；
33：第三通路；
35：第三端口部；
35a、35b：突出部；
37：柔性管；
38：成形端部；
40：第四室；
41：延长壁；
42：卡盘部；
50：脱氧剂；
51：遮蔽单元。

Claims (12)

1.一种细胞制剂的制造方法，通过对外周血单核细胞给予低氧低糖刺激并将该外周血单核细胞转换为保护型来制造用于促进血管新生或轴索伸展的细胞制剂，其中，
在被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围的第一室中，容纳接种有所述外周血单核细胞的糖浓度1.0g/L以下的低糖液体培养基并密封；
利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位，在形成于所述第一壁与所述第二壁之间的第二室中容纳脱氧剂，由此经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；
将所述低糖液体培养基的溶解氧降低至低于1％并维持，由此对所述外周血单核细胞给予24小时以下的所述低氧低糖刺激。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂的制造方法，其中，
在所述低糖液体培养基中接种所述外周血单核细胞后，将溶解氧在1小时以内降低至小于1％，然后将所述低糖液体培养基的溶解氧维持在小于1％。
3.根据权利要求1所述的细胞制剂的制造方法，其中，
在所述第一室内与所述低糖液体培养基一起容纳氮气，从而降低所述低糖液体培养基的溶解氧。
4.根据权利要求1所述的细胞制剂的制造方法，其中，
在所述第二室内容纳氮气而降低所述低糖液体培养基的溶解氧。
5.根据权利要求1所述的细胞制剂的制造方法，其中，
利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁覆盖所述第二壁的外周和/或第一壁，并且在形成于所述第三壁与所述第二壁之间和/或所述第三壁与第一壁之间的第三室中容纳氮气，从而降低所述低糖液体培养基的溶解氧。
6.根据权利要求1所述的细胞制剂的制造方法，其中，
在由所述第一壁构成的所述第一室的内壁面通过含有细胞固着促进材料的涂布材料实施涂布后，将播种有所述外周血单核细胞的所述低糖液体培养基容纳于所述第一室并密封。
7.一种低氧刺激用容器，用于对培养细胞给予低氧刺激，包括：
第一室，其被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围，容纳有低糖液体培养基和所述培养细胞并被密封；
第二室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位而形成于所述第一壁与所述第二壁之间并被密封；
脱氧剂，其容纳于所述第二室，经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；
第一通路，以连通所述第一室和外部的方式设置，能够气密地闭塞；以及
第二通路，以连通所述第二室和外部的方式设置，能够气密地闭塞。
8.一种低氧刺激用容器，用于对培养细胞给予低氧刺激，包括：
第一室，其被至少一部分具有透氧性并具有可挠性的第一壁包围，容纳有包含低糖液体培养基和所述培养细胞的细胞悬浮液并被密封；
第二室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第二壁至少覆盖所述第一壁中具有透氧性的部位而形成于所述第一壁与所述第二壁之间并被密封；
脱氧剂，其容纳于所述第二室，经由所述第一壁吸引所述低糖液体培养基中的溶解氧；
第三室，其通过利用具有氧遮蔽性和可挠性的第三壁覆盖所述第二壁的外周和/或第一壁而形成于所述第三壁与所述第二壁之间和/或所述第三壁与第一壁之间并被密封；
第一通路，以连通所述第一室和外部的方式设置，能够气密地闭塞；以及
第三通路，以连通所述第三室和外部的方式设置，能够气密地闭塞。
9.根据权利要求7或8所述的低氧刺激用容器，其中，
还设置有第四室，所述第四室能够容纳所述第一通路、所述第二通路和/或所述第三通路，具有氧遮蔽性和可挠性并能够开口和密封。
10.根据权利要求7或8所述的低氧刺激用容器，其中，
所述第一通路、所述第二通路或第三通路从所述第一室、所述第二室或所述第三室向外侧突出地设置，分别具有用于取放各室内容物的氧遮蔽性的阻气性管。
11.根据权利要求7或8所述的低氧刺激用容器，包括：
遮蔽单元，其能够将所述第一通路、所述第二通路或第三通路与所述第一室之间气密地闭塞。
12.根据权利要求7或8所述的低氧刺激用容器，其中，
在由所述第一壁构成的所述第一室的内壁面涂布有包含细胞固着促进材料的涂布材料。
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