KR101307672B1

KR101307672B1 - 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 제어 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR101307672B1
Application number: KR1020117005175A
Authority: KR
Inventors: 사토시 히라이; 가수미 오가타
Original assignee: 가부시끼가이샤 제이엠에스
Priority date: 2009-01-27
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2013-09-12
Also published as: CN102264890B; EP2388314A1; CN102264890A; JP2010193879A; US20130143322A1; US20110287540A1; US8460930B2; EP2388314A4; WO2010087283A1; KR20110036644A

Abstract

제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 배양에 의해 증식시킬 때에, 우수한 안전성으로, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 제어하는 방법을 제공한다. 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 함유하는 배지에 상기 조혈 줄기 세포를 접종한다. 이와 같이 상기 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분의 존재하이면, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 한편, 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 함유하는 배지에 상기 조혈 줄기 세포를 접종함으로써, 반대로, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따르면, 제대혈 유래의 혈청을 이용함으로써, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식·분화의 억제와 증식의 촉진을, 임의로 조절 가능하다.

Description

제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 제어 방법 및 그 용도{METHOD FOR CONTROLLING PROPAGATION OF UMBILICAL CORD BLOOD HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND USE THEREOF}

본 발명은 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 방법 및 그 용도에 관한 것이고, 보다 상세하게는, 또한, 상기 조혈 줄기 세포의 제조 방법, 및 그것에 이용하는 증식 제어제, 증식 제어 키트 및 제대혈 성분 조제 장치에 관한 것이다.

조혈 줄기 세포는, 백혈구, 적혈구, 혈소판 등의 모든 혈구계 세포로 분화 가능한 자기 재생능을 갖는 다능성 줄기 세포이며, 골수액, 말초혈, 제대혈 중에 존재한다. 그리고, 조혈 줄기 세포를 체내에 이식하는 조혈 줄기 세포 이식은, 백혈병 등의 난치성 혈액 질환의 치료 방법으로서 유용한 것이 알려져 있다. 치료에는, 일반적으로, 골수액 또는 말초혈의 조혈 줄기 세포가 사용되고 있으나, 채취 시에 도너에게 큰 부담이 가해진다는 문제가 있다. 이에 비하여, 제대혈은, 출산 시에 부차적으로 얻어지기 때문에, 도너의 부담이 적고, 또한, 이식 적합성이 우수한 점에서도, 조혈 줄기 세포의 공급원으로서 주목받고 있다.

그러나, 도너로부터 얻어지는 제대혈은, 골수액이나 말초혈과 비교하면 소량이어서, 이식에 필요한 세포수가 얻어지지 않는 경우가 있다. 그래서, 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 이식에 사용하기 위해서, 상기 조혈 줄기 세포를 배양에 의해 증식하는 방법이 개발되어 있다. 구체적인 방법으로서, 증식을 촉진하기 위해서, 상기 조혈 줄기 세포를, 간엽계 줄기 세포 또는 이종 동물 유래의 지지 세포 등과 함께 배양하는 방법이 보고되어 있다(특허 문헌 1 및 특허 문헌 2). 또한, 상기 조혈 줄기 세포의 배양은, 예컨대, 원하는 시기까지 증식을 억제하거나, 분화를 억제하는 것이 요망된다. 이 때문에, 예컨대, 분화 억제 유전자를 편입시킨 바이러스 벡터를, 상기 조혈 줄기 세포에 도입하는 방법 등이 보고되어 있다(특허 문헌 3). 그러나, 바이러스 벡터를 도입하는 방법은, 예컨대, 다른 유전자 발현에 대한 영향이 염려되고 있고, 안전성이 불충분할 우려가 있다. 또한, 조작이 번잡하고, 비용도 든다는 문제도 있다.

[특허문헌]

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제2006-61106호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 제2007-202506호 공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 평성 제11-127859호 공보

그래서, 본 발명은 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 배양에 의해 증식시킬 때에, 우수한 안전성으로, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 제어하는 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 제어 방법은, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 방법으로서, 하기 (X) 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

(X) 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 상기 조혈 줄기 세포를 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 공정

본 발명의 제조 방법은, 제대혈 조혈 줄기 세포의 제조 방법으로서, 본 발명의 제어 방법에 의해, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 증식 제어제는, 본 발명의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어제이고, 하기 (a)의 증식 억제제인 것을 특징으로 한다.

(a) 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하기 위한 증식 억제제

본 발명의 증식 제어 키트는, 본 발명의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어 키트이고, 상기 (a)의 증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 예컨대, 전술한 바와 같이, 안전성에 문제가 있는 바이러스 벡터를 사용하지 않고서, 상기 제대혈 유래의 액성 성분을 이용함으로써, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 제어할 수 있다. 구체적으로는, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 사용하는 것만으로, 상기 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 이 때문에, 매우 안전성이 우수하며, 간편한 조작으로 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 특히, 제대혈의 액성 성분이기 때문에, 예컨대, 조혈 줄기 세포와 동일한 개체의 제대혈 유래의 액성 성분을 사용할 수 있다. 따라서, 보다 유효한 제대혈의 이용이 가능하고, 또한, 동일 개체의 성분을 병용할 수 있기 때문에, 안전성에 대한 신뢰성도 향상할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있기 때문에, 예컨대, 상기 조혈 줄기 세포를 목적지까지 수송할 때나, 증식을 행하는 원하는 시기까지 상기 조혈 줄기 세포를 보존할 때 등에 유용하며, 재생 의료의 분야에 있어서, 보다 더, 제대혈 조혈 줄기 세포의 유효 이용을 촉진할 수 있는 방법이라고 말할 수 있다.

도 1은 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치의 일례의 개략을 도시하는 평면도이다.
도 2는 본 발명의 다른 제대혈 성분 조제 장치의 일례의 개략을 도시하는 평면도이다.
도 3은 본 발명의 또한 그 외의 제대혈 성분 조제 장치의 일례의 개략을 도시하는 평면도이다.
도 4는 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치에서의 세포 함유 혈장 수용부의 사용 방법의 일례를 도시하는 사시도이다.
도 5는 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치에서의, 또한 그 외의 세포 함유 혈장 수용부의 일례를 도시하는 평면도이다.
도 6은 본 발명의 또한 그 외의 제대혈 성분 조제 장치의 일례의 개략을 도시하는 평면도이다.
도 7은 실시예 1에 있어서, 혈청 존재하에서 제대혈 조혈 줄기 세포를 배양했을 때의 조혈 줄기 세포수를 도시하는 그래프이다.

<증식 제어 방법>

본 발명의 제어 방법은, 전술한 바와 같이, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 방법으로서, 하기 (X) 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을, 이하, 「처리가 끝난 액성 성분」이라고도 말한다. 혈액은, 일반적으로, 액성 성분(액성 분획)과 세포 성분(세포 분획)으로 크게 나눌 수 있고, 상기 액성 성분은, 예컨대, 혈청 또는 혈장이고, 상기 세포 성분은, 예컨대, 혈구 성분(혈구 분획)이며, 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 액성 성분은, 예컨대, 혈청이어도 되고, 혈장이어도 된다. 본 발명에서는, 상기 배지가 상기 액성 성분을 포함하고 있으면 되고, 그 외의 구성은 조금도 제한되지 않는다. 상기 배지에 포함되는 제대혈의 액성 성분은, 예컨대, 또한, 상기 세포 성분, 혈액 응고 인자 등의 제대혈 유래의 성분을 포함해도 되지만, 바람직하게는, 상기 세포 성분이 제거된 액성 성분, 상기 혈액 응고 인자가 제거된 액성 성분, 상기 세포 성분 및 상기 혈액 응고 인자가 제거된 액성 성분이 바람직하다. 또, 상기 세포 성분의 제거 및 혈액 응고 인자의 제거는, 제대혈로부터 완전히 이들을 제거하는 것에는 한정되지 않는다. 상기 혈액 응고 인자란, 예컨대, 피브리노겐(I 인자), 프로트롬빈(II 인자) 등이다.

본 발명에 있어서, 초음파 처리하는 제대혈은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 제대혈 그 자체여도 되고, 액성 성분이어도 된다. 초음파 처리 전의 액성 성분을, 이하, 「처리 전 액성 성분」이라고도 말한다. 상기 액성 성분으로서는, 예컨대, 혈장 또는 혈청을 들 수 있다. 「혈장」이란, 일반적으로, 혈액으로부터 상기 혈구를 제거한 액체 분획이고, 「혈청」이란, 일반적으로, 혈액으로부터, 상기 혈구와 여러 종류의 혈액 응고 인자를 제거한 액체 분획이다. 상기 액성 성분에 초음파 처리를 실시하는 경우, 상기 액성 성분은, 예컨대, 제대혈로부터, 상기 혈구 성분을 제거한 액체 분획, 상기 혈액 응고 인자를 제거한 액체 분획, 상기 혈구 성분 및 상기 혈액 응고 인자를 제거한 액체 분획의 어느 것이라도 되지만, 예컨대, 상기 혈구 성분을 제거한 액체 분획이 바람직하다. 또한, 상기 액성 성분을 초음파 처리하는 경우, 상기 액성 성분은, 예컨대, 혈소판을 포함해도 되고, 상기 혈소판을 포함하는 혈장으로서는, 소위 다혈소판 혈장(Platelet-Rich-Plasma) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 처리가 끝난 액성 성분은, 예컨대, 제대혈 그 자체에 초음파 처리한 후, 액성 성분을 회수함으로써 조제해도 되고, 제대혈로부터 액성 성분을 회수하고, 이것에 초음파 처리하여 조제해도 된다. 또한, 상기 제대혈로부터 액성 성분을 회수할 때, 예컨대, 혈구 외에, 피브리노겐 등의 혈액 응고 인자도 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 제대혈의 액성 성분(처리가 끝난 액성 성분)은, 예컨대, 초음파 처리한 제대혈 혈장으로부터 얻어지는 혈청(처리가 끝난 혈청)인 것이 바람직하다.

본 발명은, 또한, 하기 (Y) 공정을 가져도 된다.

(Y) 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 상기 조혈 줄기 세포를 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 공정

상기 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 이하, 「비처리의 액성 성분」이라고 한다. 비처리의 액성 성분도, 전술한 처리가 끝난 액성 성분과 마찬가지로, 예컨대, 혈장 및 혈청 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 증식 및 분화를 억제하는 (X) 공정과, 증식을 촉진하는 (Y) 공정은, 예컨대, 어느 것을 먼저 행해도 된다. 제1 형태로서는, 예컨대, 먼저, 상기 (X) 공정에 있어서, 상기 처리가 끝난 액성 성분을 이용하여, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제한 후, 상기 (Y) 공정에 있어서, 상기 비처리의 액성 성분을 이용하여, 상기 (X) 공정에 의해 억제한 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 방법을 들 수 있다. 이 형태에 따르면, 원하는 시기까지 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하고, 원하는 시기에 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 개시할 수 있다. 즉, 상기 조혈 줄기 세포의 증식의 ON-OFF를, 사용하는 혈청을 변경하는 것만으로 용이하게 억제할 수 있다.

또한, 제2 형태로서는, 예컨대, 먼저, 상기 (Y) 공정에 있어서, 상기 비처리의 액성 성분을 이용하여, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진한 후, 상기 (X) 공정에 있어서, 상기 처리가 끝난 액성 성분을 이용하여, 상기 (Y) 공정에 의해 증식한 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 방법을 들 수 있다. 이 형태에 따르면, 증식시킨 상기 조혈 줄기 세포에 대해서, 원하는 시기까지, 추가의 증식이나 분화를 방지하여, 보존할 수 있다.

본 발명에 있어서, 제어를 목적으로 하는 조혈 줄기 세포는, 제대혈 유래이고, 증식을 제어하기 위한 혈청도 제대혈 유래이다. 이 때문에, 본 발명에서는, 예컨대, 동일 개체 유래의 제대혈 조혈 줄기 세포와 제대혈 액성 성분을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와 처리가 끝난 액성 성분을 이용하여, 증식 및 분화를 억제할 수 있고, 또한, 동일 개체의 제대혈 유래의 비처리의 액성 성분을 이용하여, 증식을 촉진할 수도 있다. 이 때문에, 제대혈 성분 중, 조혈 줄기 세포 뿐만 아니라, 그 증식을 제어하기 위해서 액성 성분도 사용할 수 있고, 제대혈을 보다 더 유효하게 이용할 수 있다.

상기 개체로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 인간이나, 설치류, 가축류, 인간을 제외한, 영장류 등의 포유류 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 조혈 줄기 세포의 조제 방법은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있으며, 이하에 일례를 나타내지만, 이것에는 제한되지 않는다. 먼저, 제대혈 중의 적혈구를 침강시키고, 상청 분획을 회수한다. 제대혈은, 태반 및 제대에 포함되는 혈액이며, 통상, 병원에서, 만출(娩出) 시 및 만출 후에 태반 및 제대로부터, 항응고제를 포함하는 채혈 백 내에 채취된다. 상기 항응고제를 포함하는 제대혈에, 적혈구를 분리하기 위한, 적혈구 침강제를 첨가한다. 상기 적혈구 침강제로서는, 예컨대, HES(Hydroxy Ethyl Starch) 등을 들 수 있다. 상기 적혈구 침강제의 첨가량은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 1 ㎎/㎖∼50 ㎎/㎖가 되도록 제대혈에 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 적혈구 침강제를 첨가한 제대혈을 정치(靜置)함으로써, 적혈구를 포함하는 분획과, 조혈 줄기 세포를 포함하는 상청 분획으로 분리된다. 분리의 조건은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 온도가, 15℃∼25℃이다. 또, 예컨대, 상기 제대혈이 미리 상기 적혈구 침강제를 포함하는 경우, 상기 적혈구 침강제는 첨가하지 않아도 된다(이하, 동일함).

이어서, 상기 상청 분획을 원심 분리하여, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과, 액체 분획(상청 분획)으로 분리한다. 원심 분리의 조건은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 원심 가속도 10780 m/s²∼43120 m/s²(1100∼4400×g), 온도 2℃∼37℃, 시간 4분∼30분이다. 또, 전술한 바와 같이, 본 발명에서는, 동일 개체 유래의 조혈 줄기 세포와 액성 분획을 사용하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 원심 분리 후의 상기 액체 분획은, 후술하는 바와 같이, 상기 액성 성분의 조제에 사용하는 것이 바람직하다. 상기 원심 분리 후의 상기 액체 분획은, 예컨대, 혈장을 포함하는 분획(혈장 분획)이어도 되고, 혈청을 포함하는 분획(혈청 분획)이어도 된다. 또한, 상기 원심 분리 후의 상기 액체 분획은, 예컨대, 전술한 바와 같이, 또한, 혈소판을 포함해도 된다. 전술한 바와 같이, 상기 액성 성분은, 예컨대, 혈소판을 포함하는 액성 성분으로부터 조제해도 되기 때문에, 상기 침강 분획을 회수할 때, 예컨대, 원심 분리 후의 상기 액체 분획에 혈소판이 포함되는 조건으로 원심 분리해도 된다. 이 조건은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 종래 공지의 다혈소판 혈장의 회수 방법에 따라 행할 수 있으며, 구체적으로는, 예컨대, 원심 가속도 2940 m/s²∼11760 m/s²(300∼1200×g), 온도 1℃∼20℃, 시간 3분∼6분이다.

계속해서, 상기 침강 분획으로부터, 조혈 줄기 세포의 순화(純化)를 행한다. 구체적으로는, 먼저, 상기 침강 분획에 항CD34 항체를 고정화한 자기 비드를 첨가하여, 조혈 줄기 세포의 CD34와 상기 자기 비드의 항CD34 항체를 반응시킨다. 이 항원 항체 반응을 통해, 상기 자기 비드에 상기 조혈 줄기 세포를 결합시킨다. 계속해서, 상기 자기 비드를 첨가한 침강 분획을 자기 칼럼에 적용하고, 자기에 의해, 상기 자기 비드를 상기 칼럼 내에 트랩하며, 상기 침강 분획 중의 불필요한 성분을 제거한다. 이렇게 하여, 순화된 조혈 줄기 세포를 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 제대혈 유래의 처리가 끝난 액성 성분의 조제 방법은, 특별히 제한되지 않는다. 또, 본 발명에서는, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와 액성 성분을 사용하는 것이 바람직하기 때문에, 이하에, 일례로서, 전술한 조혈 줄기 세포의 조제와 아울러 액성 성분을 조제하는 방법을 설명한다.

먼저, 전술한 바와 같이 하여, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과, 액체 분획(상청 분획)으로 분리한다. 상기 액체 분획은, 예컨대, 전술한 바와 같이, 상기 혈장 분획이어도 되고, 혈청 분획이어도 된다. 그리고, 상기 액체 분획에 초음파 처리를 실시한다. 초음파 처리의 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 초음파 처리의 조건은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 그 대상물에 대한 초음파를 음압계로 측정했을 때, 5 ㎷ 이상의 음압이 얻어지는 조건하, 주파수를, 예컨대, 28 ㎑∼100 ㎑, 초음파 발생 장치로부터의 거리를, 예컨대, 5 ㎝∼30 ㎝, 처리 시간을, 예컨대, 5분간∼60분간, 바람직하게는 10분간∼30분간으로 하여, 초음파 처리를 행한다. 또한, 본 발명에 있어서, 초음파는, 예컨대, 통상의 초음파 발생 장치를 이용하여 발생시킬 수 있다. 이렇게 하여, 상기 처리가 끝난 액성 성분이 얻어진다.

또한, 상기 액체 분획이, 예컨대, 피브리노겐 등의 혈액 응고 인자를 포함하는 경우, 예컨대, 또한, 상기 액체 분획으로부터, 상기 혈액 응고 인자를 제거하고, 상기 제거 후의 액체 분획을, 상기 처리가 끝난 액성 성분으로 할 수도 있다. 구체적으로는, 상기 액체 분획이, 예컨대, 상기 혈액 응고 인자를 포함하는 혈장 분획인 경우, 상기 혈액 응고 인자를 제거하여, 혈청을 회수하고, 이것을 상기 처리가 끝난 액성 분획으로서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 혈액 응고 인자의 제거는, 예컨대, 초음파 처리 전에 행해도 되고, 초음파 처리 후에 행해도 된다. 상기 혈액 응고 인자의 제거 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 피브리노겐 등의 혈액 응고 인자를 변성시켜, 불용성 분획으로서 제거하는 방법을 들 수 있다. 구체예로서는, 예컨대, 피브리노겐의 변성에 의해 피브린을 형성시켜, 불용성 분획으로서 제거하는 방법을 들 수 있다. 상기 변성 방법은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 열변성을 들 수 있고, 구체적으로는, 상기 액체 분획에 가열 처리를 실시하는 방법을 들 수 있다. 가열 조건은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 가열 온도는, 50℃∼60℃가 바람직하고, 가열 시간은, 10분∼120분이 바람직하며, 보다 바람직하게는 30분∼60분이다. 상기 불용성 분획의 제거는, 예컨대, 가열 처리 후의 액체 분획을, 정치, 원심 또는 필터 여과 등에 의해 행할 수 있다. 그리고, 예컨대, 정치 후의 상청 분획, 원심 후의 상청 분획, 또는, 필터 여과 후의 여과액을 회수함으로써, 상기 처리가 끝난 액성 성분이 얻어진다. 또, 정치, 원심 또는 필터 여과 등의 조건은, 조금도 제한되지 않고, 종래 공지의 조건을 채용할 수 있다. 또한, 상기 액체 분획으로부터 혈액 응고 인자를 제거하는 방법으로서는, 이 외에, 예컨대, 상기 액체 분획에 대한, 염화칼슘, 트롬빈 등의 응고 인자의 첨가 등, 혈액 응고계의 활성화 기구를 이용한 방법을 들 수 있다. 구체적인 조건에 대해서는, 조금도 제한되지 않고, 종래 공지의 조건을 채용할 수 있다.

한편, 상기 비처리의 액성 성분은, 상기 초음파 처리를 행하지 않는 것 이외에는, 예컨대, 전술과 동일하게 하여 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (X) 공정, 즉, 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 공정은, 전술한 바와 같이, 상기 초음파 처리한 액성 성분 혈청을 포함하는 배지에 상기 조혈 줄기 세포를 접종함으로써 행할 수 있다. 이하에, 구체예로서, 상기 처리가 끝난 액성 성분이 처리가 끝난 혈청인 일례를 나타낸다. 또, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않고, 예컨대, 혈청 이외의 처리가 끝난 액성 성분에 대해서도, 마찬가지로 사용할 수 있다.

상기 배지로서는, 상기 처리가 끝난 혈청을 함유하면 되고, 그 외의 구성이나 조건은, 조금도 제한되지 않는다. 상기 배지로서는, 예컨대, 제대혈의 조혈 줄기 세포의 배양에 사용 가능한 배지를 들 수 있고, 구체예로서는, 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM), X-VIVO 배지, STEM-LINE 배지 등을 사용할 수 있다. 상기 배지에서의 상기 처리가 끝난 혈청의 농도는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.01 v/v%∼20 v/v%이고, 바람직하게는 0.1 v/v%∼10 v/v%이며, 보다 바람직하게는 2.5 v/v%∼10 v/v%이다. 상기 배지 1 ㎖당의 조혈 줄기 세포수는, 예컨대, 1000∼10만개이다. 상기 배지는, 또한, 첨가물을 포함해도 되고, 상기 첨가물로서는, 예컨대, 사이토카인, 항생 물질, 염류, 비타민 등을 들 수 있다.

상기 처리가 끝난 혈청을 포함하는 배지에 접종한 상기 조혈 줄기 세포는, 예컨대, 조혈 줄기 세포를 증식시킬 때의 일반적인 배양 조건하에 둘 수 있다. 본 발명에 따르면, 전술한 바와 같이, 상기 배지는 처리가 끝난 혈청을 함유하기 때문에, 배양에 의해서도, 그 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 상기 배양 시의 온도로서는, 예컨대, 37℃이다. 또한, 상기 조혈 줄기 세포는, 동일한 배지에, 예컨대, 1일∼7일 정도 둘 수 있고, 바람직하게는, 1일∼7일마다 새로운 배지로 교환하는 것이 바람직하다. 이와 같이 배지의 교환에 의해, 예컨대, 1일∼7일 동안, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하고, 또한, 후술하는 증식의 촉진에 의해, 증식을 개시시킬 수도 있다. 새로운 배지로의 교환 방법은, 조금도 제한되지 않으나, 예컨대, 전술한 바와 같이, 소정 시간마다 배지를 교환하는 방법, 새로운 배지를 연속적 또는 단속적으로 공급하는 방법 등을 들 수 있다. 후자의 경우, 예컨대, 아울러, 오래된 배지의 일부를 연속적 또는 단속적으로 폐기하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (Y) 공정, 즉, 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 공정은, 전술한 바와 같이, 상기 초음파 처리하지 않은 혈청을 포함하는 배지에 상기 조혈 줄기 세포를 접종함으로써 행할 수 있다. 이하에, 그 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

상기 배지로서는, 상기 처리가 끝난 혈청을 대신하여 상기 비처리의 혈청을 함유하는 것 이외에는, 전술과 동일한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지에서의 상기 비처리의 혈청의 농도는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.01 v/v%∼20 v/v%이고, 바람직하게는 0.1 v/v%∼10 v/v%이며, 보다 바람직하게는 2.5 v/v%∼10 v/v%이다. 상기 배지 1 ㎖당의 조혈 줄기 세포수는, 예컨대, 1000∼10만개이다. 상기 배지는, 또한, 전술과 동일한 첨가물을 포함해도 되고, 특별히 제한되지 않으며, 전술과 동일하다.

상기 비처리의 혈청을 포함하는 배지에 접종한 상기 조혈 줄기 세포는, 예컨대, 조혈 줄기 세포를 증식시킬 때의 일반적인 배양 조건하에 둘 수 있다. 상기 배양 시의 온도로서는, 예컨대, 37℃이다. 또한, 상기 조혈 줄기 세포는, 동일한 배지에, 예컨대, 1일∼7일 정도 둘 수 있고, 바람직하게는, 1일∼7일마다 새로운 배지로 교환하는 것이 바람직하다. 상기 비처리의 혈청을 포함하는 배지에서 상기 조혈 줄기 세포를 배양하면, 예컨대, 7일간의 배양에 의해, 초기 접종수와 비교해서, 세포수를 약 2배∼10배로 증가시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 (Y) 공정을, 예컨대, 증식 및 분화를 억제하는 상기 (X) 공정 후에 행하는 경우, 즉, 원하는 시기까지 증식 및 분화를 억제하고, 원하는 시기로부터 증식을 촉진시키는 경우에는, 상기 처리가 끝난 혈청을 포함하는 배지로부터, 상기 비처리의 혈청을 포함하는 배지로 교환하면 된다. 한편, 상기 (Y) 공정을, 예컨대, 증식 및 분화를 억제하는 상기 (X) 공정 전에 행하는 경우, 즉, 조혈 줄기 세포를 증식시키고, 증식한 조혈 줄기 세포에 대해서, 원하는 시기까지, 분화와 추가의 증식을 억제하는 경우에는, 상기 비처리의 혈청을 포함하는 배지로부터, 상기 처리가 끝난 혈청을 포함하는 배지로 교환하면 된다. 또, 상기 (X) 공정과 상기 (Y) 공정을 반복할 때에는, 전술한 바와 같이, 목적에 따라 배지를 치환하면 된다.

<제조 방법>

이어서, 본 발명의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 제대혈 조혈 줄기 세포의 제조 방법으로서, 본 발명의 제어 방법에 의해, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화의 억제에, 본 발명의 제어 방법을 사용하는 것이 특징이고, 그 외의 조건이나 구성은 조금도 제한되지 않는다. 또, 특별히 나타내지 않는 한, 본 발명의 제어 방법과 동일하게 행할 수 있다.

본 발명의 제조 방법은, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 억제 공정으로서, 상기 (X) 공정을 가지며, 또한, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 촉진 공정을 갖는 것이 바람직하다. 상기 촉진 공정은, 예컨대, 혈액의 액성 성분을 포함하는 배지에 제대혈 조혈 줄기 세포를 접종하여 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 공정이고, 바람직하게는, 상기 본 발명의 제어 방법에서의 상기 (Y) 공정이다.

본 발명에 있어서, 상기 촉진 공정에서 사용하는 배지는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 액성 성분을 포함하는 배지가 바람직하다. 상기 배지의 액성 성분으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 인간 제대혈 혈청, 소 태아 혈청, 인간 말초혈 혈청 등을 들 수 있다. 상기 액성 성분은, 예컨대, 초음파 처리하지 않은 액성 성분이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 전술한 (Y) 공정과 같이, 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분이며, 특히, 조혈 줄기 세포와 동일한 제대혈 유래의 비처리의 액성 성분이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 억제 공정과, 상기 증식을 촉진하는 공정은, 상기 본 발명의 제어 방법과 마찬가지로, 어느 것을 먼저 행해도 된다. 제1 형태로서는, 예컨대, 먼저, 조혈 줄기 세포를 증식시키길 원하는 시기까지, 상기 조혈 줄기 세포를, 상기 처리가 끝난 액성 성분을 포함하는 배지에 접종하여, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하고, 상기 원하는 시기에, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 개시하는 방법을 들 수 있다. 또한, 제2 형태로서는, 예컨대, 먼저, 상기 조혈 줄기 세포를 증식한 후, 상기 조혈 줄기 세포를 사용하길 원하는 시기까지, 상기 증식한 조혈 줄기 세포를, 처리가 끝난 액성 성분을 포함하는 배지에 접종하여, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 방법을 들 수 있다. 또, 증식 및 분화의 억제와, 증식의 촉진은, 예컨대, 전술한 본 발명의 제어 방법과 마찬가지로, 예컨대, 상기 처리가 끝난 액성 성분을 포함하는 배지와, 상기 비처리의 액성 성분을 포함하는 배지를, 제어의 목적에 따라 치환함으로써 전환 가능하다.

본 발명에서는, 전술한 제어 방법과 마찬가지로, 예컨대, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와 액성 성분을 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와 처리가 끝난 액성 성분을 이용하여, 증식 및 분화를 억제하며, 또한, 동일 개체의 제대혈 유래의 비처리의 액성 성분을 이용하여, 증식을 촉진하는 것이 바람직하다. 상기 개체로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 인간이나, 인간을 제외한 포유류 등을 들 수 있다.

<증식 제어제>

본 발명의 증식 제어제는, 본 발명의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어제이고, 하기 (a)의 증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 증식 제어제는, 상기 초음파 처리한 제대혈 혈청을 포함하고 있으면 되고, 그 외의 구성은, 조금도 제한되지 않는다. 본 발명의 증식 제어제는, 예컨대, 본 발명의 제대혈 조혈 줄기 세포의 제조 방법에도 사용할 수 있다.

본 발명의 증식 제어제는, 또한, 하기 (b)의 증식 촉진제를 포함해도 된다. 또, 상기 (a)의 증식 억제제와, 상기 (b)의 증식 촉진제는, 억제와 촉진이라고 하는 반대의 작용을 나타내기 때문에, 예컨대, 별개로 독립된 제(劑)로서, 증식 제어제에 포함되어 있다.

(b) 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하기 위한 증식 촉진제

본 발명의 증식 제어제에 있어서, 상기 증식 억제제의 액성 성분과 상기 증식 촉진제의 액성 성분이, 동일 개체의 제대혈 유래의 액성 성분인 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 증식 제어제에 있어서, 상기 증식 억제제에서의 처리가 끝난 액성 성분과, 상기 증식 촉진제에서의 비처리의 액성 성분은, 특별히 나타내지 않는 한, 전술과 동일하다.

<증식 제어 키트>

본 발명의 증식 제어 키트는, 본 발명의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어 키트이고, 하기 (a)의 증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 증식 제어 키트는, 상기 증식 억제제를 포함하고 있으면 되고, 상기 증식 억제제는, 상기 본 발명의 증식 제어제와 동일하다. 본 발명의 증식 제어 키트는, 예컨대, 본 발명의 제대혈 조혈 줄기 세포의 제조 방법에도 사용할 수 있다.

본 발명의 증식 제어 키트는, 예컨대, 또한, 하기 (b)의 증식 촉진제를 포함해도 된다. 상기 증식 촉진제를 포함함으로써, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 촉진과, 증식 및 분화의 억제를 용이하게 행할 수 있다. 상기 증식 촉진제는, 상기 본 발명의 증식 제어제와 동일하다.

본 발명의 증식 제어 키트에 있어서, 상기 증식 억제제와 상기 증식 촉진제는, 상반되는 목적으로 사용하기 때문에, 별개의 용기에 수용되어 있는 것이 바람직하다.

<제대혈 성분 조제 장치>

본 발명의 제대혈 성분 조제 장치는, 본 발명의 제어 방법 또는 본 발명의 제조 방법에 사용하는, 제대혈 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분 및 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 동일한 제대혈로부터 조제하기 위한 제대혈 성분 조제 장치이다. 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치에 따르면, 제어 목적의 제대혈 조혈 줄기 세포, 증식 및 분화를 억제하기 위한 액성 성분, 및 증식을 촉진하기 위한 액성 성분을, 이 장치 하나로 조제할 수 있다. 본 발명의 제1∼제4 제대혈 성분 조제 장치를 이하에 나타낸다.

본 발명의 제1 제대혈 성분 조제 장치는,

제대혈을 저류하는 저류부,

적혈구를 수용하는 적혈구 수용부,

조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,

혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및

혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,

상기 저류부는, 상기 적혈구 수용부, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되고,

상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하며,

상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하고,

상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하며,

상기 적혈구 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 도입 가능하고,

상기 조혈 줄기 세포 수용부는, 상기 저류부에 있어서 상기 적혈구 침강 후의 상청으로부터 침강한 조혈 줄기 세포를 도입 가능하며,

상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 저류부에서의 상기 적혈구 및 조혈 줄기 세포 침강 후의 상청을 각각 도입 가능하고,

상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하며,

상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리한 혈청으로서 도입 가능하고,

상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하며,

상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리하지 않은 혈청으로서 도입 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 제대혈 성분 조제 장치는,

제대혈을 저류하는 저류부,

조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장을 수용하는 세포 함유 혈장 수용부,

조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,

혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및

혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,

상기 저류부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부와 연결되고,

상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되며,

상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하고,

상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하며,

상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하고,

상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 포함하는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장으로서 도입 가능하며,

상기 조혈 줄기 세포 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부에 있어서 상기 조혈 줄기 세포 함유 혈장으로부터 침강한 조혈 줄기 세포를 도입 가능하고,

상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부에서의 상기 조혈 줄기 세포 제거 후의 상청을 각각 도입 가능하며,

상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하고,

상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리한 혈청으로서 도입 가능하며,

상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하고,

본 발명의 제3 제대혈 성분 조제 장치는,

제대혈을 저류하는 저류부,

혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및

혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,

상기 저류부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부와 연결되고,

상기 세포 함유 혈장 수용부는, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되며,

상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하고,

상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하며,

상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하고,

상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 포함하는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장 분획으로서 도입 가능하며, 또한, 도입된 상기 혈장 분획을 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 상청 분획으로 분리한 후, 상기 침강 분획을 갖는 하측 영역과 상기 상청 분획을 갖는 상측 영역을 격리 가능하고,

상기 세포 함유 혈장 수용부의 하측 영역은, 조혈 줄기 세포의 수용부가 되며,

상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부의 상측 영역에서의 상기 상청 분획을 각각 도입 가능하고,

상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리한 혈청 분획으로서 도입 가능하고,

상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리하지 않은 혈청으로서 도입 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제4 제대혈 성분 조제 장치는,

제대혈을 저류하는 제1 및 제2 저류부,

적혈구를 수용하는 적혈구 수용부,

조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,

혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및

혈청을 수용하는 제1, 제2 및 제3 혈청 수용부를 가지며,

상기 제1 저류부는, 상기 적혈구 수용부, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되고,

상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하며,

상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하고,

상기 제1 저류부는, 항응고제 및 적혈구 침강제를 도입 가능하며,

상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을 초음파 처리하지 않은 혈청으로서 도입 가능하고,

상기 제2 저류부는, 상기 제3 혈청 수용부와 연결하고,

상기 제2 저류부는, 혈액 응고를 촉진하는 혈액 응고 촉진 개체를 도입 가능하며,

상기 제3 혈청 수용부는, 상기 제2 저류부에 있어서 혈액 응고 후에 얻어지는 상청 분획을 도입 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 저류부 및 각종 수용부는, 각각 기밀 상태로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이에 따라, 예컨대, 본 발명의 장치의 내부를 무균 상태로 유지하는 것이 가능해져, 예컨대, 제대혈의 도입 이후, 일련의 조작을 외기에 접촉시키지 않고서 행할 수 있다. 또한, 기밀 상태로 연결함으로써, 예컨대, 액밀 상태도 유지 가능하다.

상기 저류부 및 각종 수용부는, 예컨대, 가요성 재료로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 상기 가요성 재료로서는, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 폴리올레핀; 연질 폴리염화비닐 등의 폴리염화비닐; 폴리비닐알코올; 에틸렌-아세트산비닐 공중합 수지; 실리콘; 폴리우레탄; 나일론 등의 수지를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치는, 예컨대, 위생면에서 멸균 처리가 가능한 것이 바람직하고, 또한, 후술하는 바와 같이, 상기 각 혈장 수용부는, 예컨대, 상기 피브린 형성 처리로서 가열 처리를 실시하는 경우가 있다. 이 때문에, 상기 가요성 재료로서는, 내열성을 겸하는 것이 바람직하다.

제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부에서의 상기 피브린 형성 처리로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 상기 혈장 수용부에 대한 가열 처리나, 상기 혈장 수용부에 대한 혈액 응고용 시약의 도입 처리를 들 수 있다. 전자의 경우, 각 혈장 수용부는, 예컨대, 도입된 상기 상청에 대한 가열 처리가 가능하고, 후자의 경우, 예컨대, 상기 혈액 응고용 시약이 도입 가능하면 된다. 상기 혈액 응고용 시약은, 예컨대, 미리, 각 혈장 수용부에 수용되어도 되고, 사용 시에 외부로부터 도입되어도 된다. 또, 본 발명의 제1 및 제2 혈장 수용부에서의 상기 피브린 형성 처리는, 예컨대, 가열 처리인 것이 바람직하다.

상기 저류부 및 각종 수용부의 형태는, 특별히 제한되지 않으나, 취급성이 우수하다는 점에서, 예컨대, 백(bag)이 바람직하다. 상기 백은, 예컨대, 가요성 수지제의 시트 2장을 중첩시키고, 그 주위의 가장자리부(시일부)를 접착함으로써 형성할 수 있다. 접착의 형태는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 열 융착, 고주파 융착 등의 융착이어도 되며, 접착제 등에 의한 접착 등을 들 수 있다.

상기 저류부 및 각종 수용부의 크기는, 특별히 제한되지 않는다. 상기 저류부의 용량은, 예컨대, 50 ㎖∼400 ㎖가 바람직하고, 상기 저류부 내에 도입하는 제대혈의 양은, 예컨대, 상기 저류부의 용량의 40 체적%∼80 체적%가 바람직하다. 상기 각종 수용부의 용량은, 예컨대, 상기 저류부에 도입 가능한 제대혈량에 따라 적절하게 결정할 수 있고, 25 ㎖∼200 ㎖가 바람직하며, 또한, 상기 저류부의 용량의 30 체적%∼70 체적%가 바람직하다. 상기 저류부 및 각종 수용부는, 예컨대, 내부에 공기가 함유되어도 되지만, 가능한 한 함유량이 적은 것이 바람직하다. 상기 제4 제대혈 성분 조제 장치에 있어서, 제1 저류부의 용량은, 예컨대, 전술과 동일하며, 제2 저류부는, 예컨대, 10 체적%∼80 체적%가 바람직하고, 도입하는 제대혈의 양은, 예컨대, 제2 저류부의 용량의 40 체적%∼80 체적%가 바람직하다.

상기 저류부 및 각종 수용부는, 예컨대, 튜브로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 튜브는, 예컨대, 가요성 재료로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이, 튜브의 유로를 폐쇄한 상태에서, 제대혈 성분 조제 장치로부터 조혈 줄기 세포 수용부(12), 제1 혈청 수용부(13b) 및 제2 혈청 수용부(14b)를 떼어내는 것이 바람직하다. 이 때문에, 상기 튜브는, 예컨대, 가열 용융 등에 의해 용단(溶斷) 가능한 재질로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 재료로서는, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 폴리올레핀; 연질 폴리염화비닐 등의 폴리염화비닐; 폴리비닐알코올; 에틸렌-아세트산비닐 공중합 수지; 실리콘; 폴리우레탄; 나일론 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 제대혈 성분 조제 장치는, 예컨대, 적절하게, 튜브의 유로를 폐색 및 개통 가능한 부재를 갖는 것이 바람직하다. 상기 부재로서는, 예컨대, 클램프, 겸자(forceps) 등의 협지(挾持) 부재를 들 수 있다. 상기 협지 부재로, 각 튜브를 적절하게 끼움으로써, 상기 저류부와 각종 수용부 사이나, 각종 수용부 사이의 유로를 전환할 수 있다. 또한, 상기 유로의 개폐를 행하는 상기 부재로서는, 이 외에, 예컨대, 밸브 등도 사용할 수 있다. 상기 밸브는, 예컨대, 튜브의 도중에 배치해도 되고, 후술하는 바와 같은 튜브 사이의 분기부에 구비해도 된다. 또한, 후술하는 바와 같은 분기 커넥터가 밸브를 겸해도 된다.

상기 제1 및 제3 제대혈 성분 조제 장치에 있어서, 상기 저류부는, 예컨대, 환자로부터 직접 제대혈을 도입하는 경우, 항응고제를 더 포함해도 되고, 상기 항응고제를 도입 가능해도 된다. 후자의 경우, 예컨대, 상기 저류부에 제대혈을 도입하기 전에, 상기 항응고제를 상기 저류부 내에 도입하는 것이 바람직하다. 상기 항응고제로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, CPD액(Citrate-Phosphate-Dextrose solution), ACD-A액(Acid-Citrate-Dextrose-A solution) 등을 들 수 있다. 상기 항응고제의 양은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 저류부의 체적이나, 상기 저류부에 도입하는 제대혈의 체적 등에 따라 결정할 수 있다. 상기 항응고제의 첨가량은, 예컨대, 도입하는 제대혈에 대하여, 30 체적%∼100 체적%인 것이 바람직하다. 또한, 제4 제대혈 성분 조제 장치에 있어서는, 상기 제1 저류부가, 전술한 바와 같이 항응고제를 도입 가능하고, 제2 저류부는, 항응고제의 도입은 불필요하다.

제1∼제3 제대혈 성분 조제 장치에 있어서, 상기 저류부는, 예컨대, 미리 적혈구 침강제가 수용되어도 되고, 적혈구 침강제를 외부로부터 도입해도 된다. 또한, 상기 저류부는, 예컨대, 적혈구 침강제를 포함하는 제대혈을 도입하는 경우, 적혈구 침강제를 수용 또는 도입하지 않아도 된다.

본 발명의 제대혈 성분 조제 장치는, 예컨대, 인간의 제대혈 뿐만 아니라, 설치류, 가축류, 영장류 등의 포유류의 제대혈로부터의 성분 조제에도 사용할 수 있다.

(제1 실시형태)

이어서, 본 발명의 제1 제대혈 성분 조제 장치의 일례에 대해서, 도 1을 이용하여 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다.

도 1은 본 실시형태에서의 제대혈 성분 조제 장치의 개략을 도시하는 평면도이다. 제대혈 성분 조제 장치(1)는, 제대혈을 저류하는 저류부(10), 적혈구를 수용하는 적혈구 수용부(11), 조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부(12), 혈장을 수용하는 제1 혈장 수용부(13a) 및 제2 혈장 수용부(14a), 및 혈청을 수용하는 제1 혈청 수용부(13b) 및 제2 혈청 수용부(14b)를 갖는다. 도 1의 저류부(10) 및 각 수용부(11∼14b)에 있어서, 점선의 내부는, 각종 성분을 수용 가능한 공간이고, 점선과 바깥 테두리의 실선 사이가 시일부이다. 저류부(10)는, 2개의 도입구(15a, 15b)와 2개의 도출구(16c, 16f)를 구비한다. 저류부(10)의 좌측의 도입구(15a)는, 제대혈의 도입구이고 또한 튜브(18a)의 일단이 연결되어 있으며, 튜브(18a)의 타단은, 제대혈 백과의 접속부(9)이고, 예컨대, 천자침(穿刺針) 등이 연결 가능하며, 사용 시까지, 캡 등으로 커버되어 있다. 저류부(10)의 우측의 도입구(15b)는, 적혈구 침강제의 도입구이고 또한 튜브(18b)의 일단이 연결되어 있으며, 튜브(18b)의 타단은, 적혈구 침강제의 수용기와의 접속부(9)이고, 사용 시까지, 캡 등으로 커버되어 있다. 또한, 저류부(10)의 하방의 도출구(16c)는, 제대혈로부터 침강한 적혈구 및 조혈 줄기 세포의 도출구이고 또한 튜브(18c)의 일단이 연결되며, 상방의 도출구(16f)는, 적혈구와 조혈 줄기 세포를 제거한 후의 혈장의 도출구이고 또한 튜브(18f)의 일단이 연결되어 있다. 적혈구 수용부(11)는, 제대혈로부터 침강한 적혈구의 도입구(15d)를 가지며, 도입구(15d)는, 튜브(18d)의 일단이 연결되어 있고, 조혈 줄기 세포 수용부(12)는, 제대혈로부터 침강한 조혈 줄기 세포의 도입구(15e)를 가지며, 도입구(15e)는, 튜브(18e)의 일단이 연결되어 있다. 저류부(10)에 연결된 튜브(18c)와, 적혈구 수용부(11)에 연결된 튜브(18d)와, 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 연결된 튜브(18e)는, 각각의 타단이 분기 커넥터(19)를 통해 연통(連通)되어 있다. 제1 혈장 수용부(13a)는, 적혈구와 조혈 줄기 세포를 제거한 후의 혈장의 도입구(15g)와, 혈청의 도출구(16i)를 가지며, 도입구(15g)에는, 튜브(18g)의 일단이 연결되고, 도출구(16i)에는, 튜브(18i)의 일단이 연결되어 있다. 한편, 제2 혈장 수용부(14a)도 마찬가지로, 적혈구와 조혈 줄기 세포를 제거한 후의 혈장의 도입구(15h)와, 혈청의 도출구(16k)를 가지며, 도입구(15h)에는, 튜브(18h)의 일단이 연결되고, 도출구(16k)에는, 튜브(18k)의 일단이 연결되어 있다. 저류부(10)에 연결된 튜브(18f)와, 제1 혈장 수용부(13a)에 연결된 튜브(18g)와, 제2 혈장 수용부(14a)에 연결된 튜브(18h)는, 각각의 타단이, 분기 커넥터(19)를 통해 연통되어 있다. 또한, 제1 혈청 수용부(13b)는, 혈청의 도입구(15i)를 가지며, 도입구(15i)는, 제1 혈장 수용부(13a)에 연결된 튜브(18i)의 타단이 연결되어 있다. 또한, 제2 혈청 수용부(14b)는, 혈청의 도입구(15k)를 가지며, 도입구(15k)는, 제2 혈장 수용부(14a)에 연결된 튜브(18k)의 타단이 연결되어 있다.

제대혈 성분 조제 장치(1)는, 예컨대, 튜브를 사이에 끼운 클램프 등의 협지 부재를 구비하는 것이 바람직하다(도시하지 않음). 상기 협지 부재는, 예컨대, 저류부(10)와 각종 수용부(11, 12, 13a, 14a)를 연결하는 튜브, 및 혈장 수용부(13a, 14a)와 혈청 수용부(13b, 14b)를 연결하는 튜브에, 구비되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 원하는 유로로 전환 가능하다.

제1 혈장 수용부(13a)와 제1 혈청 수용부(13b) 사이[예컨대, 튜브(18i)], 제2 혈장 수용부(14a)와 제2 혈청 수용부(14b) 사이[예컨대, 튜브(18k)]에는, 예컨대, 잔존하는 적혈구 등을 제거하기 위한 필터가 개재해도 된다. 또한, 제2 혈장 수용부(14a)에 연결되는 튜브(18h)에 필터가 개재해도 된다.

각 수용부는, 예컨대, 개구 가능한 도출구(17)를 가져도 된다. 도출구(17)는, 예컨대, 제대혈의 각종 성분을 분리할 때에는, 도 1에 도시하는 바와 같이, 개구가 폐색되어 있는 것이 바람직하다. 그리고, 각 수용부에 수용된 각종 성분을 외부로 도출할 때, 상기 폐색부를 떼어냄으로써, 개구된 도출부(17)로부터 내부의 성분을 도출할 수 있다. 또한, 폐색된 도출부(17)에, 예컨대, 채취침(採取針)을 삽입하고, 상기 채취침을 통해, 내부의 성분을 도출할 수도 있다.

본 실시형태의 제대혈 성분 조제 장치(1)를 이용하여, 제대혈로부터 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 혈청(처리가 끝난 혈청) 및 초음파 처리하지 않은 혈청(비처리의 혈청)을 조제하는 방법을, 일례를 들어 설명한다. 또, 구체적인 처리 조건은, 특별히 나타내지 않는 한, 전술과 동일하게 설정할 수 있다.

먼저, 제대혈을 준비한다. 인간 제대혈의 경우, 예컨대, 혈액 백에 수용된 상태로 입수할 수 있다. 상기 혈액 백에 수용된 인간 제대혈은, 통상, 항응고제를 포함하고 있다. 이 혈액 백에, 저류부(10)에 연결된 튜브(18a)의 일단을 접속하여, 제대혈을 저류부(10)에 도입한다. 튜브(18a) 선단의 접속부(9)에는, 예컨대, 채혈침을 장착하고, 상기 채혈침을 상기 혈액 백에 삽입함으로써, 제대혈을 저류부(10)에 도입해도 된다. 여기서, 저류부(10) 내의 제대혈이, 하부의 도출구(16c)로부터 튜브(18c, 18d, 18e), 적혈구 수용부(11) 및 조혈 줄기 세포 수용부(12)로 흘러들어가지 않도록, 튜브(18c)의 유로를 저류부(10) 근방에서 클램프에 의해 폐쇄하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 저류부(10)에 제대혈을 도입한 후, 제대혈 도입용의 튜브(18a)는, 예컨대, 선단에 캡을 씌워도 되고, 실러 등을 이용하여 원하는 부위에서 용단해도 된다. 또, 환자로부터, 직접, 튜브(18a) 선단에 장착한 채혈침을 통해, 직접, 저류부(10)에 제대혈을 회수해도 된다. 이와 같이, 환자로부터 제대혈을 직접 저류부(10)에 회수하는 경우, 저류부(10)는, 예컨대, 내부에, 미리 항응고제가 수용되어 있어도 된다. 또한, 예컨대, 제대혈의 도입 전에, 저류부(10)에 연결된 튜브(18b)를 통해, 저류부(10)에 항응고제가 도입되어도 된다.

계속해서, 저류부(10)에 연결된 튜브(18b)를 통해, 저류부(10) 내에 적혈구 침강제를 도입하고, 제대혈과 상기 적혈구 침강제를 혼합한 후, 저류부(10)를 정치(靜置)한다. 그리고, 저류부(10) 내에서, 상기 제대혈을 적혈구 분획과 상청 분획으로 분리한 후, 저류부(10) 하부의 튜브(18c와 18d)를 통해, 침강한 적혈구 분획을 적혈구 수용부(11)에 도입한다. 이때, 조혈 줄기 세포 수용부(12)로의 적혈구 분획의 도입을 방지하기 위해서, 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 연결한 튜브(18e)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 클램프에 의해 폐쇄하고 나서, 클램프에 의한 튜브(18c)의 유로의 폐쇄를 해제하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 저류부(10)로부터 적혈구 수용부(11)의 유로가 연통되어, 적혈구 분획을 적혈구 수용부(11)에 도입할 수 있다. 또, 적혈구 분획을 적혈구 수용부(11)에 도입한 후에는, 재차, 튜브(18c)의 유로를 저류부(10) 근방에서 클램프에 의해 폐색하는 것이 바람직하다.

이렇게 하여, 적혈구 분획을 도출한 후, 저류부(10)를 원심 분리기에 걸어, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 혈장을 포함하는 상청 분획으로 분리한다. 이때, 원심 분리의 조건은, 전술한 바와 같다.

그리고, 저류부(10)의 하부의 튜브(18c와 18e)를 통해, 침강한 조혈 줄기 세포 분획을 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 도입한다. 이때, 적혈구 수용부(11)로의 조혈 줄기 세포 분획의 도입을 방지하기 위해서, 적혈구 수용부(11)에 연결한 튜브(18d)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 클램프에 의해 폐쇄하고 나서, 클램프에 의한 튜브(18c)의 유로의 폐쇄를 해제하는 것이 바람직하다. 또, 조혈 줄기 세포 분획을 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 도입한 후에는, 재차, 튜브(18c)의 유로를 저류부(10) 근방에서 클램프에 의해 폐색하는 것이 바람직하다. 또한, 실러 등을 이용하여, 튜브(18c)나 도입구(15e)를, 원하는 부위에서 용단해도 된다. 이에 따라, 제대혈 성분 조정 장치(1)로부터, 조혈 줄기 세포 분획을 수용한, 밀폐 상태의 조혈 줄기 세포 수용 백이 얻어진다. 상기 백 내의 조혈 줄기 세포는, 예컨대, 도출구(17)의 폐색부를 분리하거나, 폐색한 도출구(17)에 채취침을 찌름으로써, 내부로부터 빼낼 수 있다.

한편, 저류부(10)에 잔존하는 혈장 분획을, 튜브(18f, 18g, 18h)를 통해, 제1 혈장 수용부(13a)와 제2 혈장 수용부(14a)에 분주(分注)한다. 제1 혈장 수용부(13a) 및 제2 혈장 수용부(14a)에, 순차적으로, 혈장 분획을 도입할 때, 예컨대, 제2 혈장 수용부(14a)에 연결한 튜브(18h)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 폐색하고, 제1 혈장 수용부(13a)에 혈장 분획을 도입하며, 계속해서, 제1 혈장 수용부(13a)에 연결한 튜브(18g)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 폐색한 후, 클램프에 의한 튜브(18h)의 유로의 폐색을 해제하여, 제2 혈장 수용부(14a)에 혈장 분획을 도입하는 것이 바람직하다.

이어서, 제1 혈장 수용부(13a)에 초음파 처리를 실시한다. 초음파 처리는, 예컨대, 욕조 내의 액체에 상기 혈장 수용부와 진동자를 침지하고, 상기 진동자로부터 초음파를 출력함으로써 행할 수 있다. 계속해서, 제1 혈장 수용부(13a)에 가열 처리를 실시한다. 가열 처리에 의해, 상기 혈장 분획에 있어서 피브리노겐으로부터 피브린이 형성된다. 상기 가열 처리는, 예컨대, 욕조 내의 가열한 액체에 제1 혈장 수용부(13a)를 침지함으로써 행할 수 있다. 그리고, 가열 처리 후의 제1 혈장 수용부(13a)를 원심 분리기에 걸어, 형성된 피브린이나 혈소판 등을 포함하는 침강 분획과 혈청을 포함하는 상청 분획으로 분리한다. 이 상청 분획을, 제1 혈장 수용부(13a)와 제1 혈청 수용부(13b)를 연결하는 튜브(18i)를 통해, 제1 혈청 수용부(13b)에 도입한다. 이렇게 하여, 초음파 처리한 혈청을 회수할 수 있다. 제1 혈장 수용부(13a) 내의 상청 분획을 제1 혈청 수용부(13b)에 도입할 때, 침강 분획의 혼입을 방지하는 것이 바람직하다. 이 경우, 예컨대, 상청 분획과 침강 분획의 경계를, 제1 혈장 수용부(13a)의 외부로부터 클램프 등으로 사이에 끼움으로써, 분리하는 방법을 들 수 있다.

한편, 제2 혈장 수용부(14a)에, 초음파 처리를 실시하지 않는 것과, 혈소판을 제거하는 것 이외에는, 동일하게 하여 가열 처리를 실시한다. 제2 혈장 수용부(14a)의 가열 처리는, 예컨대, 제1 혈장 수용부(13a)의 가열 처리와 동시에 행해도 된다. 계속해서, 가열 처리 후의 상기 제2 혈장 수용부(14a)를 원심 분리기에 걸어, 형성된 피브리노겐이나 혈소판 등을 포함하는 침강 분획과 혈청을 포함하는 상청 분획으로 분리한다. 이 상청 분획을, 제2 혈장 수용부(14a)와 제2 혈청 수용부(14b)를 연결하는 튜브(18k)를 통해, 제2 혈청 수용부(14b)에 도입한다. 이렇게 하여, 초음파 처리하지 않은 혈청을 회수할 수 있다.

제1 혈청 수용부(13b) 및 제2 혈청 수용부(14b)는, 예컨대, 실러 등을 이용하여, 튜브(18i) 또는 도입구(15i), 및 튜브(18k) 또는 도입구(15k)를, 원하는 부위에서 용단해도 된다. 이에 따라, 제대혈 성분 조제 장치(1)로부터, 처리가 끝난 혈청을 수용한 밀폐 상태의 혈청 수용 백, 및 비처리의 혈청을 수용한 밀폐 상태의 혈청 수용 백이 얻어진다. 상기 백 내의 혈청은, 예컨대, 도출구(17)의 폐색부를 분리하거나, 폐색한 도출구(17)에 채취침을 찌름으로써, 내부로부터 빼낼 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 조혈 줄기 세포가 수용된 조혈 줄기 세포 백, 처리가 끝난 혈청이 수용된 혈청 백, 및 비처리의 혈청이 수용된 혈청 백은, 예컨대, 사용 시까지, 냉동 보존 등으로 보존할 수 있다. 또한, 냉동 보존할 때에는, 조혈 줄기 세포 수용부(12), 제1 혈청 수용부(13b) 및 제2 혈청 수용부(14b)에 목적 성분을 각각 수용한 후, 예컨대, 연결된 어느 하나의 튜브를 통해 동결 보호제를 내부에 도입하고 나서, 상기 튜브를 용단해도 된다.

또한, 본 발명의 실시형태에 있어서, 전술한 바와 같이, 혈장으로부터 피브리노겐을 제거하여 혈청을 회수할 때, 상기 가열 처리를 대신하여, 혈액 응고계의 활성화 기구를 이용하는 것도 가능하다. 이 경우, 전술한 바와 같이, 제1 혈장 수용부(13a)에 초음파 처리를 실시한 후, 제1 혈장 수용부(13a)에, 또한, 혈액 응고용 시약을 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 혈액 응고용 시약이란, 예컨대, 전술한 바와 같은, 트롬빈 등의 응고 인자 등을 들 수 있고, 상기 제대혈이 항응고제를 포함하는 경우, 상기 혈액 응고용 시약은, 예컨대, 또한, 염화칼슘 등의 중화제를 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같이 혈액 응고용 시약을 첨가함으로써, 혈장에 있어서 피브리노겐으로부터 피브린이 형성되기 때문에, 그 후에는, 전술과 마찬가지로 원심 분리를 행하면 된다. 또, 상기 혈액 응고용 시약은, 예컨대, 트롬빈 등의 응고 인자와 중화제를 동시에 상기 혈장에 첨가해도 되고, 상기 중화제를 첨가한 후에 상기 응고 인자를 첨가해도 된다. 이러한 형태에서는, 제1 혈장 수용부(13a)는, 상기 혈액 응고용 시약의 도입구를 갖는 것이 바람직하다. 상기 도입구는, 예컨대, 튜브의 일단이 연결되어 있고, 상기 튜브의 타단은, 상기 혈액 응고용 시약의 수용부와의 접속부이며, 사용 시까지 캡 등으로 커버되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 제2 혈장 수용부(14a)도 마찬가지로, 가열 처리를 대신하여, 상기 혈액 응고용 시약을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 제2 혈장 수용부(14a)도 마찬가지로, 상기 혈액 응고용 시약의 도입구를 갖는 것이 바람직하다. 상기 도입구는, 예컨대, 튜브의 일단이 연결되어 있고, 상기 튜브의 타단은, 상기 혈액 응고용 시약의 수용부와의 접속부이며, 사용 시까지 캡 등으로 커버되어 있는 것이 바람직하다.

(제2 실시형태)

이어서, 본 발명의 제2 제대혈 성분 조제 장치의 일례에 대해서, 도 2를 이용하여 설명한다. 도 2에 있어서, 도 1과 동일한 부위에는 동일한 부호를 붙이고 있다. 또한, 특별히 나타내지 않는 한은, 상기 제1 제대혈 조제 장치와 동일하다. 또, 특별히 나타내지 않는 한, 본 발명은, 이들에는 제한되지 않는다.

도 2는 본 실시형태에서의 제대혈 성분 조제 장치의 개략을 도시하는 평면도이다. 제대혈 성분 조제 장치(2)는, 제대혈을 저류하는 저류부(10), 적혈구 제거 후의 조혈 줄기 세포 함유 혈장을 수용하는 세포 함유 혈장 수용부(20), 조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부(12), 혈장을 수용하는 제1 혈장 수용부(13a) 및 제2 혈장 수용부(14a), 및 혈청을 수용하는 제1 혈청 수용부(13b) 및 제2 혈청 수용부(14b)를 갖는다. 저류부(10)는, 2개의 도입구(15a, 15b)와 도출구(16f)를 구비한다. 저류부(10)의 좌측의 도입구(15a)는, 제대혈의 도입구이고 또한 튜브(18a)의 일단이 연결되어 있으며, 튜브(18a)의 타단은, 제대혈 백과의 접속부(9)이다. 저류부(10)의 우측의 도입구(15b)는, 적혈구 침강제의 도입구이고 또한 튜브(18b)의 일단이 연결되어 있으며, 튜브(18b)의 타단은, 적혈구 침강제의 수용기와의 접속부(9)이다. 또한, 저류부(10)의 상방의 도출구(16f)는, 적혈구를 제거한 후의 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장의 도출구이고 또한 튜브(21a)의 일단이 연결되어 있다. 세포 함유 혈장 수용부(20)는, 도입구(25b)와 도출구(26c)를 구비한다. 상부의 도입구(25b)는, 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장의 도입구이고 또한 튜브(21b)의 일단이 연결되어 있다. 세포 함유 혈장 수용부(20)에 연결된 튜브(21b)의 타단은, 저류부(10)에 연결된 튜브(21a)의 타단 및 튜브(21d)의 일단과, 분기 커넥터(19)를 통해 연결되어 있다. 튜브(21d)의 타단은, 제1 및 제2 혈장 수용부(13a, 14a)에 연결된 튜브(18g, 18h)의 일단과, 분기 커넥터(19)를 통해 연결되어 있다.

제대혈 성분 조제 장치(2)는, 예컨대, 튜브를 사이에 끼운 클램프 등의 협지 부재를 구비하는 것이 바람직하다(도시하지 않음). 상기 협지 부재는, 예컨대, 저류부(10)와 세포 함유 혈장 수용부(20)를 연결하는 튜브(21a), 튜브(21d), 세포 함유 혈장 수용부(20)와 조혈 줄기 세포 수용부(12)를 연결하는 튜브(21c), 분기 커넥터(19)로부터 혈장 수용부(13a, 13b)에 연결된 튜브(18g, 18h), 혈장 수용부(13a, 14a)와 혈청 수용부(13b, 14b)를 연결하는 튜브(18i, 18k) 등에, 전술한 바와 같은 협지 부재가 구비되는 것이 바람직하다.

본 실시형태의 제대혈 성분 조제 장치(2)를 이용하여, 제대혈로부터 조혈 줄기 세포, 처리가 끝난 혈청 및 비처리의 혈청을 조제하는 방법을, 일례를 들어 설명한다. 또, 구체적인 처리 조건은, 특별히 나타내지 않는 한, 전술과 동일하게 설정할 수 있다.

전술과 마찬가지로, 저류부(10) 내의 제대혈을 적혈구 분획과 상청 분획으로 분리시킨 후, 저류부(10) 상부의 튜브(21a와 21b)를 통해, 상기 상청 분획을 세포 함유 혈장 수용부(20)에 도입한다. 상기 상청 분획은, 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장 분획이다. 이때, 상기 상청 분획의 각 혈장 수용부(13a, 14a)로의 도입을 방지하기 위해서, 튜브(21d)의 유로를, 튜브(21b)에 연결하는 분기 커넥터(19) 근방에서 클램프에 의해 폐쇄하는 것이 바람직하다. 또한, 세포 함유 혈장 수용부(20)에 도입한 상기 상청 분획이, 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 도출되는 것을 방지하기 위해서, 튜브(21c)의 유로를 도출구(26c) 근방에서 클램프에 의해 폐색하는 것이 바람직하다.

다음으로, 세포 함유 혈장 수용부(20)를 원심 분리기에 걸어, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 혈장을 포함하는 상청 분획으로 분리한다. 이때, 원심 분리의 조건은, 전술한 바와 같이, 혈소판이 상청 분획에 포함되는 조건으로 하는 것이 바람직하다.

그리고, 세포 함유 혈장 수용부(20)의 하부의 튜브(21c)를 통해, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획을 조혈 줄기 세포 수용부(12)에 도입한다. 조혈 줄기 세포의 도입 후, 세포 함유 혈장 수용부(20)와 조혈 줄기 세포 수용부(12)를 연결하는 튜브(21c)의 유로를 클램프에 의해 폐색하는 것이 바람직하다.

한편, 세포 함유 혈장 수용부(20)에 잔존하는 혈장 분획을, 튜브(21b, 21d, 18g, 18h)를 통해, 제1 혈장 수용부(13a)와 제2 혈장 수용부(14a)에 분주한다. 이때, 혈장 분획이 저류부(10)에 도출되는 것을 방지하기 위해서, 저류부(10)에 연결된 튜브(21a)의 유로를 클램프에 의해 분기 커넥터(19) 근방에서 폐색하는 것이 바람직하다. 그리고, 분주한 혈장을 전술과 동일하게 처리하여 혈청을 조제한다.

(제3 실시형태)

이어서, 본 발명의 제3 제대혈 성분 조제 장치의 일례에 대해서, 도 3을 이용하여 설명한다. 도 3에서, 도 1 및 도 2와 동일한 부위에는 동일한 부호를 붙이고 있다. 또한, 특별히 나타내지 않는 한은, 상기 제1 및 제2 제대혈 성분 조제 장치와 동일하다. 또, 특별히 나타내지 않는 한, 본 발명은, 이들에는 제한되지 않는다.

도 3은 본 실시형태에서의 제대혈 성분 조제 장치의 개략을 도시하는 평면도이다. 제대혈 성분 조제 장치(3)는, 도 2에서의 세포 함유 혈장 수용부(20)와 조혈 줄기 세포 수용부(12)를 대신하여, 격리 가능한 세포 함유 혈장 수용부(30)를 구비하는 것 이외에는, 전술한 제2 제대혈 성분 조제 장치와 동일하다. 세포 함유 혈장 수용부(30)는, 저류부(10)에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 포함하는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 상청 분획을, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장 분획으로서 도입 가능하다. 그리고, 세포 함유 혈장 수용부(30)는, 또한, 도입된 상기 혈장 분획을 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 상청 분획으로 분리한 후, 상기 침강 분획을 갖는 하측 영역(30b)과 상기 상청 분획을 갖는 상측 영역(30a)을 격리 가능하다.

세포 함유 혈장 수용부(30)에, 적혈구 제거 후의 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장을 도입한 후, 세포 함유 혈장 수용부(30)를 원심 분리기에 걸어, 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 혈장을 포함하는 상청 분획으로 분리시킨다. 분리 후, 침강 분획을 갖는 하측 영역(30b)과 상청 분획을 포함하는 상측 영역(30a)의 경계를, 파지 부재에 의해, 세포 함유 혈장 수용부(30)의 외부로부터 사이에 끼워, 상기 양 영역을 격리한다. 구체적으로는, 예컨대, 도 4에 도시하는 바와 같이, 세포 함유 혈장 수용부(30)의 상측 영역(30a)과 하측 영역(30b)의 경계(X)를 클램프(40) 사이에 끼운다.

그리고, 상측 영역(30a)에 수용된 상청 분획을 혈장 수용부(13a, 14a)에 도출하고, 전술과 동일하게 하여 혈청을 조제한다. 한편, 상청 분획을 도출한 후의 세포 함유 혈장 수용부(30)[하측 영역(30b)]는, 조혈 줄기 세포의 수용부가 된다.

제3 제대혈 성분 조제 장치(3)에 있어서, 세포 함유 혈장 수용부로서는, 예컨대, 도 5에 도시하는 세포 함유 혈장 수용부(50)여도 된다. 도 5에 도시하는 바와 같이, 세포 함유 혈장 수용부(50)는, 침강하는 적혈구가 하측 영역(50b)으로 이동하기 쉽도록, 상측 영역(50a)의 하부가 테이퍼 형상으로 되어 있다.

(제4 실시형태)

이어서, 본 발명의 제4 제대혈 성분 조제 장치에 대해서 설명한다. 본 발명의 제4 제대혈 성분 조제 장치는, 예컨대, 혈액 응고제를 포함하지 않는 미응고의 제대혈을 도입하여, 각종 성분을 조제할 때에 사용하는 장치이다. 상기 혈액 응고제를 포함하지 않는 미응고의 제대혈이란, 통상, 환자로부터 직접 도입되는 제대혈이다. 본 실시형태의 제대혈 성분 조제 장치에 따르면, 전술한 제대혈 줄기 세포, 처리가 끝난 혈청 및 비처리의 혈청 외에, 또한, 혈액 응고를 촉진하는 혈액 응고 촉진 개체에 의해 혈소판이 활성화된 혈청을 얻을 수 있다.

본 발명의 제4 제대혈 성분 조제 장치의 일례에 대해서, 도 6을 이용하여 설명한다. 도 6에서, 도 1 내지 도 5와 동일한 부위에는 동일한 부호를 붙이고 있다. 또한, 특별히 나타내지 않는 한은, 상기 제1∼제3 제대혈 성분 조제 장치와 동일하다. 또, 특별히 나타내지 않는 한, 본 발명은, 이들에는 제한되지 않는다.

도 6은 본 실시형태에서의 제대혈 성분 조제 장치의 개략을 도시하는 평면도이다. 제대혈 성분 조제 장치(6)는, 상기 제1 실시형태를 예시하는 도 1의 제대혈 성분 조제 장치에 대해서, 또한, 제대혈을 저류하는 제2 저류부(60) 및 제3 혈청 수용부(61b)를 갖는다. 또, 도 1에서의 저류부(10)는, 본 실시형태에 있어서, 제1 저류부에 해당한다. 제1 저류부(10)는, 특별히 나타내지 않는 한, 상기 제1 실시형태에서의 저류부와 동일하고, 제1 저류부(10)로부터 튜브 등을 통해 연결되는 각종 수용부도, 특별히 나타내지 않는 한, 도 1에 예시하는 상기 제1 실시형태와 동일하다. 제1 저류부(10)는, 혈액 응고용 시약 및 적혈구 침강제를 도입 가능하고, 제대혈의 도입구(15a)를 가지며, 도입구(15a)에는, 튜브(68a)의 일단이 연결되어 있다. 제2 저류부(60)는, 혈액 응고를 촉진시키는 혈액 응고 촉진 개체(혈액 응고 촉진제)가 수용 가능하고, 도입구(65a) 및 도출구(66a)를 구비한다. 제2 저류부(60)의 좌측의 도입구(65a)는, 제대혈의 도입구이고, 튜브(68b)의 일단이 연결되어 있다. 그리고, 제1 저류부(10)에 연결된 튜브(68a) 및 제2 저류부(60)에 연결된 튜브(68b)는, 분기 커넥터(19)를 통해, 각각 튜브(68c)에 연결되어 있다. 튜브(68c)의 타단은, 제대혈을 채취하기 위한 천자침 등이 연결 가능한 접속부(9)이다. 제2 저류부(60)의 우측의 도출구(66a)는, 혈액 응고 후의 혈청을 도출하는 도출구이고, 튜브(68d)가 연결되어 있다. 또한, 제3 혈청 수용부(61b)는, 도입구(65b)를 구비하고, 도입구(65b)에는, 제2 저류부(60)에 연결된 튜브(68d)의 타단이 연결되어 있다.

본 실시형태의 제대혈 성분 조제 장치는, 후술하는 바와 같이, 제2 저류부에 있어서, 상기 혈액 응고 촉진 개체가 제대혈에 접촉함으로써, 혈액 응고의 캐스케이드계가 작용하여, 혈액의 응고 및 혈소판 활성화에 의한 증식 인자의 방출이 발생한다. 이 때문에, 상기 제2 저류부(60)에 있어서, 혈액 응고의 상청에는, 혈소판을 활성화시키지 않은 경우와 비교하여, 보다 많은 증식 인자가 포함되게 된다.

상기 혈액 응고 촉진 개체로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 일본 특허 제3788479호 등에 기재되어 있는 것을 사용할 수 있다. 상기 혈액 응고 촉진 개체의 형상은, 예컨대, 분말형, 과립형, 덩어리형인 것이 바람직하고, 또한, 대략 구(球)형인 것이 바람직하다. 상기 혈액 응고 촉진 개체의 크기는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 직경이, 1 ㎜∼10 ㎜인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 ㎜∼5 ㎜이다. 상기 혈액 응고 촉진 개체는, 예컨대, 다공질 구조여도 된다. 이와 같이 다공질 구조의 혈액 응고 촉진 개체의 단위 체적당의 표면적을 크게 설계할 수 있으며, 효율적으로 혈소판 등의 활성화를 행할 수 있다.

상기 혈액 응고 촉진 개체의 재질로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 그 표면이, 이산화규소를 포함하는 층으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 상기 이산화규소로서는, 예컨대, 유리, 실리카, 규조토, 카올린 등을 들 수 있다. 또한, 상기 혈액 응고 촉진 개체는, 예컨대, 그 코어체가, 예컨대, 자성 물질을 포함해도 된다. 이와 같이 혈액 응고 촉진 개체가 자성 물질을 포함하는 경우, 예컨대, 상기 혈액 응고 촉진 개체가 수용된 상기 제2 저류부에 자계를 작용시킴으로써, 제대혈의 교반을 행할 수 있고, 혈소판 등의 신속한 활성화가 가능해진다.

상기 제2 저류부에서의 상기 혈액 응고 촉진 개체의 양은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 상기 저류부에 도입 가능한 제대혈의 양에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 구체예로서는, 상기 혈액 응고 촉진 개체의 총 표면적을, 예컨대, 제대혈 체적에 대하여, 0.1 ㎟/㎖∼25 ㎟/㎖로 설정하는 것이 바람직하다.

본 실시형태의 제대혈 성분 조제 장치(6)를 이용하여, 제대혈 성분을 조제하는 방법을, 일례를 들어 설명한다. 또, 구체적인 처리 조건은, 특별히 나타내지 않는 한, 전술과 동일하게 설정할 수 있다.

먼저, 튜브(68c)의 접속부(9)에 천자침을 장착하고, 그 선단을 제대에 삽입하여, 튜브(68c) 내에 제대혈을 도입한다. 그리고, 튜브(68a 및 68b)를 통해, 제1 저류부(10) 및 제2 저류부(60)에 각각 제대혈을 도입한다. 제대혈의 도입 순서는, 특별히 제한되지 않고, 각 저류부에 동시에 도입해도 되고, 순차적으로 도입해도 된다. 후자의 경우, 예컨대, 먼저, 제1 저류부(10)에 연결한 튜브(68a)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 폐색해 두고, 제2 저류부(60)로의 제대혈의 도입을 행한 후, 제2 저류부(60)에 연결한 튜브(68b)의 유로를 분기 커넥터(19) 근방에서 폐색하고 나서, 상기 튜브(68a)의 폐색을 해제하여, 제1 저류부(10)에 제대혈을 도입할 수 있다. 제1 저류부(10)와 제2 저류부(60)의 각각에 제대혈을 도입한 후, 양 저류부 사이의 튜브(68a 및 68b)를 용단해도 된다.

제1 저류부(10)에는, 예컨대, 전술한 바와 같이 미리 항응고제가 수용되어도 되고, 제대혈의 도입 전에 항응고제가 도입되어도 된다. 항응고제를 구비한 제1 저류부(10)에 제대혈이 도입된 후에는, 예컨대, 제1 실시형태와 동일하게 처리를 행함으로써, 전술한, 조혈 줄기 세포, 처리가 끝난 혈청 및 비처리의 혈청을 얻을 수 있다. 또, 제1 저류부(10)에 연결되는 각종 수용부는, 예컨대, 제1 실시형태를 대신하여, 제2 또는 제3 실시형태와 동일해도 된다.

한편, 제2 저류부(60)에는, 예컨대, 전술한 바와 같이 상기 혈액 응고 촉진 개체가 미리 수용되어도 되고, 제대혈의 도입 전에 상기 혈액 응고 촉진 개체가 도입되어도 된다. 상기 혈액 응고 촉진 개체를 구비한 제2 저류부(60)에 제대혈이 도입되면, 상기 제대혈에 대해서 혈액 응고(피브린 형성)가 발생함과 아울러, 혈소판의 활성화가 일어난다. 이 활성화에 의해, 비활성화의 경우보다, 많이 증식 인자가 방출된다. 그리고, 혈액 응고가 발생한 후, 제2 저류부(60)를 원심 분리기에 걸어, 피브린이나 혈소판 등을 포함하는 침강 분획과 상청 분획으로 분리한다. 이 상청 분획을, 제2 저류부(60)와 제3 혈청 수용부(61b)를 연결하는 튜브(68d)를 통해, 제3 혈청 수용부(61b)에 도입한다. 이렇게 하여, 증식 인자를 보다 많이 포함하는 혈청을 회수할 수 있다. 또한, 본 실시형태에 따르면, 제2 저류부(60)는, 항응고제를 포함하지 않기 때문에, 예컨대, 염화칼슘 등의 중화제가 포함되어 있지 않은 혈청이 얻어진다.

이어서, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은, 이하의 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예

[실시예 1]

제대혈로부터 혈청을 조제하고, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화에 대한 영향을 확인하였다.

(1) 조혈 줄기 세포 및 혈청의 조제

항응고제로서 CPD액을 포함하는 제대혈 80 ㎖를 원침관(遠沈管)에 넣고, 적혈구 침강제로서 HES(Hydroxy Ethyl Starch)를 12 ㎎/㎖의 농도가 되도록 첨가하였다. 이것을, 실온에 60분간 정치하여 상청 분획만을 채취하고, 이것을 원심 분리(3920 m/s²(400×g), 5분간)하여, 상청 분획과 침강 분획을 얻었다. 상기 상청 분획이 다혈소판 혈장 분획이고, 상기 침강 분획이 유핵 세포 분획이다.

상기 다혈소판 혈장 분획 중 30 ㎖를 용량 50 ㎖의 원침관에 넣고, 이것을 원심 분리(22834 m/s²(2330×g), 4℃, 10분간)하여, 상청 분획을 얻었다. 상기 상청 분획을 56℃에서 30분간 가열한 후, 원심 분리(22834 m/s²(2330×g), 4℃, 10분간)하고, 피브린을 제거하여 비초음파 처리의 혈청을 조제하였다. 이것을, 이하, 제대혈 혈청(-)라고 말한다. 한편, 상기 다혈소판 혈장 분획 중 30 ㎖를 5 ×10 ㎝의 크기의 PVC제 백에 넣고, 초음파 처리한 후, 동일한 조건에서 가열 처리와 원심 분리 처리를 행하여, 초음파 처리한 혈청을 조제하였다. 이것을, 이하, 제대혈 혈청(+)라고 말한다. 상기 초음파 처리는, 통상의 초음파 발생 장치를 이용하여, 그 대상물에 대한 초음파를 음압계로 측정했을 때, 5 ㎷ 이상의 음압이 얻어지는 조건하, 주파수 45 ㎑이며, 초음파 발생 장치로부터 15 ㎝의 거리에서 30분간 초음파 처리를 행하였다.

상기 유핵 세포 분획에 대해서, 이하의 처리를 행하여, 조혈 줄기 세포의 순화(純化)를 행하였다. 먼저, 상기 유핵 세포 분획 0.3 ㎖에, CD34 항체를 고정화한 자기 비드(밀테니 바이오텍사 제조)를 50 ㎕가 되도록 첨가하고, 4℃에서 30분간 정치하였다. 그리고, 이것을 자기 칼럼(상품명 MS 칼럼, 밀테니 바이오텍사 제조)에 적용하고, 상기 유핵 세포 분획으로부터 조혈 줄기 세포를 회수하였다. 회수한 조혈 줄기 세포의 순도를, 형광 색소로 표지화한 CD34 항체(베크만·코울터사 제조)를 이용하여, 유세포 분석법(Flow cytometry)에 의해 확인한 결과, 약 70%였다.

또, 제대혈 혈청(+) 및 제대혈 혈청(-)는, 각각, 3명의 제대혈(A, B, C)로부터 각각 조제하고, 제대혈 조혈 줄기 세포는, 그 중의 1명(A)으로부터 조제하였다.

(2) 조혈 줄기 세포의 배양

혈청으로서, 상기 A, B 및 C의 상기 제대혈 혈청(-) 또는 상기 제대혈 혈청(+)를 사용하여, 하기 조성의 배지를 조제하였다. 그리고, 각 혈청 첨가 배지를 사용하여, 회수한 상기 B의 상기 조혈 줄기 세포를 1웰당 1×10⁴ 세포가 되도록 파종하고, 37℃에서 7일간 배양하였다.

(3) 세포수의 측정

배양 후, 회수한 세포를, 상기 표지화 CD34 항체를 이용하여, 유세포 분석법에 의해 해석하고, 1웰당의 총 세포수, 조혈 줄기 세포수 및 총 세포 중의 조혈 줄기 세포의 비율을 산출하였다.

(비교예 1)

상기 조혈 줄기 세포의 배양에 있어서, 혈청으로서 소 태아 혈청(FBS)을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여, 조혈 줄기 세포의 배양, 세포수의 산출을 행하였다.

(비교예 2)

상기 조혈 줄기 세포의 배양에 있어서, 혈청으로서 말초혈 혈청을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여, 조혈 줄기 세포의 배양, 세포수의 산출을 행하였다. 상기 말초혈 혈청은, 이하와 같이 하여 조제하였다. 먼저, 성인 남성의 말초혈 20 ㎖를, 유리 비드(비드 직경 4 ㎜, 브라이트 효시키 고교사 제조) 2개를 포함하는 원침관에 넣었다. 상기 원침관을, 실온에서 20분간 진탕한 후, 원심 분리(22050 m/s², 4℃, 10분간)하여, 상청을 채취하였다. 상기 상청이 혈장 분획이다. 이 상청을, 56℃에서 30분간 열 처리한 후, 구멍 직경 0.22 ㎛의 필터(PVDF막, 밀리포어사 제조)를 이용해서 여과하여, 말초혈 혈청을 조제하였다.

도 7의 그래프에, 실시예 1, 비교예 1 및 2에 대해서, 1웰당의 총 세포수, 조혈 줄기 세포수의 측정 결과를 나타낸다. 도 7의 그래프에 있어서, 세로축은 배양 후의 1웰당의 세포수(×10⁴개)이고, 각 바는, 좌측으로부터 순서대로, FBS를 사용한 비교예 1, 말초혈 혈청을 사용한 비교예 2, 상기 A∼C의 제대혈 혈청(-)를 사용한 실시예 1, 상기 A∼C의 제대혈 혈청(+)를 사용한 실시예 1의 결과이다. 상기 바 전체는, 총 세포수를 나타내고, 그 중 검게 칠한 부분은, 조혈 줄기 세포수를 나타낸다.

도 7에 도시하는 바와 같이, 제대혈 혈청(-)를 이용한 실시예 1에서는, FBS를 이용한 비교예 1 및 말초혈 혈청을 이용한 비교예 2와 마찬가지로, 조혈 줄기 세포의 증식이 확인되었다. 이 결과로부터, 제대혈 혈청(-)에 의하면, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있다고 말할 수 있다. 한편, 제대혈 혈청(+)를 이용한 실시예 1에서는, 비교예 1 및 비교예 2와 비교하여, 총 세포수가 현저하게 낮은 결과가 되었다. 구체적으로는, 제대혈 혈청(+)를 이용한 실시예 1에서는, 총 세포수가 0.165×10⁴∼1.0×10⁴개로, 비교예 1의 총 세포수 7×10⁴개에 비하여, 2.4%∼21.4%로 억제되고, 또한, 비교예 2의 총 세포수 8.5×10⁴개에 비하여, 1.9%∼17.6%로 억제되었다. 이 결과로부터, 제대혈 혈청(+)에 의하면, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 억제할 수 있다고 말할 수 있다. 또한, 제대혈 혈청(+)를 이용한 실시예 1에서는, 총 세포수에서의 조혈 줄기 세포의 비율이 85%∼88%이며, 총 세포수에 있어서 미분화 세포가 차지하는 비율이 높은 것을 나타낸다. 이 결과로부터, 제대혈 혈청(+)에 의하면, 또한, 조혈 줄기 세포의 분화도 억제할 수 있다고 말할 수 있다. 그리고, 이상의 결과로부터, 제대혈 혈청(+)에 의하면, 증식·분화의 억제가 가능하고, 제대혈 혈청(-)에 의하면, 증식의 촉진이 가능하기 때문에, 이들을 적절하게 조합함으로써, 조혈 줄기 세포의 증식을 소망에 따라 제어할 수 있다. 특히, 동일한 제대혈로부터, 증식 목적의 조혈 줄기 세포와, 제어제가 되는 제대혈 혈청(+) 및 제대혈 혈청(-)를 조제할 수 있기 때문에, 적합성이나 안전성도 우수하고, 종래 폐기되고 있던 제대혈의 유효 이용도 가능해진다. 또, 제대혈 혈청(+)를 간엽계 줄기 세포의 배양에 사용한 경우, 반대로 증식은 촉진되는 결과가 되었다. 이러한 점에서, 제대혈 혈청(+)는, 제대혈 줄기 세포의 증식·분화를 특이적으로 억제할 수 있다고 이해된다.

[실시예 2]

상기 실시예 1과 동일하게 하여, 한 사람의 제대혈로부터 조혈 줄기 세포, 제대혈 혈청(+) 및 제대혈 혈청(-)를 조제하였다. 그리고, 상기 각 혈청을 첨가한 하기 배지를 이용하여, 상기 조혈 줄기 세포를 1웰당 5×10³ 세포가 되도록 파종하고, 37℃에서 14일간 배양하였다. 상기 배지에서의 제대혈 혈청(+)의 농도는, 5 v/v%, 10 v/v%로 하고, 제대혈 혈청(-)의 농도는 0.125 v/v%, 0.25 v/v%, 0.5 v/v%, 1 v/v%, 2.5 v/v%로 하였다. 또한, 컨트롤로서, 어느 쪽의 혈청도 포함하지 않는 배지를 이용하여, 동일하게 배양을 행하였다. 그리고, 실시예 1과 동일하게 하여, 배양 후에 회수한 세포를, 유세포 분석법에 의해 해석하여, 1웰당의 조혈 줄기 세포수를 산출하였다.

하기 표에, 제대혈 혈청(+) 또는 제대혈 혈청(-)를 첨가한 배지를 사용했을 때의 조혈 줄기 세포의 증가율을 나타낸다. 혈청을 첨가하지 않고 14일간 배양했을 때의 조혈 줄기 세포수를 「100%」로 한 상대값을, 상기 증가율로 하였다.

상기 표에 나타내는 바와 같이, 초음파 처리한 제대혈 혈청(+)를 5 v/v%∼10 v/v%의 범위로 함유하는 배지에서 배양함으로써, 줄기 세포의 증가율을 억제할 수 있었다. 한편, 초음파 처리하지 않은 제대혈 혈청(-)를 0.125 v/v%∼2.5 v/v%의 범위로 함유하는 배지에서 배양함으로써, 줄기 세포의 증가율을 증가시킬 수 있었다.

[실시예 3]

상기 실시예 1과 동일하게 하여, 한 사람의 제대혈로부터 조혈 줄기 세포, 제대혈 혈청(+) 및 제대혈 혈청(-)를 조제하였다. 그리고, 제대혈 혈청(-)를 0.5 v/v%의 농도로 포함하는 상기 실시예 2의 배지를 이용하여, 상기 조혈 줄기 세포를 1웰당 5×10³ 세포가 되도록 파종하고, 37℃에서 14일간 배양하였다. 그리고, 상기 제대혈 혈청(-)를 0.5 v/v%의 농도로 포함하는 배지를, 배양 14일째에, 상기 제대혈 혈청(+)를 10 v/v%의 농도로 포함하는 상기 실시예 2의 배지로 치환하고, 또한, 배양을 행하였다. 그리고, 실시예 1과 동일하게 하여, 소정의 배양 시간(0일, 7일, 14일, 21일)에 회수한 세포를, 유세포 분석법에 의해 해석하여, 1웰당의 조혈 줄기 세포수를 산출하였다. 컨트롤로서, 배양 14일째에, 상기 제대혈 혈청(+)를 10 v/v%의 농도로 포함하는 상기 배지로 치환하지 않고서, 배양 개시 시의 혈청만을 사용하여, 동일한 혈청 농도의 조건에서 배양을 행하고, 조혈 줄기 세포수를 산출하였다.

하기 표에, 조혈 줄기 세포의 증가율을 나타낸다. 배양 개시 시(0일째)의 조혈 줄기 세포수를 「1」로 한 상대값(배율)을, 상기 증가율로 하였다.

상기 표에 나타내는 바와 같이, 제대혈 혈청(-)를 0.5 v/v%의 농도로 함유하는 배지에서 배양한 조혈 줄기 세포를, 배양 14일째에 제대혈 혈청(+)를 10 v/v%의 농도로 함유하는 배지로 치환함으로써, 조혈 줄기 세포의 증가는 억제되었다.

이와 같이, 본 발명에 따르면, 예컨대, 전술한 바와 같이 안전성에 문제가 있는 바이러스 벡터를 사용하지 않고서, 상기 제대혈 유래의 혈청을 이용함으로써, 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 제어할 수 있다. 구체적으로는, 제대혈 혈청을 사용하는 것만으로, 상기 억제를 행할 수 있다. 이 때문에, 매우 안전성이 우수하고, 간편한 조작으로 증식 및 분화의 조절을 행하는 것이 가능하다. 특히, 제대혈 유래의 혈청이기 때문에, 예컨대, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와 혈청을 사용할 수 있다. 따라서, 보다 유효한 제대혈의 이용이 가능하고, 또한, 동일 개체의 성분을 병용할 수 있기 때문에, 안전성에 대한 신뢰성도 향상할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따르면 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있기 때문에, 예컨대, 상기 조혈 줄기 세포를 목적지까지 수송할 때나, 증식을 행하는 원하는 시기까지 상기 조혈 줄기 세포를 보존할 때 등에 유용하며, 재생 의료의 분야에 있어서, 보다 더 제대혈 조혈 줄기 세포의 유효 이용을 촉진할 수 있는 방법이라고 말할 수 있다.

Claims

제대혈 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 방법으로서,
하기 (X) 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 제어 방법:
(X) 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 상기 조혈 줄기 세포를 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 공정.
제1항에 있어서, 하기 (Y) 공정을 더 갖는 제어 방법:
(Y) 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 상기 조혈 줄기 세포를 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 공정.
제2항에 있어서, 상기 (X) 공정에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제한 후,
상기 (Y) 공정에 있어서, 상기 (X) 공정에 의해 억제한 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 제어 방법.
제2항에 있어서, 상기 (Y) 공정에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진한 후,
상기 (X) 공정에 있어서, 상기 (Y) 공정에 의해 증식한 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 제어 방법.
제1항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 및 상기 액성 성분이, 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포 및 액성 성분인 제어 방법.
제5항에 있어서, 상기 개체가 포유류인 제어 방법.
제6항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 제어 방법.
제대혈 조혈 줄기 세포의 제조 방법으로서,
제1항에 기재된 제어 방법에 의해, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 증식시키는 원하는 시기까지, 상기 조혈 줄기 세포를, 상기 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 증식시킨 후, 상기 조혈 줄기 세포를 사용하는 원하는 시기까지, 상기 증식시킨 조혈 줄기 세포를, 상기 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하는 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를, 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하는 제조 방법.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어제로서,
하기 (a)의 증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 증식 제어제:
(a) 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하기 위한 증식 억제제.
제12항에 있어서, 하기 (b)의 증식 촉진제를 더 포함하는 증식 제어제:
(b) 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하기 위한 증식 촉진제.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하기 위한 증식 제어 키트로서,
하기 (a)의 증식 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 증식 제어 키트:
(a) 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 상기 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화를 억제하기 위한 증식 억제제.
제14항에 있어서, 하기 (b)의 증식 촉진제를 더 포함하는 증식 제어 키트:
(b) 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을 포함하는, 상기 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하기 위한 증식 촉진제.
제15항에 있어서, 상기 증식 억제제의 액성 성분과 상기 증식 촉진제의 액성 성분이, 동일 개체의 제대혈 유래의 액성 성분인 증식 제어 키트.
제14항에 있어서, 상기 액성 성분과 동일 개체의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포의 증식을 제어하기 위한 키트인 증식 제어 키트.
제16항에 있어서, 상기 개체가 포유류인 증식 제어 키트.
제18항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 증식 제어 키트.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하는, 제대혈 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분 및 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 동일한 제대혈로부터 조제하기 위한 제대혈 성분 조제 장치로서,
제대혈을 저류하는 저류부,
적혈구를 수용하는 적혈구 수용부,
조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,
혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및
혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,
상기 저류부는, 상기 적혈구 수용부, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되고,
상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하며,
상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하고,
상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하며,
상기 적혈구 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 도입 가능하고,
상기 조혈 줄기 세포 수용부는, 상기 저류부에 있어서 상기 적혈구 침강 후의 상청으로부터 침강한 조혈 줄기 세포를 도입 가능하며,
상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 저류부에서의 상기 적혈구 및 조혈 줄기 세포 침강 후의 상청을 각각 도입 가능하고,
상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하며,
상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리한 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능하고,
상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하며,
상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리하지 않은 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능한 것을 특징으로 하는 제대혈 성분 조제 장치.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하는, 제대혈 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분 및 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 동일한 제대혈로부터 조제하기 위한 제대혈 성분 조제 장치로서,
제대혈을 저류하는 저류부,
조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장을 수용하는 세포 함유 혈장 수용부,
조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,
혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및
혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,
상기 저류부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부와 연결되고,
상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되며,
상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하고,
상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하며,
상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하고,
상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 포함하는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장인 상기 상청 분획을 도입 가능하며,
상기 조혈 줄기 세포 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부에 있어서 상기 조혈 줄기 세포 함유 혈장으로부터 침강한 조혈 줄기 세포를 도입 가능하고,
상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부에서의 상기 조혈 줄기 세포 제거 후의 상청을 각각 도입 가능하며,
상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하고,
상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리한 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능하며,
상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하고,
상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리하지 않은 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능한 것을 특징으로 하는 제대혈 성분 조제 장치.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하는, 제대혈 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분 및 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 동일한 제대혈로부터 조제하기 위한 제대혈 성분 조제 장치로서,
제대혈을 저류하는 저류부,
조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장을 수용하는 세포 함유 혈장 수용부,
혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및
혈청을 수용하는 제1 및 제2 혈청 수용부를 가지며,
상기 저류부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부와 연결되고,
상기 세포 함유 혈장 수용부는, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되며,
상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하고,
상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하며,
상기 저류부는, 적혈구 침강제를 도입 가능하고,
상기 세포 함유 혈장 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 포함하는 침강 분획과 상청 분획 중, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 혈장 분획인 상기 상청 분획을 도입 가능하고, 또한, 도입된 상기 혈장 분획을 조혈 줄기 세포를 포함하는 침강 분획과 상청 분획으로 분리한 후, 상기 침강 분획을 갖는 하측 영역과 상기 상청 분획을 갖는 상측 영역을 격리 가능하며,
상기 세포 함유 혈장 수용부의 하측 영역은, 조혈 줄기 세포의 수용부가 되고,
상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 세포 함유 혈장 수용부의 상측 영역에서의 상기 상청 분획을 각각 도입 가능하며,
상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하고,
상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리한 혈청 분획인 상기 상청 분획을 도입 가능하며,
상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하고,
상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리하지 않은 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능한 것을 특징으로 하는 제대혈 성분 조제 장치.
제1항에 기재된 제대혈 조혈 줄기 세포의 증식의 제어 방법에 사용하는, 제대혈 조혈 줄기 세포, 초음파 처리한 제대혈의 액성 성분 및 초음파 처리하지 않은 제대혈의 액성 성분을, 동일한 제대혈로부터 조제하기 위한 제대혈 성분 조제 장치로서,
제대혈을 저류하는 제1 및 제2 저류부,
적혈구를 수용하는 적혈구 수용부,
조혈 줄기 세포를 수용하는 조혈 줄기 세포 수용부,
혈장을 수용하는 제1 및 제2 혈장 수용부, 및
혈청을 수용하는 제1, 제2 및 제3 혈청 수용부를 가지며,
상기 제1 저류부는, 상기 적혈구 수용부, 상기 조혈 줄기 세포 수용부, 제1 및 제2 혈장 수용부와 각각 연결되고,
상기 제1 혈장 수용부는, 상기 제1 혈청 수용부와 연결하며,
상기 제2 혈장 수용부는, 상기 제2 혈청 수용부와 연결하고,
상기 제1 저류부는, 항응고제 및 적혈구 침강제를 도입 가능하며,
상기 적혈구 수용부는, 상기 저류부에 있어서 제대혈로부터 침강한 적혈구를 도입 가능하고,
상기 조혈 줄기 세포 수용부는, 상기 저류부에 있어서 상기 적혈구 침강 후의 상청으로부터 침강한 조혈 줄기 세포를 도입 가능하며,
상기 제1 혈장 수용부 및 제2 혈장 수용부는, 상기 저류부에서의 상기 적혈구 및 조혈 줄기 세포 침강 후의 상청을 각각 도입 가능하고,
상기 제1 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 초음파 처리 및 피브린 형성 처리가 가능하며,
상기 제1 혈청 수용부는, 상기 제1 혈장 수용부에 있어서 상기 초음파 처리 및 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리한 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능하고,
상기 제2 혈장 수용부는, 도입된 상기 상청에 대한 피브린 형성 처리가 가능하며,
상기 제2 혈청 수용부는, 상기 제2 혈장 수용부에 있어서 상기 피브린 형성 처리 후의 상기 상청으로부터 얻어지는 침강 분획과 상청 분획 중, 초음파 처리하지 않은 혈청인 상기 상청 분획을 도입 가능하고,
상기 제2 저류부는, 혈액 응고를 촉진하는 혈액 응고 촉진 개체를 도입 가능하며,
상기 제3 혈청 수용부는, 상기 저류부에 있어서 혈액 응고 후에 얻어지는 상청 분획을 도입 가능한 것을 특징으로 하는 제대혈 성분 조제 장치.