JP5229342B2 - 血清調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、血清調製方法に関する。

現在、再生医療分野においては、対象者から採取した幹細胞を体外で増殖又は分化させたうえで対象者に移植することで対象者の組織の再生を促進させるという研究が行われている。幹細胞は、種々の組織や器官に分化する多分化能を有し、再生医療のカギを握る細胞として注目されている。

幹細胞の体外培養増殖では、培地に対して血清を添加すれば効果的であることが知られているが、ヒトの治療を目的とする場合には、ヒト以外の動物を由来とする血清を用いることは安全上の問題から避けるべきことであり、ヒト由来、特に対象者から採取した血液より調製した血清を用いることが要求される。また、血液検査と比べると再生医療の分野における幹細胞の培養には、比較的より多くの血清が必要となる。

このような血清を調製する方法としては、例えばガラス粉末からなる血液凝固促進個体が収容された採血管を用いるという方法が特許文献１に開示されている。

特開２０００−０００２２８号公報

しかし、特許文献１に記載の方法は、血液の検査を目的とする容量の小さな採血管を用いるため、幹細胞の培養に必要な量の血清を調製するためには、何度も調製操作を行わなければならず、実用に適さない。

また、調製された血清については、使用するまで一時的に冷凍又は冷蔵保存することが多い。そのため採血管から保存用の容器に移し替える作業が必要となり、この作業を何度も行うことで血清が微生物に汚染される可能性が高くなる。また、このような採血管には血清分離剤が添加されている場合が多く、この血清分離剤から血清中に不純物が混入してしまう可能性も否定できない。従ってこのような安全性や衛生面からもヒトを対象とした再生医療の分野において特許文献１に開示されている方法を用いることは適当ではない。さらに、既存の血清調製用の採血管では、採血管の構造上、血清以外の成分は取り出すことが困難であることに加え、血餅となってしまっているため再利用することは不可能である。

上述のように幹細胞の培養に際して、大量の血清を調製するのに適した血清調製容器の開発が望まれている。

本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、大量の血清を高い安全性を確保しながら迅速、かつ、効率的に生産するのに適した血液収容容器及びこれを用いた血液分離方法並びに再生医療方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明は、血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を提供する。

ここで、「血液」とは、血球（赤血球、白血球、血小板）と液体成分である血漿（血清）からなる全血、及びこれらの少なくとも１種を含んだ液体（例えば成分献血で採取された血液）をいう。また、「血清」とは、採取した血液を放置すると流動性が低下し、その後に赤い凝固塊（血餅）から分離される淡黄色の液体をいう。本発明における「血清」とは、血餅から分離されない点で生成方法が一般的な血清とは異なるが、そこに含まれる凝固因子や増殖因子が実質的に一般的な血清と同等である細胞培養に有用な血液中の液性成分をいう。

「血液由来の液性成分」とは、「血球以外の血液成分」あるいは「血球以外の血液成分に抗凝固剤等の薬剤を添加した混合液」をいう。

「凝固活性化作用」とは、血液から凝固因子を除去するために血液中の凝固因子を活性化させることをいう。

「実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能」とは、例えば幹細胞の培養に用いることができる程度の量をいう。幹細胞の培養において、血清は培地に対して１０％程度必要である。そのため５（ｍｌ）以上１０００（ｍｌ）以下であることが好ましく、１０（ｍｌ）以上６００（ｍｌ）以下であることがさらに好ましい。

具体的には、以下のようなものを提供する。

本発明は、採取した血液を複数の血液成分に分離し、収容するための装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部には、血清として実用的に使用することができる量を調製するために前記血液から凝固因子を除去する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を提供する。

上記血液成分分離装置によれば、血液貯留部を備えたことによって、採取した血液を血液貯留部に大量に貯留することができる。また、この血液貯留部には血清生成機能を付与したため、血液中の血小板及び凝固因子等を迅速に活性化することが可能となる。さらに、これらの被活性化因子は迅速に除去できるため大量の血清を調製することができる。なお、この血液成分分離装置は、血液から分離された複数の血液成分を収容する成分収容部を備えていることが好ましく、この成分収容部と血液貯留部とが無菌的かつ気密に連結していることがさらに好ましい。これによって、採血から血清調製までの一連の工程を外気に触れることなく行うことが可能であるため、微生物による汚染のリスクを低減させることができる。

なお、本発明に係る血液成分分離装置は、ヒトの血液だけではなく、げっ歯類、家畜類、霊長類等の哺乳類の血液にも使用することが可能であるため、非ヒト用血液成分分離装置として使用することも可能である。

上記血液成分分離装置において、前記複数の血液成分は、血清を含んでいてもよく、白血球及び赤血球を含んでいてもよい。

この発明によれば、血液成分分離装置によって分離された血清は、細胞増殖因子を多く含む血清であるため再生医療の分野で用いるのに適している。さらに、被活性化因子を別途回収することができるため、採取した血液を捨てることなく有効利用することができる。

上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部及び前記成分収容部は、可撓性を有する袋体であり、前記血清生成機能は、前記血液貯留部の内方に配された血液凝固促進個体により付与されているものであってもよい。

血液貯留部及び成分収容部は、可塑性を有する袋体であり、軽量で持ち運びに便利である。これらはそれぞれ少なくとも一つずつ設けられているが、複数設けられていてもよく、血液貯留部が一つ、成分収容部が二つ以上設けられていることが好ましい。また、それぞれの容量は血液から各血液成分を実質的に分離することが可能であれば特に限定されるものではないが、５（ｍｌ）から１０００（ｍｌ）であることが好ましく、１０（ｍｌ）から６００（ｍｌ）であることが特に好ましい。また、この血液貯留部の内包に血液凝固促進個体を配することによって、血清生成機能を付与することができる。血液凝固促進個体は、血液からフィブリンや血小板等の血液凝固因子を除去することが可能な程度に含有されており、血液に対して不溶解性を有するため、得られる血清に不純物が混在するという事態を回避することができる。

上記血液成分分離装置において、前記血液凝固促進個体は、前記血液に対して不溶性であり、塊状の外観形状を有することが好ましい。また、前記血液貯留部に貯留された血液中で遊動可能に設定されていることがさらに好ましい。

この発明によれば、血液凝固促進個体を粒状又は顆粒状もしくは、塊状のものとしたことによって、製造時のハンドリング性を高めることが可能となる。また、血液凝固促進個体を遊動可能に設定したことによって血液との接触をより円滑にし、血液の活性化効率を向上させることができる。

上記血液成分分離装置において、前記血液凝固促進個体の比重は、前記血液より分離される前記各血液成分よりも大きいものであってもよい。これによって、調製された血清を血液貯留部から容易に取り出すことができる。

また、血液から血清を調製する場合には、血小板及び血液凝固因子等の被活性化因子の活性化を図った上で、遠心分離を行うことになるが、この場合における赤血球の破壊（溶血）や血液貯留部の破損を抑制するという面から、血液凝固促進個体の外観形状を略球状としておくことが好ましい。そして、迅速に活性化させるという目的から、血液凝固促進材の表面を二酸化ケイ素化合物からなる層で形成しておくことが好ましい。

二酸化ケイ素化合物としては、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等から選択される少なくとも１種以上を使用することができるが、これらに限られるものではない。

また、血液凝固促進材の芯体にマグネットを用いれば、血液貯留部に対して磁界を作用させることで血液の撹拌を行うことができ、被活性化因子を迅速に活性化することができる。

血液凝固促進個体は、多孔質構造とすることにより、単位体積あたりの表面積を大きく設定することができるため、活性化を図る上で好ましい。但し、この場合には孔内に血液が侵入できるようにしておくことが必要となる。

血液貯留部内の血液凝固促進個体については、血液貯留部に貯留可能な血液量に対して、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）から２５（ｍｍ^２／ｍｌ）の関係をもってその表面積を設定しておくことが、活性化の促進及び溶血の抑制という両方の面から好ましい。なお、この値は現時点における最良の条件値であって、この範囲以外の値でも同様の効果を有するものも本発明に含まれる。

上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部は、血清分離剤が投入されていないものであってもよい。

また、上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部には少なくとも２つの接続口が形成されており、前記２つの接続口のうち、一方には前記血液を前記血液貯留部に導入するための導入路が気密接続され、他方には、前記血液貯留部において前記血液から分離された前記各血液成分を導出する導出路が気密接続されていてもよい。

この発明によれば、血液貯留部に形成された接続口に導入路及び導出路を接続したことによって、血清への血液成分の混入から保護することができる。

上記血液成分分離装置において、前記成分収容部は、２つ以上の袋体からなり、前記導出路は、各袋体に接続される複数の導出菅で構成され、前記複数の導出菅の少なくとも一部は兼用されているものであってもよい。

この発明によれば、成分収容部は、２つ以上の袋体からなり、複数の導出菅の少なくとも一部を兼用させたことによってそれぞれの袋体が一つに繋がり、取扱いが容易になる。また、このように各部を気密接続しておくことによって微生物の混入を防止することができる。

上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部には、空気が含有されているものであってもよい。血液貯留部に含有される空気は、貯留可能な血液量に対して０．０３（ｃｃ／ｍｌ）から１（ｃｃ／ｍｌ）であることが好ましい。

この発明によれば、血液貯留部に空気を含有させたことによって血液凝固促進個体が含有されているときと同様の効果を得ることが可能となる。

また、本発明の血液分離方法は、血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離することを特徴とする。

具体的には以下のような方法を提供する。

採取した血液を複数の血液成分に分離し、収容するための装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部には、血清として実用的に使用することができる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置であり、採取された血液を血液貯留部に貯留する貯留工程と、前記血清生成機能を起動させて、前記血液貯留部に貯留されている血液中の血小板及び凝固因子を含む被活性化因子の活性化を促進する活性化促進工程と、前記活性化促進工程で活性化されて凝集した前記被活性化因子を血液から分離する分離工程と、を有する血液分離方法。

上記血液分離方法において、前記活性化促進工程は、前記血液成分分離装置の振盪を行う工程であってもよい。

また、上記血液分離方法において、前記血清生成機能は、前記血液貯留部の内方に配された血液凝固促進個体により付与されているものであってもよい。

さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程で導出される前記各血液成分は、血清を含んでいてもよい。

さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程は、前記血液凝固促進個体を固定させた状態で、前記各血液中の液体成分を流動させることにより前記血液成分を前記成分収容部へ収容させる工程であってもよい。

さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程における前記血液凝固促進個体は、前記血液貯留部の内側又は外側の少なくとも一方に取り付けられた固定手段により固定されていてもよい。

さらに、上記血液分離方法において、前記固定手段は、マグネット、クランプ、前記血液貯留部を挟持する挟持体、及び前記血液貯留部内に設けられた複数の突起、からなる群から選ばれる一つ以上のものであってもよい。

これらの発明によれば、一度に多量の血液を採取し、迅速に分離することが可能となる。さらに、貯留工程から導入工程まで外気に触れることなく行うことが可能であるため、微生物による汚染のリスクが少ない。さらに、前記分離工程で血液から分離された前記被活性化因子を除く前記各血液成分を前記成分収容部へと導出する導出工程を備えていてもよい。

活性化促進工程では、血液成分分離装置全体を、又は血液貯留部を振盪させることにより被活性化因子を活性化させることができる。振盪方法は、溶血を生じさせない方法であれば特に限定されないが、血液凝固促進個体が血液中で満遍なく遊動できるような遊動速度であることが好ましい。また、芯体にマグネットを使用した血液凝固促進個体を使用した場合には、血液貯留部に対して磁界を作用させることで血液の撹拌を行うことができる。

分離工程では、活性化された被活性化因子が血液凝固促進個体に付着した状態でフィブリンが生成する。これによって、血清の回収が容易になる。また、導出工程では、フィブリンが付着した血液凝固促進個体を固定手段で固定することによって赤血球の回収がより容易になる。

さらにまた本発明は、以下のような血液中の繊維質の回収方法及び再生医療方法を提供する。

血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を用いて液性成分と非液性成分とに分離し、前記非液性成分から繊維質を回収する方法。

血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、前記液性成分を培地に添加し、この培地に対して対象者から採取した細胞を播種して培養を行い、得られる細胞又は組織を前記対象者への移植用とする再生医療方法。

上記再生医療方法において、前記液性成分は血清を含んでいてもよい。

血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、前記非液性成分の濃度を調製した後、前記対象者への輸血用とする再生医療方法。

上記血液分離方法において、前記非液性成分は、血清、白血球及び赤血球を含んでいてもよい。

これらの方法を用いれば、大量の血清を調製することが可能となるため、細胞の培養に必要な量の自家血清を調製することが可能となる。さらに、手術で輸血が必要な場合も血清採取後に赤血球やフィブリンを回収することが可能であるため、濃度を調製して自己輸血したり、フィブリンを幹細胞の足場（ｓｃａｆｏｌｄ）又は傷口のバリヤーとして使用したりすることができる。

以上説明したように、本発明の血液成分分離装置は、採取した血液を成分毎に分離するために用いるものであって、血液を貯留する血液貯留部を備え、この血液貯留部に血清生成機能を付与することとしたので、微生物の繁殖が抑制された血清を迅速、かつ、大量に調製することができ、再生医療における幹細胞の培養に用いる大量の血清を調製するのに適している。さらに血清採取後の赤血球やその他の成分は、自己輸血用血液や傷口のバリヤーとして使用するのに適している。

従って、本発明に係る血液成分分離装置を用いれば、採取した血液から、血清を始めとする大量の血液成分を高い安全性を確保しながら、迅速かつ高効率に調製（生産）することができる。

また、本発明の血液分離方法では、上記本発明に係る血液成分分離装置を用いるものであって、採取された血液を血液貯留部に貯留する貯留工程と、前記血清生成機能を起動させて、前記血液貯留部に貯留されている血液中の血小板及び凝固因子を含む被活性化因子の活性化を促進する活性化促進工程と、前記活性化促進工程で活性化されて凝集した前記被活性化因子を血液から分離する分離工程と、を有し、さらに必要に応じ血清採取後に残存する血液成分を回収し、自己血輸血用及び幹細胞の足場又は傷口のバリヤー用として用いることとした。

従って、この血清調製方法を用いれば、安全性の高い血液成分を大量に生産することができる。

また、本発明の再生医療方法は、上記の血液分離方法を用いて調製された血清を培地に対して添加し、この培地に対象者から採取した幹細胞を播種して培養を行い、培養により得られる細胞又は組織を被治療対象者に移植することとした。また、小児等の循環血液量が少ない患者や、移植時に多量の出血が危惧される場合には回収した赤血球を輸血することとし、又フィブリンは移植部位の足場、あるいは移植部位のバリヤーとして用いることとした。

従って、この再生医療方法を用いれば、生物学的な安全性が確保された大量の血清を用いることが可能であり、対象者の組織及び機能を安全かつ確実に再生することができる。

本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置を示した図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置による血液採取から血清保存に至るまでの手順を示す図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置の血液貯留部１０を振盪させている図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置の血液貯留部１０のチューブ４１を溶断させている図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置を遠心分離した後の血液貯留部１０を示した断面図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置の血液貯留部１０内で調製された血清７１を血清保存用の袋体２１に導出する方法を示す断面図である。 、本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置の血液貯留部１０と袋体のチューブ４２を溶断させている図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置において、溶断工程を経た袋体２１を示した図である。 本発明の第１実施形態に係る血液成分分離装置を遠心分離した後の導出工程における血液貯留部１０を示した斜視図である。 本発明の第２実施形態に係る血液成分分離装置に係る凝固体付着ガラス加工体１４を示す斜視図（一部断面図）である。 本発明の第４実施形態に係る血液成分分離装置１を示した図である。 本発明の第５実施形態に係る血液成分分離装置１を示した図である。 本発明の第６実施形態に係る血液成分分離装置１を示した図である。 本発明の第７実施形態に係る血液成分分離装置１を示した図である。 本発明の第５実施形態に係る血液成分分離装置１の血液貯留部１０に生理食塩水を導入している工程を示した図である。 実施例１に係る採血からの経過時間と血小板の残存率との関係を示す特性図である。 実施例２に係る血液と接触するガラス加工体の面積と細胞増殖因子（ＴＧＦ−β１）の血清中への放出量の関係を示す特性図である。 実施例２に係る血液と接触するガラス加工体の面積と細胞増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の血清中への放出量の関係を示す特性図である。 実施例３に係る血液と接触するガラス加工体の面積と上清遊離ヘモグロビン量との関係を示す特性図である。 実施例４に係る各試料と細胞数の関係を示した図である。 実施例５に係る各試料の赤血球の回収率の経時変化を示した図である。 実施例６に係る各検体の増殖因子のリリース率及び多血小板血漿の凝固時間を示した図である。 実施例７に係る各検体の血小板残存率を示した図である。 第８実施形態の血清調製装置の構成を示す機能ブロック図である。 第９実施形態の可撓性バッグの構成を示す模式図である。 第１０実施形態の血清調製装置の構成を示す機能ブロック図である。 第１２実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１３実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１４実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１５実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１６実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１７実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１９実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１９実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。 第１９実施形態の血清調製装置の構成を示す模式図である。

本発明に係る血液成分分離装置は、血清を生産する血液成分を貯留する空間に血液凝固促進機能を付与し、実用的に使用できる量の血清を生成することが可能な装置である。

装置形態の代表的な例としては、可撓性の袋体が少なくとも一つ以上無菌的かつ液密、気密に接続されたものであり、かつ、血液凝固促進機能が付与されているものが考えられる。

このような血液成分分配収容装置は、外観上、所謂血液バッグや分離バッグと類似した形態であるが、これらと同一の形態を採用したのは、これらが採取した各種成分を無菌的かつ液密、気密に分配するのに適した形態であるという長年の実績があるからである。

また、血液凝固促進機能を付与した点は、本発明の本質に関わる。単なる可撓性の袋体であっても、血液凝固因子を含む液性成分を収容した場合、時間の経過とともに凝固因子が活性化され、血清の産出が可能である。しかし比較的時間がかかるだけではなく、血清中に含まれる増殖因子が不活性化されてしまうため、得られる活性は不十分である。そこで、血液凝固促進機能を付与した。これにより前記空間において、血液凝固因子を含む液性成分と血液凝固因子とが接触し、速やかに血液凝固が促される。その結果、血清調製が極めて短時間で行うことができるとともに、活性の低下を抑制した状態で血清が調製される。このことは、袋体自体を、血液凝固促進機能を備えた材質で形成した場合にも当てはまることから、本発明は、そのような形態を排除するものではない。つまり、一般的に、血液バッグや分離バッグ等に使用される医療材料に比べて血液凝固促進機能が高い材質で、貯留空間壁面を形成した形態も本発明の範疇に含まれる。

血液凝固促進機能を有する物質としては、現在のところ最も効果が高いことが確認されているものとして、ガラス加工体が挙げられる。ガラスには、血液凝固作用が存在することは古くから知られるところであるが、比較的大量の血清の生成のために積極的に使用した例は未だ無い。本発明者らは、ガラス加工体を、血液凝固促進機能を有する物質として用い、血清を産生する血液成分中に存在させて、相互に接触を繰り返してみたところ、大量の血清を短時間で活性を低下させることなく生成することに成功した。

さらに、血液凝固促進機能を有する物質として、上記ガラス加工体ではなく空気を用いた。血液が空気と接触すると凝固することはすでに知られるが血清の生成のために積極的に使用したものはない。そこで、空気を血液凝固促進機能を有する物質として、血液と接触を繰り返してみたところ、大量の血清を短時間で生成することにも成功した。

血液凝固促進機能を有する物質は、血液との接触が多いほど活性化されることが分かっている。つまり、ガラス加工体の場合には、比表面積を大きくすることが有効であり、空気の場合には、含有量を多くすることが有効であることが分かっている。しかし、ガラス加工体のように血液凝固促進機能を有する物質として、固体を用いる場合に、溶血の心配を考慮しなければならない。

次に、血液凝固因子を含む液性成分と血液凝固促進機能を有する物質（血液凝固促進個体と以下いう）とを接触させる形態として次の形態が考えられる。

第１に、人体から採取した血液を、血液凝固促進個体を収納された血液貯留部に貯留し、血液の凝固を促して、血清を分離する形態である。

ここにおいて、分離した血清は、血液貯留部以外の袋体に無菌的に移送され、この袋体にて保存可能となる。あるいは、分離した血清は、外部に無菌的に導出して、細胞培養系に増殖因子として添加するといった利用に供することもできる。また、血清分離の際に同時に分離されたその他の血液成分（赤血球、フィブリン等）は、輸血や再生治療に使用することができる。

第２に、人体から採取した血液を、血液貯留部に貯留し、この貯留部に抗凝固剤を添加した状態で、血液成分を分離した後、分離した成分の中で、血清を産生する成分である血液凝固因子を含む液性成分と血小板とを別袋体に無菌的に移送し、この袋体中で血清を生成させるという形態が考えられる。この場合、血清を生成させる袋体中には、上述の血液凝固促進個体を収納しておくことは当然であるが、混入した抗凝固剤を中和するための中和剤を添加しておくことで、収納した凝固促進個体の機能が十分に発揮される。ここにおいて、分離した血清は、そのまま血液貯留部で保存するか、他の袋体に無菌的に移送され保存される。分離した血清は、外部に無菌的に導出して、細胞培養系に増殖因子として添加するといった利用に供することもできる。また、血清分離の前後で分離されたその他の血液成分（赤血球、フィブリン等）は、輸血や再生治療に使用することができる。

第３は、第２の形態と関連する形態である。この形態では、当該装置に導入前に、血清を産生する成分だけを血液から採取して、第２の形態と同様にして血清を生成する。この形態では、初めから、所謂成分採血をすることになるので、血清やフィブリン採取だけを目的としている場合に、無用な血液成分は、被験対象に直ちに戻すことになるので、該被験対象にかかる肉体的負担が軽減される。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。

＜第１実施形態＞
〔血液成分分離装置１の全体構成〕
本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１の構成について、図１を用いて説明する。図１では、血液成分分離装置１の構成のうち、主要な部分だけを抜き出して図示している。

図１に示すように、本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１は、血液貯留部１０、成分収容部２０を主な要素として構成されている。このうち、血液貯留部１０は、可撓性を有する樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルからなる２枚のシートが外縁部１１ａで融着されることで袋状に形成された本体部１１と、本体部１１の内部に挿入されたガラス加工体１２とから構成されている。つまり、血液貯留部１０は、外装体としての本体部１１の内部に、血液凝固促進個体としてのガラス加工体１２が収容された構成を有している。

なお、血液貯留部１０は、本体部１１における内容積及び外観形状が、所謂血液バッグや分離バッグに類似しているが、内部に抗凝固剤が充填されていない点で血液バッグと相異し、凝固促進剤を含む点で分離バッグと相異する。また、血液貯留部１０の内部は前もって滅菌処理が施されている。

本体部１１内におけるガラス加工体１２は、例えば、ソーダガラスからなる略球形をしている。また、図１では、血液貯留部１０内に３つのガラス加工体１２を備える構成としているが、血液凝固促進機能を得る上で、貯留可能な血液量に対するガラス加工体１２の表面積を、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上の関係をもって設定をしておくことが好ましい。

なお、ガラス加工体１２は、本体部１１の内壁等に接合されているものではなく、本体部１１に振盪作用あるいは振動作用等を与えた際に、本体部１１の内部で遊動可能な状態に設定されている。

また、血液貯留後に本体部１１に振盪作用あるいは振動作用等を与えた際、さらには血液を遠心分離機にかけた際に、血液中の赤血球が破壊され溶血に至るのを抑制するためには、血液貯留部１０の本体部１１に貯留可能な血液量に対して、２５．０（ｍｍ^２／ｍｌ）以下の関係となる表面積で、ガラス加工体１２を設定しておくことが好ましい。これらの数値範囲が好ましい理由については、後述する。

成分収容部２０は、６つの袋体２１〜２６から構成されており、各々が軟質ポリ塩化ビニルからなる。これらは前もって滅菌処理が施されている。

図１に示すように、血液貯留部１０の本体部１１における上縁端には、その接続口に２本のチューブ４１、４２が気密接続されている。そのうちのチューブ４１は血液を導入するための導入路の役割を担っているため他端には、採血針３０あるいは採血針と接続可能な接続部が接続されている。血液貯留部１０に気密接続されたもう一方のチューブ４２は、チューブ４３〜４６、５１〜５６及び分岐体６１〜６５を介して各袋体２１〜２６に接続されている。これらは分離された血液成分を導出するための導出路の役割を担っている。これらのチューブ４１〜４６、５１〜５６については、柔軟性を有した樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニル等の材料から構成されている。ここで、成分収容部２０の袋体２１〜２６と各チューブ５１〜５６とについても、気密接続されている。

また、チューブ４１、４２のサイズは、その内径寸法がガラス加工体１２の外形寸法よりも小さく設定されている。これは、血清を調製及び導出をする際に、ガラス加工体１２がチューブ４１、４２の方に入り込んでしまうのを防止するためである。

血液貯留部１０及び袋体２１〜２６と各チューブ４１、４２、５１〜５６とは、内部の空間が外部環境と隔絶された状態に接続されている。また、各チューブ４２〜４６、５１〜５６と各分岐体６１〜６５とについても、内部における血清が流通する領域が外部環境と隔絶された状態に接続されている。具体的には、溶剤接着、熱溶着あるいは超音波溶着等により接続されている。

図１には図示していないが、本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１では、各チューブ４２〜４６、５１〜５６の所要の箇所をクランプで挟むことで血液及び抽出された血清を導出する際に、その流路を切り替えることができる構成となっている。

〔血清調製操作について〕
上記構成を有する血液成分分離装置１を用いた血清調製操作について、図２〜図８を用いて説明する。なお、図２は操作の説明のため適宜併用して用いる。

図２に示すように、上記血液成分分離装置１を用いた血液分離操作は、大別して７つの工程（Ｓ１〜Ｓ７）から構成されている。

まず、操作の第１段階としては、上記図１における採血針３０を対象者（患者）に刺し、血液を採取する。この際、採血針３０から採取された血液は、チューブ４１を介して、下方に位置する血液貯留部１０に貯留される（貯留工程Ｓ１）。ここで、血液貯留部１０に採取された血液が成分収容部２０の方に流れ込まないように、チューブ４２と血液貯留部１０の間に破断可能な隔壁が備えられている。あるいはチューブ４２は、クランプ等を用いて血液貯留部１０の根元側で経路が閉鎖されている。貯留工程Ｓ１は、採血時における患者の体調等を考慮して、所要量を採取し終了される。ここでいう所要量は、患者の体格や体調に問題がない場合には２００〜６００（ｍｌ）程度である。

なお、採血に際しては、献血の際等に広く使われている採血機等を用いることもできる。
次に、図２に示すように、貯留工程Ｓ１を開始後、それと並行するように血液貯留部１０を振盪させる（活性化促進工程Ｓ２）。図３に示すように、採取された血液を貯留した血液貯留部１０は、振盪装置１００により緩やかに撹拌され、内部に収納されたガラス加工体１２と接触することになる。そして、血液中に含まれる血小板及び凝固因子がガラス加工体１２の表面で凝固し、凝固の際に活性化された血小板から、これらを由来とする増殖因子が放出される。（また、この活性化促進工程を低温下で行うと血小板の凝集促進に効果的である。）

なお、血液貯留部１０を通常の血液バッグと同等の外形寸法に形成しているため、血液貯留部１０の振盪には、公知の振盪装置を用いることができる。さらに、図３では図示していないが、血液貯留部１０は各袋体２１〜２６と各チューブ４１〜４６、５１〜５６を介して接続されているため、これらを折り畳んで振盪させることも可能である。

貯留工程Ｓ１後、採血対象から採血針３０を抜針し、採血針３０と血液貯留部１０とを連結しているチューブ４１の一部を溶断し、かつ、同時にその溶断端を溶着する（溶断工程Ｓ３）。チューブ４１の溶断には、図４に示すような溶断機１１０（所謂シーラー）を用いて溶断することができる。

一方、患者から分離された血液貯留部１０は、成分収容部２０及びこれらの間を連結する各チューブ４２〜４６、５１〜５６、さらには分岐体６１〜６５等とともに活性化促進工程Ｓ２を経て、コンパクトに纏められ、遠心分離機にかけられる（遠心分離工程Ｓ４）。このとき、チューブ４２は、貯留工程Ｓ１の際と同様に破断可能な隔壁あるいはクランプにより経路が閉鎖された状態に保たれている。

溶断工程Ｓ３及び遠心分離工程Ｓ４は、抗凝固剤をあらかじめ添加し採血する場合は活性化促進工程Ｓ２の前に行ってもよい。この場合、遠心分離は下記の条件で行う。
全血の遠心分離：４，４００ｇ×４〜６（ｍｉｎ．）、２，２５０ｇ×１０（ｍｉｎ．）
多血小板血漿（ＰＲＰ）の遠心分離：１，１００ｇ×４〜６（ｍｉｎ．）

血液貯留部１０に対する遠心分離の条件は、貯留された血液の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば２２５０（ｇ）×１０（ｍｉｎ．）、４（℃）に設定される。遠心分離後における血液貯留部１０について、図５を用いて説明する。

図５に示すように、活性化促進工程Ｓ２を経た後に遠心分離された血液貯留部１０内では、遠心分離条件によって異なるが大別して血清７１、白血球７２、赤血球７３の３つの層に分離される。また、血液貯留部１０における本体部１１の底には、ガラス加工体１２がその表面に血小板及び凝固因子の凝固体７４が付着した状態（以下、「凝固体付着ガラス加工体１４」という。）で沈んでいる。この凝固体付着ガラス加工体１４は、図の拡大部分に示すとおり、ガラス加工体１２の表面に血小板及び凝固因子が凝固した凝固体７４が付着したものである。ここでは、凝固体の付着の有無を区別するために、凝固体７４付着後のガラス加工体に符号１４を付している。

上述のように、図５の状態における上清成分である血清７１は、活性化促進工程Ｓ２において十分に血小板及び凝固因子から放出されたこれら由来の増殖因子を含むものである。また、遠心分離工程Ｓ４においても、血液貯留部１０の本体部１１の上縁端に気密接続された２本のチューブ４１、４２が両方ともに閉鎖された状態におかれているので、外部環境から隔絶されており、微生物等が侵入することはない。

図２に戻って、活性化促進工程Ｓ２から遠心分離工程Ｓ４で活性化された被活性化因子は、塊状になって血液から分離される（分離工程Ｓ５）。

また、分離工程Ｓ５において血液貯留部１０内で分離抽出された血清７１を成分収容部２０における各袋体２１〜２６の全部又は一部に対して順に小分けしていく（導出工程Ｓ６）。導出方法について、図６を用いて説明する。

図６に示すように、抽出された血清７１を成分収容部２０の袋体２１に導出しようとする場合には、クランプ９０を用いてチューブ４３の経路を閉鎖しておき、この状態で血液貯留部１０の外側に設置した加圧機８０をもって、血液貯留部１０を加圧（Ｆ１）する。上述のように、血液貯留部１０に気密接続されたチューブ４１は、貯留工程Ｓ１が終了した時点で、その途中４１ａが溶断され、かつ同時にその端部及び近傍４１ｂが溶着されている。

よって、加圧Ｆ１を受けることによって、分離によって抽出された上清部分である血清７１の一部は、チューブ４２、分岐体６１及びチューブ５１を介して血清保存用の袋体２１に導出される。

なお、チューブ４３の経路閉鎖については、柔軟性を有するチューブ４３を、クランプ９０の円板９１とベース９２との間で挟むことで実施される。

図２に戻って、袋体２１に所要量の血清７１が充填された後、チューブ５１を溶断及び溶着する（溶断工程Ｓ７）。この溶断及び溶着については、図７で示すように、上記遠心分離工程Ｓ４の前にチューブ４２を溶断及び溶着したのと同様の方法を用いて実施される。また図８に示すように、血清７１が内部に充填された袋体２１については、例えば、冷凍保存等の保存処置が施される。

この導出工程Ｓ６及び溶断工程Ｓ７を、袋体２１〜２６の各々に対して順次実施していき、袋体２１〜２６の全て、あるいは一部に血清７１が充填された時点で血清調製操作が終了する。さらに必要に応じて、赤血球７３を生理食塩水、ＣＰＤ、ＡＣＤ−Ａ液等抗凝固剤やＭＡＰ等の血液保存液で洗浄希釈し、輸血用血液として保存することもできる。この方法については後述する。

〔血液成分分離装置１の優位性〕
本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１では、血液バッグと同等の内容積を有する本体部１１と、その内部に配されたガラス加工体１２とから血液貯留部１０を構成し、この血液貯留部１０の内部で血液から血清を調製するので、従来のような採血管を用いる場合に比べて、一度に大量の血清を調製することができ、調製作業における工程面等で効果を奏する。また、これにより、調製した血清が微生物等によって汚染される危険性も低くなり、安全性の高い血清を調製するうえでも適している。

また、血液成分分離装置１では、血液凝固促進個体としてガラス加工体１２を収容しているので、血清調製時に血餅がガラス加工体１２の表面に付着し、血清を分取する際の血清中へのフィブリンや血餅の混入が防止される。

また、血液成分分離装置１は、上記効果に加えて、血液貯留部１０及び袋体２１〜２６と各チューブ４１、４２、５１〜５６と内部の空間が外部環境と隔絶された状態に気密接続されているので、血液あるいは血清が外部環境に晒されることがない。よって、一層の安全性が確保されている。

また、上記チューブ４１、４２、５１〜５６は、柔軟性を有し、溶断及び溶着が可能な材質から形成されているので、これらの経路を適時切り離して行く際にも、内部が外部環境に晒されることがない。よって、この面からも、血液成分分離装置１が高い安全性を有するということがいえる。

一般に、抗凝固剤（例えば、ＡＣＤ−Ａ液等）を内部に備えない容器に対して血液を貯留した場合には、採血後、容器を２０（ｍｉｎ．）以上放置すれば次第に血液中の血小板及び凝固因子は凝固することになるが、特に容器内の空気量が少ない場合は血液の凝固が促進されず、凝固までに長時間を要するという問題を生じる。

これに対して、本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１では、血液を貯留する血液貯留部１０の内部に、血液凝固促進機能を有する血液凝固促進個体としてのガラス加工体１２を挿入しているので、１０（ｍｉｎ．）以内にはほとんどの血小板（例えば、９５％以上の血小板）及び凝固因子が凝固するに至り、血清調製操作を迅速に実施することができる。よって、本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置１を用いれば、迅速に血清を調製することができる。また、前述の活性化促進工程Ｓ２を経て血清を調製した後に、血液成分分離装置１に残存する赤血球のほとんどは、血餅とならないため、赤血球を輸血用の成分として再利用できる可能性がある。

また、例えば、再生医療の分野においては、幹細胞の培養のために安全性の高い血清を多く必要とするが、上記血液成分分離装置１を用いて血清７１を調製及び保存すれば、安全かつ迅速に血清を調製及び保存することができる。よって、本実施の形態に係る血液成分分離装置１を用いれば、患者に対して、高い安全性を確保しながら、高効率に組織あるいは機能の再生治療を実施することができる。

また、上記実施の形態においては、血液貯留部１０内に貯留可能な血液量に対して、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上の関係をもった表面積でガラス加工体１２を設定した場合には、血液中における血小板及び凝固因子の活性化がより促進される。また、貯留可能な血液量に対するガラス加工体１２の表面積を、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上２５．０（ｍｍ^２／ｍｌ）以下の範囲内となるように設定する場合には、活性化促進工程Ｓ２及び遠心分離工程Ｓ４における溶血の抑制と、血小板及び凝固因子の活性化促進との両立が可能である。

なお、血液貯留部１０内におけるガラス加工体１２の数については、本実施形態では３つとしたが、これに限定されるものではない。ガラス加工体１２の収容数については、現実的に１個以上５０個以下とするのが妥当である。

また、血液成分分離装置１では、血液凝固促進個体としてガラス加工体１２を用いたが、血液凝固促進個体は、これに限定されるものではない。例えば、血液との接触領域をシリカ、珪藻土、カオリン等の二酸化珪素化合物の中から選択される少なくとも一種からなる無機物で構成したものを用いることもできる。また、接触領域に配する物質は、無機物に限定されるものでもない。

また、上記血液成分分離装置１では、血液貯留部１０の中に血液凝固促進機能を有する血液凝固促進個体（ガラス加工体１２）を収容することによって、血液貯留部１０に血液凝固促進機能を持たせたが、必ずしも血液貯留部１０内に血液凝固促進個体を収容しなくても、血液凝固促進機能が果される構成であればよい。例えば、血液貯留部１０の本体部１１における内壁の一部を上記無機物等で被覆しておいてもよい。

また、上記血液成分分離装置１におけるガラス加工体１２については、その外観形状を略球形状にしたが、本発明に係る血液凝固促進個体の外観形状は、これに限定を受けるものではない。ただし、遠心分離等の際に溶血の発生及びバッグの破れを抑制する点等からは、外表面（血液との接触領域）を連続曲面で形成しておくことが好ましい。

また、導出工程Ｓ６においては図９に示すように血液貯留部１０の外側から例えば、クランプのような挟持部１６でフィブリンが付着したガラス加工体を塞ぎ止めることによって、ガラス加工体の表面に血小板及び凝固因子が付着したものを分離し、赤血球を導出することができる。なおこの挟持部１６は、血液貯留部１０を挟んだ後でも赤血球や、フィブリンの洗浄液等が流通可能なように血液貯留部１０との接触面は波型形状や凹凸形状であることが好ましい。

また、上記発明の実施形態では、中実のガラス加工体１２を用いたが、外表面に血液凝固促進機能を有する物質を形成しておけば、必ずしも中実とする必要はない。例えば、多孔質構造としておき、孔内の壁面も含めて血液と接触する全領域をガラス等の二酸化珪素化合物等でコーティングしておいてもよい。

＜第２実施形態＞
本実施形態に係る血液成分分離装置は、上記第１実施形態に係る血液成分分離装置１と、血液貯留部１０内に収容されるガラス加工体の形態に相違点を有する。そのため、以下では、ガラス加工体の形態について、図１０を用いて説明し、その他の部分についての説明は省略する。

図１０に示すように、本実施形態に係る凝固体付着ガラス加工体１４は、略球形状の外観形状を有する点では上記ガラス加工体１２と同様であるが、芯体部１４１と表層部１４２とからなる２層構造を有するところに特徴を有する。

凝固体付着ガラス加工体１４を構成する２層の内、芯体部１４１は、マグネットから構成されている。他方、表層部１４２は、上記ガラス加工体１２を構成していた材料と同一の無機物として、例えば、ソーダガラスから構成されている。

このような構造を有する凝固体付着ガラス加工体１４を内部に収容した血液貯留部１０を用いる場合には、上記図２における活性化促進工程Ｓ２の際に血液貯留部１０に対して振盪とともに磁界を作用させることで、血液の撹拌が促進されるという効果を得ることができる。即ち、血液貯留部１０に対してその外方から、例えば、マグネチックスターラーのような撹拌機で磁界を作用させることにより、凝固体付着ガラス加工体１４が容器内で回転運動等を起こし、より高効率に血液と接触することになる。

従って、凝固体付着ガラス加工体１４を血液貯留部１０内に備える血液成分分離装置では、上記血液成分分離装置１よりもより迅速に血小板及び凝固因子の活性化を図ることができ、より迅速に血清を調製することができる。

また、ガラス加工体１４をマグネットで構成した場合、導出工程Ｓ６では血液貯留部１０の外側からマグネットで固定することができる。

＜第３実施形態＞
本実施形態に係る血液成分分離装置は、上記第１実施形態に係る血液成分分離装置１と、成分収容部２０を構成する袋体２１〜２６の一つを空気抜き用としたところに相違点を有する（図１参照）。空気は採血時には、チューブ４１の体積分だけ必然的に血液貯留部１０に混入されてしまうが、各血液成分に分離工程Ｓ５の際にはない方が好ましい。そのため本実施形態に係る空気抜き用袋体を、血液貯留部１０と成分収容部２０との間に設置すれば各血液成分に分離工程Ｓ５前に空気のみを除去することが可能である。なお、本実施形態におけるその他の構成は第１実施形態と同様であるためその他の部分についての説明は省略する。

＜第４実施形態＞
本実施形態に係る血液成分分離装置は、図１１に示すように上記第１実施形態に係る血液成分分離装置１の血液貯留部１０に添加される血液凝固促進個体の代わりに空気１５を含有させたところに相違点を有する。この場合、あらかじめ血液凝固促進個体を添加させておく必要がないため、製造コストの削減に繋がる。空気１５の含有量は、貯留可能な血液量に対して０．０３（ｃｃ／ｍｌ）から１（ｃｃ／ｍｌ）であることが好ましく、あらかじめ前記含有量となるよう封入した空気の漏出を使用時まで防止する機構をチューブ４１に有することが好ましい。
また、空気と血液凝固促進個体を併用してもよい。

＜第５実施形態＞
本実施形態に係る血液成分分離装置は、図１２に示すように、上記第１実施形態に係る血液成分分離装置１の成分収容部を構成する袋体２１〜２６の少なくとも一つにガラス加工体１２（血液凝固促進個体）を添加したところに相違点を有する。また、本実施形態の場合、ガラス加工体１２を添加する容器にカルシウムイオンを含むクエン酸中和剤をさらに添加してもよい。この場合、血液貯留部１０には、ＣＰＤ液のような抗凝固剤を添加した所謂「献血用血液バッグ」を用いることができる。

血液貯留部１０中の血液は、遠心分離等によりある程度は分離されるが、抗凝固剤が添加されているため、このままでは血清を生成させることができない。本実施形態では、血液貯留部１０中の血液を袋体２１中に添加されている中和剤で中和させ、血液中の増殖因子を活性化させ、生成した血清を袋体２２へ導出させることが可能となる。

＜第６実施形態＞
本実施形態に係る血液成分分離装置は、図１３に示すように、上記第５実施形態に係る血液成分分離装置１の袋体２１に添加されている血液凝固促進個体の代わりに空気１５を含有させたところに相違点を有する。この場合第４実施形態と同様に、あらかじめ血液凝固促進個体を添加させておく必要がないため、製造コストの削減に繋がる。空気１５の含有量は、貯留可能な血液量に対して０．０３（ｃｃ／ｍｌ）から１（ｃｃ／ｍｌ）であることが好ましく、あらかじめ前記含有量となるよう封入した空気の漏出を使用時まで防止する機構をチューブ５１に有することが好ましい。
また、空気と血液凝固促進個体を併用してもよい。

また、第１実施形態及び第４実施形態に係る血液成分分離装置１では、成分収容部を６つの袋体２１〜２６から構成したが、成分収容部を構成する袋体の数については、これに限定を受けるものではない。さらに、第１実施形態及び第４実施形態に係る血液成分分離装置１では、血液凝固促進個体としてガラス加工体が用いられているが、ガラス加工体の代わりに空気が含有されているものでも同様の効果を奏する。この場合、貯留可能な血液量に対して０．０３（ｃｃ／ｍｌ）から１（ｃｃ／ｍｌ）であることが好ましい。

また、本発明は血液を分離した後に血液貯留部１０に残っている赤血球やフィブリンを有効利用することが可能である。以下、それについて詳細に説明する。

＜第７実施形態＞
第１実施形態において血液を分離した血液成分分離装置１を使用する。図１４に示すように血液を分離し、血清を袋体２１（成分収容部）に導出させた後の血液貯留部１０には、フィブリンが付着した凝固体付着ガラス加工体１４と赤血球等の残渣が残っている。この血液貯留部１０と気密接続された成分収容部２１〜２６のうち血清が収容されなかったいずれか一つにあらかじめ生理食塩水を入れておき、あるいはこの血液貯留部１０のチューブ４１に生理食塩水が含有されている生理食塩水含有袋体１２０を接続させ、血液貯留部１０中の赤血球と混合させた後に輸血用血液として使用することができる（図１５参照）。また、フィブリンが付着した凝固体付着ガラス加工体１４は、全ての血液成分を導出した後にさらに洗浄し、洗浄後に得られるフィブリンを幹細胞の足場、あるいは傷口のバリヤーとして使用することができる。

さらに、第１実施形態及び第２実施形態では、血液成分分離装置として、血液貯留部と成分収容部との間をチューブ等で連通した構成を採用したが、血液を貯留する部分と血清を保存する部分とを必ずしも別の容器として構成する必要はない。例えば、溶断及び溶着等によって一部分を切り離せるような構成の一つの容器を用意しておき、この容器内に血液を貯留し、これから成分収容部２０として用いるような構成としても構わない。また、導出工程Ｓ６では、フィブリンが付着したガラス加工体１２、又は凝固体付着ガラス加工体１４を導出しないように血液貯留部１０を挟み持つクランプが挙げられていたがこれに限定されるものではない。

＜第８実施形態＞
上記実施形態で説明した、血清調製並びに血清の小分けを機械的かつ自動的に行うことを可能としたのが本実施形態の血清調製装置である。図２４に示すように、本血清調製装置２４０は、血液凝固促進容器２４１に採取した血液を無菌的に導入する血液導入手段２４２（落差圧や突出ポンプ等）と、前記血液凝固促進容器にて調製された血清を無菌的に導出する血清導出手段２４３（吸引ポンプ等）と、導出した血清を複数の血清保存容器２４４に導出・分配する血清導入手段２４５（落差圧や突出ポンプ等）と、血清調製容器に血液を導入し始めた時点から該血清調製容器を振とうさせる振とう手段２４６と、振とう終了後、血清調製容器を遠心して血清成分を分離する分離手段２４７と、これらの各動作タイミング並びに動作自体を制御する制御手段２４８とから構成されている。血液凝固促進容器とは、上記したように血清調製のために血液凝固機能を備えた容器のことであって、上記した可撓性バッグ内にガラス加工体を配したもののほか、ガラス容器等その他血液凝固機能を備えた容器であれば何れでもよい。また、図３０に示す混注ポート５１１〜５１６を備えた容器を使用してもよい。なお、無菌的にするには、扱う液体に菌が混入しないような外気と液体とを隔離する構造を備えていればよいのであって、その形態は特に限定されない。また、上記血液、血清等の液体の量を公知の流量計によって、モニタしその結果により動作制御（導入血液量の制御、分配血清量の制御等）してもよい。また、血清を分配した後に、血清保存容器に自動的に密栓をするようにしてもよい。

上記血清調製装置２４０によると、血液採取後、自動的に血清が調製され、調製された血清は、自動的に保存容器に取り分けられるので、血清の調製を極めて簡便に行うことが可能となる。
なお、上記血清調製装置２４０において、別途、血清を調製した後において、該調製容器を装着すると、保存容器に分配することができるような分配装置として機能させてもよい。

＜第９実施形態＞
図２５は、血清調製バッグに空気量調節のためのフィルタ２５１を備えた可撓性バッグ（図１の１０に相当する容器）を示している。
該フィルタは、血液をバッグ内に導入した後、フィルタを外部に開放（図示しない蓋部をオープンにすることで解放される）することで空気量を調整する機能を持つ。これは、空気量が多量である場合に、撹拌量が不十分であると血餅が生じ、赤血球等の血液成分が回収できなくなってしまうことを回避するために配されており、空気量を調整することで血液の凝固速度を血液量に適した相対的な大きさに調整するという機能を持たせたものである。

＜第１０実施形態＞
図２６は、血清調製のための血液凝固促進容器２６１を振とうさせる時間帯を血清調製量が十分なレベルにまで達するよう最適に制御する機能を備えた血清調製装置の機能ブロック図である。

構成としては、図２４の装置と同様であるが、振とう時間を血清調製容器に血液を導入し始めた時点から採血終了後の所定の時間帯継続して振とうさせるという振とう制御が行われる。これによって、血清が効率良く産出されることになる。採血開始時から振とうさせ、かつ、採血時間よりも長い間振とうさせることが血清産生を十分に行えることになるという発明者らの経験則に基づいて実現した動作制御である。なお、該振とう時間は、実際に産出される血清の量をモニタリングし、その結果に基づいて決定するようにしてもよい。

＜第１１実施の形態＞
本実施形態では、血球成分を使用せず分離された血清を主として使用する場合を想定した実施形態であり、上記ガラス加工体以外に血清分離剤が収納された血清調製容器であることに特徴点がある。このように血清分離剤を備えることによって、血清の産生がガラスによる血液凝固促進によって促されるとともに、産生された血清が他の成分ときれいにかつ効率良く分離されることになる。

＜第１２実施の形態＞
図２７は、図１における血清調製装置と同様に、採取した血液中から血液凝固促進させて血清を調製する装置である血清調製装置２７０を示す。該血清調製装置２７０が図１のものと異なるのは、採取した血液を複数の血清調製容器２７１に分配し、該血清調製容器２７１中で血清を調製し、調製血清を複数の保存容器２７２に移送・保存するという点である。このように採取した血液を複数の血清調製容器２７１に分配し、該血清調製容器２７１中で血清を調製することによって、血清調製容器の血液による膨らみが大きくなり、ガラス加工体の自由度が大となるので、ガラスが撹拌され易く、血液との接触性が向上することとなり血清の調製がより効率良く行われることになる。

＜第１３実施形態＞
図２８は、新たな血清調製装置２８０を示す。該血清調製装置２８０は、カテーテル２８１が接続された留置針２８２と、カテーテル２８１の端部に接続されるシリンジ２８３とを備え、シリンジ２８３内には血液凝固促進個体２８４（ガラス等）が収納されている。

上記血清調製装置２８０によると、留置針２８２からカテーテル２８１を通じて採取した血液をシリンジ２８３を振とうさせながら該シリンジ２８３に導入することで、血清調製を行うことが可能となる。その後、シリンジ２８３ごと遠心することで血清を分離することができる。なお、この血清調製装置２８０で人体から血清を調製する場合は、血液凝固の凝固シグナルが人体に伝達されないよう、なるべく人体から離間させるとともに採血部から下方にシリンジ２８３を位置させて行うことが好ましい。

＜第１４実施形態＞
図２９は、図１の血清調製装置と略同様の構成であるが、バッグからバッグの間の導通路にフィルタ２９１を備えている点が大きく異なる。このフィルタ２９１は、血球成分を通さず、血清を選択的に通過させるような大きさのポアを有するフィルタである。このため、遠心分離工程を経なくても、このフィルタに振とう後の液体を通過させることによって血清を簡便に分離することができる。

＜第１５実施形態＞
図３０は、図１の血清調製装置と略同様の構成であるが、各バッグが、無菌的に接続・離脱自在に構成されている血清調製装置である点で異なる。接続・離脱自在に構成とは、挿入具の挿脱にともなって弁体のスリット状開口部が開閉する機能を有する気密性の高い混注ポート（日本国特許第３３８９９８３号等参照）を備えた構成が挙げられる。なお、この場合、接続する導通路となるチューブ先端には、ルアを用いることが望ましい。かかる構成によって、バッグの取り付け、取り外しを簡便に行うことができる。

＜第１６実施形態＞
図３１は、図１の血液貯留部１０と略同一の機能を持つが、血清取出口付近に血清調製時に血液が進入しないように、仕切りとなる一時的仕切り３１０を備えている点で異なる。ここにおいて、血清取出口付近に血液が進入し、凝固した場合血清が取り出し難くなる。あるいは、保存する血清に凝固した血液が混入することになる。一時的仕切り３１０は、血清調製後は、取り除くことが可能で、血清取出口から血清を保存バッグに移送させることができるようになっている。一時的仕切り３１０としては、クランプによる閉鎖、イージーピール等による閉鎖が考えられる。要すれば、一時的仕切り３１０は、血清調製時に前記取出口及びその近傍を血液から隔離でき、血清取出時には、隔離が解除されるものであれば、その形態は問わない。

＜第１７実施形態＞
図３２は、図１の血液貯留部１０と略同一の機能を持つが、血清取出口付近に血清調製操作により血液が進入しないように、フラッシュ用バッグ３２０を備えている点で異なる。ここにおいて、血清取出口付近に血液が進入し、凝固した場合血清が取り出し難くなる。あるいは、保存する血清に凝固した血液が混入することになる。

フラッシュ用バッグ３２０内には、ガスあるいは液体が入っており、血清取出口及びその付近に付着した血液（凝固した血液も含む）をフラッシュし、取り除く。

上記実施形態１６、１７は、下記のガラス加工体を配さない実施形態１８の血清調製バッグを用いる場合において特に効果的である。ガラス加工体を備えていると凝固した成分がガラス加工体に付着するので、血清取出口付近に凝固成分が付着することを防ぐことはできるが、ガラス加工体がないと、凝固成分が浮遊して場合によっては血清取出口付近に付着することがあるからである。

＜第１８実施形態＞
本実施形態では、図１の血液貯留部１０にガラス加工体を有さず、採取した血液はその空のバッグ内で放置されて血清が調製されることになる。そして、調製された血清が、保存バッグに移送されて複数の保存バッグに小分けされて保存されることになる。

＜第１９実施形態＞
本実施形態では、図１に示したガラス加工体がチューブ４２等に入り込んで、血清の移送の障害にならないよう工夫した点について特記する。

まず、ガラス加工体と移送路を形成するチューブとの径の関係をガラス加工体の径をチューブ内径よりも大とすることでガラス加工体がチューブ４２等に入り込むことを防ぐことができる。例えば、チューブ内径よりもビーズ径が１ｍｍから５ｍｍ程度大であることが好ましく、チューブ内径が３ｍｍの場合、ビーズ径は、４ｍｍ程度が好ましい。

次に、図３３に示すように血清取出しチューブ口の近傍に複数のスポット溶着部３３１を形成して（熱溶着させて形成）ガラスの移行を妨害することができる。ここで、スポット溶着部３３１同士間の間隔は、ビーズ径よりも小さい。また、スポットの数は、ビーズの数以上であることが望ましい。何故なら、ビーズ数よりもスポット数が少ないと、図３５に示すように、ビーズが血清を取り出す流路を完全に塞いでしまって、血清を取り出す流路が確保されないということになるが、スポット数がビーズ数以上であると、図３４に示すように、ビーズが血清を取り出す流路を完全に塞いでしまうことがなく、血清を取り出す流路が必ず確保されることになるからである。

なお、上記した各実施形態はそれ単独で実施できるのは言うまでもなく、また、それぞれを任意に組合せて実施しても構わない。本発明の実施は、単独実施形態に限定されない。そして、調製された血清を用いて患者から採取した細胞を培養し、これを患者に移植したり、調製された血球成分を患者に輸血したりして再生医療に供することもできる。

以下、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下では、第１実施形態における血液成分分離装置を用いて調製した血清の有効性、回収された赤血球の有効性、及び幹細胞の増殖について検討を行った結果について説明する。なお、実験においては、ポリ塩化ビニル製の外装体を用いた。

〔実施例１〕
［活性化促進効果の確認］
ソーダガラスからなる、大小のガラス加工体をそれぞれ表１の条件で血液収容部に添加した。この血液収容部に２０ｍｌのヒト新鮮血を入れ、撹拌しながらインキュベートし、１０，２０，３０，６０，９０分後に１．５ｍｌずつ採取し、血小板数の計測を行った。なお、撹拌には、撹拌（振盪）装置（マルチシェーカーＭＭＳ−３００ 東京理科器械製）を、血球カウントには、血球カウント装置（多項目自動血球計数装置 Ｋ−４５００ シスメックス製）を用いた。

図１６は血小板の数とインキュベーション時間の関係を示したものである。これより、血液１ｍｌ当りのガラス加工体の表面積比が大きいほど血小板は活性化され、凝集することが分かる。また、ガラス加工体を添加しない試料は、血液凝集まで約９０分と、かなりの時間を要していることが示された。さらに、仮にガラス加工体を添加せずに長時間放置し、血小板からの増殖因子の放出を促したとしてもその他の凝固の活性化が不十分である為、その後の過程で血清が凝固、あるいは大量のフィブリンが析出する場合が多い。よって、実験例に係るサンプルＢ〜Ｉの容器では、ガラス加工体が収容されていることにより、迅速に血小板を凝集させることができ、血清の調製に必要となる血小板由来の増殖因子を高効率で放出可能なことがわかる。

〔実施例２〕
［増殖因子放出効果の確認］
増殖因子放出効果の検討を行った。実施例１で用いた９つの試料の中から５つの試料を選び、５名の対象者の新鮮血をそれぞれの試料に添加し、２０分経過後の増殖因子の測定を行う。具体的には、下記の表２の条件で実施例１と同様の方法でインキュベートした後、市販のテストキット（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）により増殖因子（ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＢＢ）量をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて測定し、ガラス加工体との接触面積０の検体における量との比として表した。その結果を図１７及び図１８に示す。図中、横軸はガラス表面積を、縦軸には各増殖因子の量を示す。図１７より、ガラス加工体を血液１ｍｌ当り０．６ｍｍ^２とわずかでも添加すると、増殖因子の放出量は大幅に増加した。しかし、表面積比を極端に大きくした場合には、ＴＧＦ−β１量はほぼ平衡となることがわかった。また、図１８では、ガラス加工体を僅かに添加するだけで増殖因子の大幅な増加が確認された。さらに、図１７と同様に表面積比を極端に大きくした場合には、ＰＤＧＦ−ＢＢ量はほぼ平衡となることがわかった。

〔実施例３〕
［ガラス加工体による溶血性の検討］
実施例１及び２より、ガラス加工体を添加することにより、血小板の活性化と増殖因子の増加に効果があることが確認された。しかし、ガラス加工体の添加により血清調製中に溶血を引き起こすことが懸念された。そこで、ガラス加工体の添加量と溶血の関係を検討した。

実施例１で用いた試料Ａ，Ｆ，Ｈ，Ｉ及び血液１ｍｌあたりのガラス表面積比を広範囲に調製したＪ〜Ｍの各試料に調製したウシ血液を入れ、撹拌を行いながらインキュベートした。これを経時的にサンプリングし、遠心分離した上清のヘモグロビン濃度を測定（ヘモグロビンＢ−テストワコー 和光純薬工業株式会社製）した。９０分インキュベーション後の結果を図１９に示す。血液貯留部内部に収容されたガラス加工体の表面積が増加するにつれて、上清ヘモグロビンの増加率が上昇していることがわかる。これはガラス加工体が血液との過剰な接触面積を有し、活性化促進工程あるいは遠心分離工程において赤血球の破壊（溶血）を多く生じる原因となったことを示している。しかしながら、１２．５ｍｍ^２まではガラス加工体を添加していない試料Ａと同等の溶血性を示すことが確認された。

〔実施例４〕
［ラット幹細胞の増殖確認］
血液１（ｍｌ）あたりのガラス加工体の接触面積を０（ｍｍ^２）あるいは１．５（ｍｍ^２）とし、ヒトから採取した血液を前記ガラス加工体のいずれかが収容された血液貯留部中にて２０分間振盪した。振盪終了後血液を遠心分離（遠心分離条件：２２５０（ｇ）×１０（ｍｉｎ．）、４（℃））し、上清を分離した。上清を５６℃で３０分間熱処理した後、０．２２（μｍ）のフィルターでろ過し、−８０℃にて凍結保存した。上清は細胞培養時に解凍され、細胞培養用の培地に添加された。細胞は、ラットの大腿骨骨髄より得られた細胞をあらかじめ７日間培養し、得られた接着性の細胞を骨髄由来細胞とし本実施例に供した。１ウェルあたり１万個の細胞を播種し、培地には１０％濃度となるようガラス加工体を添加して得た上清、ガラス加工体未添加で得た上清、あるいは市販の細胞培養用のウシ胎児血清を添加し培養した。培養開始後１，３，７日に細胞数をカウントした。細胞の増殖への効果を確認した結果を図２０に示す。

図２０に示すようにラット骨髄由来細胞を培養する際に添加する血清調製時の、ガラス加工体との接触の有無が、細胞増殖性に著しく影響を及ぼしていることが判る。また、ガラス加工体を添加し得られた上清では、これまで一般的に用いられてきたウシ胎児血清よりも良好な結果が得られた。

〔実施例５〕
［赤血球の回収］
回収される赤血球について確認を行った。ガラス加工体接触面積を血液１（ｍｌ）あたり１２．５（ｍｍ^２）とし、２０（ｍｌ）採血後６０分間マルチシェーカーＭＭＳ−３００（東京理科器械株式会社製）にて撹拌しながら振盪させた。対象として従来の血清調製方法により、試験管に採血し同じ時間静置した血液を用い、経時的な赤血球数の変化を調べた。その結果を図２１に示す。これより、採血直後の赤血球数を１００％とした場合、ガラス加工体と６０分振盪した後の赤血球は約８０％残存していた。一方、従来の方法で血清を採取した場合においては、容器内の血液の大部分が血餅となるため、採血後６０分でわずか１０％しか赤血球が回収されなかった。

〔実施例６〕
［多血小板血漿（ＰＲＰ）からの血清回収］
あらかじめＣＰＤ液等の抗凝固剤を用いて採血された血液、あるいは成分献血により調製された多血小板血漿（ＰＲＰ）からも、増殖因子を多く含む血清が調製可能であることを確認した。最終濃度が１２．２％となるようにＣＰＤを添加したヒト新鮮血液を調製した。このＣＰＤ加血液を７６０ｇ、１０分（２２℃）の条件で遠心分離し、多血小板血漿を調製した。得られた多血小板血漿０．８ｍＬを表４に示すようにあらかじめ塩化カルシウムとガラス加工体が添加された容器内で３７℃にてインキュベートを開始し、適宜振盪した。多血小板血漿添加後に多血小板血漿からフィブリンが析出し、外観上流動性が低下するまでの時間を測定した。流動性の低下した各検体は直ちに２，２５０ｇ、１０分（４℃）の条件にて遠心分離を行い、得られた上清を分離した。その後この上清に含まれるＰＤＧＦ−ＢＢ量とＴＧＦ−β１量を測定した。測定した各増殖因子の量は、同一血液から調製した血清中に含まれていた各増殖因子量に対する比（％）として図２２に示した。

図２２に示すようにガラス加工体の添加量を添加する事により、またその面積を増やすことにより多血小板血漿の凝固時間が短縮され、ＰＤＧＦ−ＢＢとＴＧＦ−β１のリリース量も増加した。

〔実施例７〕
［空気添加効果の確認］
空気、あるいはガラス加工体をそれぞれ表５に示す条件で血液収容部に添加した。この血液収容部に２０（ｍｌ）のヒト新鮮血を入れ、マルチシェーカーＭＭＳ−３００（東京理科器械社製）にて撹拌しながらインキュベートし、２０分後の血小板数を多項目自動血球計数装置Ｋ−４５００（シスメックス社製）を用いて計数した。

図２３に示すように、ガラス加工体も空気も添加していない検体１では２０分後でも９０％近い血小板が残存していた。空気のみを添加した場合（検体名２〜４）、空気の添加量に比例して血小板の残存率が低下した。さらにガラス加工体と空気を組合せた場合は、血小板残存率の低下は著しく、また空気の添加量と血小板残存率には比例関係が認められた。従って、ガラス加工体ほどではないものの、空気単独でも血小板の活性化及び凝集の促進効果があり、さらにガラス加工体と組合せることで、血小板の活性化及び凝集をより促進する効果が得られることが示唆された。

上記実施例１より、血小板を迅速に凝集させるためには、血液貯留部内に血液凝固促進個体としてのガラス加工体を収容しておくことが有効であることが分かった。即ち、ガラス加工体を収容した血液貯留部を用いれば、採取した血液から血清を調製するために必要となる血小板由来の増殖因子を迅速かつ高効率に生成することができる。よって、このようなガラス加工体を血液成分分離装置内に収納しておけば、大量の血清を迅速に調製（生産）することができる。

また、実施例２より、ガラス加工体を収容した容器内で採取した血液から調製された血清には、その調製過程において細胞の増殖に有用な増殖因子が充分に放出されており、その結果、その血清を培地に添加することで骨髄由来細胞の増殖に寄与していることが確認された。よって、ガラス加工体を血液成分分離装置内に収納しておくことは細胞の増殖促進に有効な血清を調製する上で有用である。

また、実施例３より、遠心分離工程により分離された血清中の上清遊離ヘモグロビン量という点からは、血液貯留部内への過剰なガラス加工体の収容は振盪時及び遠心分離時の赤血球の破壊（溶血）を招くことになり、望ましくないことが分かる。

また、実施例４から７より細胞の培養に有効に作用する血清を調製した後で、さらに大部分の赤血球を血餅状態ではなく、個々の単離した細胞として回収可能であった。これは循環血液量の少ない患者や、あるいは多量の出血を伴う可能性がある移植手術を受ける患者への幹細胞移植時に輸血用血液として自己血を保存できることを示唆している。よってガラス加工体を収容した採血容器を用いて振盪下で血清を調製することにより、血清以外の成分も回収可能となる。

以上、実施例１から７を考慮したとき、血液貯留部中におけるガラス加工体を、血小板及び凝固因子の活性化促進、及び増殖因子の回収の観点からは、容器内に貯留可能な血液量に対するガラス加工体の表面積を０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上の関係を有するように設定することが望ましく、溶血の発生という要因も考慮したときには、２５．０（ｍｍ^２／ｍｌ）以下の関係を有するように設定することが好ましいことが分かる。

以上説明したように、本発明の血液成分分離装置は、微生物の繁殖が抑制された血清を迅速、かつ、大量に調製することができる。そのため、再生医療における幹細胞の培養に用いる大量の血清を調製するのに適している。

Claims (3)

1. 少なくとも血液由来の凝固因子を含む液性成分と、血小板と、を含む流動体を貯留する血液貯留部と、
   前記血液貯留部に、無菌的かつ気密に連結された成分収容部と、を備え、
   前記血液貯留部は、前記流動体と接触し凝固を促進させる血液凝固促進個体を含有し、
   前記血液凝固促進個体は、前記流動体に対して不溶性であり、かつ、塊状の外観形状を有する表面が二酸化ケイ素化合物からなる層で形成されたものである血液成分分離収容装置を用いた血清調製方法であって、
   前記流動体を前記血液貯留部内で前記血液凝固促進個体と接触させて血液凝固を促進させ血清を調製する工程と、
   前記血液貯留部内で調製された前記血清を、前記血液貯留部に無菌的かつ気密に連結された前記成分収容部に移送して収容する工程と、を備える血清調製方法。
2. 前記血清を移送した後の前記血液貯留部に残存している残渣に、生理食塩水及び血液保存液から選択される少なくとも一種を添加して前記残渣と混合する工程を更に有する請求項１に記載の血清調製方法。
3. 請求項２に記載の血清調製方法において、
   前記血液貯留部に残存している残渣を洗浄して、前記流動体由来の非細胞成分を回収する工程、を更に含む血清調製方法。

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