WO2011087103A1 - 間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法 - Google Patents

間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法 Download PDF

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cord blood
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umbilical cord
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花澄 緒方
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株式会社ジェイ・エム・エス
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a growth promoting agent that promotes the proliferation of mesenchymal stem cells, a method for promoting the proliferation of mesenchymal stem cells using the same, and a method for producing the same.
  • Mesenchymal stem cells are pluripotent stem cells having the ability to differentiate into mesenchymal cells such as osteoblasts, adipocytes and chondrocytes, and are present in bone marrow fluid and adipose tissue. Because of this pluripotency, attempts have been made to reconstruct the mesenchymal stem cells into bones, blood vessels, and myocardium and use them in regenerative medicine. A number of the mesenchymal stem cells are required for the reconstruction of the tissue, but the mesenchymal stem cells obtained from a biological sample such as the bone marrow fluid are few. For this reason, development of a method for proliferating the mesenchymal stem cells is expected.
  • Patent Document 1 a method using a medium containing an antimicrobial peptide
  • Patent Document 2 a method of introducing a transcription factor gene using a viral vector
  • the present invention provides a proliferation promoter that promotes the proliferation of the mesenchymal stem cells with excellent safety when proliferating the mesenchymal stem cells by culturing, and a method for promoting proliferation and a production method using the same. Objective.
  • the growth promoter of the present invention is a growth promoter that promotes the growth of mesenchymal stem cells, and is characterized by containing a humoral cord blood liquid component.
  • the proliferation promoting method of the present invention is a method of promoting the proliferation of mesenchymal stem cells, wherein the mesenchymal stem cells are cultured in a medium containing the proliferation promoting agent of the present invention, thereby Including a step of promoting proliferation.
  • the production method of the present invention is a method for producing mesenchymal stem cells, and includes the step of promoting the proliferation of the mesenchymal stem cells by the proliferation promoting method of the present invention.
  • proliferation of mesenchymal stem cells can be promoted by using a liquid component of coagulated umbilical cord blood without using a virus vector having a safety problem. For this reason, mesenchymal stem cells can be proliferated by a very simple operation with excellent safety.
  • the proliferation of mesenchymal stem cells can be promoted, effective utilization of mesenchymal stem cells can be further promoted, for example, in the field of regenerative medicine.
  • the growth promoting agent of the present invention is a growth promoting agent that promotes the proliferation of mesenchymal stem cells, and is characterized by containing a liquid component of coagulated umbilical cord blood.
  • Umbilical cord blood is blood contained in the placenta and umbilical cord.
  • the umbilical cord blood is usually collected in a blood collection bag through a needle through the placenta and umbilical cord at the time of delivery and after delivery in a hospital, and through a tube from the needle.
  • Umbilical cord blood can be obtained from the tube and the blood collection bag.
  • uncoagulated umbilical cord blood is referred to as “untreated umbilical cord blood” or “non-coagulated umbilical cord blood”.
  • the untreated umbilical cord blood is not particularly limited as long as it contains platelets.
  • the untreated umbilical cord blood may be, for example, umbilical cord blood itself or an umbilical cord blood component containing platelets.
  • the cord blood component containing platelets is preferably, for example, plasma containing platelets. Examples of the plasma containing platelets include so-called platelet-rich plasma (Platelet-Rich-Plasma).
  • Plasma generally refers to the liquid fraction of blood minus blood cells (red blood cells, white blood cells and platelets), and “serum” generally refers to blood cells (red blood cells, white blood cells and platelets) and several types of blood. It means a liquid fraction excluding blood coagulation factor, and the blood coagulation factor is, for example, fibrinogen (factor I), prothrombin (factor II) or the like.
  • the blood coagulation factor is, for example, fibrinogen (factor I), prothrombin (factor II) or the like.
  • plasma when plasma is used as the untreated umbilical cord blood, it may be plasma containing platelets.
  • the untreated umbilical cord blood or the non-coagulated umbilical cord blood subjected to a coagulation treatment is referred to as “coagulated umbilical cord blood”.
  • the coagulated umbilical cord blood may be, for example, umbilical cord blood itself subjected to clotting treatment, or umbilical cord blood component containing platelets subjected to clotting treatment.
  • the method for the coagulation treatment is not limited at all, and conventionally known methods can be mentioned.
  • “coagulation” may mean platelet aggregation, for example, and “coagulation treatment” may be platelet coagulation treatment.
  • the coagulated umbilical cord blood can be obtained as follows.
  • non-coagulated cord blood containing an anticoagulant examples thereof include non-coagulated cord blood containing an anticoagulant and non-coagulated cord blood containing no anticoagulant.
  • noncoagulated cord blood containing the anticoagulant when collecting cord blood from the body, for example, by using a blood collection bag containing an anticoagulant, noncoagulated cord blood containing the anticoagulant can be obtained.
  • the coagulation treatment for non-coagulated umbilical cord blood containing the anticoagulant is not particularly limited.
  • the coagulation treatment is preferably performed, for example, in the presence of a neutralizing agent for the anticoagulant.
  • the anticoagulant include citric acid and heparin.
  • the neutralizing agent is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the anticoagulant, and examples thereof include calcium and protamine.
  • the neutralizer is preferably a calcium liquid such as calcium chloride, and when the anticoagulant is heparin, the neutralizer is preferably protamine or the like.
  • the coagulation process may be a physical process or a chemical process, for example.
  • the physical treatment include a method of bringing the non-coagulated umbilical cord blood into contact with a foreign substance in the presence of the neutralizing agent.
  • the foreign material include blood coagulants such as beads described later, containers such as bags and centrifuge tubes, and the like.
  • the chemical treatment include a method of adding a blood coagulant that promotes a blood coagulation reaction in the presence of the neutralizing agent.
  • the blood coagulant include substances that promote platelet aggregation. Specific examples include ADP (adenosine diphosphate), collagen, thrombin, vitamin K, and the like.
  • the coagulation treatment includes, for example, physical treatment, and specifically, a method of bringing the non-coagulated umbilical cord blood into contact with the foreign substance.
  • the cord blood from the body comes into contact with the blood collection tube and the blood collection bag. Blood coagulation reaction occurs.
  • the umbilical cord blood in the blood collection tube and the blood collection bag can be used as the coagulated umbilical cord blood as it is.
  • the liquid component of the coagulated umbilical cord blood may be included in the coagulated umbilical cord blood, or may be recovered from the coagulated umbilical cord blood, for example.
  • a liquid component of the coagulated cord blood can be obtained by collecting a liquid fraction from the coagulated cord blood.
  • the liquid component may be, for example, serum or plasma.
  • the method for recovering the liquid component from the coagulated umbilical cord blood is not particularly limited, and a known method can be adopted. Specific examples include centrifugation, precipitation, membrane separation, filtration, adsorption, and the like. Examples of the membrane separation treatment include a method of removing blood cell components and the like with various filters and collecting the liquid component. Of these, centrifugation is preferred.
  • the conditions for the centrifugation treatment are not particularly limited, and examples include conditions of 22834 m / s 2 , 4 ° C. and 10 minutes.
  • the coagulated umbilical cord blood is obtained as follows. be able to.
  • the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood can be recovered from the umbilical cord blood, for example, by the same method as described above.
  • the umbilical cord blood includes, for example, umbilical cord blood containing an anticoagulant, from which the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood can be recovered.
  • the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood only needs to contain platelets, and examples thereof include plasma containing platelets. Among them, platelet-rich plasma is preferable.
  • the coagulation treatment of the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood is not particularly limited, and can be performed in the same manner as the coagulation treatment of the non-coagulated umbilical cord blood itself containing the anticoagulant described above.
  • the coagulation process may be a physical process or a chemical process, for example.
  • the physical treatment include a method in which the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood is brought into contact with the aforementioned foreign substance in the presence of the neutralizing agent.
  • Examples of the chemical treatment include a method of adding the above-described blood coagulant in the presence of the neutralizing agent.
  • the coagulated liquid component of non-coagulated umbilical cord blood can be used as the growth promoter of the present invention.
  • the liquid component of the non-coagulated umbilical cord blood is plasma, for example, after the coagulation treatment, the coagulation fraction is further removed, and serum is collected as the liquid component, which is used as the growth promoter of the present invention. May be used.
  • removing the coagulated fraction for example, it is preferable to remove the coagulated fraction after heat-treating the liquid component of the coagulated non-coagulated cord blood.
  • the origin of the cord blood is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human mammals such as rodents, livestock, and primates excluding humans.
  • an erythrocyte sedimentation agent for separating erythrocytes is added to the non-coagulated umbilical cord blood.
  • the erythrocyte sedimenting agent include HES (Hydroxy Ethyl Starch).
  • the amount of the erythrocyte sedimenting agent added to the non-coagulated umbilical cord blood is not particularly limited, and is preferably, for example, 1 to 50 mg / mL.
  • the separation conditions are not particularly limited, and are, for example, a temperature of 15 to 25 ° C.
  • the erythrocyte sedimentation agent may not be added (hereinafter the same).
  • the supernatant fraction is separated into a sedimented fraction containing hematopoietic stem cells and a liquid fraction containing platelets.
  • the liquid fraction is, for example, a fraction containing platelet-containing liquid components.
  • the liquid fraction is, for example, a fraction containing plasma (plasma fraction), more preferably platelet-rich plasma.
  • the separation conditions for the liquid fraction containing platelets are not particularly limited, and can be performed, for example, according to a conventionally known method for collecting platelet-rich plasma. Examples of the recovery method include centrifugation, and the conditions of the centrifugation are not particularly limited.
  • the centrifugal acceleration is 2940 to 11760 m / s 2 (300 to 1200 ⁇ g)
  • the temperature is 1 to 20 ° C.
  • the time 3-6 minutes are examples of the centrifugal acceleration.
  • the blood coagulant is brought into contact with the liquid fraction containing the platelets.
  • the blood coagulant for example, promotes blood coagulation, and specifically activates activated factors such as platelets and blood coagulation factors.
  • the blood coagulant is not particularly limited, and for example, those described in Japanese Patent No. 3788479 can be used.
  • the blood coagulant is insoluble in the cord blood and is preferably solid.
  • the form of the blood coagulant is preferably, for example, granular, granular, or massive.
  • the shape of the blood coagulant is preferably a spherical shape such as a substantially spherical shape or a regular spherical shape.
  • the size of the blood coagulant is not particularly limited, and when the shape is spherical, for example, the diameter is preferably 1 to 10 mm, more preferably 3 to 5 mm.
  • the blood coagulant may have a porous structure, for example.
  • the blood coagulant having the porous structure can be designed with a large surface area per unit volume, and can efficiently activate platelets and the like.
  • the material of the blood coagulant is not particularly limited, and for example, the surface is preferably formed from a layer containing silicon dioxide.
  • the silicon dioxide include glass, silica, diatomaceous earth, and kaolin.
  • the blood coagulant is preferably glass beads.
  • the core of the blood coagulant may contain, for example, a magnetic substance.
  • stirring of the liquid fraction and recovery of the blood coagulant can be performed easily and quickly.
  • This contact treatment can be performed, for example, by injecting the liquid fraction into a tube or bag such as a centrifuge tube containing the blood coagulant.
  • Ratio of the coagulant to said liquid fraction is not particularly limited, for example, the surface area of the coagulant is, with respect to the liquid fraction 1 mL, in the range of 0.1 mm 2 ⁇ 25 mm 2 preferable.
  • the conditions for the contact treatment are not particularly limited, and for example, the temperature is preferably 4 to 37 ° C., more preferably 15 to 25 ° C., and the time is preferably 10 to 90 minutes, more preferably 20 to 30 minutes. Minutes.
  • the contact treatment is preferably performed under shaking conditions, for example.
  • the liquid component of the coagulated cord blood can be obtained by adding the blood coagulant to the liquid fraction.
  • the liquid component of the coagulated umbilical cord blood may be used as it is as the growth promoter of the present invention, or for example, diluted and concentrated can be used as the growth promoter of the present invention.
  • the blood coagulation factor may be further removed from the liquid fraction and used as a liquid component of the coagulated cord blood. It can.
  • the liquid fraction containing the blood coagulant is, for example, a plasma fraction containing the blood coagulation factor
  • the blood coagulation factor is removed, and serum is collected, which is used as the coagulation umbilical cord. It is preferably used as a liquid component of blood.
  • the removal of the blood coagulation factor is preferably performed after the contact treatment with the blood coagulant, for example.
  • the method for removing the blood coagulation factor is not particularly limited, and examples thereof include a method in which a blood coagulation factor such as fibrinogen is denatured and removed as an insoluble fraction. Specifically, for example, there is a method of forming fibrin by denaturation of fibrinogen and removing it as an insoluble fraction.
  • the denaturing method is not particularly limited, and examples thereof include heat denaturation. Specifically, for example, a method of subjecting the liquid fraction containing the blood coagulant to a heat treatment can be exemplified.
  • the conditions for the heat treatment are not particularly limited, and for example, the temperature is preferably 50 to 60 ° C., the time is preferably 10 to 120 minutes, and more preferably 30 to 60 minutes.
  • the insoluble fraction can be removed by, for example, standing, centrifuging or filtering the liquid fraction containing the blood coagulant after the heat treatment.
  • solidification cord blood is obtained by collect
  • Conditions such as the standing, centrifugation or filter filtration are not limited at all, and conventionally known conditions can be adopted.
  • the method for removing the blood coagulation factor from the liquid fraction containing the blood coagulant for example, addition of a coagulation factor such as calcium chloride, thrombin to the liquid fraction containing the blood coagulant, etc.
  • a coagulation factor such as calcium chloride, thrombin
  • a method using the activation mechanism of the blood coagulation system is exemplified.
  • the specific conditions of the said method are not restrict
  • the liquid component of the coagulated umbilical cord blood prepared as described above may be used, for example, as it is as the growth promoter of the present invention, for example, the diluted and concentrated product of the growth promoter of the present invention. It can also be used as
  • the blood coagulant is brought into contact with the non-coagulated umbilical cord blood.
  • the blood coagulant is, for example, as described above, and can be used in the same manner.
  • coagulated umbilical cord blood can be obtained by adding the blood coagulant to the non-coagulated umbilical cord blood.
  • the coagulated umbilical cord blood is separated into a sedimented fraction and a liquid fraction.
  • This liquid fraction can be used as a liquid component of the coagulated umbilical cord blood of the present invention.
  • the separation method is not particularly limited, and for example, a centrifugal separation process is preferable as in the first embodiment. Moreover, you may perform modification
  • the production method of the present invention includes a step of recovering a liquid component of coagulated umbilical cord blood.
  • the coagulated umbilical cord blood and the liquid component are as described above.
  • the present invention may further include a step of coagulating the untreated umbilical cord blood.
  • the untreated umbilical cord blood can be coagulated by contacting with a blood coagulant.
  • the method for promoting proliferation of the present invention is a method for promoting the proliferation of mesenchymal stem cells, wherein the mesenchymal stem cells are cultured in a medium containing the growth promoting agent of the present invention. It includes a step of promoting the proliferation of leaf stem cells.
  • the type of mesenchymal stem cells for the purpose of promoting proliferation is not particularly limited.
  • bone marrow mesenchymal stem cells For example, bone marrow mesenchymal stem cells, umbilical cord blood mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp mesenchymal stem cells Etc.
  • the method for collecting the mesenchymal stem cells is not particularly limited, and can be performed based on a conventionally known method.
  • the origin of the mesenchymal stem cells is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human mammals such as rodents, livestock, and primates excluding humans. Moreover, it is preferable that the liquid component of the coagulated umbilical cord blood in the growth promoter of the present invention and the mesenchymal stem cell to be proliferated are derived from the same individual.
  • the step of promoting the proliferation of the mesenchymal stem cells can be performed by seeding the mesenchymal stem cells in a medium containing the proliferation promoter of the present invention as described above.
  • the specific example is shown below, this invention is not restrict
  • the medium only needs to contain the growth promoter of the present invention, and other configurations and conditions are not limited at all.
  • the medium include media that can be used for culturing the mesenchymal stem cells. Specifically, for example, ⁇ -Minimal essential medium medium ( ⁇ MEM medium), Dulbecco's modified easy medium medium (DMEM medium). ) Etc. can be used.
  • the concentration of the growth promoter of the present invention in the medium is not particularly limited.
  • the concentration of the liquid component of the coagulated umbilical cord blood is 0.01 to 20 v / v%, preferably 1 to 15 v / v. v%, more preferably 5 to 10 v / v%.
  • the number of mesenchymal stem cells per 1 mL of the medium is, for example, 1000 to 100,000.
  • the medium may further contain an additive. Examples of the additive include cytokines, antibiotics, salts, vitamins and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited, and the temperature is, for example, 37 ° C., and the time is, for example, 2 to 10 days.
  • the medium is preferably replaced with a new medium every 1 to 5 days, for example.
  • the method for replacing the medium is not limited at all, and examples thereof include a method for exchanging the medium every predetermined time and a method for supplying a new medium continuously or intermittently. In the latter case, for example, it is preferable to discard a part of the old medium continuously or intermittently in accordance with the supply of the new medium.
  • the production method of the present invention is a method for producing mesenchymal stem cells, the step of promoting the proliferation of the mesenchymal stem cells by the method for promoting the proliferation of mesenchymal stem cells of the present invention. It is characterized by including.
  • the production method of the present invention is characterized in that the proliferation promotion method of the present invention is used for promoting the proliferation of the mesenchymal stem cells, and other conditions and configurations are not limited at all. Unless otherwise indicated, the production method of the present invention can be carried out in the same manner as the growth promotion method of the present invention.
  • Example 1 glass beads were used as the blood coagulant, and serum of the coagulated umbilical cord blood was prepared to confirm the influence on the proliferation of the mesenchymal stem cells.
  • a control medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) at 10 v / v% instead of the coagulated umbilical cord blood serum was prepared, and the human mesenchymal stem cells were cultured in the same manner.
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 1 shows the amplification factor results of Example 1 and Comparative Example 1.
  • “+” indicates that the glass beads were treated.
  • Example 1 using serum obtained from umbilical cord blood plasma treated with glass beads is more than Comparative Example 1 using serum obtained from peripheral blood plasma treated with glass beads.
  • Excellent mesenchymal stem cell amplification was observed.
  • a significant difference was observed. From this result, it was found that mesenchymal stem cells can be expanded by using serum obtained from umbilical cord blood plasma treated with a blood coagulant. The same results as in Example 1 were obtained for serum obtained by platelet coagulation treatment of platelet-rich plasma.
  • the antibody array kit is manufactured by Ray Human (registered trademark) Cytokine Antibody Array 6 (trade name, Ray Biotech) of Human Cytokine Antibody Array C series 2000 (Cat # AAH-CYT-2000, Ray Biotech). Human (registered trademark) Cytokine Antibody Array 7 (trade name, Ray Biotech), Ray Human (registered trademark) Cytokine Antibody Array 8 (trade name, Ray Biotech) were used.
  • Table 2 shows 20 types of cytokines in the coagulated umbilical cord blood serum that showed a cytokine ratio (C / D) more than twice that of the peripheral blood serum.
  • Table 3 shows 19 types of cytokines that were expressed in the serum of the coagulated umbilical cord blood and not expressed in the serum of the peripheral blood.
  • Example 3 serum of the coagulated cord blood was prepared from non-coagulated cord blood containing no anticoagulant without using the blood coagulant, and the effect on the proliferation of the mesenchymal stem cells was confirmed. .
  • the human umbilical cord blood was centrifuged, heat-treated and filtered in the same manner as in Example 1 (1) to obtain the serum (2 lots).
  • This coagulated umbilical cord blood serum was used as the serum of the examples.
  • the amount of fibrinogen in the serum was measured with a fully automatic blood coagulation analyzer (CA-530, manufactured by Sysmex Corporation), and as a result, was less than the measurement limit value.
  • CA-530 fully automatic blood coagulation analyzer
  • the measured value ( ⁇ 10 4 / ⁇ L) of each lot was 1.9 and 1. It was 5.
  • serum of coagulated peripheral blood was prepared as the serum of Comparative Example 2 by the following method.
  • 6 mL of human peripheral blood was collected in a centrifuge tube (15 mL) containing no anticoagulant.
  • the centrifuge tube was allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for 6 hours, and then centrifuged, heat-treated and filtered in the same manner as in Example 1 (1) to obtain the serum (2 lots).
  • the amount of fibrinogen in the serum was less than the measurement limit value.
  • the platelet count of the said serum was measured with the said multiitem automatic blood cell analyzer, the measured value (x10 ⁇ 4 > / microliter) of each lot was 1.3 and 0.9, respectively. From the above results, it was confirmed that the umbilical cord blood and the peripheral blood coagulated to the same extent.
  • Example 3 was 12.28883 ⁇ 10 4 cells, and the average cell number in Comparative Example 2 was 9.581833 ⁇ 10 4 cells.
  • the average cell number of Example 3 was about 1.3 times the average cell number of Comparative Example 2. From this result, it was found that, according to the serum of coagulated umbilical cord blood, for example, human mesenchymal stem cells can be efficiently proliferated compared with the serum of coagulated peripheral blood. Moreover, it was found that mesenchymal stem cells can be proliferated with the blood serum not only by clotting umbilical cord blood but also umbilical cord blood coagulated by the blood's original clotting system. From this, it became clear that mesenchymal stem cells can be proliferated with the serum of coagulated umbilical cord blood without being influenced by the mechanism of blood coagulation.
  • the proliferation of mesenchymal stem cells is achieved. Can be promoted. For this reason, mesenchymal stem cells can be proliferated by a very simple operation with excellent safety.
  • the proliferation of mesenchymal stem cells can be promoted, effective utilization of mesenchymal stem cells can be further promoted, for example, in the field of regenerative medicine.

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Abstract

　間葉系幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた増殖促進方法および製造方法を提供する。　本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。このように、本発明によれば、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。

Description

間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法
　本発明は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法に関する。
　間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞等の間葉系細胞への分化能を持つ多能性幹細胞であり、骨髄液および脂肪組織等に存在する。この多能性から、前記間葉系幹細胞を、骨、血管、心筋に再構築し、再生医療に利用することが試みられている。組織の再構築には、多数の前記間葉系幹細胞を要するが、前記骨髄液等の生体試料から得られる前記間葉系幹細胞はわずかである。このため、前記間葉系幹細胞の増殖方法の開発が期待されている。前記増殖方法として、例えば、抗菌ペプチドを含む培地を用いる方法（特許文献１）、ウイルスベクターを用いて転写因子遺伝子を導入する方法（特許文献２）等が報告されている。しかしながら、これらの方法は、細胞の増殖効率および安全性が十分ではない。
特開２００７－３７４２６号公報 特開２００９－１１２５４号公報
　そこで、本発明は、間葉系幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤、それを用いた増殖促進方法および製造方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の増殖促進剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
　本発明の増殖促進方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、前記本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の製造方法は、間葉系幹細胞の製造方法であって、前記本発明の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
　本発明によれば、前述のように、例えば、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。
＜増殖促進剤＞
　本発明の増殖促進剤は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする。
　臍帯血は、胎盤および臍帯に含まれる血液である。前記臍帯血は、通常、病院において、娩出時および娩出後に、胎盤および臍帯に針を刺し、前記針からチューブを介して、採血バックに採取される。前記チューブおよび前記採血バックから、臍帯血を得られる。
　本発明において、凝固していない臍帯血を「未処理臍帯血」または「非凝固臍帯血」という。前記未処理臍帯血は、特に制限されず、血小板を含んでいればよい。前記未処理臍帯血は、例えば、臍帯血そのものでもよいし、血小板を含む臍帯血液性成分でもよい。前記血小板を含む臍帯血液性成分は、例えば、前記血小板を含む血漿が好ましい。前記血小板を含む血漿は、例えば、いわゆる多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ－Ｐｌａｓｍａ）等があげられる。「血漿」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）を除いた液体画分を意味し、「血清」は、一般に、血液から、血球（赤血球、白血球および血小板）と数種の血液凝固因子とを除いた液体画分を意味し、前記血液凝固因子は、例えば、フィブリノゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）等である。本発明において、前記未処理臍帯血として血漿を使用する場合、血小板を含む血漿であればよい。
　本発明において、前記未処理臍帯血または前記非凝固臍帯血に凝固処理を施したものを「凝固臍帯血」という。前記凝固臍帯血は、例えば、臍帯血そのものに凝固処理を施したものでもよいし、前記血小板を含む臍帯血液性成分に凝固処理を施したものでもよい。前記凝固処理の方法は、何ら制限されず、従来公知の方法があげられる。本発明において、「凝固」は、例えば、血小板の凝集の意味でもよく、「凝固処理」は、血小板の凝固処理でもよい。
　臍帯血そのものを凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
　前記未処理臍帯血が、凝固していない臍帯血そのものである場合は、例えば、抗凝固剤を含む非凝固臍帯血と、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血とがあげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、抗凝固剤を含む採血バックを使用することで、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血が得られる。前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に対する凝固処理は、特に制限されない。前記凝固処理は、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記抗凝固剤は、例えば、クエン酸、へパリン等があげられる。前記中和剤は、特に制限されず、前記抗凝固剤の種類に応じて適宜設定でき、例えば、カルシウム、プロタミン等があげられる。前記抗凝固剤がクエン酸の場合、前記中和剤は、例えば、塩化カルシウム液等のカルシウム液が好ましく、前記抗凝固剤がヘパリンの場合、前記中和剤は、例えば、プロタミン等が好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血を異物と接触させる方法があげられる。前記異物は、例えば、ビーズ等の後述する血液凝固剤、バック、遠沈管等の容器等があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、例えば、血液凝固反応を促進する血液凝固剤を添加する方法があげられる。前記血液凝固剤は、例えば、血小板凝集を促進する物質があげられ、具体例としては、例えば、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、コラーゲン、トロンビン、ビタミンＫ等があげられる。
　他方、前記抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血の場合、凝固処理は、例えば、物理的な処理があげられ、具体的には、前記非凝固臍帯血を前記異物と接触させる方法があげられる。前述のように、体内から臍帯血を採取する際、例えば、前記抗凝固剤を含まない採血チューブおよび採血バックを使用することで、体内からの臍帯血が、前記採血チューブおよび採血バックと接触し、血液凝固反応が起こる。このため、前記採血チューブおよび前記採血バック内の臍帯血を、そのまま凝固臍帯血として使用できる。
　このように臍帯血そのものを凝固処理した場合、前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前記凝固臍帯血に含まれた状態でもよいし、前記凝固臍帯血から回収された状態でもよい。後者の場合、例えば、前記凝固臍帯血から液体画分を回収することにより、前記凝固臍帯血の液性成分を得ることができる。前記液性成分は、例えば、血清でもよいし、血漿でもよい。
　前記凝固臍帯血からの液性成分の回収方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、遠心分離処理、沈殿処理、膜分離処理、ろ過処理、吸着処理等があげられる。前記膜分離処理は、例えば、各種フィルターにより、血球成分等を除去し、前記液性成分を回収する方法があげられる。中でも、遠心分離処理が好ましい。前記遠心分離処理の条件は、特に制限されず、例えば、２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間の条件が例示できる。また、前記液性成分として、前記凝固臍帯血から血清を得る場合、例えば、前記凝固臍帯血に加熱処理を施した後、前記回収処理を行うことが好ましい。
　つぎに、凝固していない血小板を含む臍帯血液性成分（以下、「非凝固臍帯血の液性成分」ともいう）を凝固処理する場合、例えば、以下のようにして、前記凝固臍帯血を得ることができる。
　前記非凝固臍帯血の液性成分は、例えば、前述と同様の方法によって、臍帯血から回収できる。前記臍帯血は、例えば、抗凝固剤を含む臍帯血があげられ、これから前記非凝固臍帯血の液性成分を回収できる。前記非凝固臍帯血の液性成分は、血小板を含んでいればよく、例えば、血小板を含む血漿があげられ、中でも、好ましくは多血小板血漿である。前記非凝固臍帯血の液性成分の凝固処理は、特に制限されず、前述した前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血そのものの凝固処理と同様に行うことができる。具体的には、例えば、前記抗凝固剤に対する中和剤の存在下で行うことが好ましい。前記凝固処理は、例えば、物理的な処理でもよいし、化学的な処理でもよい。前記物理的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前記非凝固臍帯血の液性成分を、前述した異物と接触させる方法があげられる。前記化学的な処理は、例えば、前記中和剤の存在下、前述した血液凝固剤を添加する方法があげられる。
　前記血小板を含む非凝固臍帯血の液性成分を凝固処理した場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分を、本発明の増殖促進剤として使用できる。前記非凝固臍帯血の液性成分が血漿の場合、例えば、前記凝固処理の後、さらに、凝固画分を除去し、液性成分として血清を回収し、これを、本発明の増殖促進剤として使用してもよい。前記凝固画分を除去する場合、例えば、前記凝固処理した前記非凝固臍帯血の液性成分に加熱処理を施した後、前記凝固画分の除去を行うことが好ましい。
　前記臍帯血の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。
（第１の形態）
　一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血から多血小板血漿を回収し、前記多血小板血漿に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
　まず、前記非凝固臍帯血に、赤血球を分離するための赤血球沈降剤を添加する。前記赤血球沈降剤は、例えば、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ　Ｅｔｈｙｌ　Ｓｔａｒｃｈ）等があげられる。前記赤血球沈降剤の前記非凝固臍帯血への添加量は、特に制限されず、例えば、１～５０ｍｇ／ｍＬが好ましい。前記赤血球沈降剤を添加した前記非凝固臍帯血の静置によって、前記非凝固臍帯血は、赤血球を含む画分と、造血幹細胞を含む上清画分とに分離される。前記分離の条件は、特に制限されず、例えば、温度１５～２５℃である。前記非凝固臍帯血が、例えば、予め前記赤血球沈降剤を含む場合、前記赤血球沈降剤を添加しなくてもよい（以下、同様）。
　つぎに、前記上清画分を、造血幹細胞を含む沈降画分と、血小板を含む液体画分とに分離する。前記液体画分は、例えば、血小板含有の液性成分を含む画分である。前記液体画分は、例えば、血漿を含む画分（血漿画分）であり、より好ましくは、多血小板血漿である。前記血小板を含む液体画分の分離条件は、特に制限されず、例えば、従来公知の多血小板血漿の回収方法に従って行える。前記回収方法は、例えば、遠心分離があげられ、前記遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、遠心加速度２９４０～１１７６０ｍ／ｓ２（３００～１２００×ｇ）、温度１～２０℃、時間３～６分である。
　つぎに、前記血小板を含む液体画分に、前記血液凝固剤を接触させる。
　前記血液凝固剤は、例えば、血液の凝固を促進するものであり、具体的には、例えば、血小板および血液凝固因子等の被活性化因子を活性化する。前記血液凝固剤は、特に制限されず、例えば、特許第３７８８４７９号等に記載されているものが使用できる。前記血液凝固剤は、例えば、前記臍帯血に不溶であり、固体であることが好ましい。前記血液凝固剤の形態は、例えば、粒状、顆粒状、塊状が好ましい。前記血液凝固剤の形状は、略球状、正球状等の球状が好ましい。前記血液凝固剤の大きさは、特に制限されず、前記形状が球状の場合、例えば、直径は、１～１０ｍｍが好ましく、より好ましくは３～５ｍｍである。前記血液凝固剤は、例えば、多孔質構造でもよい。前記多孔質構造の前記血液凝固剤は、単位体積あたりの表面積を大きく設計でき、効率良く血小板等の活性化を行える。
　前記血液凝固剤の材質は、特に制限されず、例えば、その表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されていることが好ましい。前記二酸化ケイ素は、例えば、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等があげられる。前記血液凝固剤は、好ましくは、ガラスビーズである。さらに、前記血液凝固剤は、その芯体が、例えば、磁性物質を含んでもよい。このように前記血液凝固剤が磁性物質を含む場合、例えば、磁界を作用させることにより、前記液体画分の攪拌および前記血液凝固剤の回収を、容易かつ迅速に行える。
　この接触処理は、例えば、前記血液凝固剤を入れた遠心管等のチューブまたはバックに、前記液体画分を注入することで行える。
　前記液体画分に対する前記血液凝固剤の割合は、特に制限されず、例えば、前記血液凝固剤の表面積が、前記液体画分１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２～２５ｍｍ２の範囲であることが好ましい。
　前記接触処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、４～３７℃が好ましく、より好ましくは１５～２５℃であり、時間は、１０～９０分が好ましく、より好ましくは２０～３０分である。前記接触処理は、例えば、振とう条件下で行うことが好ましい。
　このように、前記液体画分に前記血液凝固剤を添加することによって、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記凝固臍帯血の液性成分は、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
　前記血液凝固剤を含む液体画分がフィブリノゲン等の血液凝固因子を含む場合、例えば、さらに、前記液体画分から前記血液凝固因子を除去して、前記凝固臍帯血の液性成分として使用することもできる。具体的には、前記血液凝固剤を含む液体画分が、例えば、前記血液凝固因子を含む血漿画分である場合、前記血液凝固因子を除去して、血清を回収し、これを前記凝固臍帯血の液性成分として使用することが好ましい。
　前記血液凝固因子の除去は、例えば、前記血液凝固剤による接触処理の後に行うことが好ましい。前記血液凝固因子の除去方法は、特に制限されず、例えば、フィブリノゲン等の血液凝固因子を変性させ、不溶性画分として除去する方法があげられる。具体的には、例えば、フィブリノゲンの変性によりフィブリンを形成させて、不溶性画分として除去する方法があげられる。前記変性方法は、特に制限されず、例えば、熱変性があげられ、具体的には、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に加熱処理を施す方法があげられる。前記加熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、温度は、５０～６０℃が好ましく、時間は、１０～１２０分が好ましく、より好ましくは３０～６０分である。前記不溶性画分の除去は、例えば、前記加熱処理後の前記血液凝固剤を含む液体画分を、静置、遠心またはフィルターろ過等することによって行える。そして、例えば、静置後の上清画分、遠心後の上清画分、または、フィルターろ過後のろ液を回収することで、前記凝固臍帯血の液性成分が得られる。前記静置、遠心またはフィルターろ過等の条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。また、前記血液凝固剤を含む液体画分からの前記血液凝固因子の除去方法は、この他に、例えば、前記血液凝固剤を含む液体画分に対する、塩化カルシウム、トロンビン等の凝固因子の添加等、血液凝固系の活性化機構を利用した方法があげられる。前記方法の具体的な条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。
　以上のようにして調製した前記凝固臍帯血の液性成分は、例えば、そのまま、本発明の増殖促進剤として使用してもよいし、例えば、希釈、濃縮したものを、本発明の増殖促進剤として使用することもできる。
（第２の形態）
　一例として、前記抗凝固剤を含む非凝固臍帯血に凝固処理を施し、前記凝固臍帯血の液性成分を回収する方法を説明する。本発明は、これには制限されない。
　まず、前記非凝固臍帯血に、前記血液凝固剤を接触させる。前記血液凝固剤は、例えば、前述の通りであり、同様にして使用できる。このように、前記非凝固臍帯血に前記血液凝固剤を添加することによって、凝固臍帯血を得ることができる。
　つぎに、前記凝固臍帯血を、沈降画分と液体画分とに分離する。この液体画分を、本発明の凝固臍帯血の液性成分として使用することができる。前記分離方法は、特に制限されず、例えば、前記第１の形態と同様に、遠心分離処理が好ましい。また、分離の前に、前述と同様に、加熱処理等の変性処理を施してもよい。
＜増殖促進剤の製造方法＞
　本発明の製造方法は、凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明において、前記凝固臍帯血および前記液性成分等は、前述の通りである。
　本発明は、さらに、前記未処理臍帯血を凝固させる工程を含んでもよく、例えば、前記未処理臍帯血を血液凝固剤と接触させることで凝固させることができる。
＜増殖促進方法＞
　本発明の増殖促進方法は、前述のように、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、本発明の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
　本発明において、増殖促進目的とする間葉系幹細胞の種類は、特に制限されず、例えば、骨髄間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞等があげられる。前記間葉系幹細胞の採取方法は、特に制限されず、従来公知の方法に基づいて行える。
　前記間葉系幹細胞の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、および、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等があげられる。また、本発明の増殖促進剤における前記凝固臍帯血の液性成分と、増殖対象となる前記間葉系幹細胞とは、同一の個体由来であることが好ましい。
　本発明において、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程は、前述のように、前記本発明の増殖促進剤を含む培地に前記間葉系幹細胞を播種することで行える。以下に、その具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。
　前記培地は、前記本発明の増殖促進剤を含有すればよく、その他の構成や条件は、何ら制限されない。前記培地は、例えば、前記間葉系幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体的には、例えば、α－Ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ培地（αＭＥＭ培地）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ培地（ＤＭＥＭ培地）等が使用できる。前記培地における前記本発明の増殖促進剤の濃度は、特に制限されず、例えば、前記凝固臍帯血の液性成分の濃度が、０．０１～２０ｖ／ｖ％であり、好ましくは１～１５ｖ／ｖ％であり、より好ましくは５～１０ｖ／ｖ％である。前記培地１ｍＬあたりの前記間葉系幹細胞数は、例えば、１０００～１０万個である。前記培地は、さらに、添加物を含んでもよく、前記添加物は、例えば、サイトカイン、抗生物質、塩類、ビタミン等があげられる。
　前記培養条件は、特に制限されず、温度は、例えば、３７℃であり、時間は、例えば、２～１０日である。また、前記培地は、例えば、１～５日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましい。前記培地の取換え方法は、何ら制限されず、例えば、所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的または断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば、前記新たな培地の供給にあわせて、古い培地の一部を連続的または断続的に廃棄することが好ましい。
＜間葉系幹細胞の製造方法＞
　つぎに、本発明の製造方法は、前述のように、間葉系幹細胞の製造方法であって、本発明の間葉系幹細胞の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞の増殖促進に、本発明の増殖促進方法を使用することが特徴であり、その他の条件および構成は何ら制限されない。本発明の製造方法は、特に示さない限り、本発明の増殖促進方法と同様に行える。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
［実施例１］
　本例では、前記血液凝固剤としてガラスビーズを使用し、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
（１）血清の調製
　ガラスビーズ（粒径４ｍｍ、ブライト標識工業社製）２個を含む５×１０ｃｍの大きさのＰＶＣ製バッグに、抗凝固剤を含むヒト臍帯血２０ｍＬを入れた（ｎ＝８）。前記バッグを、２０℃で３０分間インキュベートして凝固処理を行った後、遠心分離（２２８３４ｍ／ｓ２、４℃、１０分間）して、上清を採取した。この上清を、５６℃で３０分間加熱処理した後、孔径０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いてろ過し、前記血清を得た。これを前記凝固臍帯血の血清として使用した。
（２）間葉系幹細胞の培養
　α－ＭＥＭ培地（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンおよび０．０２ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン含有、Ｇｉｂｃｏ社製）に、前記凝固臍帯血の血清を１０ｖ／ｖ％となるように添加し、前記血清の添加培地を調製した。ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を前記血清の添加培地に懸濁し、１ウェルあたり３×１０３細胞となるように播種し、３７℃で７日間培養した。コントロールとして、前記凝固臍帯血の血清に代えて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０ｖ／ｖ％となるように添加したコントロール培地を調製し、同様にして前記ヒト間葉系幹細胞を培養した。
（３）細胞数の測定
　培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。下記式に各細胞数を代入し、前記コントロール培地での細胞数に対する、前記凝固臍帯血の血清の添加培地での細胞数の増幅率を算出した。
　　増幅率＝Ａ／Ｂ
　　　Ａ：前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた細胞数
　　　Ｂ：前記コントロール培地を用いた細胞数
［比較例１］
　本例では、臍帯血に代えて末梢血を使用し、前記ＰＶＣ製バッグに代えて遠沈管（容量５０ｍＬ）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、血清を調製し、前記実施例１と同様にして、培養後の細胞数の増幅率を算出した（ｎ＝８）。前記遠沈管のインキュベートは、振盪装置（商品名：マルチシェーカーＭＭＳ－３００、東京理科器械社製）を使用して行った。
　下記表１に、実施例１および比較例１の増幅率の結果を示す。下記表１において、「＋」は、前記ガラスビーズ処理したことを示す。下記表１に示すように、前記ガラスビーズで処理した臍帯血血漿から得た血清を使用した実施例１は、前記ガラスビーズで処理した末梢血血漿から得た血清を使用した比較例１よりも、優れた間葉系幹細胞の増幅が見られた。また、実施例１および比較例１の平均細胞数について、ｔ－検定を行った結果、有意差が認められた。この結果から、血液凝固剤で処理した臍帯血血漿から得た血清によれば、間葉系幹細胞の増殖が可能とわかった。また、多血小板血漿を血小板凝固処理して得られた血清についても、前記実施例１と同様の結果が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
　抗体アレイキットを用いて、前記実施例１と同様にして調製した前記凝固臍帯血の血清（ｎ＝２）および前記比較例１と同様にして調製した末梢血の血清（ｎ＝２）中のサイトカインを測定した。前記抗体アレイキットは、Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ　Ｃ　ｓｅｒｉｅｓ　２０００（Ｃａｔ　＃ＡＡＨ－ＣＹＴ－２０００、レイ・バイオテック社）のＲａｙ　Ｈｕｍａｎ（登録商標）　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ６（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ　Ｈｕｍａｎ（登録商標）　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ７（商品名、レイ・バイオテック社）、Ｒａｙ　Ｈｕｍａｎ（登録商標）　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ８（商品名、レイ・バイオテック社）を使用した。そして、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ（商品名、富士フィルム社製）を用いて、前記キットのメンブレンにおいて、発色した各スポットの濃淡を数値化し、各サイトカインレベルの平均値（ｎ＝２）を算出した。前記サイトカインレベルの平均値を、ポジティブコントロール（ビオチン結合ＩｇＧ）の平均値（ｎ＝１８）により補正した。そして、下記式を用いて、各サイトカインについて、前記凝固臍帯血の血清と前記末梢血の血清とのサイトカイン比を算出した。前記サイトカインは、前記３種類の抗体アレイキットで解析できる１７４種類を測定対象とした。
　　サイトカイン比＝Ｃ／Ｄ
　　　　Ｃ＝前記凝固臍帯血の血清のサイトカインレベルの補正値
　　　　Ｄ＝前記末梢血の血清のサイトカインレベルの補正値
　下記表２に、前記凝固臍帯血の血清において、前記末梢血の血清に対して２倍以上のサイトカイン比（Ｃ／Ｄ）を示した２０種類のサイトカインを示す。また、下記表３に、前記凝固臍帯血の血清において発現が認められ、且つ、前記末梢血の血清において発現が認められなかった１９種類のサイトカインを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例３］
　本例では、抗凝固剤を含まない非凝固臍帯血から、前記血液凝固剤を使用せずに、前記凝固臍帯血の血清を調製して、前記間葉系幹細胞の増殖への影響を確認した。
（１）血清の調製
　臍帯血は、臍帯表面の血管に針を刺し、前記針に連結されたチューブを介して、採血バック（ＰＶＣ製）に回収される。前記チューブには、抗凝固剤が添加されていないため、採血後、前記チューブ内に残存する臍帯血は、血液本来の凝固系によって凝固する。そこで、前記チューブ内の残存ヒト臍帯血を採取し、血清の調製に使用した。具体的には、臍帯血を採取後、その内部に臍帯血を有する前記チューブを、５～１０℃で２４時間保存した。前記チューブから、凝固臍帯血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に回収した。そして、前記ヒト臍帯血について、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。この前記凝固臍帯血の血清を、実施例の血清として使用した。前記血清のフィブリノゲン量を、全自動血液凝固測定装置（ＣＡ－５３０、シスメックス社製）で測定した結果、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を、多項目自動血球分析装置（ＸＴ－１８００ｉ、シスメックス社製）で測定した結果、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．９および１．５であった。
　他方、以下の方法により、凝固末梢血の血清を、比較例２の血清として調製した。まず、ヒト末梢血６ｍＬを、抗凝固剤を含まない遠沈管（１５ｍＬ）に採取した。前記遠沈管を室温（約２５℃）に６時間放置した後、前記実施例１の（１）と同様にして、遠心分離、加熱処理、ろ過を行い、前記血清（２ロット）を得た。前記血清のフィブリノゲン量は、測定限界値未満であった。また、前記血清の血小板数を前記多項目自動血球分析装置で測定したところ、各ロットの測定値（×１０４／μＬ）は、それぞれ１．３および０．９であった。以上の結果から、前記臍帯血および前記末梢血が同程度に凝固したことを、確認した。
（２）間葉系幹細胞の培養
　血清として、前記凝固臍帯血の血清（２ロット）および前記凝固末梢血の血清（２ロット）を使用し、１ウェルあたりの播種細胞数を５×１０３細胞とし、培養日数を６日間とした以外は、前記実施例１の（２）と同様にして、ヒト間葉系幹細胞を培養した。
（３）細胞数の測定
　培養後、各血清添加培地毎に細胞を回収し、細胞数をそれぞれカウントし、細胞数の平均値を算出した。前記血清の各ロットについて、測定数（ｎ）は３とした。細胞数のカウントには、コールターカウンター（ベックマンコールター社製）を使用した。そして、前記凝固末梢血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（比較例２）と、前記凝固臍帯血の血清の添加培地を用いた平均細胞数（実施例３）を算出した。
　その結果、前記実施例３の平均細胞数は、１２．２８７８３×１０４個であり、前記比較例２の平均細胞数は、９．５８１８３３×１０４個であった。前記比較例２の平均細胞数に対して、前記実施例３の平均細胞数は、約１．３倍であった。この結果から、凝固臍帯血の血清によれば、例えば、凝固末梢血の血清と比較して、ヒト間葉系幹細胞を効率良く増殖できることがわかった。また、血液凝固剤による凝固臍帯血に限らず、血液本来の凝固系により凝固させた臍帯血であっても、その血清により、間葉系幹細胞を増殖できることがわかった。このことから、血液凝固のメカニズムに影響されることなく、凝固臍帯血の血清であれば、間葉系幹細胞を増殖できることが明らかとなった。
　このように、本発明によれば、例えば、前述のように、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、前記凝固臍帯血の液性成分を用いることで、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で、間葉系幹細胞を増殖できる。このように、本発明によれば、間葉系幹細胞の増殖を促進できるため、例えば、再生医療の分野において、より一層、間葉系幹細胞の有効利用を促進できる。

Claims (17)

  1. 間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤であって、
    凝固臍帯血の液性成分を含むことを特徴とする増殖促進剤。
  2. 前記凝固臍帯血が、血液凝固剤と接触させた臍帯血である、請求項１記載の増殖促進剤。
  3. 前記血液凝固剤が、血小板の活性化剤である、請求項２記載の増殖促進剤。
  4. 前記血液凝固剤が、臍帯血の液性成分に不溶である、請求項２記載の増殖促進剤。
  5. 前記血液凝固剤が、粒状体である、請求項２記載の増殖促進剤。
  6. 前記血液凝固剤の表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されている、請求項２記載の増殖促進剤。
  7. 前記血液凝固剤が、ガラスビーズである、請求項２記載の増殖促進剤。
  8. 前記血液凝固剤の表面積が、臍帯血１ｍＬに対して、０．１ｍｍ２～２５ｍｍ２の範囲である、請求項２記載の増殖促進剤。
  9. 前記臍帯血が、血小板を含む臍帯血血漿である、請求項１記載の増殖促進剤。
  10. 間葉系幹細胞の増殖を促進する方法であって、
    請求項１記載の増殖促進剤を含む培地で前記間葉系幹細胞を培養することにより、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする増殖促進方法。
  11. 前記間葉系幹細胞および前記増殖促進剤における前記液性成分が、同一個体由来である、請求項１０記載の増殖促進方法。
  12. 前記個体が、哺乳類である、請求項１１記載の増殖促進方法。
  13. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２記載の増殖促進方法。
  14. 間葉系幹細胞の製造方法であって、
    請求項１０記載の増殖促進方法により、前記間葉系幹細胞の増殖を促進する工程を含むことを特徴とする製造方法。
  15. 凝固臍帯血の液性成分を回収する工程を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の増殖促進剤の製造方法。
  16. さらに、臍帯血を凝固させる工程を含む、請求項１５記載の製造方法。
  17. 臍帯血を血液凝固剤と接触させ、凝固させる、請求項１６記載の製造方法。
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