WO2004103439A1 - 血清調製用容器及びそれを用いた再生医療方法 - Google Patents

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WO2004103439A1
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serum
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component separation
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Koji Suzuki
Junya Fujii
Mari Matsuura
Seishin Tanaka
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Jms Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a blood container, a blood separation method using the same, and a regenerative medical method.
  • Stem cells are attracting attention as cells that have the pluripotency to differentiate into various tissues and organs and are the key to regenerative medicine.
  • the prepared serum is often temporarily frozen or refrigerated until use. For this reason, it is necessary to transfer the blood collection tube to a storage container. If this operation is repeated many times, there is a high possibility that the serum will be contaminated with microorganisms.
  • a serum separating agent is often added to such a blood collection tube, and it cannot be denied that impurities may be mixed into the serum from this serum separating agent. Therefore, it is not appropriate to use the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2 00 0-0 0 0 2 28 in the field of regenerative medicine intended for humans from the viewpoint of safety and hygiene. .
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a blood storage container suitable for producing a large amount of serum quickly and efficiently while ensuring high safety, and blood using the same
  • the purpose is to provide separation methods and regenerative medicine methods.
  • the present invention provides a serum generation function for generating a practically usable amount of serum in the presence of blood-derived liquid components and blood platelets by a coagulation activating action.
  • a blood component separation device is provided.
  • blood refers to whole blood consisting of blood cells (red blood cells, white blood cells, platelets) and plasma (serum), which is a liquid component, and a liquid containing at least one of these (for example, collected by component blood donation) Blood).
  • plasma a liquid component
  • serum refers to a pale yellow liquid that is separated from red clots (blood clots) after the collected blood is left undisturbed.
  • serum is different from general serum in that it is not separated from clots, but the coagulation factors and growth factors contained therein are substantially the same as general serum.
  • blood-derived liquid component refers to “a blood component other than blood cells” or “a mixed solution obtained by adding a drug such as an anticoagulant to a blood component other than blood cells”.
  • Coagulation activating effect means activating a coagulation factor in blood in order to remove the coagulation factor from blood.
  • the “serum-producing function that produces a practically usable amount of serum” refers to an amount that can be used for stem cell culture, for example.
  • serum requires about 10% of the medium. Therefore, it is preferably 5 (m l) or more and 1 0 0 0 (m l) or less, more preferably 1 0 (m l) or more and 6 0 0 (m l) or less.
  • the present invention is an apparatus for separating and storing collected blood into a plurality of blood components, and in the blood reservoir for storing the blood, an amount that can be practically used as serum is prepared. Therefore, a blood component separation device provided with a serum production function for removing a coagulation factor from the blood is provided. According to the blood component separation device, a large amount of collected blood can be stored in the blood storage unit by providing the blood storage unit. In addition, since the blood reservoir is provided with a serum generation function, platelets and coagulation factors in the blood can be rapidly activated. Furthermore, since these activators can be removed quickly, a large amount of serum can be prepared.
  • the blood component separation device preferably includes a component storage unit that stores a plurality of blood components separated from blood. It is more preferable that the distilling part is aseptically and airtightly connected. As a result, a series of steps from blood collection to serum preparation can be performed without touching the outside air, so that the risk of contamination by microorganisms can be reduced.
  • the blood component separation device can be used not only for human blood but also for blood of mammals such as rodents, livestock, and primates. It can also be used as a component separation device.
  • the plurality of blood components may contain serum, and may contain white blood cells and red blood cells.
  • the serum separated by the blood component separation device is a serum containing a large amount of cell growth factors, and is therefore suitable for use in the field of regenerative medicine. Furthermore, since the activator can be collected separately, the collected blood can be effectively used without being discarded.
  • the blood storage part and the component storage part are flexible bags, and the serum generation function is performed by a blood coagulation promoting individual arranged inside the blood storage part. It may be given.
  • the blood storage part and the component storage part are plastic bags and are lightweight and convenient to carry. At least one of these is provided, but a plurality of these may be provided, and it is preferable that one blood storage part and two or more component storage parts are provided.
  • Each volume is not particularly limited as long as each blood component can be substantially separated from blood, but it is preferably 5 (ml) to 100 (ml). In particular, it is particularly preferably from 1 0 (m 1) to 6 0 0 (m 1).
  • a blood coagulation promoting individual in the inclusion of this blood reservoir, blood It is possible to provide a cleansing function. Blood coagulation-promoting individuals are contained to such an extent that blood clotting factors such as fibrin and platelets can be removed from the blood, and are insoluble in blood, so that the resulting serum contains impurities. The situation of doing can be avoided.
  • the blood coagulation promoting individual is insoluble in the blood and has a massive appearance. Further, it is more preferable that the movement is set in the blood stored in the blood storage part.
  • the blood coagulation promoting individual is in the form of particles, granules, or lumps, so that handling at the time of production can be improved.
  • the blood coagulation promoting individual is set to be movable, the contact with blood can be made smoother and the blood activation efficiency can be improved.
  • the specific gravity of the blood coagulation promoting individual may be larger than each blood component separated from the blood. Thereby, the prepared serum can be easily taken out from the blood reservoir.
  • the appearance shape of the blood coagulation promoting individual is substantially spherical from the viewpoint of suppressing breakage of the blood reservoir and blood.
  • silicon dioxide compound at least one selected from glass, silica, diatomaceous earth, kaolin and the like can be used. It is not limited to.
  • blood can be stirred by applying a magnetic field to the blood reservoir, and the activator can be activated quickly.
  • a blood coagulation promoting individual is preferable for activation because it has a porous structure and can set a large surface area per unit volume. In this case, however, it is necessary to allow blood to enter the hole.
  • the surface area is set with a relationship of 0.1 (mm 2 / ml) to 25 (mm 2 / m 1) for the amount of blood that can be stored in the blood reservoir. It is preferable from the viewpoint of both promotion of activation and suppression of hemolysis. It should be noted that this value is the best condition value at the present time, and values other than this range also have the same effect are included in the present invention.
  • the blood reservoir may be one in which a serum separating agent is not injected.
  • connection ports are formed in the blood reservoir, and one of the two connection ports is used for introducing the blood into the blood reservoir.
  • the introduction path may be hermetically connected, and on the other side, a lead-out path for deriving each blood component separated from the blood in the blood reservoir may be hermetically connected.
  • the component storage portion includes two or more bags
  • the lead-out path includes a plurality of lead-out rods connected to the bags. The at least some of the plurality of lead-out rods may be used in combination.
  • the component accommodating portion is composed of two or more bags, and by using at least a part of the plurality of lead-out rods, the respective bags are connected together, and handling is facilitated.
  • microorganisms can be prevented from being mixed by keeping the respective parts airtightly connected.
  • the blood reservoir may contain air.
  • the air contained in the blood reservoir is preferably 0.03 (cc / ml) and 1 (cc / ml) relative to the amount of blood that can be stored.
  • the blood separation method of the present invention is a blood component to which a blood generation function for generating serum in a quantity that can be practically used by coagulation activation in the presence of blood-derived liquid component and platelets is provided. It is characterized by separating blood into a liquid component and a non-liquid component using a separation device.
  • a blood component separation apparatus having a function, a storage step of storing the collected blood in the blood storage unit, and the blood generation unit storing the blood generation unit by activating the serum generation function
  • An activation promoting step that promotes activation of an activator including platelets and a coagulation factor, and a separation step that separates the activator that has been activated and aggregated in the activation promoting step from blood.
  • the activation promoting step may be a step of shaking the blood component separation device.
  • the serum generation function may be provided by a blood coagulation promoting individual arranged inward of the blood reservoir.
  • each blood component derived in the deriving step may include serum.
  • the derivation step is a step of accommodating the blood component in the component accommodating portion by flowing the liquid component in each blood in a state where the blood coagulation promoting individual is fixed.
  • the blood coagulation promoting individual in the derivation step may be fixed by a fixing means attached to at least one of the inside and the outside of the blood reservoir. Good.
  • the fixing means is selected from the group consisting of a magnet, a clamp, a holding body that holds the blood storage part, and a plurality of protrusions provided in the blood storage part. It may be more than that. '
  • a derivation step of deriving each blood component excluding the activated factor separated from blood in the separation step to the component storage unit may be provided.
  • the activator can be activated by shaking the whole blood component separation device or the blood reservoir. How to shake The method is not particularly limited as long as it does not cause hemolysis, but it is preferable that the velocity is such that blood coagulation promoting individuals can move evenly in the blood. In addition, when a blood coagulation promoting individual using a magnet for the core is used, the blood can be stirred by applying a magnetic field to the blood reservoir.
  • the separation step fibrin is produced in a state where the activated factor is attached to the blood coagulation promoting individual. This facilitates serum recovery.
  • red blood cells can be collected more easily by fixing the blood coagulation promoting individual with fipurin attached thereto by a fixing means. Furthermore, the present invention provides the following method for recovering fiber in blood and regenerative medical method.
  • Liquid components and non-liquids are obtained using a blood component separation device that has been provided with a serum-generating function that produces serum that can be used practically by coagulation activation in the presence of blood-derived liquid components and platelets.
  • a method for recovering the fibrous material from the non-liquid component is obtained using a blood component separation device that has been provided with a serum-generating function that produces serum that can be used practically by coagulation activation in the presence of blood-derived liquid components and platelets.
  • blood is separated into liquid components using a blood component separation device that is provided with a serum-generating function that generates a practically usable amount of serum by clotting activation.
  • the liquid component is separated into non-liquid components, the liquid components are added to the medium, cells collected from the subject are seeded and cultured on the medium, and the resulting cells or tissues are transferred to the subject. Regenerative medicine method for transplantation.
  • the liquid component may contain serum.
  • Serum generating function for generating a practically usable amount of serum in the presence of blood-derived liquid component and platelets by clotting activation.
  • Blood is separated into a liquid component and a non-liquid component using a blood component separation device to which A regenerative medical method for transfusion to the subject after preparing the concentration of the liquid component.
  • the non-liquid component may include serum, white blood cells, and red blood cells.
  • fibrin can be collected after serum collection. Therefore, the concentration can be adjusted for self-transfusion, or fibrin can be used as a scaffold for stem cells (scafo 1d). Or it can be used as a barrier for wounds.
  • the blood component separation device of the present invention is used to separate collected blood for each component, and includes a blood reservoir that stores blood, and the blood reservoir has a serum generation function. Therefore, it is possible to quickly prepare a large amount of serum in which the growth of microorganisms is suppressed, and it is suitable for preparing a large amount of serum used for stem cell culture in regenerative medicine.
  • erythrocytes and other components after serum collection are suitable for use as autotransfusion blood and wound barriers.
  • the blood component separation device Accordingly, by using the blood component separation device according to the present invention, a large amount of blood components including serum can be prepared (produced) quickly and efficiently while ensuring high safety from the collected blood. Can do.
  • the blood component separation device In the blood separation method of the present invention, the blood component separation device according to the present invention is used, and the storage step of storing the collected blood in the blood storage unit and the serum generation function are activated.
  • An activation promoting step for promoting activation of an activator including platelets and coagulation factors in blood stored in the blood reservoir, and the activated and aggregated in the activation promoting step A separation step of separating the activator from the blood, and if necessary, The blood components remaining after serum collection were collected and used for autologous blood transfusion and stem cell scaffolds or wound barriers.
  • serum prepared by using the blood separation method described above is added to a medium, stem cells collected from a subject are seeded on the medium, cultured, and cultured. The resulting cells or tissues were to be transplanted into the subject.
  • the collected red blood cells should be transfused. It was.
  • FIG. 1 is a view showing a blood component separation device according to a first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure from blood collection to serum storage by the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram in which the blood reservoir 10 of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention is shaken.
  • FIG. 4 is a view in which the tube 41 of the blood reservoir 10 of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention is fused.
  • FIG. 5 shows a centrifugal separation of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing the blood reservoir 10 after separation.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a method for deriving the serum 71 prepared in the blood reservoir 10 of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention into the bag 21 for storing the serum.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a method for deriving the serum 71 prepared in the blood reservoir 10 of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention into the bag 21 for storing the serum.
  • FIG. 7 is a view in which the blood reservoir 10 and the tube 42 of the bag body of the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention are fused.
  • FIG. 8 is a view showing the bag body 21 that has undergone the fusing process in the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a perspective view showing the blood reservoir 10 in the derivation step after the blood component separation device according to the first embodiment of the present invention has been centrifuged.
  • FIG. 10 is a perspective view (partially sectional view) showing a coagulated body-attached glass processed body 14 according to the blood component separation apparatus according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing a blood component separation device 1 according to the fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing a blood component separation device 1 according to the fifth embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a view showing a blood component separation device 1 according to the sixth embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a view showing a blood component separation device 1 according to the seventh embodiment of the present invention.
  • FIG. 15 is a diagram showing a process of introducing physiological saline into the blood fluid storage unit 10 of the blood component separation device 1 according to the fifth embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a characteristic diagram showing the relationship between the elapsed time from blood collection and the residual rate of platelets according to Example 1.
  • FIG. 17 is a characteristic diagram showing the relationship between the area of the processed glass body in contact with blood and the amount of cell growth factor (TGF-GF) released into serum according to Example 2.
  • TGF-GF cell growth factor
  • FIG. 18 is a characteristic diagram showing the relationship between the area of the processed glass body in contact with blood and the amount of cell growth factor (PDGF—BB) released into serum according to Example 2.
  • PDGF—BB cell growth factor
  • FIG. 19 is a characteristic diagram showing the relationship between the area of the processed glass body in contact with blood according to Example 3 and the amount of hemoglobin released from the supernatant.
  • FIG. 20 shows the relationship between each sample and the number of cells according to Example 4.
  • FIG. 21 is a graph showing changes with time in the red blood cell recovery rate of each sample according to Example 5.
  • FIG. 22 is a graph showing the growth factor release rate and blood platelet plasma clotting time for each specimen according to Example 6.
  • FIG. 23 is a graph showing the platelet residual rate of each specimen according to Example 7. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a blood component separation device is a device capable of generating blood coagulation promoting functions in a space for storing blood components that produce serum and generating a practically usable amount of serum. .
  • a typical example of the device configuration is one in which at least one flexible bag body is connected in a sterile, liquid-tight, and air-tight manner and has a blood coagulation promoting function. Conceivable.
  • Such a blood component distribution and storage device is similar in appearance to a so-called blood bag or separation bag.
  • the same configuration as these is used to aseptically and liquid-tighten the various components collected by these devices. This is because it has a long history of being suitable for airtight distribution.
  • the point which provided the blood coagulation promotion function is related to the essence of this invention.
  • a simple flexible bag contains liquid components including blood coagulation factors
  • coagulation factors are activated over time, and serum can be produced.
  • the growth factor contained in the serum is inactivated, resulting in insufficient activity. Therefore, blood coagulation promoting function was added.
  • the liquid component containing the blood coagulation factor comes into contact with the blood coagulation factor in the space, and blood coagulation is promptly promoted.
  • serum can be prepared in an extremely short time, and serum can be prepared in a state where the decrease in activity is suppressed.
  • the present invention does not exclude such a form. That is, generally, a form in which a storage space wall surface is formed of a material having a blood coagulation promoting function higher than that of a medical material used for a blood bag or a separation bag is also included in the category of the present invention.
  • a glass processed body As a substance having a blood coagulation promoting function, a glass processed body can be mentioned as one that has been confirmed to be most effective at present. Glass has long been known to have a blood clotting effect. There are no examples of active use for the production of relatively large amounts of serum.
  • the inventors of the present invention used a processed glass as a substance having a function of promoting blood coagulation, made it exist in blood components that produce serum, and repeated contact with each other. As a result, a large amount of serum was activated in a short time. We succeeded in generating without lowering.
  • Substances that have a function of promoting blood clotting become more active as they come into contact with blood. I know that In other words, it has been found that it is effective to increase the specific surface area in the case of a glass processed body, and it is effective to increase the content in the case of air. However, when a solid is used as a substance having a blood coagulation promoting function, such as a glass processed body, the concern of hemolysis must be considered.
  • a liquid component containing a blood coagulation factor and a substance having a blood coagulation promoting function hereinafter referred to as a blood coagulation promoting individual
  • blood collected from the human body is stored in a blood reservoir that contains a blood coagulation promoting individual, and blood coagulation is promoted to separate serum.
  • the separated serum is aseptically transferred to a bag other than the blood reservoir and can be stored in this bag.
  • the separated serum can be aseptically derived outside and added to the cell culture system as a growth factor for use.
  • other blood components red blood cells, fibrin, etc.
  • blood collected from the human body is stored in the blood reservoir, and after adding blood coagulants to the reservoir, the blood components are separated, and the components that produce serum among the separated components
  • the liquid component containing blood coagulation factor and platelets are aseptically transferred to a separate bag and serum is produced in this bag.
  • a neutralizing agent for neutralizing the mixed anticoagulant is added.
  • the separated serum is stored as it is in the blood reservoir or aseptically transferred to another bag and stored.
  • the separated serum is aseptically extracted outside and added to the cell culture system as a growth factor. If you add, you can also use it at any time.
  • Other blood components red blood cells, fibrin, etc.
  • separated before and after serum separation can be used for blood transfusion and regenerative treatment.
  • the third is a form related to the second form.
  • the serum-producing component is collected from the blood and serum is produced in the same manner as in the second form.
  • component blood is collected from the beginning, unnecessary blood components are immediately returned to the test subject when the purpose is to collect serum fibrin. Such physical burden is reduced.
  • the configuration of the blood component separation device 1 according to the embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. In FIG. 1, only the main part of the configuration of the blood component separation device 1 is extracted and shown.
  • a blood component separation device 1 is mainly composed of a blood storage unit 10 and a component storage unit 20.
  • the blood reservoir 10 is a main body formed in a bag shape by fusing two sheets of flexible resin material, for example, soft polyvinyl chloride, at the outer edge 11a. It is composed of a part 11 and a glass processed body 12 inserted into the main part 11. That is, the blood reservoir 10 has a configuration in which a glass processed body 12 as a blood coagulation promoting individual is accommodated inside a main body 11 as an exterior body.
  • the blood reservoir 10 is similar to a so-called blood bag or separation bag in the internal volume and appearance of the main body 11, but is different from the blood bag in that the anticoagulant is not filled therein. It is different in that it contains a coagulation promoter. Different from G. In addition, the inside of the blood reservoir 10 has been sterilized in advance.
  • the processed glass body 12 in the main body 11 has, for example, a substantially spherical shape made of soda glass. Further, in FIG. 1, the blood storage section 10 is provided with three glass processed bodies 1 2. However, in order to obtain a blood coagulation promoting function, the surface area of the glass processed body 12 relative to the amount of blood that can be stored is determined. , 0.1 (m mVm 1) or more is preferable. Note that the glass processed body 12 is not joined to the inner wall of the main body 11 and is free to move inside the main body 11 when a shaking action or a vibration action is applied to the main body 11. It is set to a possible state.
  • the glass processed body 12 is set with a surface area having a relationship of 25.0 (mm / m 1) or less with respect to the amount of blood that can be stored in the main body portion 11 of the blood storage portion 10. It is preferable to keep. The reason why these numerical ranges are preferable will be described later.
  • the component container 20 is composed of six bags 21 to 26, each of which is made of soft polyvinyl chloride. These will be sterilized in advance.
  • two tubes 4 1 and 4 2 are hermetically connected to the connection edge of the upper edge of the main body 11 of the blood reservoir 10.
  • the tube 41 plays a role of an introduction path for introducing blood, so the blood collection needle 30 or a connection portion connectable to the blood collection needle is connected to the other end.
  • the other tube 4 2 hermetically connected to the blood reservoir 10 is connected to each bag 2 1-26 via tubes 4 3-4 6, 5 1-5 6 and branch bodies 6 1-6 5 It is connected.
  • These tubes 4 1 to 4 6 and 5 1 to 5 6 are made of a resin material having flexibility, for example, a material such as soft polyvinyl chloride.
  • the bag body 2 1 to 2 6 and the tubes 5 1 to 5 6 of the component container 20 are also airtightly connected.
  • the sizes of the tubes 4 1 and 4 2 are set so that the inner diameter is smaller than the outer diameter of the glass processed body 12. This is to prevent the processed glass body 12 from entering the tubes 4 1 and 4 2 when the serum is prepared and derived.
  • the blood reservoir 10 and the bags 2 1 to 2 6 and the tubes 4 1, 4 2 and 5 1 to 5 6 are connected in a state where the internal space is isolated from the external environment.
  • each of the tubes 4 2 to 4 6, 5 1 to 5 6 and each branch body 6 1 to 6 5 are connected to a state in which the region where the serum circulates is isolated from the external environment. . Specifically, they are connected by solvent adhesion, heat welding, ultrasonic welding or the like. .
  • blood is obtained by sandwiching the required portions of the tubes 4 2 to 4 6 and 5 1 to 5 6 with clamps.
  • the flow path can be switched when the extracted serum is derived.
  • FIGS. Fig. 2 A serum preparation operation using the blood component separation apparatus 1 having the above-described configuration will be described with reference to FIGS. Fig. 2 is used together for explanation of the operation.
  • the blood separation operation using the blood component separation apparatus 1 is roughly composed of seven steps (S 1 to S 7).
  • the blood collection needle 30 in FIG. A person (patient) is stabbed and blood is collected.
  • the blood collected from the blood collection needle 30 is stored in the blood storage section 10 located below via the tube 41 (storage process S 1).
  • a breakable partition wall is provided between the tube 42 and the blood storage unit 10 so that the blood collected in the blood storage unit 10 does not flow into the component storage unit 20.
  • the tube 4 2 is closed on the root side of the blood reservoir 10 using a clamp or the like.
  • the storage step S 1 is completed after collecting the required amount in consideration of the patient's physical condition at the time of blood collection.
  • the required amount here is about 200 to 600 (ml) when there is no problem in the patient's physique or physical condition.
  • the blood storage unit 10 is shaken so as to be parallel thereto (activation promotion step S 2).
  • activation promotion step S 2 the blood storage unit 10 storing the collected blood is gently stirred by the shaking device 100 and comes into contact with the glass processed body 12 housed therein.
  • the platelets and coagulation factors contained in the blood coagulate on the surface of the glass body 12, and the growth factors derived from these are released from the platelets activated during the coagulation.
  • this activation promotion step is performed at low temperature, it is effective for promoting platelet aggregation.
  • blood reservoir 10 is formed to have the same outer dimensions as a normal blood pug, a known shaking device can be used for shaking of blood reservoir 10. Further, although not shown in FIG. 3, the blood reservoir 10 is connected to each bag 21 1-26 via each tube 41-4 46, 51-6. It is also possible to fold and shake.
  • the blood collection needle 30 is removed from the blood collection target, a part of the tube 41 connecting the blood collection needle 30 and the blood storage unit 10 is melted, and the same Sometimes the fusing end is welded (fusing step S3).
  • a fusing machine 110 for fusing the tube 41, a fusing machine 110 (so-called sealer) as shown in FIG. 4 can be used.
  • the blood reservoir 10 separated from the patient is composed of the component container 20 and the tubes 42 to 46, 51 to 56, and the branch bodies 61 to 65, etc.
  • the activation promotion step S 2 they are combined into a compact and subjected to a centrifuge (centrifugation step S 4).
  • the tube 42 is maintained in a state where the path is closed by a breakable partition wall or a clamp as in the storage step S 1.
  • the fusing step S 3 and the centrifugation step S 4 may be performed before the activation promoting step S 2 when blood is collected by adding an anticoagulant in advance. In this case, centrifuge under the following conditions.
  • Centrifugation conditions for the blood reservoir 10 are set according to the amount of blood stored and the types of components to be separated. For example, 2 250 (g) XI 0 (min.), 4 ( Set to ° C). The blood reservoir 10 after centrifugation will be described with reference to FIG.
  • the glass processed body 12 is attached to the bottom of the main body portion 11a in the blood storage section 10a with a blood plate and a coagulation body 74 of a coagulation factor (hereinafter referred to as "coagulation body adhesion glass"). It ’s called “Processed body 1 4”.)
  • coagulation body adhesion glass As shown in the enlarged portion of the figure, the body 14 is formed by adhering a coagulated body 74 having a blood platelet and a coagulation factor coagulated on the surface of the glass processed body 12.
  • the reference numeral 14 is attached to the glass body after the solidified body 74 is adhered.
  • the serum 71 which is a supernatant component in the state of FIG. 5, contains growth factors derived from these sufficiently released from platelets and coagulation factors in the activation promoting step S2. Also in the centrifugation step S 4, the two tubes 4 1 and 4 2 that are hermetically connected to the upper edge of the main body portion 11 of the blood reservoir 10 are both closed. Therefore, it is isolated from the external environment and microorganisms do not enter.
  • the activator activated in the activation promotion step S 2 to the centrifugation step S 4 is agglomerated and separated from the blood (separation step S 5 and separation step S 5 Then, the serum 71 separated and extracted in the blood reservoir 10 is subdivided sequentially for all or a part of the bag bodies 21 to 26 in the component container 20 (derivation step S 6).
  • the derivation method will be explained using Fig. 6.
  • the path of the tube 43 is closed using the clamp 90.
  • the blood reservoir 10 is pressurized (F 1) with the pressurizer 80 installed outside the blood reservoir 10.
  • the tube 41 that is airtightly connected to the blood reservoir 10 is fused at the time when the reservoir process S 1 is completed, and the end and the vicinity 41 1 are in the middle. b is welded.
  • a part of serum 71 which is a supernatant extracted by separation by receiving pressurized F1 is divided into tube 42, branch 61, and tube. It is led out to the bag body 21 for serum preservation through the bu 51.
  • the passage closing of the tube 4 3 is performed by sandwiching the flexible tube 43 between the disc 91 of the clamp 90 and the base 92.
  • the tube 51 is melted and welded (melting step S7).
  • the fusing and welding are performed using a method similar to that for fusing and fusing the tube 42 before the centrifugation step S4.
  • a preservation treatment such as cryopreservation is performed for the bag body 21 in which the serum 71 is filled.
  • This derivation process S6 and fusing process S7 are sequentially performed on each of the bags 21 to 26, and all or part of the bags 21 to 26 are filled with serum 71. At that time, the serum preparation operation is completed. Furthermore, if necessary, the red blood cells 73 can be washed and diluted with an anticoagulant such as physiological saline, CPD, ACD_A solution, or a blood storage solution such as MAP, and stored as blood for transfusion. This method will be described later.
  • an anticoagulant such as physiological saline, CPD, ACD_A solution, or a blood storage solution such as MAP
  • a blood reservoir 10 is formed from a main body 11 having an internal volume equivalent to that of a blood bag, and a glass processed body 12 disposed in the body. Since serum is prepared from blood inside this blood reservoir 10, a larger amount of serum can be prepared at a time than in the case of using a conventional blood collection tube. Effective in terms of process. This also reduces the risk of the prepared serum being contaminated by microorganisms and is suitable for preparing highly safe serum.
  • glass processing is performed as a blood coagulation promoting individual. Since the body 12 is accommodated, blood clots adhere to the surface of the glass processed body 12 at the time of serum preparation, so that fipurin and blood clots are prevented from being mixed into the serum when the serum is separated.
  • the blood component separation device 1 has a blood reservoir 10 and a bag body 2 1 to 2 6 and tubes 4 1, 4 2, 5 1 to 5 6 and an internal space outside. Because it is airtightly connected to the environment, blood or serum is not exposed to the external environment. Therefore, further safety is ensured.
  • the tubes 41, 42, 51-5 are made of a material that is flexible and can be cut and welded. The inside is not exposed to the external environment. Therefore, also from this aspect, it can be said that the blood component separation device 1 has high safety.
  • the glass processed body 1 as a blood coagulation promoting individual having a blood coagulation promoting function is provided inside the blood reservoir 10 for storing blood. 2 so that most platelets (for example, 95% or more of platelets) and coagulation factors coagulate within 10 (min.), So that the serum preparation operation can be performed quickly. it can. Therefore, serum can be rapidly prepared by using the blood component separation device 1 according to the embodiment of the present invention.
  • red blood cells remaining in the blood component separation apparatus 1 are removed. Most of them do not become blood clots, so red blood cells may be reused as a component for transfusion.
  • serum 71 is prepared and stored using the blood component separation apparatus 1, In addition, serum can be prepared and stored quickly. Therefore, by using the blood component separation device 1 according to the present embodiment, it is possible to perform regenerative treatment of a tissue or function with high efficiency while ensuring high safety for a patient.
  • the glass workpiece 12 is formed with a surface area having a relationship of 0.1 (mm 2 / ml) or more with respect to the amount of blood that can be stored in the blood reservoir 10.
  • 0.1 (mm 2 / ml) or more with respect to the amount of blood that can be stored in the blood reservoir 10.
  • the surface area of the glass body 12 with respect to the storable blood volume is set to be within the range of 0.1 (mm / m 1) to 25.0 (mm / m 1). It is possible to achieve both suppression of hemolysis in the activation promotion step S2 and centrifugation step S4 and promotion of activation of platelets and coagulation factors.
  • the number of glass processed bodies 12 in the blood reservoir 10 is three in this embodiment, but is not limited to this. Regarding the number of glass workpieces 12 that can be accommodated, it is practically appropriate to set the number to 1 or more and 50 or less.
  • the glass processed body 12 is used as the blood coagulation promoting individual, but the blood coagulation promoting individual is not limited to this.
  • the contact region with blood may be composed of an inorganic substance composed of at least one selected from silicon dioxide compounds such as silica, diatomaceous earth, and kaolin.
  • the substance disposed in the contact area is not limited to inorganic substances.
  • the blood coagulation promoting function may be achieved as long as the blood coagulation promoting individual is not accommodated in the blood reservoir 10.
  • a part of the inner wall of the main body part 11 of the blood storage part 10 may be covered with the inorganic substance.
  • the glass processed body 12 in the blood component separation apparatus 1 has a substantially spherical appearance, but the appearance of the blood coagulation promoting individual according to the present invention is not limited thereto.
  • glass processing is performed by blocking the glass processing body to which fibrin has adhered from the outside of the blood storage unit 10, for example, with a clamping unit 16 such as a clamp.
  • Red blood cells can be derived by separating platelets and coagulation factors attached to the surface of the body.
  • the clamping portion 16 has a corrugated shape or an uneven shape on the contact surface with the blood reservoir 10 so that erythrocytes or fibrin washing liquid can flow even after the blood reservoir 10 is sandwiched. It is preferable.
  • the solid glass processed body 12 is used.
  • a substance having a blood coagulation promoting function is formed on the outer surface, it is not necessarily required to be solid.
  • a porous structure may be used, and the entire region in contact with blood including the wall surface in the pore may be coated with a silicon dioxide compound such as glass.
  • the blood component separation device is a form of the blood component separation device 1 according to the first embodiment and a glass processed body accommodated in the blood reservoir 10. There are differences. Therefore, in the following, the form of the glass processed body will be described with reference to FIG. 10, and description of other parts will be omitted.
  • the coagulated body-attached glass processed body 14 according to the present embodiment is similar to the glass processed body 12 in that it has a substantially spherical appearance, but the core body portion 14 It is characterized by having a two-layer structure consisting of 1 and a surface layer portion 14 2.
  • the core body section 14 1 is composed of a magnet.
  • the surface layer portion 14 2 is made of, for example, soda glass as the same inorganic material as the material constituting the glass filler body 12.
  • the blood reservoir 10 containing the coagulated body-adhered glass processed body 14 having such a structure therein, the blood reservoir 10 is not subjected to the activation promoting step S2 in FIG.
  • the effect of promoting the stirring of blood can be obtained by applying a magnetic field together with shaking. That is, by applying a magnetic field to the blood reservoir 10 from the outside with, for example, a stirrer such as a magnetic stirrer, the coagulant-adhered glass processed body 14 rotates in the container. Wake up and come into contact with blood more efficiently.
  • the glass processed body 14 when the glass processed body 14 is composed of a magnet, it can be fixed with a magnet from the outside of the blood reservoir 10 in the derivation step S 6. ⁇ Third embodiment>
  • the blood component separation device is the blood according to the first embodiment. There is a difference between the component separator 1 and one of the bag bodies 21 to 26 constituting the component container 20 for air venting (see FIG. 1). When blood is collected, only the volume of the tube 41 is inevitably mixed into the blood reservoir 10, but it is preferable that each blood component is not present during the separation step S5. Therefore, if the air vent bag according to the present embodiment is installed between the blood storage unit 10 and the component storage unit 20, it is possible to remove only air from each blood component before the separation step S5. is there. Note that other configurations in the present embodiment are the same as those in the first embodiment, and thus description of other portions is omitted. ⁇ Fourth embodiment>
  • the blood component separation device uses air 15 5 instead of the blood coagulation promoting individual added to the blood reservoir 10 of the blood component separation device 1 according to the first embodiment.
  • air 15 is preferably 0-0 3 (cc Z ml) to 1 (cc / m 1) with respect to the amount of blood that can be stored.
  • the tube 41 has a mechanism for preventing leakage of the tube until use.
  • Air and blood coagulation promoting individuals may be used in combination.
  • the blood component separation device is provided in at least one of the bag bodies 21 to 26 that constitute the component storage portion of the blood component separation device 1 according to the first embodiment.
  • the difference is the addition of glass processed body 12 (blood coagulation promoting individual).
  • a citrate neutralizing agent containing calcium ions may be further added to the container to which the glass processed body 12 is added.
  • the blood reservoir 10 can be a so-called “blood donation blood bag” to which an anticoagulant such as a CPD solution is added.
  • the blood in the blood reservoir 10 is supplemented with a force S that is separated to some extent by centrifugation or the like, and an anticoagulant, so that serum cannot be produced as it is.
  • the blood in the blood reservoir 10 is neutralized with a neutralizing agent added in the bag 21, the growth factor in the blood is activated, and the generated serum is stored in the bag 2 2.
  • the blood component separation device uses air 1 instead of the blood coagulation promoting individual added to the bag body 21 of the blood component separation device 1 according to the fifth embodiment.
  • air 1 instead of the blood coagulation promoting individual added to the bag body 21 of the blood component separation device 1 according to the fifth embodiment.
  • the content of air 15 is preferably 0.0 3 (cc / ml) to 1 (cc / m 1) with respect to the storable blood volume, and is sealed in advance so as to be the content described above.
  • the tube 51 has a mechanism for preventing air leakage until it is used.
  • Air and blood coagulation promoting individuals may be used in combination.
  • the component storage portion is configured by the six bag bodies 21 to 26.
  • the number of bags constituting the component storage portion is not limited. Is not limited to this.
  • the force in which a glass processed body is used as a blood coagulation promoting individual may be the same even if it contains air instead of the glass processed body. The effect of. In this case, 0 ⁇ 03 (c cZm l) to 1 (c cZm l) is preferable for the storable blood volume.
  • the present invention can effectively utilize erythrocytes or fibrin remaining in the blood reservoir 10 after separating blood. About that This will be described in detail.
  • a blood component separation device 1 that separates blood is used.
  • blood is separated and blood is introduced into the bag body 21 (component storage section), and then blood storage section 10 has a coagulated body adhered glass processed body 1 with fibrin attached thereto. Residues such as 4 and red blood cells remain.
  • One of the component storage units 21 to 26 that is airtightly connected to the blood storage unit 10 does not store serum.
  • Saline-containing bag body 1 20 containing physiological saline is connected to tube 41 and mixed with red blood cells in blood reservoir 10 and used as blood for transfusion (Fig. 1 5).
  • the coagulated body-attached glass processed body 14 with fibrin adhered should be further washed after all blood components are derived, and the fibrin obtained after washing should be used as a scaffold for stem cells or a barrier for wounds. Can do.
  • the blood component separation device a configuration in which the blood storage unit and the component storage unit are communicated with each other by a tube or the like is employed, but the blood storage part and the serum are stored. It is not always necessary to configure the parts to be separated as separate containers. For example, it is possible to prepare a container that can be partially separated by fusing, welding, etc., store blood in this container, and then use it as the component container 20. . In the derivation step S 6, a clamp with the blood reservoir 10 sandwiched so as not to derive the glass additive 12 with fibrin attached or the coagulated substance-attached glass processed article 14 was mentioned. It is not limited to.
  • Figure 16 shows the relationship between the number of platelets and the incubation time. From this, it can be seen that the larger the surface area ratio of the processed glass per 1 m1 of blood, the more the platelets are activated and aggregate. In addition, it was shown that the sample without the glass processing body took quite a long time, about 90 minutes, until blood aggregation. Furthermore, even if it is allowed to stand for a long time without adding the glass processed body and promotes the release of growth factors from the platelets, the activation of other coagulation is insufficient, so that the serum coagulates in the subsequent process, or A large amount of bouillin often precipitates. Therefore, samples B to I related to the experimental example It can be seen that the container contains the processed glass, so that platelets can be rapidly aggregated, and the platelet-derived growth factor required for serum preparation can be released with high efficiency.
  • the growth factor release effect was examined. Select 5 samples from the 9 samples used in Example 1, add fresh blood from 5 subjects to each sample, and measure growth factors after 20 minutes. Specifically, after incubation in the same manner as in Example 1 under the conditions shown in Table 2 below, the amount of growth factor (TGF-j31, PDGF-BB) was measured using a commercially available test kit (R & D SYSTEMS). It was measured using a mouth plate reader (Mu 1 tiskan BI CHROMAT ICL absystem) and expressed as a ratio to the amount in the specimen having a contact area of 0 with the glass processed body. The results are shown in Figs. 17 and 18.
  • the horizontal axis represents the glass surface area
  • the vertical axis represents the amount of each growth factor. From Fig. 17, it can be seen that the amount of growth factor released significantly increased when glass processing bodies were added as little as 0.6 mm 2 per 1 ml of blood. However, when the surface area ratio was extremely increased, the amount of TGF-3 1 was found to be almost in equilibrium. In addition, in FIG. 18, a significant increase in growth factors was confirmed by adding a small amount of glass processed body. Furthermore, it was found that when the surface area ratio is extremely increased, as in Fig. 17, the PDGF-BB amount is almost balanced. ⁇ Table 2>
  • the contact area of the glass processed body per 1 ml of blood was set to 0 (mm 2 ) or 1.5 (mm), and the blood sampled from the human contained one of the glass processed bodies. Shake for 20 minutes in the blood reservoir. After shaking, the blood was centrifuged (centrifugation conditions: 2 25 50 (g) X 10 (min)), 4 (° 0), and the supernatant was separated. After heat treatment for 30 minutes, it was filtered through a 0.22 ( ⁇ ) filter and stored frozen at 80 ° C. The supernatant was thawed during cell culture and added to the cell culture medium.
  • Cells obtained from rat femur bone marrow were cultured in advance for 7 days, and the obtained adherent cells were used as bone marrow-derived cells in this Example. Cells are seeded and the supernatant obtained by adding glass processed body to the medium to a concentration of 10%, supernatant obtained without adding glass processed body, or commercially available urchin fetal serum for cell culture The number of cells was counted 1, 3, and 7 days after the start of culture Figure 20 shows the results of confirming the effect on cell proliferation.
  • the collected red blood cells were confirmed.
  • the contact area of the glass processed body is 12.5 (mm 2 ) per 1 ml of blood, and 20 (ml) after blood collection, 60 minutes after shaking with Multi-shaker MMS-300 (manufactured by Tokyo Science Instruments Co., Ltd.) I let you.
  • the change in the number of red blood cells over time was examined. The result is shown in FIG. As a result, when the number of red blood cells immediately after blood collection was 100%, about 80% of red blood cells remained after shaking for 60 minutes with the glass processed body.
  • serum was collected by the conventional method most of the blood in the container became blood clot, and only 10% of red blood cells were collected 60 minutes after blood collection.
  • serum rich in growth factors could be prepared from blood collected using anticoagulants such as CPD solution or platelet rich plasma (PRP) prepared by blood donation.
  • CPD solution or platelet rich plasma (PRP) prepared by blood donation.
  • Fresh human blood to which CPD was added was prepared so that the final concentration was 12.2%.
  • This CPD-added blood was centrifuged at 760 g for 10 minutes (22 ° C) to prepare platelet-rich plasma.
  • 0.8 ml of the obtained platelet-rich plasma was incubated at 37 ° C in a container to which calcium chloride and a glass processed body had been added in advance, and shaken appropriately. The time until fibrin precipitated from platelet-rich plasma after addition of platelet-rich plasma and fluidity decreased in appearance was measured.
  • each sample with reduced fluidity is immediately 2,250 g, 10 minutes Centrifugation was performed at (4 ° C), and the resulting supernatant was separated. Thereafter, the amount of PDGF-BB and the amount of TGF_i31 contained in the supernatant were measured. The amount of each growth factor measured is shown in FIG. 22 as a ratio (%) to the amount of each growth factor contained in serum prepared from the same blood.
  • Example 1 it was found that it is effective to house a glass processed body as a blood coagulation promoting individual in a blood reservoir in order to rapidly aggregate platelets. That is, if a blood reservoir containing a glass processed body is used, platelet-derived growth factors necessary for preparing serum from collected blood can be rapidly and efficiently generated. Therefore, if such a glass processed body is stored in the blood component separation apparatus, a large amount of serum can be rapidly prepared (produced).
  • serum prepared from blood collected in a container containing a glass processed body has a useful increase in cell growth during the preparation process. Growth factors were sufficiently released, and as a result, it was confirmed that adding the serum to the medium contributed to the growth of bone marrow-derived cells. Therefore, storing the processed glass in the blood component separation apparatus is useful for preparing serum effective for promoting cell growth.
  • Example 3 from the viewpoint of the amount of hemoglobin in the supernatant freed from the serum separated by the centrifugation step, it is necessary to store the excessive glass processed body in the blood reservoir in the case of erythrocytes during shaking and centrifugation. It will lead to smashing (hemolysis), which is not desirable.
  • the glass processed body in the blood reservoir can be stored in a container from the viewpoint of promoting the activation of platelets and coagulation factors and collecting the growth factors. It is desirable to set the surface area of the glass workpiece to 0.1 (mm 2 / ni l) or more with respect to the amount, and 25.0 (m mVm 1) It is understood that it is preferable to set so as to have the following relationship.
  • the blood component separation device of the present invention can quickly and in large quantities prepare serum in which the growth of microorganisms is suppressed. Therefore, it is suitable for preparing a large amount of serum used for stem cell culture in regenerative medicine. doing.

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Abstract

　大量の血清を高い安全性を確保しながら迅速、かつ、効率的に生産するのに適した血液収容容器及びこれを用いた血液分離方法並びに再生医療方法を提供する。採取した血液を複数の血液成分に分離し、保存をするための血液成分分離装置１において、前記血液を貯留する血液貯留部１０と、この血液貯留部１０に無菌的かつ気密に連結された成分収容部２０と、を備え、前記血液貯留部１０には、血清として実用的に使用することができる程度に、前記血液から凝固因子を除去する血清生成機能が付与されており、前記成分収容部２０は、前記血液貯留部１０において前記血液が分離されて生じた各血液成分を収容する。

Description

明 細 書 血清調製用容器及びそれを用いた.再生医療方法 技術分野
本発明は、 血液収容容器及びこれを用いた血液分離方法並びに再生医 療方法に関する。 背景技術
現在、 再生医療分野においては、 対象者から採取した幹細胞を体外で 增殖又は分化させたうえで対象者に移植することで対象者の組織の再生 を促進させるという研究が行なわれている。 幹細胞は、 種々の組織や器 官に分化する多分化能を有し、 再生医療のカギを握る細胞として注目さ れている。
幹細胞の体外培養増殖では、 培地に対して血清を添加すれば効果的で あることが知られているが、 ヒ トの治療を目的とする場合には、 ヒ ト以 外の動物を由来とする血清を用いることは安全上の問題から避けるべき ことであり、 ヒ ト由来、 特に対象者から採取した血液より調製した血清 を用いることが要求される。 また、 血液検査と比べると再生医療の分野 における幹細胞の培養には、 比較的より多くの血清が必要となる。 このような血清を調製する方法としては、 例えばガラス粉末からなる 血液凝固促進個体が収容された採血管を用いるという方法が特開 200 0 -000228号公報に開示されている。 発明の開示
し力 し、 特開 2000— 000228号公報に記載の方法は、 血液の 検査を目的とする容量の小さな採血管を用いるため、 幹細胞の培養に必 要な量の血清を調製するためには、 何度も調製操作を行なわなければな らず、 実用に適さない。
また、 調製された血清については、 使用するまで一時的に冷凍又は冷 蔵保存することが多い。 そのため採血管から保存用の容器に移し替える 作業が必要となり、 この作業を何度も行なうことで血清が微生物に汚染 される可能性が高くなる。 また、 このような採血管には血清分離剤が添 加されている場合が多く、 この血清分離剤から血清中に不純物が混入し てしまう可能性も否定できない。 従ってこのような安全性や衛生面から もヒ トを対象とした再生医療の分野において特開 2 0 0 0— 0 0 0 2 2 8号公報に開示されている方法を用いることは適当ではない。 更に、 既 存の血清調製用の採血管では、 採血管の構造上、 血清以外の成分は取り 出すことが困難であることに加え、 血餅となってしまっているため再利 用することは不可能である。
上述のように幹細胞の培養に際して、 大量の血清を調製するのに適し た血清調製容器の開発が望まれている。
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、 大量の血清 を高い安全性を確保しながら迅速、 かつ、 効率的に生産するのに適した 血液収容容器及びこれを用いた血液分離方法並びに再生医療方法を提供 することを目的とする。
上記の目的を達成するために、 本発明は、 血液由来の液性成分と血小 板との存在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生 成する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を提供する。
ここで、 「血液」 とは、 血球 （赤血球、 白血球、 血小板） と液体成分 である血漿 （血清） からなる全血、 及ぴこれらの少なくとも 1種を含ん だ液体 （例えば成分献血で採取された血液） をいう。 また、 「血清」 と は、 採取した血液を放置すると流動性が低下し、 その後に赤い凝固塊 （ 血餅） から分離される淡黄色の液体をいう。 本発明における 「血清」 と は、 血餅から分離されない点で生成方法が一般的な血清とは異なるが、 そこに含まれる凝固因子や増殖因子が実質的に一般的な血清と同等であ る細胞培養に有用な血液中の液性成分をいう。
「血液由来の液性成分」 とは、 「血球以外の血液成分」 あるいは 「血 球以外の血液成分に抗凝固剤等の薬剤を添加した混合液」 をいう。
, 「凝固活性化作用」 とは、 血液から凝固因子を除去するために血液中 の凝固因子を活性化させることをいう。 '
「実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能」 とは、 例え ば幹細胞の培養に用いることができる程度の量をいう。 幹細胞の培養に おいて、 血清は培地に対して 1 0 %程度必要である。 そのため 5 ( m l ) 以上 1 0 0 0 (m l ) 以下であることが好ましく、 1 0 (m l ) 以上 6 0 0 (m l ) 以下であることがさらに好ましい。
具体的には、 以下のようなものを提供する。
本発明は、採取した血液を複数の血液成分に分離し、 収容するための 装置であって、 前記血液を貯留する血液貯留部には、 血清として実用的 に使用することができる量を調製するために前記血液から凝固因子を除 去する血清生成機能が付与されている血液成分分離装置を提供する。 上記血液成分分離装置によれば、 血液貯留部を備えたことによって、 採取した血液を血液貯留部に大量に貯留することができる。 また、 この 血液貯留部には血清生成機能を付与したため、 血液中の血小板及び凝固 因子等を迅速に活性化することが可能となる。 更に、 これらの被活性化 因子は迅速に除去できるため大量の血清を調製することができる。 なお 、 この血液成分分離装置は、 血液から分離された複数の血液成分を収容 する成分収容部を備えていることが好ましく、 この成分収容部と血液貯 留部とが無菌的かつ気密に連結していることが更に好ましい。 これによ つて、 採血から血清調製までの一連の工程を外気に触れることなく行な うことが可能であるため、 微生物による汚染のリスクを低減させること ができる。
なお、 本発明に係る血液成分分離装置は、 ヒ トの血液だけではなく、 げっ歯類、 家畜類、 霊長類等の哺乳類の血液にも使用することが可能で あるため、 非ヒ ト用血液成分分離装置として使用することも可能である 上記血液成分分離装置において、前記複数の血液成分は、 血清を含ん でいてもよく、白血球及び赤血球を含んでいてもよい。
' この発明によれば、血液成分分離装置によって分離された血清は、 細 胞増殖因子を多く含む血清であるため再生医療の分野で用いるのに適し ている。 さらに、 被活性化因子を別途回収することができるため、 採取 した血液を捨てることなく有効利用することができる。
上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部及び前記成分収容部 は、 可撓性を有する袋体であり、 前記血清生成機能は、 前記血液貯留部 の内方に配された血液凝固促進個体により付与されているものであって もよい。
血液貯留部及び成分収容部は、 可塑性を有する袋体であり、 軽量で持 ち運びに便利である。 これらはそれぞれ少なくとも一つずつ設けられて いるが、 複数設けられていてもよく、 血液貯留部が一^つ、 成分収容部が 二つ以上設けられていることが好ましい。 また、 それぞれの容量は血液 から各血液成分を実質的に分離することが可能であれば特に限定される ものではないが、 5 (m l ) から 1 0 0 0 (m l ) であることが好まし く、 1 0 ( m 1 ) から 6 0 0 (m 1 ) であることが特に好ましい。 また 、 この血液貯留部の内包に血液凝固促進個体を配することによって、 血 清生成機能を付与することができる。 血液凝固促進個体は、 血液からフ イブリンや血小板等の血液凝固因子を除去することが可能な程度に含有 されており、 血液に対して不溶解性を有するため、 得られる血清に不純 物が混在するという事態を回避することができる。
上記血液成分分離装置において、前記血液凝固促進個体は、 前記血液 に対して不溶性であり、塊状の外観形状を有することが好ましい。 また、 前記血液貯留部に貯留された血液中で遊動可能に設定されていることが 更に好ましい。
この発明によれば、 血液凝固促進個体を粒状又は顆粒状もしくは、塊 状のものとしたことによって、 製造時のハンドリング性を高めることが 可能となる。 また、 血液凝固促進個体を遊動可能に設定したことによつ て血液との接触をより円滑にし、血液の活性化効率を向上させることが できる。
上記血液成分分離装置において、前記血液凝固促進個体の比重は、 前 記血液より分離される前記各血液成分よりも大きいものであってもよい 。 これによつて、調製された血清を血液貯留部から容易に取り出すこと ができる。
また、血液から血清を調製する場合には、 血小板及び血液凝固因子等 の被活性化因子の活性化を図った上で、 遠心分離を行なうことになるが 、 この場合における赤血球の破壊 （溶血） や血液貯留部の破損を抑制す るという面から、 血液凝固促進個体の外観形状を略球状としておくこと が好ましい。 そして、 迅速に活性化させるという目的から、 血液凝固促 進材の表面を二酸化ケイ素化合物からなる層で形成しておくことが好ま しい。
二酸化ケイ素化合物としては、 ガラス、 シリカ、 珪藻土、 カオリン等 から選択される少なくとも 1種以上を使用することができるが、 これら に限られるものではない。
また、 血液凝固促進材の芯体にマグネットを用いれば、 血液貯留部に 対して磁界を作用させることで血液の撹拌を行なうことができ、 被活性 化因子を迅速に活性化することができる。
血液凝固促進個体は、 多孔質構造とすることにより、 単位体積あたり の表面積を大きく設定することができるため、 活性化を図る上で好まし い。 但し、 この場合には孔内に血液が侵入できるようにしておくことが 必要となる。
血液貯留部内の血液凝固促進個体については、 血液貯留部に貯留可能 な血液量に対して、 0 . 1 ( m m 2 / m l ) から 2 5 ( m m 2 / m 1 ) の関係をもってその表面積を設定しておくことが、 活性化の促進及び溶 血の抑制という両方の面から好ましい。 なお、 この値は現時点における 最良の条件値であって、 この範囲以外の値でも同様の効果を有するもの も本発明に含まれる。
上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部は、 血清分離剤が投 入されていないものであってもよい。
また、上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部には少なくとも 2つの接続口が形成されており、 前記 2つの接続口のうち、一方には前 記血液を前記血液貯留部に導入するための導入路が気密接続され、 他方 には、 前記血液貯留部において前記血液から分離された前記各血液成分 を導出する導出路が気密接続されていてもよい。
この発明によれば、 血液貯留部に形成された接続口に導入路及び導出 路を接続したことによって、 血清への血液成分の混入から保護すること ができる。
上記血液成分分離装置において、前記成分収容部は、 2つ以上の袋体 からなり、 前記導出路は、 各袋体に接続される複数の導出菅で構成され 、 前記複数の導出营の少なくとも一部は兼用されているものであっても よい。
この発明によれば、 成分収容部は、 2つ以上の袋体からなり、 複数の 導出菅の少なくとも一部を兼用させたことによってそれぞれの袋体が一 つに繋がり、 取扱いが容易になる。 また、 このように各部を気密接続し ておくことによって微生物の混入を防止することができる。
上記血液成分分離装置において、前記血液貯留部には、 空気が含有さ れているものであってもよい。 血液貯留部に含有される空気は、 貯留可 能な血液量に対して 0 . 0 3 ( c c /m l ) カゝら 1 ( c c /m l ) であ るこ が好ましい。
この発明によれば、 血液貯留部に空気を含有させたことによって血液 凝固促進個体が含有されているときと同様の効果を得ることが可能とな る。
また、 本発明の血液分離方法は、 血液由来の液性成分と血小板との存 在下で凝固活性化作用により実用的に使用できる量の血清を生成する血 清生成機能が付与されている血液成分分離装置を用いて血液を液性成分 と非液性成分とに分離することを特徴とする。
具体的には以下のような方法を提供する。
採取した血液を複数の血液成分に分離し、 収容するための装置であつ て、 前記血液を貯留する血液貯留部には、 血清として実用的に使用する ことができる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液成 分分離装置であり、 採取された血液を血液貯留部に貯留する貯留工程と 、 前記血清生成機能を起動させて、 前記血液貯留部に貯留されている血 液中の血小板及ぴ凝固因子を含む被活性化因子の活性化を促進する活性 化促進工程と、 前記活性化促進工程で活性化されて凝集した前記被活性 化因子を血液から分離する分離工程と、 を有する血液分離方法。 上記血液分離方法において、前記活性化促進工程は、 前記血液成分分 離装置の振盪を行なう工程であってもよい。
また、上記血液分離方法において、前記血清生成機能は、 前記血液貯留 部の内方に配された血液凝固促進個体により付与されているものであつ てもよい。
さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程で導出される前記各 血液成分は、 血清を含んでいてもよい。
さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程は、 前記血液凝固促 進個体を固定させた状態で、 前記各血液中の液体成分を流動させること により前記血液成分を前記成分収容部へ収容させる工程であってもよい さらに、上記血液分離方法において、前記導出工程における前記血液凝 固促進個体は、 前記血液貯留部の内側又は外側の少なく とも一方に取り 付けられた固定手段により固定されていてもよい。
さらに、上記血液分離方法において、前記固定手段は、 マグネット、 ク ランプ、 前記血液貯留部を挟持する挟持体、 及び前記血液貯留部内に設 けられた複数の突起、 からなる群から選ばれる 1つ以上のものであって もよい。 '
これらの発明によれば、 一度に多量の血液を採取し、 迅速に分離する ことが可能となる。 更に、 貯留工程から導入工程まで外気に触れること なく行なうことが可能であるため、 微生物による汚染のリスクが少ない。 さらに、 前記分離工程で血液から分離された前記被活性化因子を除く前 記各血液成分を前記成分収容部へと導出する導出工程を備えていてもよ い。
活性化促進工程では、 血液成分分離装置全体を、 又は血液貯留部を振 盪させることにより被活性化因子を活性化させることができる。 振盪方 法は、 溶血を生じさせない方法であれば特に限定されないが、 血液凝固 促進個体が血液中で満遍なく遊動できるような遊動速度であることが好 ましい。 また、 芯体にマグネットを使用した血液凝固促進個体を使用し た場合には、 血液貯留部に対して磁界を作用させることで血液の撹拌を 行なうことができる。
分離工程では、 活性化された被活性化因子が血液凝固促進個体に付着 した状態でフイブリンが生成する。 これによつて、 血清の回収が容易に なる。 また、 導出工程では、 フィプリンが付着した血液凝固促進個体を 固定手段で固定することによって赤血球の回収がより容易になる。 更にまた本発明は、 以下のような血液中の繊維質の回収方法及ぴ再生 医療方法を提供する。
血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用 的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液 成分分離装置を用いて液性成分と非液性成分とに分離し、 前記非液性成 分から繊維質を回収する方法。
血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用 的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液 成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、 前記液 性成分を培地に添加し、 この培地に対して対象者から採取した細胞を播 種して培養を行い、 得られる細胞又は組織を前記対象者への移植用とす る再生医療方法。
上記再生医療方法において、前記液性成分は血清を含んでいてもよい 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により実用 的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている血液 成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、 前記非 液性成分の濃度を調製した後、 前記対象者への輸血用とする再生医療方 法。
上記血液分離方法において、前記非液性成分は、 血清、 白血球及ぴ赤 血球を含んでいてもよい。
これらの方法を用いれば、 大量の血清を調製することが可能となるた め、 細胞の培養に必要な量の自家血清を調製することが可能となる。 さ らに、 手術で輸血が必要な場合も血清採取後に赤血球ゃフイブリンを回 収することが可能であるため、 濃度を調製して自己輸血したり、 フイブ リンを幹細胞の足場 （ s c a f o 1 d ) 又は傷口のバリヤ一として使用 したりすることができる。
以上説明したように、 本発明の血液成分分離装置は、 採取した血液を 成分毎に分離するために用いるものであって、 血液を貯留する血液貯留 部を備え、 この血液貯留部に血清生成機能を付与することとしたので、 微生物の繁殖が抑制された血清を迅速、 且つ、 大量に調製することがで き、 再生医療における幹細胞の培養に用いる大量の血清を調製するのに 適している。 さらに血清採取後の赤血球やその他の成分は、 自己輸血用 血液や傷口のバリヤ一として使用するのに適している。
従って、 本発明に係る血液成分分離装置を用いれば、 採取した血液か ら、 血清を始めとする大量の血液成分を高い安全性を確保しながら、 迅 速且つ高効率に調製 （生産） することができる。
また、 本発明の血液分離方法では、 上記本発明に係る血液成分分離装 置を用いるものであって、 採取された血液を血液貯留部に貯留する貯留 工程と、 前記血清生成機能を起動させて、 前記血液貯留部に貯留されて いる血液中の血小板及ぴ凝固因子を含む被活性化因子の活性化を促進す る活性化促進工程と、 前記活性化促進工程で活性化されて凝集した前記 被活性化因子を血液から分離する分離工程と、 を有し、 さらに必要に応 じ血清採取後に残存する血液成分を回収し、 自己血輸血用及ぴ幹細胞の 足場又は傷口のパリヤー用として用いることとした。
従って、 この血清調製方法を用いれば、 安全性の高い血液成分を大量 に生産することができる。
また、 本発明の再生医療方法は、 上記の血液分離方法を用いて調製さ れた血清を培地に対して添加し、 この培地に対象者から採取した幹細胞 を播種して培養を行い、 培養により得られる細胞又は組織を被治療対象 者に移植することとした。 また、 小児などの循環血液量が少ない患者や 、 移植時に多量の出血が危惧される場合には回収した赤血球を輸血する こととし、 又フイブリンは移植部位の足場、 あるいは移植部位のバリヤ 一として用いることとした。
従って、 この再生医療方法を用いれば、 生物学的な安全性が確保され た大量の血清を用いることが可能であり、 対象者の組織及び機能を安全 且つ確実に再生することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置を示した 図である。
図 2は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置による血 液採取から血清保存に至るまでの手順を示す図である。
図 3は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置の血液貯 留部 1 0を振盪させている図である。
図 4は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置の血液貯 留部 1 0のチューブ 4 1を溶断させている図である。
図 5は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置を遠心分 離した後の血液貯留部 1 0を示した断面図である。
図 6は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置の血液貯 留部 1 0内で調製された血清 7 1を血清保存用の袋体 2 1に導出する方 法を示す断面図である。
図 7は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置の血液貯 留部 1 0と袋体のチューブ 4 2を溶断させている図である。
図 8は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置において 、 溶断工程を経た袋体 2 1を示した図である。
図 9は、本発明の第 1実施形態実施に係る血液成分分離装置を遠心分 離した後の導出工程における血液貯留部 1 0を示した斜視図である。 図 1 0は、本発明の第 2実施形態実施に係る血液成分分離装置に係る 凝固体付着ガラス加工体 1 4を示す斜視図 （一部断面図） である。 図 1 1は、本発明の第 4実施形態実施に係る血液成分分離装置 1を示 した図である。
図 1 2は、本発明の第 5実施形態実施に係る血液成分分離装置 1を示 した図である。
図 1 3は、本発明の第 6実施形態実施に係る血液成分分離装置 1を示 した図である。
図 1 4は、本発明の第 7実施形態実施に係る血液成分分離装置 1を示 した図である。
図 1 5は、本発明の第 5実施形態実施に係る血液成分分離装置 1の血 液貯留部 1 0に生理食塩水を導入している工程を示した図である。 図 1 6は、実施例 1に係る採血からの経過時間と血小板の残存率との 関係を示す特性図である。
図 1 7は、実施例 2に係る血液と接触するガラス加工体の面積と細胞 増殖因子 （T G F— ΐ ) の血清中への放出量の関係を示す特性図であ る。
図 1 8は、実施例 2に係る血液と接触するガラス加工体の面積と細胞 増殖因子 （P D G F— B B ) の血清中への放出量の関係を示す特性図で ある。
· 図 1 9は、実施例 3に係る血液と接触するガラス加工体の面積と上清 遊離へモグロビン量との関係を示す特性図である。
図 2 0は、実施例 4に係る各試料と細胞数の関係を示した図である。 図 2 1は、実施例 5に係る各試料の赤血球の回収率の経時変化を示し た図である。
図 2 2は、実施例 6に係る各検体の増殖因子のリ リース率及び多血小 板血漿の凝固時間を示した図である。
図 2 3は、実施例 7に係る各検体の血小板残存率を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明に係る血液成分分離装置は、 血清を生産する血液成分を,貯留す る空間に血液凝固促進機能を付与し、 実用的に使用できる量の血清を生 成することが可能な装置である。
装置形態の代表的な例としては、 可撓性の袋体が少なくとも 1つ以上 無菌的かつ液密、 気密に接続されたものであり、 かつ、 血液凝固促進機 能が付与されているものが考えられる。
このような血液成分分配収容装置は、 外観上、 所謂血液バッグや分離 バッグと類似した形態であるが、 これらと同一の形態を採用したのは、 これらが採取した各種成分を無菌的かつ液密、気密に分配するのに適し た形態であるという長年の実績があるからである。
また、 血液凝固促進機能を付与した点は、 本発明の本質に関わる。 単 なる可撓性の袋体であっても、 血液凝固因子を含む液性成分を収容した 場合、 時間の経過とともに凝固因子が活性化され、 血清の産出が可能で ある。 しかし比較的時間がかかるだけではなく、 血清中に含まれる増殖 因子が不活性化されてしまうため、 得られる活性は不十分である。 そこ で、 血液凝固促進機能を付与した。 これにより前記空間において、 血液 凝固因子を含む液性成分と血液凝固因子とが接触し、 速やかに血液凝固 が促される。 その結果、 血清調製が極めて短時間で行うことができると ともに、 活性の低下を抑制した状態で血清が調製される。 このことは、 袋体自体を、 血液凝固促進機能を備えた材質で形成した場合にも当ては まることから、 本発明は、 そのような形態を排除するものではない。 つ まり、 一般的に、 血液バッグや分離バッグなどに使用される医療材料に 比べて血液凝固促進機能が高い材質で、 貯留空間壁面を形成した形態も 本発明の範疇に含まれる。
血液凝固促進機能を有する物質としては、 現在のところ最も効果が高 いことが確認されているものとして、 ガラス加工体が挙げられる。 ガラ スには、 血液凝固作用が存在することは古くから知られるところである 力 比較的大量の血清の生成のために積極的に使用した例は未だ無い。 本発明者らは、 ガラス加工体を、血液凝固促進機能を有する物質として 用い、 血清を産生する血液成分中に存在させて、 相互に接触を繰り返し てみたところ、 大量の血清を短時間で活性を低下させることなく生成す ることに成功した。
更に、 血液凝固促進機能を有する物質として、 上記ガラス加工体では なく空気を用いた。 血液が空気と接触すると凝固することはすでに知ら れるが血清の生成のために積極的に使用したものはない。 そこで、 空気 を血液凝固促進機能を有する物質として、 血液と接触を繰り返してみた ところ、 大量の血清を短時間で生成することにも成功した。
血液凝固促進機能を有する物質は、 血液との接触が多いほど活性化さ れることが分かっている。 つまり、 ガラス加工体の場合には、 比表面積 を大きくすることが有効であり、 空気の場合には、 含有量を多くするこ とが有効であることが分かっている。 し力 し、 ガラス加工体のように血 液凝固促進機能を有する物質として、 固体を用いる場合に、 溶血の心配 を考慮しなければならない。
次に、 血液凝固因子を含む液性成分と血液凝固促進機能を有する物質 (血液凝固促進個体と以下いう） とを接触させる形態として次の形態が 考えられる。
第 1に、 人体から採取した血液を、 血液凝固促進個体を収納された血 液貯留部に貯留し、 血液の凝固を促して、 血清を分離する形態である。 ここにおいて、 分離した血清は、 血液貯留部以外の袋体に無菌的に移 送され、 この袋体にて保存可能となる。 或いは、 分離した血清は、 外部 に無菌的に導出して、 細胞培養系に増殖因子として添加するといつた利 用に供することもできる。 また、 血清分離の際に同時に分離されたその 他の血液成分 （赤血球、 フイブリンなど） は、 輸血や再生治療に使用す ることができる。
第 2に、 人体から採取した血液を、 血液貯留部に貯留し、 この貯留部 に抗凝固剤を添加した状態で、 血液成分を分離した後、 分離した成分の 中で、 血清を産生する成分である血液凝固因子を含む液性成分と血小板 とを別袋体に無菌的に移送し、 この袋体中で血清を生成させるという形 態が考えられる。 この場合、 血清を生成させる袋体中には、 上述の血液 凝固促進個体を収納しておくことは当然であるが、 混入した抗凝固剤を 中和するための中和剤を添加しておくことで、 収納した凝固促進個体の 機能が十分に発揮される。 ここにおいて、 分離した血清は、 そのまま血 液貯留部で保存するか、 他の袋体に無菌的に移送され保存される。 分離 した血清は、 外部に無菌的に導出して、 細胞培養系に増殖因子として添 加するといつた利用に供することもできる。 また、 血清分離の前後で分 離されたその他の血液成分 （赤血球、 フイブリンなど） は、 輸血や再生 治療に使用することができる。
第 3は、 第 2の形態と関連する形態である。 この形態では、 当該装置 に導入前に、 血清を産生する成分だけを血液から採取して、 第 2の形態 と同様にして血清を生成する。 この形態では、 初めから、 いわゆる成分 採血をすることになるので、 血清ゃフイブリン採取だけを目的としてい る場合に、 無用な血液成分は、 被験対象に直ちに戻すことになるので、 該被験対象にかかる肉体的負担が軽減される。
以下、 本発明について更に詳しく説明する。
<第 1実施形態 >
〔血液成分分離装置 1の全体構成〕
本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置 1の構成について、 図 1 を用いて説明する。 図 1では、 血液成分分離装置 1の構成のうち、 主要 な部分だけを抜き出して図示している。
図 1に示すように、 本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置 1は 、 血液貯留部 1 0、 成分収容部 2 0を主な要素として構成されている。 このうち、 血液貯留部 1 0は、 可撓性を有する樹脂材料、 例えば、 軟質 ポリ塩化ビニルからなる 2枚のシートが外縁部 1 1 aで融着されること で袋状に形成された本体部 1 1と、 本体部 1 1の内部に挿入されたガラ ス加工体 1 2とから構成されている。 つまり、 血液貯留部 1 0は、 外装 体としての本体部 1 1の内部に、 血液凝固促進個体としてのガラス加工 体 1 2が収容された構成を有している。
なお、 血液貯留部 1 0は、 本体部 1 1における内容積及び外観形状が 、 所謂血液バッグや分離バッグに類似しているが、 内部に抗凝固剤が充 填されていない点で血液バッグと相異し、 凝固促進剤を含む点で分離パ ッグと相異する。 また、 血液貯留部 1 0の内部は前もって滅菌処理が施 されている。
本体部 1 1内におけるガラス加工体 1 2は、 例えば、 ソーダガラスか らなる略球形をしている。 また、 図 1では、 血液貯留部 1 0内に 3つの ガラス加工体 1 2を備える構成としているが、 血液凝固促進機能を得る 上で、 貯留可能な血液量に対するガラス加工体 1 2の表面積を、 0 . 1 (m mVm 1 ) 以上の関係をもって設定をしておくことが好ましい。 なお、 ガラス加工体 1 2は、 本体部 1 1の内壁などに接合されている ものではなく、 本体部 1 1に振盪作用あるいは振動作用などを与えた際 に、 本体部 1 1の内部で遊動可能な状態に設定されている。
また、 血液貯留後に本体部 1 1に振盪作用あるいは振動作用などを与 えた際、 さらには血液を遠心分離機にかけた際に、 血液中の赤血球が破 壊され溶血に至るのを抑制するためには、 血液貯留部 1 0の本体部 1 1 に貯留可能な血液量に対して、 2 5 . 0 (m m /m 1 ) 以下の関係とな る表面積で、 ガラス加工体 1 2を設定しておくことが好ましい。 これら の数値範囲が好ましい理由については、 後述する。
成分収容部 2 0は、 6つの袋体 2 1〜 2 6から構成されており、 各々 が軟質ポリ塩化ビニルからなる。 これらは前もって滅菌処理が施されて レヽる。
図 1に示すように、 血液貯留部 1 0の本体部 1 1における上縁端には 、 その接続口に 2本のチューブ 4 1、 4 2が気密接続されている。 その うちのチューブ 4 1は血液を導入するための導入路の役割を担っている ため他端には、 採血針 3 0あるいは採血針と接続可能な接続部が接続さ れている。 血液貯留部 1 0に気密接続されたもう一方のチューブ 4 2は 、 チューブ 4 3〜4 6、 5 1〜 5 6及び分岐体 6 1〜 6 5を介して各袋 体 2 1〜2 6に接続されている。 これらは分離された血液成分を導出す るための導出路の役割を担っている。 これらのチューブ 4 1〜4 6、 5 1〜 5 6については、 柔軟性を有した樹脂材料、 例えば、 軟質ポリ塩化 ビニルなどの材料から構成されている。 ここで、 成分収容部 2 0の袋体 2 1〜 2 6と各チューブ 5 1〜 5 6とについても、 気密接続されている o
また、 チューブ 4 1、 4 2のサイズは、 その内径寸法がガラス加工体 1 2の外形寸法よりも小さく設定されている。 これは、 血清を調製及び 導出をする際に、 ガラス加工体 1 2がチューブ 4 1、 4 2の方に入り込 んでしまうのを防止するためである。
血液貯留部 1 0及ぴ袋体 2 1〜 2 6と各チューブ 4 1、 4 2、 5 1〜 5 6とは、 内部の空間が外部環境と隔絶された状態に接続されている。 また、 各チューブ 4 2〜4 6、 5 1〜5 6と各分岐体 6 1〜 6 5とにつ いても、 内部における血清が流通する領域が外部環境と隔絶された状態 に接続されている。 具体的には、 溶剤接着、 熱溶着あるいは超音波溶着 等により接続されている。 .
図 1には図示していないが、 本発明の実施の形態に係る血液成分分離 装置 1では、 各チューブ 4 2〜4 6、 5 1〜 5 6の所要の箇所をクラン プで挟むことで血液及び抽出された血清を導出する際に、 その流路を切 り替えることができる構成となっている。
〔血清調製操作について〕
上記構成を有する血液成分分離装置 1を用いた血清調製操作について 、 図 2〜図 8を用いて説明する。 なお、 図 2は操作の説明のため適宜併 用して用いる。
図 2に示すように、 上記血液成分分離装置 1を用いた血液分離操作は 、 大別して 7つの工程 （S 1〜S 7 ) から構成されている。
まず、 操作の第 1段階としては、 上記図 1における採血針 3 0を対象 者 （患者） に刺し、 血液を採取する。 この際、 採血針 3 0から採取され た血液は、 チューブ 4 1を介して、 下方に位置する血液貯留部 1 0に貯 留される （貯留工程 S l )。 ここで、 血液貯留部 1 0に採取された血液 が成分収容部 2 0の方に流れ込まないように、 チューブ 4 2と血液貯留 部 1 0の間に破断可能な隔壁が備えられている。 あるいはチューブ 4 2 は、 クランプなどを用いて血液貯留部 1 0の根元側で経路が閉鎖されて いる。 貯留工程 S 1は、 採血時における患者の体調などを考慮して、 所 要量を採取し終了される。 ここでいう所要量は、 患者の体格や体調に問 題がない場合には 2 0 0〜6 0 0 (m l ) 程度である。
なお、 採血に際しては、 献血の際などに広く使われている採血機など を用いることもできる。
次に、 図 2に示すように、 貯留工程 S 1を開始後、 それと並行するよ うに血液貯留部 1 0を振盪させる （活性化促進工程 S 2 )。 図 3に示す ように、採取された血液を貯留した血液貯留部 1 0は、振盪装置 1 0 0に より緩やかに攪拌され、 内部に収納されたガラス加工体 1 2と接触する ことになる。 そして、 血液中に含まれる血小板及び凝固因子がガラス加 ェ体 1 2の表面で凝固し、 凝固の際に活性化された血小板から、 これら を由来とする増殖因子が放出される。 （また、 この活性化促進工程を低 温下で行うと血小板の凝集促進に効果的である。）
なお、 血液貯留部 1 0を通常の血液パッグと同等の外形寸法に形成し ているため、 血液貯留部 1 0の振盪には、 公知の振盪装置を用いること ができる。 さらに、図 3では図示していないが、 血液貯留部 1 0は各袋 体 2 1〜 2 6と各チューブ 4 1〜4 6、 5 1〜5 6を介して接続されて いるため、これらを折り畳んで振盪させることも可能である。
貯留工程 S 1後、 採血対象から採血針 3 0を抜針し、 採血針 3 0と血 液貯留部 1 0とを連結しているチューブ 4 1の一部を溶断し、 且つ、 同 時にその溶断端を溶着する （溶断工程 S 3)。 チューブ 4 1の溶断には、 図 4に示すような溶断機 1 1 0 (所謂シーラー） を用いて溶断すること ができる。
一方、 患者から分離された血液貯留部 1 0は、 成分収容部 20及ぴこ れらの間を連結する各チューブ 4 2〜46、 5 1〜5 6、 さらには分岐 体 6 1〜6 5等とともに活性化促進工程 S 2を経て、 コンパク トに纏め られ、 遠心分離機にかけられる （遠心分離工程 S 4)。 このとき、 チュ ーブ 42は、 貯留工程 S 1の際と同様に破断可能な隔壁あるいはクラン プにより経路が閉鎖された状態に保たれている。
溶断工程 S 3及び遠心分離工程 S 4は、 抗凝固剤をあらかじめ添加し 採血する場合は活性化促進工程 S 2の前に行なってもよい。 この場合、 遠心分離は下記の条件で行なう。
全血の遠心分離： 4， 400 g X 4〜6 (m i n.)、 2, 2 50 g X 1 0 (m i n.)
多血小板血漿 （ P R P ) の遠心分離 ： 1， 1 0 0 g X 4〜 6 (m i n.)
血液貯留部 1 0に対する遠心分離の条件は、 貯留された血液の量及び 分離する成分の種類によって設定されるものであるが、 例えば 2 2 50 (g) X I 0 (m i n.)、 4 (°C) に設定される。 遠心分離後における 血液貯留部 1 0について、 図 5を用いて説明する。
図 5に示すように、 活性化促進工程 S 2を経た後に遠心分離された血 液貯留部 1 0内では、 遠心分離条件によって異なるが大別して血清 7 1 、 白血球 7 2、 赤血球 7 3の 3つの層に分離される。 また、 血液貯留部 1 0における本体部 1 1 aの底には、 ガラス加工体 1 2がその表面に血 小板及び凝固因子の凝固体 74が付着した状態 （以下、 「凝固体付着ガ ラス加工体 1 4」 という。） で沈んでいる。 この凝固体付着ガラス加工 体 1 4は、 図の拡大部分に示すとおり、 ガラス加工体 1 2の表面に血小 板及び凝固因子が凝固した凝固体 7 4が付着したものである。 ここでは 、 凝固体の付着の有無を区別するために、 凝固体 7 4付着後のガラス加 ェ体に符号 1 4を付している。
上述のように、 図 5の状態における上清成分である血清 7 1は、 活性 化促進工程 S 2において十分に血小板及ぴ凝固因子から放出されたこれ ら由来の増殖因子を含むものである。 また、 遠心分離工程 S 4において も、 血液貯留部 1 0の本体部 1 1の上縁端に気密接続された 2本のチュ ーブ 4 1、 4 2が両方ともに閉鎖された状態におかれているので、 外部 環境から隔絶されており、 微生物などが侵入することはない。
図 2に戻って、 活性化促進工程 S 2から遠心分離工程 S 4で活性化さ れた被活性化因子は、 塊状になって血液から分離される （分離工程 S 5 また、 分離工程 S 5において血液貯留部 1 0内で分離抽出された血清 7 1を成分収容部 2 0における各袋体 2 1〜 2 6の全部又は一部に対し て順に小分けしていく （導出工程 S 6 )。 導出方法について、 図 6を用 いて説明する。
図 6に示すように、 抽出された血清 7 1を成分収容部 2 0の袋体 2 1 に導出しょうとする場合には、 クランプ 9 0を用いてチューブ 4 3の経 路を閉鎖しておき、 この状態で血液貯留部 1 0の外側に設置した加圧機 8 0をもって、 血液貯留部 1 0を加圧 （F 1 ) する。 上述のように、 血 液貯留部 1 0に気密接続されたチューブ 4 1は、 貯留工程 S 1が終了し た時点で、 その途中 4 1 aが溶断され、 且つ同時にその端部及び近傍 4 1 bが溶着されている。
よって、 加圧 F 1を受けることによって、 分離によって抽出された上 清部分である血清 7 1の一部は、 チューブ 4 2、 分岐体 6 1及びチュー ブ 5 1を介して血清保存用の袋体 2 1に導出される。
なお、 チューブ 4 3の経路閉鎖については、 柔軟性を有するチューブ 4 3を、 クランプ 9 0の円板 9 1とベース 9 2との間で挟むことで実施 される。
図 2に戻って、 袋体 2 1に所要量の血清 7 1が充填された後、 チュー ブ 5 1を溶断及び溶着する （溶断工程 S 7 )。 この溶断及び溶着につい ては、 図 7で示すように、上記遠心分離工程 S 4の前にチューブ 4 2を 溶断及ぴ溶着したのと同様の方法を用いて実施される。 また図 8に示す ように、血清 7 1が内部に充填された袋体 2 1については、 例えば、 冷 凍保存などの保存処置が施される。
この導出工程 S 6及ぴ溶断工程 S 7を、 袋体 2 1〜 2 6の各々に対し て順次実施していき、 袋体 2 1〜2 6の全て、 あるいは一部に血清 7 1 が充填された時点で血清調製操作が終了する。 さらに必要に応じて、 赤 血球 7 3を生理食塩水、 C P D、 A C D _ A液等抗凝固剤や MA P等の 血液保存液で洗浄希釈し、 輸血用血液として保存することもできる。 こ の方法については後述する。
〔血液成分分離装置 1の優位性〕
本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置 1では、 血液バッグと同 等の内容積を有する本体部 1 1と、 その内部に配されたガラス加工体 1 2とから血液貯留部 1 0を構成し、 この血液貯留部 1 0の内部で血液か ら血清を調製するので、 従来のような採血管を用いる場合に比べて、 一 度に大量の血清を調製することができ、 調製作業における工程面などで 効果を奏する。 また、 これにより、 調製した血清が微生物などによって 汚染される危険性も低くなり、 安全性の高い血清を調製するうえでも適 している。
また、 血液成分分離装置 1では、 血液凝固促進個体としてガラス加工 体 1 2を収容しているので、 血清調製時に血餅がガラス加工体 1 2の表 面に付着し、 血清を分取する際の血清中へのフィプリンゃ血餅の混入が 防止される。
'また、 血液成分分離装置 1は、 上記効果に加えて、 血液貯留部 1 0及 ぴ袋体 2 1〜 2 6と各チューブ 4 1、 4 2、 5 1〜5 6と内部の空間が 外部環境と隔絶された状態に気密接続されているので、 血液あるいは血 清が外部環境に晒されることがない。 よって、 一層の安全性が確保され ている。
また、 上記チューブ 4 1、 4 2、 5 1〜5 6は、 柔軟性を有し、 溶断 及び溶着が可能な材質から形成されているので、 これらの経路を適時切 り離して行く際にも、 内部が外部環境に晒されることがない。 よって、 この面からも、 血液成分分離装置 1が高い安全性を有するということが いえる。
一般に、 抗凝固剤 （例えば、 A C D— A液など） を内部に備えない容 器に対して血液を貯留した場合には、 採血後、 容器を 2 0 ( m i n . ) 以上放置すれば次第に血液中の血小板及び凝固因子は凝固することにな るが、 特に容器内の空気量が少ない場合は血液の凝固が促進されず、 凝 固までに長時間を要するという問題を生じる。
これに対して、 本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置 1では、 血液を貯留する血液貯留部 1 0の内部に、 血液凝固促進機能を有する血 液凝固促進個体としてのガラス加工体 1 2を揷入しているので、 1 0 ( m i n . ) 以内には殆どの血小板 （例えば、 9 5 %以上の血小板） 及び 凝固因子が凝固するに至り、 血清調製操作を迅速に実施することができ る。 よって、 本発明の実施の形態に係る血液成分分離装置 1を用いれば 、 迅速に血清を調製することができる。 また、 前述の活性化促進工程 S 2を経て血清を調製した後に、 血液成分分離装置 1に残存する赤血球の ほとんどは、 血餅とならないため、 赤血球を輸血用の成分として再利用 できる可能性がある。
また、 例えば、 再生医療の分野においては、 幹細胞の培養のために安 全性の高い血清を多く必要とするが、 上記血液成分分離装置 1を用いて 血清 7 1を調製及び保存すれば、 安全且つ迅速に血清を調製及び保存す ることができる。 よって、 本実施の形態に係る血液成分分離装置 1を用 いれば、 患者に対して、 高い安全性を確保しながら、 高効率に組織ある いは機能の再生治療を実施することができる。
また、 上記実施の形態においては、 血液貯留部 1 0内に貯留可能な血 液量に対して、 0 . 1 (m m2/m l ) 以上の関係をもった表面積でガラ ス加工体 1 2を設定した場合には、 血液中における血小板及ぴ凝固因子 の活性化がより促進される。 また、 貯留可能な血液量に対するガラス加 ェ体 1 2の表面積を、 0 . 1 (m m /m 1 ) 以上 2 5 . 0 (m m / m 1 ) 以下の範囲内となるように設定する場合には、 活性化促進工程 S 2及 ぴ遠心分離工程 S 4における溶血の抑制と、 血小板及ぴ凝固因子の活性 化促進との両立が可能である。
なお、 血液貯留部 1 0内におけるガラス加工体 1 2の数については、 本実施形態では 3つとしたが、 これに限定されるものではない。 ガラス 加工体 1 2の収容数については、 現実的に 1個以上 5 0個以下とするの が妥当である。
また、 血液成分分離装置 1では、 血液凝固促進個体としてガラス加工 体 1 2を用いたが、 血液凝固促進個体は、 これに限定されるものではな い。 例えば、 血液との接触領域をシリカ、 珪藻土、 カオリンなどの二酸 化珪素化合物の中から選択される少なくとも一種からなる無機物で構成 したものを用いることもできる。 また、 接触領域に配する物質は、 無機 物に限定されるものでもない。 また、 上記血液成分分離装置 1では、 血液貯留部 1 0の中に血液凝固 促進機能を有する血液凝固促進個体 （ガラス加工体 1 2 ) を収容するこ とによって、 血液貯留部 1 0に血液凝固促進機能を持たせたが、 必ずし も血液貯留部 1 0内に血液凝固促進個体を収容しなくても、 血液凝固促 進機能が果される構成であればよい。 例えば、 血液貯留部 1 0の本体部 1 1における内壁の一部を上記無機物などで被覆しておいてもよい。 また、 上記血液成分分離装置 1におけるガラス加工体 1 2については、 その外観形状を略球形状にしたが、 本発明に係る血液凝固促進個体の外 観形状は、 これに限定を受けるものではない。 ただし、 遠心分離などの 際に溶血の発生及びバッグの破れを抑制する点などからは、 外表面 （血 液との接触領域） を連続曲面で形成しておくことが好ましい。
また、 導出工程 S 6においては図 9に示すように血液貯留部 1 0の外 側から例えば、 クランプのような挟持部 1 6でフイブリンが付着したガ ラス加工体を塞ぎ止めることによって、 ガラス加工体の表面に血小板及 ぴ凝固因子が付着したものを分離し、 赤血球を導出することができる。 なおこの挟持部 1 6は、 血液貯留部 1 0を挟んだ後でも赤血球や、 フィ プリンの洗浄液などが流通可能なように血液貯留部 1 0との接触面は波 型形状や凹凸形状であることが好ましい。
また、 上記発明の実施形態では、 中実のガラス加工体 1 2を用いたが 、 外表面に血液凝固促進機能を有する物質を形成しておけば、 必ずしも 中実とする必要はない。 例えば、 多孔質構造としておき、 孔内の壁面も 含めて血液と接触する全領域をガラスなどの二酸化珪素化合物などでコ 一ティングしておいてもよい。
<第 2実施形態 >
本実施形態に係る血液成分分離装置は、 上記第 1実施形態に係る血液 成分分離装置 1と、 血液貯留部 1 0内に収容されるガラス加工体の形態 に相違点を有する。 そのため、 以下では、 ガラス加工体の形態について 、 図 1 0を用いて説明し、 その他の部分についての説明は省略する。 図 1 0に示すように、 本実施形態に係る凝固体付着ガラス加工体 1 4 は、 略球形状の外観形状を有する点では上記ガラス加工体 1 2と同様で あるが、 芯体部 1 4 1と表層部 1 4 2とからなる 2層構造を有するとこ ろに特徴を有する。
凝固体付着ガラス加工体 1 4を構成する 2層の内、 芯体部 1 4 1は、 マグネットから構成されている。 他方、 表層部 1 4 2は、 上記ガラス加 ェ体 1 2を構成していた材料と同一の無機物として、 例えば、 ソーダガ ラスから構成されている。
このような構造を有する凝固体付着ガラス加工体 1 4を内部に収容し た血液貯留部 1 0を用いる場合には、 上記図 2における活性化促進工程 S 2の際に血液貯留部 1 0に対して振盪とともに磁界を作用させること で、 血液の攪拌が促進されるという効果を得ることができる。 即ち、 血 液貯留部 1 0に対してその外方から、 例えば、 マグネチックスターラー のような撹拌機で磁界を作用させることにより、 凝固体付着ガラス加工 体 1 4が容器内で回転運動などを起こし、 より高効率に血液と接触する ことになる。
従って、 凝固体付着ガラス加工体 1 4を血液貯留部 1 0内に備える血 液成分分離装置では、 上記血液成分分離装置 1よりもより迅速に血小板 及び凝固因子の活性化を図ることができ、 より迅速に血清を調製するこ とができる。
また、 ガラス加工体 1 4をマグネットで構成した場合、 導出工程 S 6 では血液貯留部 1 0の外側からマグネットで固定することができる。 <第 3実施形態 >
本実施形態に係る血液成分分離装置は、 上記第 1実施形態に係る血液 成分分離装置 1と、 成分収容部 2 0を構成する袋体 2 1〜2 6の一つを 空気抜き用としたところに相違点を有する （図 1参照）。 空気は採血時 には、 チューブ 4 1の体積分だけ必然的に血液貯留部 1 0に混入されて しまうが、 各血液成分に分離工程 S 5の際にはない方が好ましい。 その ため本実施形態に係る空気抜き用袋体を、 血液貯留部 1 0と成分収容部 2 0との間に設置すれば各血液成分に分離工程 S 5前に空気のみを除去 することが可能である。' なお、 本実施形態におけるその他の構成は第 1 実施形態と同様であるためその他の部分についての説明は省略する。 <第 4実施形態 >
本実施形態に係る血液成分分離装置は、 図 1 1に示すように上記第 1 実施形態に係る血液成分分離装置 1の血液貯留部 1 0に添加される血液 凝固促進個体の代わりに空気 1 5を含有させたところに相違点を有する 。 この場合、 あらかじめ血液凝固促進個体を添加させておく必要がない ため、 製造コス トの削減に繋がる。 空気 1 5の含有量は、 貯留可能な血 液量に対して 0 - 0 3 ( c c Z m l ) から 1 ( c c / m 1 ) であること が好ましく、 あらかじめ前記含有量となるよう封入した空気の漏出を使 用時まで防止する機構をチューブ 4 1に有することが好ましい。
また、 空気と血液凝固促進個体を併用してもよい。
<第 5実施形態 >
本実施形態に係る血液成分分離装置は、 図 1 2に示すように、 上記第 1実施形態に係る血液成分分離装置 1の成分収容部を構成する袋体 2 1 〜2 6の少なくとも一つにガラス加工体 1 2 (血液凝固促進個体） を添 加したところに相違点を有する。 また、 本実施形態の場合、 ガラス加工 体 1 2を添加する容器にカルシウムイオンを含むクェン酸中和剤を更に 添加してもよい。 この場合、血液貯留部 1 0には、 C P D液のような抗凝 固剤を添加した所謂 「献血用血液バッグ」 を用いることができる。 血液貯留部 1 0中の血液は、遠心分離等によりある程度は分離される 力 S、抗凝固剤が添加されているため、このままでは血清を生成させること ができない。 本実施形態では、血液貯留部 1 0中の血液を袋体 2 1中に 添加されている中和剤で中和させ、血液中の増殖因子を活性化させ、生成 した血清を袋体 2 2へ導出させることが可能となる。
<第 6実施形態 >
本実施形態に係る血液成分分離装置は、 図 1 3に示すように、 上記第 5実施形態に係る血液成分分離装置 1の袋体 2 1に添加されている血液 凝固促進個体の代わりに空気 1 5を含有させたところに相違点を有する 。 この場合第 4実施形態と同様に、 あらかじめ血液凝固促進個体を添加 させておく必要がないため、 製造コス トの削減に繋がる。 空気 1 5の含 有量は、 貯留可能な血液量に対して 0. 0 3 (c c/m l ) から 1 (c c/m 1 ) であることが好ましく、 あらかじめ前記含有量となるよう封 入した空気の漏出を使用時まで防止する機構をチューブ 5 1に有するこ とが好ましい。
また、 空気と血液凝固促進個体を併用してもよい。
また、 第 1実施形態及び第 4実施形態に係る血液成分分離装置 1では 、 成分収容部を 6つの袋体 2 1〜2 6から構成したが、 成分収容部を構 成する袋体の数については、 これに限定を受けるものではない。 更に、 第 1実施形態及び第 4実施形態に係る血液成分分離装置 1では、 血液凝 固促進個体としてガラス加工体が用いられている力 ガラス加工体の代 わりに空気が含有されているものでも同様の効果を奏する。 この場合、 貯留可能な血液量に対して 0 · 03 (c cZm l ) から 1 (c cZm l ) であることが好ましい。
また、 本発明は血液を分離した後に血液貯留部 1 0に残っている赤血 球ゃフイブリンを有効利用することが可能である。 以下、 それについて 詳細に説明する。
<第 7実施形態 >
第 1実施形態において血液を分離した血液成分分離装置 1を使用する。 図 1 4に示すように血液を分離し、 血清を袋体 2 1 (成分収容部） に導 出させた後の血液貯留部 1 0には、 フイブリンが付着した凝固体付着ガ ラス加工体 1 4と赤血球等の残渣が残っている。 この血液貯留部 1 0と 気密接続された成分収容部 2 1〜 2 6のうち血清が収容されなかったい ずれか一つにあらかじめ生理食塩水を入れておき、 あるいはこの血液貯 留部 1 0のチューブ 4 1に生理食塩水が含有されている生理食塩水含有 袋体 1 2 0を接続させ、 血液貯留部 1 0中の赤血球と混合させた後に輸 血用血液として使用することができる （図 1 5参照）。 また、 フイブリ ンが付着した凝固体付着ガラス加工体 1 4は、 全ての血液成分を導出し た後にさらに洗浄し、 洗浄後に得られるフイブリンを幹細胞の足場、 あ るいは傷口のパリヤーとして使用することができる。
更に、 第 1実施形態及び第 2実施形態では、 血液成分分離装置として 、 血液貯留部と成分収容部との間をチューブなどで連通した構成を採用 したが、 血液を貯留する部分と血清を保存する部分とを必ずしも別の容 器として構成する必要はない。 例えば、 溶断及び溶着などによって一部 分を切り離せるような構成の 1つの容器を用意しておき、 この容器内に 血液を貯留し、 これから成分収容部 2 0として用いるような構成として も構わない。 また、 導出工程 S 6では、 フイブリンが付着したガラス加 ェ体 1 2、 又は凝固体付着ガラス加工体 1 4を導出しないように血液貯 留部 1 0を挟み持つクランプが挙げられていたがこれに限定されるもの ではない。
以下では、 第 1実施形態における血液成分分離装置を用いて調製した 血清の有効性、 回収された赤血球の有効性、 及ぴ幹細胞の増殖について 検討を行なった結果について説明する。 なお、 実験においては、 ポリ塩 化ビニル製の外装体を用いた。
〔実施例 1〕
[活性化促進効果の確認]
ソーダガラスからなる、 大小のガラス加工体をそれぞれ表 1の条件で 血液収容部に添加した。 この血液収容部に 2 0 m 1 のヒ ト新鮮血を入れ 、 攪拌しながらインキュベートし、 1 0 , 2 0， 3 0， 6 0， 9 0分後 に 1 . 5 m lずつ採取し、 血小板数の計測を行なった。 なお、 撹拌には 、 攪拌 （振盪） 装置 （マルチシヱ一力一 MM S _ 3 0 0 東京理科器械 製） を、 血球カウントには、 血球カウント装置 （多項目自動血球計数装 置 K— 4 5 0 0 シスメックス製） を用いた。
<表 1 >
Figure imgf000032_0001
図 1 6は血小板の数とインキュベーショ ン時間の関係を示したもので ある。 これより、 血液 1 m 1当りのガラス加工体の表面積比が大きいほ ど血小板は活性化され、 凝集することが分かる。 また、 ガラス加工体を 添加しない試料は、 血液凝集まで約 9 0分と、 かなりの時間を要してい ることが示された。 さらに、 仮にガラス加工体を添加せずに長時間放置 し、 血小板からの增殖因子の放出を促したとしてもその他の凝固の活性 化が不十分である為、 その後の過程で血清が凝固、 あるいは大量のブイ ブリンが析出する場合が多い。 よって、 実験例に係るサンプル B〜 I の 容器では、 ガラス加工体が収容されていることにより、 迅速に血小板を 凝集させることができ、 血清の調製に必要となる血小板由来の増殖因子 を高効率で放出可能なことがわかる。
〔実施例 2〕
[増殖因子放出効果の確認]
増殖因子放出効果の検討を行った。 実施例 1で用いた 9つの試料の中 から 5つの試料を選ぴ、 5名の対象者の新鮮血をそれぞれの試料に添加 し、 20分経過後の増殖因子の測定を行なう。 具体的には、 下記の表 2 の条件で実施例 1と同様の方法でィンキュベートした後、 市販のテスト キット （R&D SYSTEMS社製） により増殖因子 （TGF— j3 1、 PDGF— BB) 量をマイク口プレートリーダー （Mu 1 t i s k a n B I CHROMAT I C L a b s y s t e m社製） を用いて測定し、 ガラス加工体との接触面積 0の検体における量との比として表した。 そ の結果を図 1 7及び図 1 8に示す。 図中、 横軸はガラス表面積を、 縦軸 には各増殖因子の量を示す。 図 1 7より、 ガラス加工体を血液 1 m 1当 り 0. 6 mm2とわずかでも添加すると、 増殖因子の放出量は大幅に増 加した。 しかし、 表面積比を極端に大きくした場合には、 TGF— 3 1 量はほぼ平衡となることがわかった。 また、 図 18では、 ガラス加工体 を僅かに添加するだけで増殖因子の大幅な増加が確認された。 更に、 図 1 7と同様に表面積比を極端に大きくした場合には、 PDGF— BB量 はほぼ平衡となることがわかった。 <表 2 >
Figure imgf000034_0001
〔実施例 3〕
[ガラス加工体による溶血性の検討]
実施例 1及び 2より、 ガラス加工体を添加することにより、 血小板の 活性化と増殖因子の増加に効果があることが確認された。 しかし、 ガラ ス加工体の添加により血清調製中に溶血を引き起こすことが懸念された 。 そこで、 ガラス加工体の添加量と溶血の関係を検討した。
実施例 1で用いた試料 A， F， H， I及び血液 1 m 1あたりのガラス 表面積比を広範囲に調製した J〜Mの各試料に調製したゥシ血液を入れ、 攪拌を行いながらインキュベートした。 これを経時的にサンプリングし、 遠心分離した上清のヘモグロビン濃度を測定 （ヘモグロビン B —テスト ヮコー 和光純薬工業株式会社製） した。 9 0分インキュベーション後 の結果を図 1 9に示す。 血液貯留部内部に収容されたガラス加工体の表 面積が増加するにつれて、 上清へモグロビンの増加率が上昇しているこ とがわかる。 これはガラス加工体が血液との過剰な接触面積を有し、 活 性化促進工程あるいは遠心分離工程において赤血球の破壌 （溶血） を多 く生じる原因となったことを示している。 しかしながら、 1 2 . 5 mm 2まではガラス加工体を添加していない試料 Aと同等の溶血性を示すこ とが確認された。 <表 3 >
Figure imgf000035_0001
〔実施例 4〕
[ラット幹細胞の増殖確認]
血液 1 (m l ) あたりのガラス加工体の接触面積を 0 (mm2) あるい は 1. 5 (mm) とし、 ヒ トから採取した血液を前記ガラス加工体のい 'ずれかが収容された血液貯留部中にて 2 0分間振盪した。 振盪終了後血 液を遠心分離 （遠心分離条件： 2 2 5 0 ( g) X 1 0 (m i n.)、 4 ( °0) し、 上清を分離した。 上清を 5 6°Cで 3 0分間熱処理した後、 0 . 2 2 ( μ ΐα) のフィルターでろ過し、 一 8 0 °Cにて凍結保存した。 上 清は細胞培養時に解凍され、 細胞培養用の培地に添加された。 細胞は、 ラットの大腿骨骨髄より得られた細胞をあらかじめ 7日間培養し、 得ら れた接着性の細胞を骨髄由来細胞とし本実施例に供した。 1ゥエルあた り 1万個の細胞を播種し、 培地には 1 0%濃度となるようガラス加工体 を添加して得た上清、 ガラス加工体未添加で得た上清、 あるいは市販の 細胞培養用のゥシ胎児血清を添加し培養した。 培養開始後 1 , 3， 7日 に細胞数をカウントした。 細胞—の増殖への効果を確認した結果を図 2 0 に示す。
図 2 0に示すようにラット骨髄由来細胞を培養する際に添加する血清 調製時の、 ガラス加工体との接触の有無が、 細胞增殖性に著しく影響を 及ぼしていることが判る。 また、 ガラス加工体を添加し得られた上清で は、 これまで一般的に用いられてきたゥシ胎児血清よりも良好な結果が 得られた。
〔実施例 5〕
[赤血球の回収]
回収される赤血球について確認を行なった。 ガラス加工体接触面積を 血液 1 (m l ) あたり 1 2. 5 (mm2) とし、 20 (m l ) 採血後 6 0分間マルチシェーカー MMS— 300 (東京理科器械株式会社製） に て攪拌しながら振盪させた。 対象として従来の血清調製方法により、 試 験管に採血し同じ時間静置した血液を用い、 経時的な赤血球数の変化を 調べた。 その結果を図 21に示す。 これより、 採血直後の赤血球数を 1 00%とした場合、 ガラス加工体と 60分振盪した後の赤血球は約 80 %残存していた。 一方、 従来の方法で血清を採取した場合においては、 容器内の血液の大部分が血餅となるため、 採血後 60分でわずか 10% しか赤血球が回収されなかった。
〔実施例 6〕
[多血小板血漿 （PRP) からの血清回収]
あらかじめ C PD液などの抗凝固剤を用いて採血された血液、 あるい は成分献血により調製された多血小板血漿 （PRP) からも、 増殖因子 を多く含む血清が調製可能であることを確認した。 最終濃度が 1 2. 2 %となるように C PDを添加したヒ ト新鮮血液を調製した。 この CP D加血液を 760 g、 10分 （22°C) の条件で遠心分離し、 多血小板 血漿を調製した。 得られた多血小板血漿 0. 8 mLを表 4に示すように あらかじめ塩化カルシウムとガラス加工体が添加された容器内で 37 °C にてインキュベートを開始し、 適宜振盪した。 多血小板血漿添加後に多 血小板血漿からフイブリンが析出し、 外観上流動性が低下するまでの時 間を測定した。 流動性の低下した各検体は直ちに 2， 250 g、 1 0分 (4°C) の条件にて遠心分離を行い、 得られた上清を分離した。 その後 この上清に含まれる PDGF— B B量と TGF_ i3 1量を測定した。 測 定した各増殖因子の量は、 同一血液から調製した血清中に含まれていた 各増殖因子量に対する比 （％) として図 22に示した。
<表 4 >
Figure imgf000037_0001
図 22に示すようにガラス加工体の添加量を添加する事により、 また その面積を増やすことにより多血小板血漿の凝固時間が短縮され、 PD GF— BBと TGF_ ]3 1のリリース量も増加した。
〔実施例 7〕
[空気添加効果の確認]
'空気、 あるいはガラス加工体をそれぞれ表 5に示す条件で血 液収容部に添加した。 この血液収容部に 2 0 (m l ) のヒ ト新 鮮血を入れ、 マルチシヱ一力一 MM S— 3 0 0 (東京理科器械 社製） にて攪拌しながらイ ンキュベー ト し、 2 0分後の血小板 数を多項目 自動血球計数装置 K— 4 5 0 0 (シスメ ッ ク ス社 製） を用いて計数した。 <表 5 >
Figure imgf000038_0001
図 2 3に示すように、 ガラス加工体も空気も添加していない検体 1で は 2 0分後でも 9 0 %近い血小板が残存していた。 空気のみを添加した 場合 （検体名 2〜4 )、 空気の添加量に比例して血小板の残存率が低下 した。 さらにガラス加工体と空気を組み合わせた場合は、 血小板残存率 の低下は著しく、 また空気の添加量と血小板残存率には比例関係が認め られた。 従って、 ガラス加工体ほどではないものの、 空気単独でも血小 板の活性化及び凝集の促進効果があり、 さらにガラス加工体と組み合わ せることで、 血小板の活性化及び凝集をより促進する効果が得られるこ とが示唆された。
上記実施例 1より、 血小板を迅速に凝集させるためには、 血液貯留部 内に血液凝固促進個体としてのガラス加工体を収容しておくことが有効 であることが分かった。 即ち、 ガラス加工体を収容した血液貯留部を用 いれば、 採取した血液から血清を調製するために必要となる血小板由来 の増殖因子を迅速且つ高効率に生成することができる。 よって、 このよ うなガラス加工体を血液成分分離装置内に収納しておけば、 大量の血清 を迅速に調製 （生産） することができる。
また、 実施例 2より、 ガラス加工体を収容した容器内で採取した血液 から調製された血清には、 その調製過程において細胞の増殖に有用な増 殖因子が充分に放出されており、 その結果、 その血清を培地に添加する ことで骨髄由来細胞の増殖に寄与していることが確認された。 よって、 ガラス加工体を血液成分分離装置内に収納しておくことは細胞の増殖促 進に有効な血清を調製する上で有用である。
また、 実施例 3より、 遠心分離工程により分離された血清中の上清遊 離へモグロビン量という点からは、 血液貯留部内への過剰なガラス加工 体の収容は振盪時及び遠心分離時の赤血球の破壌 （溶血） を招くことに なり、 望ましくないことが分かる。
また、 実施例 4から 7より細胞の培養に有効に作用する血清を調製し た後で、 さらに大部分の赤血球を血餅状態ではなく、 個々の単離した細 胞として回収可能であった。 これは循環血液量の少ない患者や、 あるい は多量の出血を伴う可能性がある移植手術を受ける患者への幹細胞移植 時に輸血用血液として自己血を保存できることを示唆している。 よって ガラス加工体を収容した採血容器を用いて振盪下で血清を調製すること により、 血清以外の成分も回収可能となる。
以上、 実施例 1から 7を考慮したとき、 血液貯留部中におけるガラス 加工体を、 血小板及ぴ凝固因子の活性化促進、 及び増殖因子の回収の観 点からは、 容器内に貯留可能な血液量に対するガラス加工体の表面積を 0 . 1 (m m2/ni l ) 以上の関係を有するように設定することが望まし く、 溶血の発生という要因も考慮したときには、 2 5 . 0 (m mVm 1 ) 以下の関係を有するように設定することが好ましいことが分かる。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明の血液成分分離装置は、 微生物の繁殖が 抑制された血清を迅速、 且つ、 大量に調製することができる。 そのため 、 再生医療における幹細胞の培養に用いる大量の血清を調製するのに適 している。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用により 実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されている 血液成分分離装置。
2 . 前記血液由来の液性成分と前記血小板とからなる流動体を同一空 間内に貯留し、 この流動体中に存在する血液凝固促進個体とが接触され ることで血清生成が促進される請求項 1に記載の血液成分分離装置。
3 . 成分分離が実質的になされていない血液を貯留し、 この血液中に 前記血液凝固促進個体が存在しており、 前記血液と接触されることで血 清生成が促進される請求項 1又は 2に記載の血液成分分離装置。
4 . 予め血液中から分離した血液由来の液性成分と血小板とからなる 成分を貯留し、 これらが貯留された同一空間内に前記血液凝固促進個体 が存在しており、 抗凝固剤に対する中和剤を添加し、 前記血液と接触さ せることで血清生成が促進される請求項 1又は 2に記載の血液成分分離 装置。
5 . 成分分離が実質的になされていない血液を貯留し、 この血液中か ら分離した血液由来の液性成分と血小板とからなる成分を更に貯留し、 これらが貯留された同一空間内に前記血液凝固促進個体が存在しており 、 抗凝固剤に対する中和剤を添加し、 前記血液と接触させることで血清 生成が促進される請求項 1又は 2に記載の血液成分分離装置。
6 . 前記血液凝固促進個体は、 前記血液に対して不溶性のものである 請求項 2から 5いずれかに記載の血液成分分離装置。
7 . 前記血液凝固促進個体は、 塊状の外観形状を有する請求項 2から 6いずれかに記載の血液成分分離装置。
8 . 前記血液凝固促進個体は、 前記血液貯留部に貯留された血液中で 遊動可能に設定されている請求項 2から 7いずれかに記載の血液成分分 離装置。
9 . 前記血液凝固促進個体の比重は、 前記血液より分離される前記各 血液成分よりも大きいものである請求項 2から 8いずれかに記載の血液 成分分離装置。
1 0 . 前記血液凝固促進個体の外表面は、 無機物からなる層を含む請 求項 2から 9いずれかに記載の血液成分分離装置。
1 1 . 前記無機物は、 二酸化ケイ素化合物を含む請求項 1 0に記載の 血液成分分離装置。
1 2 . 前記血液凝固促進個体は、 芯体にマグネットを含む請求項 2か ら 1 1いずれかに記載の血液成分分離装置。
1 3 . 前記血液凝固促進個体は、 前記血液が侵入可能な空孔を有する 多孔質構造である請求項 2から 1 2いずれかに記載の血液成分分離装置 1 4 . 前記血液凝固促進個体は、 前記血液由来の液性成分と前記血小 板とからなる流動体と攪拌されて接触されるものである請求項 2から 1 3いずれかに記載の血液成分分離装置。
1 5 . 生成された血清を貯留するための容器を複数備えるものである 請求項 1から 1 4いずれかに記載の血液成分分離保存装置。
1 6 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用によ り実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されてい る血液成分分離装置と、 この血液成分分離装置に無菌的に接続された保 存手段と、 を有する血液成分分離保存装置。
1 7 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用によ り実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されてい る血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離する 血液分離方法。 '
1 8 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用によ り実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されてい る血液成分分離装置を用いて液性成分と非液性成分とに分離し、 前記非 液性成分から非細胞性成分を回収する方法。
1 9 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用によ り実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されてい る血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、 前記液性成分を培地に添加し、 この培地に対して対象者から採取した細 胞を播種して培養を行い、 得られる細胞又は組織を前記対象者への移植 用とする再生医療方法。
2 0 . 前記液性成分は血清を含む請求項 1 7に記載の血液分離方法。 2 1 . 血液由来の液性成分と血小板との存在下で凝固活性化作用によ り実用的に使用できる量の血清を生成する血清生成機能が付与されてい る血液成分分離装置を用いて血液を液性成分と非液性成分とに分離し、 前記非液性成分の濃度を調製した後、 前記対象者への輸血用とする再生 医療方法。
2 2 . 前記非液性成分は、 白血球及び赤血球を含む請求項 1 9に記載 の血液分離方法。
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