JPH10236976A

JPH10236976A - 骨形成促進剤

Info

Publication number: JPH10236976A
Application number: JP9059959A
Authority: JP
Inventors: Noritaka Isogai; 典孝磯貝; Takaharu Mori; 隆治森; Yoshimitsu Ishihara; 義光石原
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1997-02-26
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 1998-09-08

Abstract

(57)【要約】【目的】骨母細胞の増殖を促進し、該骨膜細胞注入に
よる患部での骨形成に際しこれを促進する骨形成促進剤
を提供する。【構成】フィブリノゲンにトロンビンを作用させて形
成されるフィブリンを主成分とする骨形成促進剤。およ
び骨母細胞およびフィブリンの懸濁液より構成される骨
形成剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は、外科領域で使用され
る医療用薬剤に関する。詳細には、骨形成促進剤および
骨形成剤に関する。より詳細には、骨母細胞の増殖およ
び骨母細胞に基づく骨の形成を促進する際の、フィブリ
ンを主たる構成成分とする骨形成促進剤並びに骨母細胞
および前記骨形成促進剤を主たる構成成分とする骨形成
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】骨折
や骨欠損部における骨形成は、内軟骨性骨化と膜性骨化
が混在しこれらの協同によって生ずる。内軟骨性骨化で
は骨膜、膜性骨化では骨髄由来の未分化間葉系細胞がま
ず局所に遊走する。次に血小板や骨から徐放された形質
転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、骨形成蛋白質（ＢＭ
Ｐ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）などの
活性サイトカインが、これらの未分化間葉系細胞の軟骨
芽細胞、骨芽細胞への分化を誘導する。分化した骨芽細
胞群は、１型を中心としたコラーゲンや骨蛋白質（oste
oprotein）、骨カルサイン（osteocalcine）、骨シアロ
蛋白質（bonesialoprotein）などの細胞外基質を産生し
て骨組織が形成される（Ｇrainger,Ｄ.Ｊ., et al., Ｎ
ature Ｍed., １,ｐ.９３２-９３７(１９９５)、Ｈult
h,Ａ., Ｃlin.Ｏrthop., ２４９,ｐ.２６５-２８４(１
９８９)、Ｌavine,Ｌ.Ｓ., et al.,Ｃlin.Ｏrthop., １
２４,ｐ.６９-(１９７７)）。

【０００３】しかし、実際の臨床例では、全身状態や開
放創、感染の有無、骨折、骨欠損の部位などの条件によ
り、骨形成は阻害され遷延される。また、骨形成の機序
や骨代謝の調節因子について不明な点が数多く、このた
め、骨形成促進の工夫と開発は今後の重要な課題であ
る。近年、生体治癒反応を常に刺激し続けることで骨形
成過程を積極的に促進しようとする試みがなされつつあ
る。電気・磁気刺激や自家骨髄血移植などの臨床治験
（Ｂrighton,Ｃ.Ｔ., et al.,Ｊ.Ｂone Ｊoint Ｓurg.,
６３-Ａ,ｐ.２-１２(１９８１)）を始めとして、骨形成
刺激物質の全身あるいは局所投与、培養骨芽細胞を用い
た自家細胞移植などの進歩は、これまで難治とされた骨
折や関節の治療などに応用されつつある（Ｂrighton,
Ｃ.Ｔ., et al.,Ｏrthop.Ｃlin.ＮorthＡm.,１５,ｐ.３
３-４５(１９８４)）。一方、先天性奇形や外傷後変形
に対する骨、軟部組織の延長や、湾曲矯正時に生ずる骨
の大欠損の補填方法には未だ限界があり、代用骨など新
しい方法の開発が切望されている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従来、形成外科領域にお
いては、骨移植は重要な課題であった。さらに、移植を
目的とした骨材料は多方面にわたって検討されたが、な
おいくつかの欠点を有し、骨母細胞の培養とマトリック
スの形成、さらには移植材料としての応用は今後の発展
が期待されているところであった。そこで、本願発明者
等は上述の問題を鑑み鋭意検討した結果、骨形成の第一
段階としての、骨母細胞の好適な培養と該培養マトリッ
クスを骨移植の材料として使用することについての知見
を得た。とりわけ、その手段として、生体由来蛋白質で
あるフィブリンを骨母細胞増殖に利用すること、および
フィブリンによるマトリックス形成の寄与に着目し、こ
れを移植用の代用骨として使用する可能性を拓いたもの
である。

【０００５】以下、本願発明をさらに詳細に説明する。
本願発明では、骨母細胞とりわけ骨膜細胞を局所患部に
注入し新たな骨形成の基質として利用する。その際、骨
母細胞の増殖培地にフィブリノゲンを共存させこれにト
ロンビンを作用させて該骨母細胞含有フィブリンマトリ
ックスを調製する。これより骨母細胞・フィブリン塊混
和物を得る。かくして得られた骨母細胞・フィブリン塊
混和物を、骨移植用の代用骨として使用した場合、骨母
細胞を単独で注入した場合に比較して顕著な骨形成が促
進される。

【０００６】本願発明の主要構成要件のひとつである骨
母細胞としては、例えば骨膜細胞、滑膜細胞、軟骨細
胞、腱細胞または骨細胞などが例示されるが骨膜細胞は
好適な例である。該骨母細胞は、例えば、同種または異
種動物の長骨骨幹（diaphyses）より常法（Ｋoshihara,
Ｙ., et al., Ｉn Ｖitro Ｃell Ｄev. Ｂiol.,２５,
ｐ.３７-(１９８９)）によって調製し、例えば牛胎児血
清含有培地、Ｍ１９９培地中で拡張して使用する。ある
いは、市販のもしくは寄託機関に寄託されている各種細
胞株、例えば、ＨＣＳ-２／８（ヒト軟骨肉腫細胞
株）、Ｇ-292ＣloneＡ141Ｂ１（滑肉腫細胞株）、ＳＫ-
ＥＳ-１（サルコーマ細胞株）もしくはＨs696（サルコ
ーマ細胞株）なども適用され得る。

【０００７】本願発明においては、上記骨母細胞を基に
骨形成促進剤としてフィブリンを共存させることを大き
な特徴とする。この場合、フィブリン塊中に骨母細胞が
分散した状態、すなわち、骨母細胞含有フィブリンマト
リックスの形成およびこれより得られる骨母細胞・フィ
ブリン塊混和物が骨形成剤として最適な態様である。前
記マトリックスの調製においては、フィブリンの前駆物
質であるフィブリノゲンを含有する骨母細胞分散液に、
トロンビンを作用させてマトリックスを形成させる。こ
の時の、骨母細胞の好適な濃度は例えば、５×１０⁵〜
１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、フィブリノゲンお
よびトロンビンの好ましい濃度は各々８０ｍｇ／ｍｌ、
２５０単位程度である。なお、前記フィブリンマトリッ
クス調製時には、必要に応じて他の成分、例えば、血液
凝固第XIII因子およびアプロチニンが付加的に添加され
ることもある。

【０００８】ところで、繊維素原（フィブリノゲン）
は、いわゆる血液凝固カスケードの最終段階に存在する
非常に重要な役割を担う凝固因子である。フィブリノゲ
ンは、例えば損傷後の血液凝固系の活性化において、上
述のごとくトロンビンにより、その可溶性形態から止血
および創傷治癒に重要な寄与をする不溶性のフィブリン
に変換される。近年、この血液凝固の最終相の原理を利
用した組織接着剤が開発され、外科手術において縫合代
用の接着剤としてまたは縫合補助剤として、幅広い臨床
の現場で応用されている。従って、本願発明に用いられ
るフィブリンの生体内での安全性は十分保証されるもの
と考えられる。フィブリンマトリックスの調製において
は、フィブリノゲンおよびトロンビンの単独の市販製剤
を用いることもできるが、各々の成分および各種添加剤
が一包装形態にパッケージングされた市販の生体組織接
着剤、例えばボルヒール（登録商標: (財)化学及血清療
法研究所製）等は簡便に使用することができる。

【０００９】フィブリンマトリックスから骨母細胞・フ
ィブリン塊混和物（懸濁液）を調製する。調製にあたっ
て、フィブリノゲン溶液に骨母細胞を懸濁し、トロンビ
ンを作用させてフィブリンマトリックスを形成させる。
その後、時間と共に強固なフィブリン塊となる。臨床使
用においては、該骨母細胞・フィブリン塊混和物を好ま
しい径を有する注射針等で局所患部に注入する。かくし
て、本願発明の骨母細胞・フィブリン塊混和物の注入に
より、患部でのカルシウムを主とする無機質の付着・堆
積、を達成することができ、本願発明によって提供され
るフィブリンを主たる構成成分とする骨形成促進剤によ
って、骨形成の新たな可能性を拓くことができるもので
ある。

【００１０】

【発明の効果】本願発明は、骨移植の材料として、骨母
細胞をフィブリン共存下で培養し、該細胞含有マトリッ
クスを形成し、これを移植用代用骨として使用すること
を可能とするものである。従って、外科領域、とりわけ
形成外科領域での重要な克服課題であった骨形成に関し
て効果的な材料及び方法を提供し得るものである。以下
に、実施例並びに試験例を挙げて本願発明を具体的に説
明するが、本願発明はこれらの例に何ら限定されるもの
ではない。

【００１１】

【実施例】実施例１（in vitro 試験: フィブリン塊の中での骨膜細胞の増
殖性）１. 試験方法ラットの１０×１０ｍｍの骨膜細胞の抽出物を切り出
し、ＦＢＳ加Ｍ１９９培地にて４週間培養し、これに
０.２５％トリプシンを２０分間処理し、骨膜細胞を得
た。得られた骨膜細胞（３×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
をフィブリノゲン溶液と混合し、トロンビンを作用させ
てフィブリンのディスクを作製し、７日間培養した。こ
の時、細胞のみの培養を対照群とした。試験群と対照群
の比較は顕微鏡観察とＤＮＡ測定で行なった。

【００１２】２. 試験結果 1)顕微鏡観察図１に示すように対照群と試験群との間に細胞形態上の
変化はないことから、フィブリンマトリックスによる細
胞の成長に及ぼす影響はないことが推察された。 2)ＤＮＡ含量試験骨膜細胞含有フィブリン塊及び骨膜細胞のみの各々の検
体のＤＮＡ量を測定することによって増殖した細胞の量
を知ることができる。対照群は４０μｇでほぼ一定であ
るが、試験群は４日目で１５０μｇと最高値を示し、測
定の各時点で高値を示した。このことは試験群の方が対
照群よりも細胞が増殖していることを明らかに示してい
る。即ち、フィブリンによって形成された架橋の中に骨
膜細胞が立体的に分布し増殖するために、細胞数が増加
するものと考えられる（図２）。これらの試験から、フ
ィブリン塊に封入された細胞は、細胞の形状の観点から
問題はなく、むしろ量的には増加していることが推測さ
れた。

【００１３】実施例２（in vivo 試験: ヌ−ドマウスにおける骨膜細胞・フィ
ブリン塊混和物挿入による骨形成試験）１. 試験方法骨膜細胞をフィブリノゲン溶液に混合し、これにトロン
ビンを作用させ、フィブリン塊を形成させた。これをヌ
−ドマウスの背部皮下に挿入し、骨形成を図った。対照
は骨膜細胞のみ、またはフィブリン塊のみを挿入したも
のとした。検体は試験開始後３、８、１２週間目に採取
し、検査は、肉眼観察、組織学的検査、レントゲン検
査、カルシウム含量測定を行なった。

【００１４】２. 試験結果 1)肉眼観察図３は挿入後１２週目の肉眼観察像である。フィブリン
塊のみを挿入した群は明らかに塊が分解され、その痕跡
のみが残り、骨形成は認められなかった（対照群）。並
行して行なった骨膜細胞のみを挿入した群は、痕跡さえ
も認められなかった。これらに対して骨膜細胞・フィブ
リン塊混和物挿入群は、図３に見られるように、分解す
ることなく明らかに背部皮下に存在し、骨形成が促され
ていた。

【００１５】2)組織学的検査図４に組織学的所見を示した。フィブリン塊のみを挿入
した群は観察期間を通じて無構造なフィブリン塊のみが
観察され、骨膜細胞の創生などはまったく観察されなか
った（対照）。さらに、骨膜細胞のみを挿入した群にお
いては、何ら組織学的変化は観察されなかった。これら
に対して、骨膜細胞・フィブリン塊混和物挿入部は、骨
膜細胞の増生が明らかに観察され、一部カルシウムの形
成とその沈着を伺わせる構造が観察された。

【００１６】3)レントゲン検査図５に挿入後３、８、１２週目の検体のレントゲンによ
る観察結果を示した。左が肉眼観察、右がレントゲン観
察である。フィブリン塊のみを挿入した群は、肉眼的に
フィブリン塊の痕跡が観察されたが、レントゲン観察で
はカルシウムと思われる沈殿物はほとんど観察されなか
った（対照群）。さらに、骨膜細胞のみを挿入した群は
痕跡すらも観察できず、当然レントゲン観察においても
何ら観察されるものではなかった。これらに対して、骨
膜細胞・フィブリン塊混和物挿入群においては、肉眼観
察においても白色のカルシウムと考えられる沈殿物が観
察され、さらに、レントゲン観察においても、カルシウ
ムと思われる沈殿物の明かな存在が確認された。このこ
とは、骨膜細胞・フィブリン塊混和物挿入が骨形成の初
期段階の役割を演じ得ることを示していると考えられ
る。

【００１７】4)カルシウム含量測定図６に検体挿入後の３、８、１２週目の各検体のカルシ
ウム含量を測定した結果を示した。カルシウム含量は日
本薬局方に記載の方法に従って決定した。即ち、骨膜細
胞含有フィブリン塊混合物及び骨膜細胞のみの両群の検
体を、湿重量１ｇを秤量し、これに８Ｎ水酸化カリウム
試液を加え、その後Ｎ,Ｎ指示薬を添加し、ＥＤＴＡ・
２Ｎaを加えて滴定した。フィブリン塊のみを挿入した
群は、上述のレントゲン検査で、カルシウムと思われる
沈着物がほとんど認められなかったことを裏付けるよう
に、痕跡程度のカルシウム量しか検出できなかった。さ
らに、骨膜細胞のみの挿入群はさらに低い値であった。
これらに対して、骨膜細胞・フィブリン塊混和物挿入群
は、２５０から３００ｍｇ／ｇと明らかに高い値を示し
骨形成が促進されたことを示した。

【００１８】試験例１（骨膜細胞を支持するフィブリン塊を形成する各成分の
濃度範囲を確認する試験）１. 試験方法実施例２の4)に記載のカルシウム含量試験が骨形成を最
も有力に反映した試験と考えられ得るので、この方法を
適用し、フィブリン塊のフィブリノゲン濃度、トロンビ
ン濃度、アプロチニン濃度、塩化カルシウム濃度の好的
な範囲を確認した。

【００１９】２. 試験結果フィブリン塊のフィブリノゲン含量の変化による骨形
成（カルシウム量）への影響：フィブリン塊の他の成分
の含量は、トロンビン：２５０単位、アプロチニン：１
０００ＫＩＥ、塩化カルシウム：４０ｍｇ／ｍｌに固定
し、挿入後８週目にサンプリングした。結果を表１に示
す。

【００２０】

【表１】

【００２１】フィブリン塊のトロンビン含量の変化に
よる骨形成（カルシウム量）への影響フィブリン塊の他
の成分の含量は、フィブリノゲン：８０ｍｇ、アプロチ
ニン：１０００ＫＩＥ、塩化カルシウム：４０ｍｇ／ｍ
ｌに固定し、挿入後８週目にサンプリングした。結果を
表２に示す。

【００２２】

【表２】フィブリン塊のアプロチニン含量の変化による骨形成
（カルシウム量）への影響：フィブリン塊の他の成分の
含量は、フィブリノゲン：８０ｍｇ、トロンビン：２５
０単位、塩化カルシウム：４０ｍｇ／ｍｌに固定し、挿
入後８週目にサンプリングした。結果を表３に示す。

【００２３】

【表３】

【００２４】フィブリン塊の塩化カルシウム含量の変
化による骨形成（カルシウム量）への影響：フィブリン
塊の他の成分の含量は、フィブリノゲン：８０ｍｇ、ト
ロンビン：２５０単位、アプロチニン：１０００ＫＩＥ
に固定し、挿入後８週目にサンプリングした。結果を表
４に示す。

【００２５】

【表４】上記の結果からフィブリン塊の構成成分の中で、使用に
適するフィブリノゲン量は５ｍｇ以上であること、トロ
ンビン量は２単位以上であることが判明した。なお、ア
プロチニン量とカルシウム量は臨界的な範囲は認められ
なかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】フィブリン塊中で培養した骨膜細胞の顕微鏡
観察を示す模式図である。培養後７日目の細胞の形態を
示し、左がフィブリン無添加の対照で右がフィブリン塊
中での骨膜細胞の形態である。

【図２】フィブリン塊中で培養した骨膜細胞のＤＮＡ
含量の経時変化を示す図である。図の横軸は培養期間、
縦軸はＤＮＡ含量を示す。

【図３】骨膜細胞の局所挿入後の肉眼観察像を示す図
である。左はフィブリン塊のみを挿入した対照群、右は
骨膜細胞・フィブリン塊混和物を挿入した試験群であ
る。

【図４】骨膜細胞の局所挿入後の組織学的所見を示す
図である。上図は、フィブリン塊のみを挿入した対照群
検体の左から各々挿入後３、８、１２週目のＨＥ染色図
である。下図は、骨膜細胞・フィブリン塊混和物を挿入
した試験群検体の左から各々挿入後３、８、１２週目の
ｓａｆ-Ｏ染色図である。

【図５】骨膜細胞の局所挿入後の検体のレントゲン観
察を示す図である。左側は、フィブリン塊のみを挿入し
た対照群検体の肉眼観察およびレントゲン観察を、右側
は、骨膜細胞・フィブリン塊混和物を挿入した試験群検
体の肉眼観察およびレントゲン観察を示す。

【図６】骨膜細胞の局所挿入後の検体のカルシウム含
量を示す図である。図の横軸は局所挿入後の経過時間、
縦軸はカルシウム含量（ｍｇ／ｇ乾燥重量）を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成９年４月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】フィブリン塊中で培養した骨膜細胞の形態を
示す顕微鏡写真（図面代用写真）である。培養後７日目
の細胞の形態を示し、左がフィブリン無添加の対照で右
がフィブリン塊中での骨膜細胞の形態である。

【図３】局所挿入後の骨膜細胞の形態（生物の形態）
を示す図面代用写真である。左はフィブリン塊のみを挿
入した対照群、右は骨膜細胞・フィブリン塊混和物を挿
入した試験群である。

【図４】局所挿入後の骨膜細胞の組織学的所見を示す
顕微鏡写真（図面代用写真）である。上はフィブリン塊
のみを挿入した対照群検体の、左から各々挿入後３、
８、１２週目のＨＥ染色図である。下は骨膜細胞・フィ
ブリン塊混和物を挿入した試験群検体の、左から各々挿
入後３、８、１２週目のｓａｆ−Ｏ染色図である。

【図５】局所挿入後の骨膜細胞の検体のレントゲン観
察を示すレントゲン写真（図面代用写真）である。左側
は、フィブリン塊のみを挿入した対照群検体の肉眼観察
およびレントゲン観察を、右側は、骨膜細胞・フィブリ
ン塊混和物を挿入した試験群検体の肉眼観察およびレン
トゲン観察を示す。

【図６】局所挿入後の骨膜細胞の検体のカルシウム含
量を示す図である。図の横軸は局所挿入後の経過時間、
縦軸はカルシウム含量（ｍｇ／ｇ乾燥重量）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】骨母細胞の増殖を促進し、該骨母細胞注
入による患部での骨形成に際しこれを促進する、フィブ
リンを主成分とする骨形成促進剤。
【請求項２】フィブリノゲンにトロンビンを作用させ
て形成されるフィブリンを用いる請求項１記載の骨形成
促進剤。
【請求項３】フィブリノゲンの濃度が５ｍｇ／ｍｌ以
上およびトロンビン濃度が２単位／ｍｌ以上である、請
求項２記載の骨形成促進剤。
【請求項４】付加的に血液凝固第XIII因子およびアプ
ロチニンを含有する請求項１から請求項３のいずれかに
記載の骨形成促進剤。
【請求項５】骨母細胞およびフィブリンの懸濁液より
構成される骨形成剤。
【請求項６】骨母細胞が骨膜細胞またはこれに由来す
る細胞である請求項５記載の骨形成剤。
【請求項７】フィブリノゲンにトロンビンを作用させ
て形成されるフィブリンを用いる請求項５記載の骨形成
剤。
【請求項８】フィブリノゲンの濃度が５ｍｇ／ｍｌ以
上およびトロンビン濃度が２単位／ｍｌ以上である、請
求項７記載の骨形成剤。
【請求項９】付加的に血液凝固第XIII因子およびアプ
ロチニンを含有する請求項５から請求項８のいずれかに
記載の骨形成剤。