JP6452271B2 - 血清の調製方法 - Google Patents
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Description
そこで、調製に煩雑な操作を必要するPRPに代わって、高濃度の増殖因子を含有し、細胞培養だけでなく、創傷治癒、骨再生、美容等の様々な医療分野においても利用することのできる血清が求められている。
まず、本発明に係る血清の調製方法の好ましい一実施態様について、図1に沿って説明する。
本実施態様における「血液」とは、血球成分(赤血球、白血球、血小板)と液性成分である血漿(血清)からなる全血をいう。また、採取した血液は放置することによって流動性が低下し、赤い凝固塊(血餅)と淡黄色の液体とに分離される。この淡黄色の液体を「血清」という。
本実施態様に係る血清の調製方法で用いられる容器の材質としては、ポリプロピレン(PP)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ABS樹脂等が挙げられる。本実施態様に係る血清の調製方法では、耐遠心性が強いことから、ポリプロピレン(PP)製の容器を用いることが好ましい。
下層3は、赤血球層31と、バフィーコート層32とからなる(図1(b))。
赤血球層31は、主に赤血球を含有し、バフィーコート層32は、主に白血球及び血小板を含有する。
第一の分離工程(S1)における遠心分離の最適な条件は、5000g×5分、25℃である。
除去工程(S2)における上層2の除去手段としては、ピペットによる吸引等を挙げることができるが、これに限定されない。
活性化工程(S3)では、容器を振とうすることによって血小板の活性化を促進してもよい。
回収工程(S5)における血清6の回収手段としては、ピペットによる吸引等を挙げることができるが、これに限定されない。
なお、全血をそのまま活性化して凝固させた後に遠心分離をすることによって得られる通常の血清を濃縮することによっても濃縮血清を得ることは可能である。しかし、通常の血清を濃縮した濃縮血清は、タンパク質についても濃縮されてしまう。タンパク質濃度の高い血清は、粘度が高いことから取り扱いが困難である上に、細胞や組織との浸透圧の差が大きく、そのまま細胞培養等に用いると細胞や組織を破壊してしまうおそれもある。
一方、本発明に係る血清は、増殖因子を高濃度で含有する上にタンパク質濃度は通常の生体におけるタンパク質濃度とそれほど差はないので、細胞培養だけでなく、創傷治癒、骨再生、美容等の様々な医療分野においても利用することが可能である上に、粘性が低く、扱いやすい。
<採血>
3名の健常者(表1では、それぞれドナーI,J,Kと表記)から採血し、それぞれ10mlの全血を、容量が15mLの遠沈管(材質:ポリプロピレン、株式会社サンプラテック製)に入れた。
採血した全血をただちに遠心分離した(条件:5000g×5分、25℃)。遠心分離によって、血液は上層(血漿)と下層(赤血球層及びバフィーコート層)に分離された。
<上層の除去>
上層と下層に分離した血液の上層(血漿)をピペットで少しずつ採取し、上層(血漿)の80%を除去することによって約1mLの上層(血漿)を残した。残りの血液成分(赤血球、バフィーコート及び約1mLの血漿)は、よく懸濁した。
上記の残りの血液成分に、血液凝固促進材としてガラスビーズ(粒径4mm、ブライト標識工業株式会社製、表1では「ガラスビーズ(大)」と表記)を2個加えて、1時間室温で振とうすることにより、血液成分を凝固させた。
<2回目の遠心分離及び濃縮血清の回収>
続いて、血小板の活性化後の血液成分を遠心分離した(条件:5000g×10分、25℃)。遠心分離によって、血液成分は上層(濃縮血清)と下層(血餅)に分離される。
遠心分離後に濃縮血清をピペットにより回収した。
粒径4mmのガラスビーズの代わりに、血液凝固促進材として、粒径1mmのガラスビーズ(ブライト標識工業株式会社製、表1では「ガラスビーズ(小)」と表記)を0.3g用いたこと以外は、実施例1の手順と同様の手順で血清を調製した。
塩化カルシウム(和光純薬工業株式会社)を超純水に溶解し、2%塩化カルシウム水溶液を調製した。
粒径4mmのガラスビーズの代わりに、血液凝固促進材として、2%塩化カルシウム水溶液を0.148mL用い、血液成分と血液凝固促進材とをよく混和した後、1時間室温で静置することにより、血液成分を凝固させたこと以外は、実施例1の手順と同様の手順で血清を調製した。
ドナーI,J,K以外のドナーから採血し、10mlの全血を、ガラスビーズ(粒径4mm、ブライト標識工業株式会社製)が2個入った、容量15mLの遠沈管(材質:ポリプロピレン、株式会社サンプラテック製)に入れた。続いて、全血を1時間振とうし、遠心分離(条件:2330g×10分、25℃)することにより得られた上層(血清)をトロンビン溶液とした。
粒径4mmのガラスビーズの代わりに、血液凝固促進材として、上記トロンビン溶液を0.1mL用い、血液成分と血液凝固促進材とをよく混和した後、1時間室温で静置することにより、血液成分を凝固させたこと以外は、実施例1の手順と同様の手順で血清を調製した。
<採血>
3名の健常者(上記実施例1のドナーI,J,Kと同じ)から採血し、それぞれ10mlの全血を、ガラスビーズ(粒径4mm、ブライト標識工業株式会社製、表1では「ガラスビーズ(大)」と表記)が2個入った、容量15mLの遠沈管(材質:ポリプロピレン、株式会社サンプラテック製)に入れた。
上記の全血を1時間室温で振とうすることにより、血液成分を凝固させた。
<遠心分離及び血清の回収>
続いて、血小板の活性化後の全血を遠心分離した(条件:2330g×10分、25℃)。遠心分離によって、血液成分は上層(血清)と下層(血餅)に分離される。
遠心分離後に血清をピペットにより回収した。
<抗凝固剤の調製>
クエン酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社製)を超純水に溶解し、3.2%クエン酸ナトリウム水溶液を調製した。
<採血>
3名の健常者(上記実施例1のドナーI,J,Kと同じ)から採血し、それぞれ9mlの全血を、容量が15mLの遠沈管(材質:ポリプロピレン、株式会社サンプラテック製)に入れた。続いて、全血の入った遠沈管に、調製した3.2%クエン酸ナトリウム水溶液を1mL加えて混合した。
続いて、抗凝固剤入りの全血を遠心分離した(条件:900g×5分、25℃)。遠心分離によって、血液は上層(血漿)と下層(赤血球層及びバフィーコート層)に分離される。
<血漿とバフィーコートの回収>
上層(血漿)とバフィーコート層をピペットにより回収して、別の遠沈管(材質:ポリプロピレン、容量:15mL、株式会社サンプラテック製)に移した
<2回目の遠心分離及び上層の除去>
上層(血漿)とバフィーコート層を再度遠心分離して、上層(血漿)と下層(バフィーコート層)に分離した。続いて、上層(血漿)をピペットで少しずつ採取し、上層(血漿)約1mL及びバフィーコート層を残した。残った血漿及びバフィーコートはよく懸濁することで活性化前の(血小板を含有する)PRPとした。
塩化カルシウム(和光純薬工業株式会社)を超純水に溶解し、2%塩化カルシウム水溶液を調製した。
上記活性化前の(血小板を含有する)PRPに、0.148mLの2%塩化カルシウム水溶液を添加し、よく混和した後、1時間室温で静置した。
<3回目の遠心分離及びPRPの回収>
続いて、活性化後の(血小板を含有する)PRPを遠心分離した(条件:5000g×10分、25℃)。遠心分離によって、血液成分は上層(PRP)と下層に分離される。
遠心分離後に上層(PRP)をピペットにより回収した。
<血小板の利用率>
実施例1〜4(濃縮血清の調製)での血小板の利用率については、次の式(1)により求めた。
参考例(PRPの調製)での血小板の利用率については、次の式(2)により求めた。
実施例、比較例及び参考例でそれぞれ調製した濃縮血清、血清及びPRPの含有する濃縮因子の濃度(PDGF−AB、PDGF−BB、TGF−β1)は、これらの濃度を測定するキット(Quantikine human ELISA、R&D system社製)を用いて測定した。測定された増殖因子の濃度は、表1に示す。
2 上層
3 下層
4 血液凝固促進材
5 血餅(凝固成分)
6 血清
Claims (2)
- 採血された血液を、該血液が凝固する前に4〜37℃の条件下で2000〜7000gの遠心加速度で3〜10分遠心分離することにより、液性成分からなる上層と、その他の成分からなる下層とに分離する第一の分離工程と、
前記第一の分離工程において、前記上層と前記下層とに分離された前記血液から、前記上層の30〜90%を除去する除去工程と、
前記除去工程において、前記上層の30〜90%が除去された前記血液に、血液凝固促進材を添加することによって、前記下層に含まれる血小板を活性化し、前記血液を凝固させるとともに、前記血小板から増殖因子を放出させる活性化工程と、
前記活性化工程において放出された前記増殖因子を含む前記血液を、遠心分離することにより、前記増殖因子を含む血清と、前記血液の成分が凝固した凝固成分とに分離する第二の分離工程と、
前記第二の分離工程によって分離された前記血清を回収する回収工程と、を有する血清の調製方法。 - 前記血液凝固促進材は、二酸化ケイ素を含む物質である請求項1記載の血清の調製方法。
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