CN101496917B - 细胞培养的血清调制装置和血清调制方法及细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适用于在确保高安全性的同时迅速且高效地生成大量血清的血液容纳容器、以及适用该容器的血液分离方法及再生医疗方法。在用于将采取的血液分离为多种血液成分并保存的血液成分分离装置(1)中，包括用于贮存所述血液的血液贮存部(10)、以及无菌且气密地连接于该血液贮存部(10)的成分容纳部(20)，上述血液贮存部(10)被赋予了作为血清可实用的程度下从所述血液中除去凝固因子的血清生成功能，所述成分容纳部(20)容纳在上述血液贮存部(10)中分离所述血液而生成的各血液成分。

Description

细胞培养的血清调制装置和血清调制方法及细胞培养方法

本申请是申请日为2004年5月21日、标题为“调制血清用容器及使用该容器的再生医疗方法”的第200480013939.6号中国专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及血液容纳容器及使用该容器的血液分离方法以及再生医疗方法。 

背景技术

在再生医疗领域，正在致力于研究将从对象者体内采取的干细胞在体外增殖或分化之后再移植到对象者体内，从而促进对象者的组织再生。干细胞具有分化为各种组织或器官的多分化功能，作为掌握再生医疗的关键的细胞而受到关注。 

在干细胞的体外培养增殖中，对培养基添加血清时非常有效是公知的，但在以治疗人为目的时，因为安全上的问题需要避免使用来源于人以外的动物的血清，因而要求使用利用来源于人、特别是从对象者身上采取的血液调制的血清。并且，与血液检查相比，再生医疗领域中的干细胞的培养需要较多的血清。 

作为调制这种血清的方法，例如，在日本特开2000-000228号公报中披露了使用容纳有玻璃粉末构成的促进血液凝固功能体的方法。 

但是，在日本特开2000-000228号公报中记载的方法中，因为使用以血液检查为目的的小容量采血管，所以，为了调制培养干细胞所需要的量的血清，必须进行多次调制操作，不宜实用。 

另外，关于调制后的血清，在使用之前暂时冷冻或冷藏保存的情况较多。因此，需要从采血管移送到保存用的容器中的作业，如果多次进行该作业则血清极有可能被微生物污染。此外，在这样的采血管中添加血清分离剂的情况多，并且也不能否定杂质从该血清分离剂混入到血清中。因此，从这种安全性和卫生性方面出发，在将人作为对象的再生医疗领域中，不适于使用日本特开2000-000228号公报中公开的方法。另外，在现有的调制血清用的采血管中，在采血管的结构上，难以取出血清以外的成分，并且，因为形成了血饼，所以不能再利用。 

如上所述，需要开发出在培养干细胞时适用于调制大量血清的血清调制容器。 

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明的目的在于提供一种适用于在确保高度安全性的同时迅速、且有效地生产大量血清的血液容纳容器以及使用该容器的血液分离方法及再生医疗方法。 

为了达成上述目的，本发明提供一种血液成分分离装置，在来源于血液的液性成分和血小板的存在下，利用凝固活性化作用赋予用于生成可实用的量的血清的血清生成功能。 

在此，所谓“血液”指的是由血球(红血球、白血球、血小板)和作为液体成分的血浆(血清)构成的全血、以及包含这些中的至少一种的液体(例如，用成分献血采取的血液)。并且，所谓“血清”指的是当放置采取的血液时流动性降低、然后从红色的凝固块(血饼)中分离的淡黄色液体。本发明中的“血清”指的是对细胞培养有用的血液中的液性成分，其中，在不从血饼中分离这点上与一般的血清生成方法不同，但其中所包含的凝固因子、增殖因子实质上与一般的血清相同。 

所谓“来源于血液的液性成分”指的是“红血球以外的血液成分”或“在红血球以外的血液成分中添加抗凝固剂等药剂的混合液”。 

所谓“凝固活性化作用”指的是为了从血液中除去凝固因子而使血液中的凝固因子活性化。 

所谓“用于生成可实用的量的血清的血清生成功能”指的是例如可用于培养干细胞程度的量。在干细胞培养中，血清需要培养基的10％左右。因此，优选5(ml)以上至1000(ml)以下，更优选10(ml)以上至600(ml)以下。 

具体提供如下所述的装置。 

本发明提供一种血液成分分离装置，是一种用于将采取的血液分离为多种血液成分并将其容纳的装置，为了调制可作为血清实用的量，在用于贮存所述血液的血液贮存部中，赋予了从所述血液中除去凝固因子的血清生成功能。 

根据上述血液成分分离装置，由于包括血液贮存部，从而可将采取的血液大量地贮存在血液贮存部中。并且，该血液贮存部被赋予了血清生成功能，所以可迅速地使血液中的血小板和凝固因子等 活性化。另外，这些被活性化因子可迅速除去，所以可调制大量血清。并且，该血液成分分离装置优选包括用于容纳从血液中分离的多种血液成分的成分容纳部，该成分容纳部和血液贮存部优选无菌且气密地连接。由此，可在不接触外界气体的情况下进行从采血到调制血清的一系列工序，所以可降低微生物引起污染的风险。 

另外，根据本发明的血液成分分离装置除了可以使用人的血液，还可使用啮齿类、家畜类、灵长类等哺乳类的血液，所以还可以作为非人用血液成分分离装置使用。 

在上述血液成分分离装置中，上述多种血液成分既可以含有血清，也可以含有白血球及红血球。 

根据本发明，由血液成分分离装置分离的血清是含有大量细胞增殖因子的血清，所以适用于再生医疗领域。另外，因为可以单独回收被活性化因子，所以可不必废弃采取的血液而有效利用。 

在上述血液成分分离装置中，所述血液贮存部及所述成分容纳部为具有可挠性的袋体，通过分配到所述血液贮存部内的促进血液凝固体赋予所述血清生成功能。 

血液贮存部和成分容纳部为具有可塑性的袋体，其轻量而便于携带、运输。这些可以至少各设置一个，但也可以设置多个，优选方式为，血液贮存部设置一个，成分容纳部设置两个或以上。并且，各自的容量只要可从血液中分离各血液成分即可，并没有特别限定，但优选为5(ml)至1000(ml)，更优选为10(ml)至600(ml)。并且，通过在该血液贮存部的内包中分配促进血液凝固体，从而可赋予血清生成功能。促进血液凝固体的含量为可从血液中除去纤维蛋白或血小板等的血液凝固因子的量，由于不溶于血液，所以可避免在得到的血清中混合杂质。 

在上述血液成分分离装置中，所述促进血液凝固体优选对上述血液具有不溶性、且具有块状外观形状。并且，更优选在贮存于上述血液贮存部内的血液中可游动。 

根据本发明，通过将促进血液凝固体形成粒状或颗粒状、块状，从而可提高制造时的处理性。并且，通过将促进血液凝固体设定为可游动，从而可更加顺利地与血液接触，提高血液的活性化效率。 

在上述血液成分分离装置中，上述促进血液凝固体的比重可以大于从上述血液中分离的上述各血液成分。由此，可容易地从血液贮存部中取出调制后的血清。 

并且，在从血液调制血清时，在实现了血小板及血液凝固因子等的被活性化因子的活性化的基础上，进行离心分离，但从抑制此时的红血球的破坏(溶血)、血液贮存部的破坏方面来看，优选将促进血液凝固体的外观形状形成为大致球状。并且，从使迅速活性化的目的出发，优选预先用由二氧化硅化合物构成的层形成促进血液凝固材料的表面。 

作为二氧化硅化合物，可使用选自玻璃、二氧化硅、硅藻土、高岭土等中的至少一种，但并不限定于此。 

并且，当促进血液凝固材料的芯体使用磁体时，通过对血液贮存部施加磁场，从而可进行血液的搅拌，并可使被活性化因子迅速活性化。 

促进血液凝固体由于形成多孔质结构，可将相当于单位面积的表面积设定得较大，所以为了实现活性化而优选。但是，此时需要在孔内可侵入血液。 

关于血液贮存部内的促进血液凝固体，从促进活性化及抑制溶血两方面考虑，相对于可贮存在血液贮存部的血液量，优选预先以0.1(mm²/ml)至25(mm²/ml)的关系设定其表面积。另外，该值是目前的最佳条件值，但这个范围以外的值只要具有同样效果也包含在本发明内。 

在上述血液成分分离装置中，上述血液贮存部中也可以不投放血清分离剂。 

另外，在上述血液成分分离装置中，上述血液贮存部至少形成两个接口，在所述两个接口中，一个可气密连接用于将所述血液导入至上述血液贮存部的导入路，另一个可气密连接在上述血液贮存部中将从所述血液分离的上述各血液成分导出的导出路。 

根据本发明，通过在形成于血液贮存部上的接口连接导出路和导入路，从而可防止血液成分混入血清。 

在上述血液成分分离装置中，上述成分容纳部由两个袋体构成，上述导出路由连接于各袋体的多个导出管构成，也可以兼用上述多个导出管的至少一部分。 

根据本发明，成分容纳部由两个以上袋体构成，通过兼用多个导出管的至少一部分，各个袋体连成一个，容易处理。并且，通过将各部分预先气密连接，从而可防止微生物混入。 

在上述血液成分分离装置中，上述血液贮存部也可以含有空气。血液贮存部含有的空气优选相对于可贮存的血液量为0.03(cc/ml)至1(cc/ml)。 

根据本发明，通过使血液贮存部含有空气，从而可得到与含有促进血液凝固体时同样的效果。 

另外，根据本发明的血液分离方法，其特征为，在来源于血液的液性成分和血小板存在下，使用被赋予了血清生成功能的血液成分分离装置将血液分离为液性成分和非液性成分，其中，所述血清生成功能是通过凝固活性化作用生成可实际实用的量的血清。 

具体提供以下方法。 

一种血液分离方法，是一种用于将采取的血液分离为多种血液成分并将其容纳的装置，尤其是一种用于贮存所述血液的血液贮存部被赋予了血清生成功能的装置，所述血清生成功能是生成作为血清可实用的量的血清，包括：贮存工序，将采取的血液贮存在血液贮存部；促进活性化工序，使上述血清生成功能起动，促进被活性化因子的活性化，所述被活性化因子包含贮存在上述血液贮存部中的血液中的血小板和凝固因子；分离工序，将从血液中分离在上述促进活性化工序中被活性化而凝集的上述被活性化因子。 

在上述血液分离方法中，所述促进活性化工序也可以为进行上述血液成分分离装置的振荡的工序。 

并且，在上述血液分离方法中，所述血清生成功能也通过分配给上述血液贮存部内的促进血液凝固体赋予。 

另外，在上述血液分离方法中，在上述导出工序中导出的上述血液成分也可以包含血清。 

另外，在上述血液分离方法中，上述导出工序也可以是以下工序：在将所述促进血液凝固个体固定的状态下，通过使所述各血液中的液体成分流动，从而将上述血液成分容纳到上述成分容纳部。 

另外，在上述血液分离方法中，上述导出工序中的所述促进血液凝固个体通过固定装置来固定，所述固定装置安装在所述血液贮存部内侧或外侧中的至少一方。 

另外，在上述血液分离方法中，所述固定装置也可以是选自磁体、夹紧工具、用于夹持所述血液贮存部的夹持体、以及设置在上述血液贮存部内的多个突起中的至少一个。 

根据这些发明，可一次采取大量血液，且能迅速分离。并且，可在不与外界气体接触的情况下进行贮存工序至导入工序，所以微生物污染的危险性小。另外，还可以包括导出工序，将用于除去在上述分离工序中从血液分离的所述被活性化因子的上述各血液成分导出至上述成分容纳部。 

在促进活性化工序中，通过振荡整个血液成分分离装置或血液贮存部，可使被活性化因子活性化。只要是不发生溶血的方法，振荡方法就没有特别限定，但优选促进血液凝固个体可在血液中到处游动这样的游动速度。并且，在使用芯体使用磁体的促进血液凝固个体时，通过使磁场对血液贮存部发挥作用，从而可进行血液搅拌。 

在分离工序中，在被活性化的被活性化因子附着于促进血液凝固个体的状态下生成纤维蛋白。由此，血清的回收变得容易。并且，在导出工序中，通过用固定装置固定附着有纤维蛋白的促进血液凝固个体，从而红血球回收更加容易。 

此外，本发明还提供以下血液中的纤维质的回收方法及再生医疗方法。 

一种使用被赋予了血清生成功能的血液成分分离装置分离为液性成分和非液性成分、并从上述非液性成分中回收纤维质的方 法，其中，所述血清生成功能是在来源于血液的液性成分和血小板存在下，通过凝固活性化作用生成可实用的量的血清。 

一种再生医疗方法，使用被赋予了血清生成功能的血液成分分离装置将血液分离为液性成分和非液性成分，将所述液性成分添加到培养基中，对该培养基播种从对象者身上采取的细胞进行培养，将得到的细胞或组织移植到上述对象者体内，其中，所述血清生成功能是在来源于血液的液性成分和血小板存在下，通过凝固活性化作用生成可实用的量的血清。 

在上述再生医疗方法中，所述液性成分也可以包括血清。 

一种再生医疗方法，使用被赋予了血清生成功能的血液成分分离装置将血液分离为液性成分和非液性成分，在将所述非液性成分的浓度调制好后，用于向上述对象者输血，其中，所述血清生成功能是在来源于血液的液性成分和血小板存在下，通过凝固活性化作用生成可实用的量的血清。 

在上述血液分离方法中，所述非液性成分还可以包括血清、白血球及红血球。 

因为使用这些方法可调制大量血清，所以可调制细胞培养所需要量的自用血清。另外，在手术中需要输血时，在采取血清后也可以回收红血球和纤维蛋白，所以可调制浓度给自己输血，或者将纤维蛋白作为干细胞的架板(scafold)或伤口障壁(barrier)来使用。 

如上所述，本发明的血液成分分离装置是用于将采取的血液按照每种成分分离后使用，包括用于贮存血液的血液贮存部，对该血液贮存部赋予血清生成功能，所以可迅速且大量地调制可抑制微生物繁殖的血清，适用于调制再生医疗中的干培养细胞用的大量血清。此外，采取血清后的红血球或其他成分还适用于自己输血用血液或伤口障壁。

因此，如果使用根据本发明的血液成分分离装置，可在确保高安全性的同时，从采取的血液中迅速且高效地调制(生产)以血清为代表的大量血液成分。 

另外，在本发明的血液分离方法中，使用根据上述本发明的血液成分分离装置，包括：将采取的血液贮存在血液贮存部中的贮存工序；起动上述血清生成功能，促进被活性化因子的活性化的活性化工序，该被活性化因子包括贮存在上述血液贮存部内的血液中的血小板和凝固因子；以及分离工序，将在上述促进活性化工序中被活性化而聚集的上述被活性化因子从血液中分离。另外，根据需要回收采取血清后残存的血液成分，作为自己血输血用及干细胞的架板或伤口障壁而使用。 

因此，使用该血清调制方法，可以大量生产安全性高的血液成分。 

另外，根据本发明的再生医疗方法，将使用上述血液分离方法调制的血清添加到培养基中，在该培养基中播种从对象者身上采取的干细胞进行培养。将通过培养得到的细胞或组织移植给被治疗对象者。并且，在移植时担心大量出血的情况下输血回收的红血球，或者纤维蛋白作为移植部位的架板或移植部位的障壁而使用。 

因此，如果使用该再生医疗方法，可使用确保生物学安全性的大量血清，可安全且确实地再生对象者的组织及机能。 

本发明提供一种用于细胞培养的血清调制装置，包括：血液贮存部，所述血液贮存部贮存包含来源于血液的血小板和至少包含凝固因子的液性成分的液体；成分容纳部，所述成分容纳部包含贮存在所述血液贮存部中的所述液体的血清成分；以及管，所述管无菌地和以气密的方式连接所述血液贮存部和所述成分容纳部，其中，所述血液贮存部包含与所述液体接触并促进凝固的促进血液凝固体，并且所述促进血液凝固体无菌地生成适用于所述培养的血清。 

根据本发明的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体为其中能够活性化所述液体中的所述血小板，并且能够使所述液体中的纤维蛋白附着于其表面的粒状体。 

根据本发明的用于细胞培养的血清调制装置，其中，实施所述血液贮存部中的所述血清与其他成分之间的分离。 

根据本发明的用于细胞培养的血清调制装置，进一步包括贴合用包，所述贴合用包设置在所述血液贮存部与所述成分容纳部之间，并且连接于所述管，其中，所述血液贮存部由具有可挠性的挠性袋体所配置。 

本发明还提供了一种用于细胞培养的血清调制装置，包括：血液贮存部，所述血液贮存部贮存包含来源于血液的血小板和至少包含凝固因子的液性成分的液体；成分容纳部，所述成分容纳部包含贮存在所述血液贮存部中的所述液体；以及管，所述管无菌地和以气密的方式连接所述血液贮存部和所述成分容纳部，其中：向所述血液贮存部中添加用于抑制液体凝固的抗凝固剂；所述成分容纳部由多个袋体构成；向多个袋体中的一个袋体中添加与所述液体接触并促进凝固的促进血液凝固体和相对于抗凝固剂的中和剂；以及所述促进血液凝固体无菌地生成适用于所述培养的血清。 

根据本发明的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体是具有的比重大于所述液体的固体，并且所述血清和所述凝固因子通过以向下的方向使所述促进血液凝固体沉淀而分离。 

根据本发明的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体是由二氧化硅化合物形成的球体，并且对于1ml的所述液体来说具有0.1mm²至25mm²的表面积。 

本发明还提供一种血清调制方法，包括：在具有促进血液凝固体的血液贮存部中贮存血液以调制所述血清，所述促进血液凝固体通过与血液接触和促进凝固而生成血清；以及在无菌地和以气密的方式连接于所述血液贮存部的成分容纳部中贮存所述血清。 

本发明还提供一种通过根据如上所述的血清调制方法调制的人血清。 

附图说明

图1是表示根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置的图； 

图2是表示利用本发明第一实施方式的血液成分分离装置的从采取血液到保存血清的顺序的图； 

图3是使根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置的血液贮存部10振荡的图； 

图4是使根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置的血液贮存部10的管41熔断的图； 

图5是表示将根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置离心分离后的血液贮存部10的剖面图； 

图6是表示将在本发明第一实施方式的血液成分分离装置的血液贮存部10内调制的血清71导出至保存血清用的袋体21的方法的剖视图； 

图7是将根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置的血液贮存部10和袋体的管42熔断的图； 

图8是表示在根据本发明第一实施方式的血液成分分离装置中，经过了熔断工序的袋体21的图； 

图9是表示将本发明第一实施方式的血液成分分离装置离心分离后的导出工序中的血液贮存部10的立体图； 

图10是表示本发明第二实施方式的血液成分分离装置的凝固体附着玻璃加工体14的立体图(局部剖视图)。 

图11是表示根据本发明第四实施方式的血液成分分离装置1的图； 

图12是表示根据本发明第五实施方式的血液成分分离装置1的图； 

图13是表示根据本发明第六实施方式的血液成分分离装置1的图； 

图14是表示根据本发明第七实施方式的血液成分分离装置1的图； 

图15是表示向根据本发明第五实施方式的血液成分分离装置1的血液贮存部10导入生理盐水的工序的图； 

图16是表示根据实施方式一的从采血的经过时间和血小板的残存率之间的关系的特性图； 

图17是表示根据实施方式二的与血液接触的玻璃加工体的面积和细胞增殖因子(TGF-β1)向血清中的放出量的关系的特性图； 

图18是表示根据实施方式二的与血液接触的玻璃加工体的面积和细胞增殖因子(PDGF-BB)向血清中的放出量的关系的特性图； 

图19是表示根据实施方式三的与血液接触的玻璃加工体的面积和上清游离血红蛋白量之间的关系的特性图； 

图20是表示根据实施方式四的各试样和细胞数的关系的图； 

图21是表示根据实施方式五的各试样的红血球的回收率随时间变化的图； 

图22是表示根据实施方式六的各检测体的增殖因子的释放率及多血小板血浆的凝固时间的图； 

图23是表示根据实施方式七的各检测体的血小板残存率的图； 

图24是表示第八实施方式的血清调制装置的构成的功能框图； 

图25是表示第九实施方式的挠性包的构成的示意图； 

图26是表示第十实施方式的血清调制装置的构成的功能框图； 

图27是表示第十二实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图28是表示第十三实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图29是表示第十四实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图30是表示第十五实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图31是表示第十六实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图32是表示第十七实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图33是表示第十九实施方式的血清调制装置的构成的示意图； 

图34是表示第十九实施方式的血清调制装置的构成的示意图；以及 

图35是表示第十九实施方式的血清调制装置的构成的示意图。 

具体实施方式

根据本发明的血液成分分离装置是一种对用于贮存生产血清的血液成分的空间赋予促进血液凝固功能、且可生成能实用的量的血清的装置。 

作为装置形态的代表例，可考虑如下，无菌地且液密、气密连接至少一个以上的可挠性袋体，并且被赋予了促进血液凝固功能。 

这种血液成分分配容纳装置在外观上为与所谓的血液包、分离包类似的形态，但之所以采用与这些相同的状态是因为具有长期实效，即这些处于适用于无菌地且液密、气密分配采取的各种成分的形态。 

另外，赋予了促进血液凝固功能这点与本发明的本质相关。即便只是可挠性袋体，在容纳含有血液凝固因子的液性成分时，凝固因子随着时间的经过而被活性化，从而可产出血清。但是，不但比较费时间，血清中含有的增殖因子还被钝化，所以得到的活性不充分。因此赋予了促进血液凝固功能。由此，在上述空间内，含有血液凝固因子的液性成分和血液凝固因子接触，迅速地促进血液凝固。其结果是，可在极短时间内进行血清调制，并在抑制活性降低的状态下调制血清。这个还适用于用具有促进血液凝固功能的材料形成袋体自身的情况，所以本发明并不排除该种形态。即，采用促进血液凝固功能高于通常使用于血液包、分离包等医疗材料的材质形成贮存空间壁面的形态也包含在本发明的范畴内。 

作为具有促进血液凝固功能的材质，目前被确认为最有效的可以列举玻璃加工体。玻璃一直以来就被公认为存在血液凝固作用，但还没有发现为了生成较大量的血清而积极使用的例子。本申请发 明人将玻璃加工体作为具有促进血液凝固功能的物质使用，并使其存在于可产生血清的血液成分中，相互反复接触的结果是，成功地在短时间内生成了大量血清，且不会使活性降低。 

另外，作为具有促进血液凝固功能的物质，未使用上述玻璃加工体，而使用了空气。众所周知，血液一旦接触空气便会凝固，但还没有为了生成血清而积极使用。因此，将空气作为具有促进血液凝固功能的物质，与血液反复接触的结果是，也成功地在短时间内生成了大量血清。 

具有促进血液凝固功能的物质与血液接触得越多越被活性化是公知的。即，当采用玻璃加工体时增大比表面积尤其有效、而当采用空气时增大含有量尤其有效是公知的。但是，作为具有促进血液凝固功能的物质使用象玻璃加工体这样的固体时，必须考虑溶血的可能性。 

其次，作为使含有血液凝固因子的液性成分和具有促进血液凝固功能的物质(以下称为促进血液凝固体)接触的形态，考虑到以下形态。 

第一形态是，将从人体内采取的血液贮存在用于收纳促进血液凝固体的血液贮存部中，促进血液凝固以分离血清。 

在此，分离的血清可无菌地移送到血液贮存部以外的袋体中，并用该袋体保存。或者，分离的血清也可以无菌地导出到外部，用于作为增殖因子添加到细胞培养系中。并且，在分离血清时同时分离的其他血液成分(红血球、纤维蛋白等)可使用于输血、再生治疗。 

第二形态可考虑如下：将从人体内采取的血液贮存在血液贮存部，在该贮存部中添加了抗凝固剂的状态下分离血液成分后，在分 离的成分中，将含有作为产生血清的成分的血液凝固因子的液性成分和血小板无菌地移送到其他袋体中，并在该袋体中生成血清。此时，在用于生成血清的袋体中，当然要预先容纳上述促进血液凝固体，但是，通过预先添加用于中和混入的抗凝固剂的中和剂，收纳的促进凝固体的功能可充分发挥。在此，分离的血清直接保存在血液贮存部中或者无菌地移送到其他袋体中保存。分离的血清无菌地导出到外部，可用于作为增殖因子添加到细胞培养系中。另外，在分离血清前后分离出的其他血液成分(红血球、纤维蛋白等)可使用于输血、再生治疗。 

第三形态与第二形态相关。在该形态中，在导入到该装置之前，只从血液中采取用于产生血清的成分，与第二形态同样地生成血清。在该状态中，因为从开始就进行所谓的成分采血，所以在以只采取血清、纤维蛋白为目的时，无用的血液成分直接返回至试验对象，所以减轻了对该试验对象的身体负担。 

下面，对本发明进行更加详细的说明。 

<第一实施方式> 

[血液成分分离装置1的整体构成] 

使用图1对根据本发明实施方式的血液成分分离装置1的构成进行说明。在图1中，在血液成分分离装置1的构成中，只选出主要部分加以图示。 

如图1所示，根据本发明实施方式的血液成分分离装置1的主要要素包括血液贮存部10和成分容纳部20。其中，血液贮存部10包括通过将软质聚氯化乙烯形成的两片材用外缘部11a热粘接而形成袋状的本体部11、以及插入到本体部11内部的玻璃加工体12。 即，血液贮存部10具有在作为外壳的本体部11内部容纳有作为促进血液凝固体的玻璃加工体12的结构。 

并且，血液贮存部10的本体部11的内部容积及外观形状与所谓的血液包、分离包类似，但在内部未填充抗凝固剂这点上与血液包不同，在含有凝固促进剂这点上与分离包不同。另外，血液贮存部10的内部预先施加了灭菌处理。 

本体部11内的玻璃加工体12由钠玻璃形成并具有大致的球形。并且，在图1中，血液贮存部10内包括三个玻璃加工体12，但在取得促进血液凝固功能上，优选预先将玻璃加工体12的表面积相对于可贮存的血液量的关系设定为大于等于0.1(mm²/ml)。 

另外，玻璃加工体12并不与本体部11的内壁等接合，且设定为以下状态：当对本体部11施加振荡作用或振动作用等时，可在本体部11内部游动。 

另外，当在贮存血液后对本体部11施加振荡作用或振动作用等时，以及将血液提供给离心分离机时，为了抑制血液中的红血球被破坏而溶血，优选将玻璃加工体12设定为：其表面积相对于可贮存在血液贮存部10的本体部11内的血液量为小于等于25.0(mm²/ml)的关系。对于优选这些数值范围的理由进行以下叙述。 

成分容纳部20包括六个袋体21～26，分别由软质聚氯化乙烯制成。对这些预先施加了灭菌处理。 

如图1所示，在血液贮存部10的本体部11的上缘端，在其接口处气密连接有两根管41、42。其中，管41起到用于导入血液的导入路的作用，所以其另一端连接有采血针30或可与采血针连接的连接部。与血液贮存部10气密连接的另一管42通过管43～46、51～56及分叉体61～65连接于各袋体21～26。这些起到用于导出 分离的血液成分的导出路的作用。这些管41～46、51～56由具有柔软性的树脂材料、例如软质聚氯化乙烯等材料制成。在此，成分容纳部20的袋体21～26和各管51～56也是气密连接。 

另外，管41、42的尺寸设定为其内径尺寸小于玻璃加工体12的外形尺寸。这是为了防止玻璃加工体12在调制和导出血清时进入导管41、42。 

血液贮存部10以及袋体21～26和各管41、42、51～56在内部空间与外部环境隔绝的状态下相连接。并且，各管42～46、51～56和各分叉体61～65也是在内部的血清流通的区域与外部环境隔绝的状态下连接。具体地，通过溶剂粘接、热粘接或超声波粘接等进行连接。 

虽然图1没有示出，但在根据本发明实施方式的血液成分分离装置1中，通过将各管42～46、51～56的规定位置用夹子夹住，从而在导出血液及抽出的血清时，可以切换其流路。 

[关于调制血清的操作] 

基于图2～图8对使用具有上述构成的血液成分分离装置1调制血清的操作进行说明。并且，为了说明操作，还适当地结合使用图2。 

如图2所示，使用上述血液成分分离装置1分离血液的操作大致由七个工序(S1～S7)构成。 

首先，作为操作的第一步骤，将上述图1中的采血针30扎入采血对象(患者)，采取血液。此时，从采血针30采取的血液通过管41贮存到位于下方的血液贮存部10(贮存工序S1)。在此，在管42和血液贮存部10之间具有可破裂的隔壁，使得采取到血液贮 存部10中的血液不会流入成分容纳部20。或者使用夹子等在血液贮存部10的基侧封锁管42的路径。在贮存工序S1中，考虑到采血时患者的身体条件等，采取到需要量后便结束。在此所说的需要量是在患者的体格、身体条件没有问题的情况下采取200～600(ml)左右。 

另外，当采血时，还可以使用广泛用于献血时等的采血机等。 

其次，如图2所示，在贮存工序S1开始后，与其同时地使血液贮存部10振荡(活性化促进工序S2)。如图3所示，贮存有采取到的血液的血液贮存部10由振荡装置100缓缓搅拌，与收纳在内部的玻璃加工体12接触。并且，血液中含有的血小板和凝固因子在玻璃加工体12的表面凝固，从凝固时被活性化的血小板释放出来源于这些的增殖因子。(另外，在低温下进行该活性化促进工序时有助于促进血小板的凝集。) 

另外，因为将血液贮存部10形成为与一般的血液包等同的外形尺寸，所以振荡血液贮存部10时，可使用公知的振荡装置。此外，虽然在图3中没有示出，但血液贮存部10通过各管41～46、51～56与各袋体21～26相连接，所以还可将这些折叠后再进行振荡。 

在贮存工序S1后，从采血对象的身上拔出采血针30，将连接采血针30和血液贮存部10的管41的一部分熔断，且同时熔敷其熔断端(熔断工序S3)。对于管41的熔断可使用图4所示的烧割机110(所谓的密封器)进行熔断。 

另一方面，与患者分离的血液贮存部10与成分容纳部20以及在这些之间连接的各管42～46、51～56及分叉体61～65等一起经过活性化促进工序S2，紧紧缠绕，再提供给离心分离机(离心分离 工序S4)。此时，与贮存工序S1同样，管42利用可破裂的隔壁或夹子保持为路径封锁状态。 

在预先添加抗凝固剂采血的情况下，熔断工序S3和离心分离工序S4也可以在活性化促进工序S2之前进行。此时，离心分离按下述条件进行。 

全血的离心分离：4,400g×4～6(min.)、2,250g×10(min.) 

多血小板血浆(PRP)的离心分离：1,100g×4～6(min.) 

根据贮存的血液量和分离成分的种类来设定血液贮存部10的离心分离的条件，例如设定为2250(g)×10(min.)、4(℃)。使用图5对离心分离后的血液贮存部10加以说明。 

如图5所示，在经过活性化促进工序S2后被离心分离的血液贮存部10内，虽然根据离心条件会有所不同，但大体分为血清71、白血球72和红血球73三层。并且，在血液贮存部10的本体部11a的底部，玻璃加工体12以在其表面上附着有血小板和凝固因子的凝固体74的状态(以下称为“凝固体附着玻璃加工体14”)沉淀。该凝固体附着玻璃加工体14如图中的放大部分所示，在玻璃加工体12的表面上附着有血小板和凝固因子凝固而成的凝固体74。在此，为了区分是否附着有凝固体，对附着有凝固体74的玻璃加工体赋予符号14。 

如上所述，图5状态下的作为上清成分的血清71包括在活性化促进工序S2中充分从血小板和凝固因子中放出的来源于这些的增殖因子。并且，在离心分离工序S4中，与血液贮存部10的本体部11的上缘端气密连接的两根管41、42两者都处于封闭状态，所以与外部环境隔离，微生物等不会侵入。 

返回图2，在活性化促进工序S2至离心分离工序S4中被活性化的被活性化因子呈块状地从血液中分离(分离工序S5)。 

另外，在分离工序S5中，将在血液贮存部10内分离抽出的血清71依次分给成分容纳部20中的各袋体21～26的全部或一部分(导出工序S6)。关于导出方法，使用图6加以说明。 

如图6所示，在将抽出的血清71导出至成分容纳部20的袋体21中时，使用夹子90预先封锁管43的路径，在该状态下，用设置在血液贮存部10外侧的加压机80对血液贮存部10加压(F1)。如上所述，气密连接于血液贮存部10的管41在贮存工序S1结束的时刻，其中间部41a被熔断，并且，同时其端部和附近部41b被熔敷。 

由此，通过接受加压F1，分离后被抽出的作为上清部分的血清71的一部分通过管42、分叉体61和管51导出至保存血清用的袋体21中。 

另外，关于管43的路径封锁，通过在夹子90的圆板91和基体92之间夹持具有柔软性的管43而实施。 

再参照图2，在袋体21中填充需要量的血清71后，熔断并熔敷管51(熔断工序S7)。关于该熔断和熔敷，如图7所示，在上述离心分离工序S4之前，使用与熔断和熔敷管42同样的方法来实施。再如图8所示，对于内部填充有血清71的袋体21，例如实施冷冻保存等保存措施。 

对各袋体21～26依次实施该导出工序S6和熔断工序S7，在袋体21～26的全部或部分中填充有血清71的时刻，结束血清调制操作。此外，还可以根据需要，用生理盐水、CPD、ACD-A液等抗凝 固剂或MAP等血液保存液洗净、稀释红血球73，然后作为输血用血液保存。对于该方法在后面进行叙述。 

[血液成分分离装置1的优越性] 

在根据本发明实施方式的血液成分分离装置1中，由具有与血液包等同的内部容积的本体部11、以及配置在其内部的玻璃加工体12构成血液贮存部10，在该血液贮存部10的内部由血液调制血清，所以，与现有的使用采血管的情况相比，可以一次调制大量血清，在调制作业的工序方面等奏效。并且，由此，调制的血清被微生物等污染的危险性降低，适于调制安全性高的血清。 

另外，在血液成分分离装置1中，作为促进血液凝固体容纳有玻璃加工体12，所以调制血清时血饼附着在玻璃加工体12的表面，可防止在分取血清时纤维蛋白、血饼混入到血清中。 

另外，在血液成分分离装置1中，不但具有上述效果，还因为血液贮存部10以及袋体21～26和各管41、42、51～56与内部空间在与外部环境隔绝的状态下气密连接，所以血液或血清不会暴露在外部环境中。由此，进一步确保了安全性。 

另外，上述管41、42、51～56具有柔软性，由可熔断和熔敷的材质形成，所以，即使在适时切断这些路径时，内部也不会暴露在外部环境中。由此，从这方面来看，可以说血液成分分离装置1具有高安全性。 

通常，在利用内部不包括抗凝固剂(例如，ACD-A液等)的容器贮存血液时，在采血后，如果将容器放置20(min.)以上，则血液中的血小板和凝固因子逐渐地凝固，但是，尤其是在容器内的空气量少时，存在不促进血液凝固、凝固需要很长时间的问题。 

与此相对，在根据本发明实施方式的血液成分分离装置1中，因为在用于贮存血液的血液贮存部10的内部插入具有促进血液凝固功能的作为促进血液凝固体的玻璃加工体12，所以，几乎所有的血小板(例如，95％以上的血小板)及凝固因子在10(min.)以内凝固，可迅速实施调制血清的操作。由此，如果使用根据本发明实施方式的血液成分分离装置1，可迅速地调制血清。并且，在经过上述活性化促进工序S2调制好血清之后，残留在血液成分分离装置1中的红血球大部分不成为血饼，所以具有可将红血球作为输血用的成分再利用的可能性。 

另外，例如，在再生医疗领域，为了培养干细胞，需要较多安全性高的血清，如果使用上述血液成分分离装置1调制和保存血清71，则可安全且迅速地调制和保存血清。由此，如果使用根据本实施方式的血液成分分离装置1，可对患者确保高安全性，同时可高效地实施组织或功能的再生治疗。 

并且，在上述实施方式中，当以相对可贮存在血液贮存部10内的血液量具有大于等于0.1(mm²/ml)的关系的表面积设定玻璃加工体12时，则进一步促进了血液中的血小板和凝固因子的活性化。另外，当将玻璃加工体12的表面积相对于可贮存的血液量设定为大于等于0.1(mm²/ml)且小于等于25.0(mm²/ml)的范围内时，可在抑制活性化促进工序S2和离心分离工序S4中的溶血的同时促进血小板和凝固因子的活性化。 

另外，关于血液贮存部10内的玻璃加工体12的数目，在本实施例中为三个，但并不限定于此。关于玻璃加工体12的容纳数目，实际上为一个以上且五十个以下为比较妥当。 

另外，在血液成分分离装置1中，作为促进血液凝固体使用了玻璃加工体12，但促进血液凝固体并不限定于此。例如，与血液接 触的区域也可以使用由选自二氧化硅、硅藻土、高岭土等二氧化硅化合物中的至少一种无机物构成的物质。并且，分配给接触区域的物质并不限定于无机物。 

另外，在上述血液成分分离装置1中，通过在血液贮存部10中容纳具有促进血液凝固功能的促进血液凝固体(玻璃加工体12)，从而可使血液贮存部10具有促进血液凝固功能，但未必在血液贮存部10内容纳促进血液凝固体，只要是可发挥促进血液凝固功能的构成即可。例如，也可以用上述无机物等包覆血液贮存部10的本体部11的一部分内壁。 

另外，对于上述血液成分分离装置1中的玻璃加工体12，将其外观形成为类球形形状，但根据本发明的促进血液凝固体的外观形状并不限定于此。只是，在进行离心分离等时，从抑制发生溶血以及包的破裂方面等出发，优选用连续曲面形成外表面(与血液的接触区域)。 

另外，在导出工序S6中，如图9所示，通过从血液贮存部10外侧用例如夹子等夹持部16劫住附着有纤维蛋白的玻璃加工体，将玻璃加工体表面附着有血小板和凝固因子的物质分离，从而可导出红血球。并且，该夹持部16优选与血液贮存部10的接触面为波型形状或凹凸形状，以便在夹住血液贮存部10后红血球、纤维蛋白的洗净液可流通。 

另外，在上述发明的实施方式中，使用了实心的玻璃加工体12，但只要是能预先在外表面形成具有促进血液凝固功能的物质，未必需要实心。例如，预先形成多孔质结构，也可以预先用玻璃等二氧化硅化合物等涂布包括孔内的壁面在内的与血液接触的整个区域。 

<第二实施方式> 

根据本实施方式的血液成分分离装置，与根据上述第一实施方式的血液成分分离装置1相比，在容纳于血液贮存部10内的玻璃加工体的形态上具有不同点。因此，以下使用图10对玻璃加工体的形态加以说明，对其他部分省略说明。 

如图10所示，根据本实施方式的凝固体附着玻璃加工体14在具有类球形的外观形状上与上述玻璃加工体12同样，但具有以下特征，即具有由芯体部141和表层部142构成的双层结构。 

在构成凝固体附着玻璃加工体14的双层内，芯体部141由磁体构成。另一方面，表层部142作为与构成上述玻璃加工体12的材料相同的无机物，例如由钠玻璃构成。 

在使用内部容纳有具有这种结构的凝固体附着玻璃加工体14的血液贮存部10时，在上述图2的活性化促进工序S2中，对血液贮存部10进行振荡，同时使磁场发挥作用，可得到促进血液搅拌的效果。即，例如用电磁式搅拌器等搅拌机使磁场从外部对血液贮存部10发挥作用，从而使凝固体附着玻璃加工体14在容器内发生旋转运动等，更加高效地与血液接触。 

因此，利用血液贮存部10内包括凝固体附着玻璃加工体14的血液成分分离装置，可比上述血液成分分离装置1更加迅速地实现血小板和凝固因子的活性化，可更加迅速地调制血清。 

另外，在用磁体构成玻璃加工体14时，在导出工序S6中，可从血液贮存部10外侧用磁体固定。 

<第三实施方式> 

根据本实施方式的血液成分分离装置，与根据上述第一实施方式的血液成分分离装置1相比，不同点是将构成成分容纳部20的 袋体21～26中的一个用于抽出空气(参照图1)。在采血时，管41的体积的空气必然混入到血液贮存部10中，但优选在进行分离工序S5时各血液成分中没有空气。因此，如果在血液贮存部10和成分容纳部20之间设置根据本实施方式的抽出空气用袋体，则可以在分离工序S5之前在各血液成分中只除去空气。此外，本实施方式中的其他构成与第一实施方式相同，因此省略对其他部分的说明。 

<第四实施方式> 

根据本实施方式的血液成分分离装置，如图11所示，取代添加到上述第一实施方式的血液成分分离装置1的血液贮存部10中的促进血液凝固体，包括空气15。此时，因为不必预先添加促进血液凝固体，所以可削减制造成本。空气15的含有量相对于可贮存的血液量优选为0.03(cc/ml)至1(cc/ml)，并且，管41优选具有在使用之前防止为了成为上述含有量而预先封入的空气漏出的机构。 

另外，也可以同时使用空气和促进血液凝固体。 

<第五实施方式> 

根据本实施方式的血液成分分离装置，如图12所示，将玻璃加工体12(促进血液凝固体)添加到构成上述第一实施方式的血液成分分离装置1的成分容纳部的袋体21～26中的至少一个内。并且，在本实施方式中，还可以向添加有玻璃加工体12的容器中再添加含有钙离子的柠檬酸中和剂。此时，在血液贮存部10中可使用添加有CPD液等抗凝固剂的所谓的“献血用血液包”。 

血液贮存部10中的血液通过离心分离等分离至一定程度，但因为添加有抗凝固剂，所以不能直接生成血清。在本实施方式中， 利用添加到袋体21中的中和剂来中和血液贮存部10中的血液，可以使血液中的增殖因子活性化，并将生成的血清导出至袋体22。 

<第六实施方式> 

根据本实施方式的血液成分分离装置，如图13所示，取代添加到上述第五实施方式的血液成分分离装置1的袋体21中的促进血液凝固体，包括空气15。此时与第四实施方式同样，因为不必预先添加促进血液凝固体，所以可削减制造成本。空气15的含有量相对于可贮存的血液量优选为0.03(cc/ml)至1(cc/ml)，并且，管51优选具有使用之前可防止为了成为上述含有量而预先封入的空气漏出的机构。 

另外，也可以同时使用空气和促进血液凝固体。 

另外，在根据第一实施方式和第四实施方式的血液成分分离装置1中，由六个袋体21～26构成成分容纳部，但是构成成分容纳部的袋体的数目并不限定于此。此外，在根据第一实施方式和第四实施方式的血液成分分离装置1中，作为促进血液凝固体可使用玻璃加工体，但是取代玻璃加工体而包括空气也可以起到同样效果。此时，优选相对于可贮存的血液量为0.03(cc/ml)至1(cc/ml)。 

另外，本发明可有效利用在分离血液后残留在血液贮存部10中的红血球、纤维蛋白。以下，对其进行详细说明。 

<第七实施方式> 

在第一实施方式中，使用将血液分离的血液成分分离装置1。如图14所示，在分离血液、将血清导出到袋体21(成分容纳部)内后的血液贮存部10中残留有附着了纤维蛋白的凝固体附着玻璃加工体14和红血球等残渣。在与该血液贮存部10气密连接的成分 容纳部21～26中，预先向未容纳血清的任意一个注入生理盐水，或者使含有生理盐水的生理盐水含有袋体120连接于该血液贮存部10的管41，在与血液贮存部10中的红血球混合之后，可作为输血用血液使用(参照图15)。另外，附着了纤维蛋白的凝固体附着玻璃加工体14在导出全部血液成分后再洗净，将洗净后得到的纤维蛋白作为干细胞的架板或伤口的障壁来使用。 

另外，在第一和第二实施方式中，作为血液成分分离装置采用了在血液贮存部和成分容纳部之间用管等连通的构成，但未必将用于贮存血液的部分和用于保存血清的部分作为不同的容器构成。例如，预先准备利用熔断和熔敷等切离一部分这种构成的一个容器，在该容器内贮存血液，于是，也可以形成作为成分容纳部20使用的构成。此外，在导出工序S6中，可以列举，为了不导出附着有纤维蛋白的玻璃加工体12或凝固体附着玻璃加工体14而夹持血液贮存部10的夹子，但并不限定于此。 

<第八实施方式> 

在上述实施方式中说明的可机械且自动地进行血清调制以及血清分取的是本实施方式的血清调制装置。如图24所示，本血清调制装置240包括：血液导入装置242(落差压和突出泵等)，用于将采取的血液无菌地导入到促进血液凝固容器241中；血清导出装置243(吸引泵等)，用于将在上述促进血液凝固容器中调制的血清无菌地导出；血清导入装置245(落差压和突出泵等)，用于将导出的血清导出、分配到多个血清保存容器244内；振荡装置246，从开始向血清调制容器导入血液的时刻开始，使该血清调制容器振荡；分离装置247，在振荡结束后，使血清调制容器离心，并分离血清成分；控制装置248，用于控制这些各动作的时序以及动作本身。如上所述，所说的促进血液凝固容器是为了调制血清而具有血液凝固功能的容器，除了可在上述可挠性包内分配玻璃加工体外， 只要是玻璃容器等具有其他血液凝固功能的容器都可以。另外，也可以使用图30所示的具有混注通道511～516的容器。并且，为了无菌，只要是具有为防止混入细菌而隔离外界气体和液体的结构即可，其形式没有特别限定。另外，还可以利用公知的流量计监控上述血液、血清等液体的量，利用其结果执行动作控制(导入血液量的控制、分配血清量的控制等)。此外，在分配完血清后，也可以自动盖严血清保存容器的盖。 

利用上述血清调制装置240，在采取血液后，自动调制血清，调制好的血清自动分配给保存容器，所以可极其简便地进行血清的调制。 

另外，在上述血清调制装置240中，其另一用途为，在调制好血清之后，安装该调制容器，还可以起到可分配给该保存容器的分配装置的功能。 

<第九实施方式> 

图25示出了血清调制包具有用于调节空气量的过滤器251的可挠性包(相当于图1的10的容器)。 

该过滤器具有以下功能：在将血液导入包内之后，通过使过滤器向外部开放(通过打开未图示的盖部而开放)，从而调整空气量。其具有如下功能：当空气量多时，为了避免一旦搅拌不充分就会产生血饼而红血球等的血液成分不能回收，通过分配、调整空气量，将血液的凝固速度调整为适合于血液量的相对大小。 

<第十实施方式> 

图26为具有如下功能的血清调制装置的功能框图，为了血清调制量达到充分水平，适当地控制用于调制血清的促进血液凝固容器261振荡的时间带。 

其构成与图24的装置同样，但是，对振动时间进行如下控制，在从开始向血清调制容器导入血液的时刻到采血结束后的预定时间的时间带内持续振动。由此，血清高效产出。这是一种基于在比采血时间长的期间内振荡可充分进行血清产生的发明人的经验原则实现的动作控制。此外，该振荡时间也可以通过监控实际产出的血清量、根据其结果进行决定。 

<第十一实施方式> 

本实施方式是一种假设不使用血球成分而主要使用分离的血清的情况下的实施方式，并除上述玻璃加工体外还收纳血清分离剂的血清调制容器。这样，由于包括血清分离剂，通过玻璃的促进血液凝固作用而促进血清的产生的同时，产生的血清与其他成分明显且高效地分离。 

<第十二实施方式> 

图27表示血清调制装置270，该血清调制装置270与图1中的血清调制装置同样，是一种从采取的血液中促进血液凝固以调制血清的装置。该血清调制装置270与图1中不同的方面在于：将采取的血液分配给多个血清调制容器271，在该血清调制容器271中调制血清，再将调制血清移送到多个保存容器272中并保存。通过将这样采取的血液分配给多个血清调制容器271，在该血清调制容器271中调制血清，从而血清调制容器由于血液引起的膨胀变大，玻璃加工体的自由度变大，所以玻璃容易搅拌，与血液的接触性提高，血清的调制可更加有效地进行。 

<第十三实施方式> 

图28表示新的血清调制装置280。该血清调制装置280包括连接有导管281的留置针(针头)282、以及连接于导管281的端部的注射管283，在注射管283内收纳有促进血液凝固体284(玻璃等)。 

在上述血清调制装置280中，在振动注射管283的同时将从留置针282通过导管281采取的血液导入至该注射管283，从而可进行血清调制。然后，通过对注射管283进行离心，从而可分离血清。另外，当用该血清调制装置280从人体调制血清时，优选方式为，尽量在从人体离开的同时使注射管283位于采血部的下方，以使血液凝固的凝固信号不传递给人体。 

<第十四实施方式> 

图29是与图1的血清调制装置大致同样的构成，但在包与包之间的导通路上具有过滤器291这点上大不相同。该过滤器291是具有不使血球成分通过、有选择地使血清通过这种大小的孔的过滤器。因此，即便不经过离心分离工序，通过使振荡后的液体通过该过滤器，从而可简单地分离血清。 

<第十五实施方式> 

图30是与图1的血清调制装置大致同样的构成，但在其是一种各包构成为无菌且可自由连接、脱离的血清调制装置这点上不同。所谓构成为可自由连接、脱离的结构可列举以下：具有阀体的缝隙状开口部随着插入工具的插入脱离而开闭的功能的气密性高的混注通道(参照日本专利第3389983号等)。并且，此时，在构成连接的导通路的管尖端最好使用诱导物。根据这种构成，可简单地进行包的安装、拆卸。 

<第十六实施方式> 

图31具有与图1的血液贮存部10大致同样的功能，但在血清取出口附近具有为了调制血清时不让血液进入而形成隔离的临时隔断310这点上不同。在此，当在血清取出口附近进入血液而凝固时，血清难以取出。或者在保存的血清中混入凝固的血液。临时隔断310在调制血清后可去除，可从血清取出口将血清移送到保存包中。作为临时隔断310，可考虑利用夹具的封锁、利用易剥的封锁。如果需要，临时隔断310只要在调制血清时可在上述取出口及其附近与血液隔离、在取出血清时解除隔离即可，与其形态无关。 

<第十七实施方式> 

图32具有与图1的血液贮存部10大致相同的功能，但在血清取出口附近具有贴合用包320以便不让血清通过调制血清的操作进入这点上不同。在此，在血清取出口附近进入血液而凝固时难以取出血清。或者凝固的血液混入到保存的血清中。 

在贴合用包320内通入气体或液体，将附着在血清取出口及其附近的血液(也包括凝固的血液)贴合、除去。 

上述实施方式十六、十七在使用不分配下述玻璃加工体的实施方式十八的血清调制包时尤其有效。当具有玻璃加工体时，凝固成分附着在玻璃加工体上，所以可防止凝固成分附着在血清取出口附近，但是，当没有玻璃加工体时凝固成分游离，根据情况有时附着在血清取出口附近。 

<第十八实施方式> 

在本实施方式中，在图1的血液贮存部10内不具有玻璃加工体，采取的血液在其空包内放置，并调制血清。并且，调制的血清移送到保存包内，再分给多个保存包进行保存。 

<第十九实施方式> 

在本实施方式中，对防止图1所示的玻璃加工体进入管42等而妨碍血清移送进行特别叙述。 

首先，玻璃加工体和形成移送路的管的直径关系为玻璃加工体的直径大于管内径，从而可防止玻璃加工体进入到管42等内。例如，优选玻璃珠直径比管内径大1mm至5mm左右，当管内径为3mm时，玻璃珠直径优选为4mm。 

接着，如图33所示，在血清取出管口附近形成多个点熔敷部331(热熔敷而形成)，可阻碍玻璃移动。在此，点熔敷部331之间的间隔小于玻璃珠直径。并且，点数优选为大于等于玻璃珠数。因为当点数少于玻璃珠数时，如图35所示，玻璃珠完全堵塞了用于取出血清的流路，不能确保用于取出血清的流路，但当点数大于等于玻璃珠数时，如图34所示，玻璃珠不会完全堵塞用于取出血清的流路，确保用于取出血清的流路。 

此外，上述实施方式当然可分别单独实施，也可分别自由组合后实施。本发明的实施不限定于单个实施方式。并且，使用调制的血清培养从患者身上采取的细胞，将此移植到患者身上，或者将调制后的血球成分输血给患者，或者供给再生医疗。 

以下，更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。 

以下，对使用第一实施方式的血液成分分离装置调制的血清的有效性、回收的红血球的有效性、以及干细胞的增殖进行讨论的结果进行说明。另外，在实验中，使用了聚氯化乙烯制的外壳体。 

[实施例一] 

[活性化促进效果的确认] 

在表1的条件下，将由钠玻璃构成的大小加工体分别添加到血液容纳部中。向该血液容纳部加入20ml的人体新鲜血液，边搅拌边培育，在10、20、30、60、90分钟后各采取1.5ml，进行血小板数的测量。另外，搅拌时使用搅拌(振荡)装置(マルチシエ一カ一MMS-300，东京理科器械制造)，血球计数使用血球计数装置(多项自动血球计数装置K-4500シスメツクス制造)。 

<表1> 

图16表示血小板数和培育时间的关系。由此可知，每1ml血液的玻璃加工体的表面积比越大血小板越被活性化、凝集。另外，还显示出未添加玻璃加工体的试样，血液凝集大约需要90分钟，非常费时间。并且，即使在不添加玻璃加工体的情况下长时间放置，促进增殖因子从血小板的放出，但其他凝固的活性化不充分，所以在之后的过程中，血清凝固或析出大量纤维蛋白的情况比较多。由 此可知，在根据实施例的样品B～I的容器中，通过容纳玻璃加工体，可迅速地使血小板凝集，可高效率地释放调制血清所需的来源于血小板的增殖因子。 

[实施例二] 

[增殖因子释放效果的确认] 

进行增殖因子释放效果的讨论。从实施例一中使用的九种试样中选择五种，将五名对象的新鲜血液添加到各个试样中，经过20分钟后，进行增殖因子的测定。具体地，在下述表2的条件下，用与实施例一同样的方法培育后，利用市场销售的试验试剂盒(R&DSYSTEMS社制造)，使用マイクロプレ一トリ一ダ一(MultiskanBICHROMATIC Labsystem社制造)测定增殖因子(TGF-β1，PDGF-BB)量，作为与玻璃加工体的接触面积0的检测体中的量之比表示，其结果如图17和图18所示。图中横轴表示玻璃表面积，纵轴表示各增殖因子的量。根据图17，如果添加玻璃加工体，即便每1ml血液中仅仅为0.6mm²，则增殖因子的释放量大幅度地增加。但是，可以看出，当比表面积无限增大时，TGF-β1量大致呈平衡。并且，在图18中可以确认，即便只添加少量玻璃加工体，增殖因子也大幅度增加。另外，可以看出，与图17同样，当表面积比无限增大时，PDGF-BB量大致呈平衡。 

<表2> 

[实施例三] 

[玻璃加工体的溶血性的确认] 

根据实施例一、二可以确认，通过添加玻璃加工体，对血小板的活性化和增殖因子的增加有效。但是，添加玻璃加工体可能会在调制血清中引起溶血。为此而研究了玻璃加工体的添加量和溶血的关系。 

在实施例一使用的试样A、F、H、I以及大范围调制每1ml血液的玻璃表面积比的J～M的各试样中加入调制好的牛血液，边搅拌边培养。随着时间的经过将其制成样品，测定离心分离后的上清血红蛋白浓度(血红蛋白B-テストワコ一和光纯药工业株式会社制造)。培养90分钟后结果如图19所示。可以看出，随着容纳在血液贮存部内部的玻璃加工体的表面积增加，上清血红蛋白的增加率上升。这表示玻璃加工体与血液之间具有过剩的接触面积，在活性化促进工序或离心分离工序中，成为导致红血球大量破坏(溶血)的原因。但是，还可确认在达到12.5mm²之前显示出与未添加玻璃加工体的试样A同等的溶血性。 

<表3> 

试样	A	F	H	I	J	K	L	M
									数目(，，4mm)	0	1	5	10	20	35	50	75
每1ml血液的玻璃比表面积(mm2/ml)	0	2.5	12.5	25	50	87.5	125	187.5

[实施例四] 

[大白鼠干细胞的增殖确认] 

使每1(ml)血液的玻璃加工体的接触面积为0(mm²)或1.5(mm²)，将从人体采取的血液在容纳有上述玻璃加工体中的任意一种的血液贮存部中振荡20分钟。在振荡结束后，将血液离心分离(离心分离条件：2250(g)×10(min.)，4(℃))，分离上清。在56℃下将上清热处理30分钟后，用0.22(μm)的过滤器过滤，在-80℃下冻结保存。上清在培养细胞时解冻，添加到培养细胞用的培养基中。细胞是将从大白鼠大腿骨骨髓中得到的细胞预先培养七天，将得到的粘接性细胞作为骨髓来源细胞供本实施例使用。在每一个孔中播种一万个细胞，在培养基中添加以下上清，使其浓度达到10％，进行培养：添加玻璃加工体得到的上清、未添加玻璃加工体得到的上清、或者市场销售的培养细胞用的牛胎儿血清。在培养开始后，在第1、3、7日时统计细胞数。确认细胞增殖效果的结果如图20所示。 

如图20所示，可以判断出，培养来源于大白鼠骨髓细胞时添加的调制血清时的与玻璃加工体的接触有无，明显对细胞增殖性带来影响。并且，用添加玻璃加工体得到的上清，可得到比一直以来通常使用的牛胎儿血清更好的结果。 

[实施例五] 

[红血球的回收] 

对回收的红血球进行确认。使玻璃加工体接触面积相对于每1(ml)血液为12.5(mm²)，在采取20(ml)血后60分钟内，用マルチシエ一カ一MMS-300(东京理科器械株式会社制造)边搅拌边振荡。作为对象，使用利用现有的血清调制方法在试管中采血并静置同样时间的血液，调查红血球数随时间的变化。其结果如图21所示。由此，在采血之后的红血球数为100％的情况下，与玻璃加工体振荡60分钟后的红血球大约残存80％。另一方面，在用现有 的方法采取血清的情况下，因为容器内的大部分血液成为血饼，所以在采血后60分钟内仅回收到10％的红血球。 

[实施例六] 

[从多血小板血浆(PRP)回收血清] 

可以确认，从预先使用CPD液体等抗凝固剂采血的血液、或者通过成分献血调制后的多血小板血浆(PRP)都能调制含大量增殖因子的血清。调制添加了CPD的人的新鲜血液，使其最终浓度为12.2％。在760g、10分钟(22℃)的条件下离心分离该CPD添加血液，调制多血小板血浆。如表4所示，在预先添加有氯化钙和玻璃加工体的容器内以37℃开始培养得到的0.8mL多血小板血浆，适当地振荡。在添加多血小板血浆后，从多血小板血浆析出纤维蛋白，测定直至外观上流动性降低的时间。流动性降低的各检测体直接在2,250g、10分钟(4℃)的条件下进行离心分离，将得到的上清分离。然后，测定该上清中所包含的PDGF-BB量和TGF-β1量。测定的各增殖因子量相对于从同一血液中调制的血清中所包含的各增殖因子量的比(％)如图22所示。 

<表4> 

如图22所示，通过添加玻璃加工体的添加量，并通过增加其面积，可缩短多血小板血浆的凝固时间，PDGF-BB和TGF-β1的释放量也增加。 

[实施例七] 

[空气添加效果的确认] 

在表5所示的条件下分别将空气或玻璃加工体添加到血液容纳部内。在该血液容纳部中加入20(ml)人新鲜血液，用マルチシエ一カ一MMS-300(东京理科器械社制造)边搅拌边培养，20分钟后使用多项自动血球计数装置K-4500(シスメツクス社制造)对血小板数进行计数。 

<表5> 

检测体名称	1	2	3	4	5	6	7
								添加的玻璃  加工体的总  面积(mm2)	0	0	0	0	50	50	50
添加的空气  总量(cc)	0	2.5	5.0	20	2.5	5.0	20

如图23所示，在均未添加玻璃加工体、空气的检测体1中，20分钟后残留有近90％的血小板。当只添加空气时(检测体名称为2～4)，血小板的残存率与空气的添加量成比例地降低。此外，在将玻璃加工体和空气组合的情况下，血小板残存率显著降低，并且，可以确认空气的添加量和血小板残存率呈比例关系。因此，虽然效果不如玻璃加工体，但只有空气也有促进血小板的活性化和凝聚的效果，并且通过与玻璃加工体组合，可以更加促进血小板的活性化和凝聚的效果。 

根据实施例一，在血液贮存部中容纳作为血液凝固促进个体的玻璃加工体，有利于迅速凝聚血小板。即，使用容纳玻璃加工体的血液贮存部，可以迅速且高效率地生成从采取的血液中调制血清所需的来源于血清的增殖因子。因此，如果将这种玻璃加工体预先收纳在血液成分分离装置内，则可以迅速调制(生产)大量血清。 

另外，根据实施例二，在容纳有玻璃加工体的容器内，在从采取的血液调制成的血清中，在其调制过程中，对细胞增殖有用的增殖因子充分释放，其结果可以确认，通过将其血清添加到培养基中，有利于增殖来源于骨髓的细胞。由此，将玻璃加工体预先收纳在血液成分分离装置内，在调制有助于促进细胞增殖的血清方面有用。 

另外，根据实施例三，从利用离心分离工序分离的血清中的上清游离血红蛋白量这点可知，过剩的玻璃加工体容纳到血液贮存部内会导致振荡时及离心分离时红血球的破坏(溶血)，所以并不优选。 

另外，根据实施例四～七，在调制完对细胞培养起有效作用的血清之后，可将大部分红血球作为不是血饼状态的单个分离的细胞回收。这表示：在向血液循环量少的患者、或者接受有可能伴随大量出血的移植手术的患者移植干细胞时，作为输血用血液可保存自己的血液。由此，通过使用容纳有玻璃加工体的采血容器在振荡的条件下调制血清，从而还可以回收除血清以外的成分。 

以上，考虑实施例一～七可知，从促进血小板和凝固因子活性化以及回收增殖因子的观点出发，优选将血液贮存部中的玻璃加工体设定为，玻璃加工体相对于可贮存在容器内的血液量的表面积具有大于等于0.1(mm²/ml)的关系；而当考虑发生溶血的要素时，优选设定为具有小于等于25.0(mm²/ml)的关系。 

产业上的利用可能性 

如上所述，本发明的血液成分分离装置可迅速且大量地调制抑制了微生物繁殖的血清。因此，适用于调制用于再生医疗中的干细胞的培养的大量血清。 

Claims (5)

1.一种用于细胞培养的血清调制装置，包括：

血液贮存部，所述血液贮存部贮存包含来源于血液的血小板和至少包含凝固因子的液性成分的液体；

成分容纳部，所述成分容纳部包含贮存在所述血液贮存部中的所述液体；

以及管，所述管无菌地和以气密的方式连接所述血液贮存部和所述成分容纳部，其中：

向所述血液贮存部中添加用于抑制所述液体凝固的抗凝固剂；

所述成分容纳部由多个袋体构成；

向多个袋体中的一个袋体中添加与所述液体接触并促进凝固的促进血液凝固体和相对于抗凝固剂的中和剂；以及

所述促进血液凝固体无菌地生成适用于所述培养的血清。

2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体是由二氧化硅化合物形成的球体，并且对于1ml的所述液体来说具有0.1mm²至25mm²的表面积。

3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体为其中能够活性化所述液体中的所述血小板，并且能够使所述液体中的纤维蛋白附着于其表面的粒状体。

4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的血清调制装置，进一步包括贴合用包，所述贴合用包设置在所述血液贮存部与所述成分容纳部之间，并且连接于所述管，其中，所述血液贮存部由具有可挠性的挠性袋体所配置。

5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的血清调制装置，其中，所述促进血液凝固体是具有的比重大于所述液体的固体，并且所述血清和所述凝固因子通过以向下的方向使所述促进血液凝固体沉淀而分离。

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