JP2987207B2 - 血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用 - Google Patents
血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明の目的は、凝固性ヒト血漿蛋白質を含有する生
物接着剤を製造することである。本発明に従って得られ
る生物接着剤は、特に、血小板由来の成長因子を含有す
る。
物接着剤を製造することである。本発明に従って得られ
る生物接着剤は、特に、血小板由来の成長因子を含有す
る。
トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物又はフィブリノー
ゲン溶液が、特に止血作用を発揮しながら生組織の結合
を可能とする接着物質の製造中に用いられるということ
は知られている。例えば、仏国特許第2448900号明細書
に見ることができる。この接着物質は、一般に“生物接
着剤”と呼ばれており、手術で用いられている。
ゲン溶液が、特に止血作用を発揮しながら生組織の結合
を可能とする接着物質の製造中に用いられるということ
は知られている。例えば、仏国特許第2448900号明細書
に見ることができる。この接着物質は、一般に“生物接
着剤”と呼ばれており、手術で用いられている。
生物接着剤は、生理的条件下で凝固工程の最終段階を
再現することを可能とする。そのために、フィブリノー
ゲン及び第XIII因子を含んだ溶液を、使用の直前に、処
置する生組織上で、トロンビン及びカルシウムイオンを
含んだ溶液と混合する。トロンビン及びカルシウムイオ
ンの存在下で、フィブリノーゲンはフィブリンに転化す
る。フィブリンモノマーは相互に結合し、フィブリンポ
リマーを形成し、これらのポリマーは活性化された第XI
II因子の作用によって架橋結合される。カルシウムイオ
ンの存在下でトロンビンの作用により活性化された第XI
II因子は、トランスアミダーゼであり、ネットワークの
形成を伴ったフィブリン鎖間のペプチド結合を形成す
る。
再現することを可能とする。そのために、フィブリノー
ゲン及び第XIII因子を含んだ溶液を、使用の直前に、処
置する生組織上で、トロンビン及びカルシウムイオンを
含んだ溶液と混合する。トロンビン及びカルシウムイオ
ンの存在下で、フィブリノーゲンはフィブリンに転化す
る。フィブリンモノマーは相互に結合し、フィブリンポ
リマーを形成し、これらのポリマーは活性化された第XI
II因子の作用によって架橋結合される。カルシウムイオ
ンの存在下でトロンビンの作用により活性化された第XI
II因子は、トランスアミダーゼであり、ネットワークの
形成を伴ったフィブリン鎖間のペプチド結合を形成す
る。
本明細書において、“生物接着剤”なる語は、トロン
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物（高濃度物:concentrate）
を意味する。だが、実際、正確にはそのような濃縮物が
接着剤を構成するのは、トロンビンとカルシウム塩の存
在下（又は、それが含有するプロトロンビンの活性化の
後）のみである。
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物（高濃度物:concentrate）
を意味する。だが、実際、正確にはそのような濃縮物が
接着剤を構成するのは、トロンビンとカルシウム塩の存
在下（又は、それが含有するプロトロンビンの活性化の
後）のみである。
フィブリンネットワークの形成が、生物接着剤の止血
活性を引き起こす。更に、フィブリンは、特にフィブロ
ネクチン及びコラーゲンを通して周辺組織に接着する。
加えて、活性化第XIII因子は、フィブリン及びフィブロ
ネクチン間にペプチド結合を形成し、これによって接着
性を補強する。
活性を引き起こす。更に、フィブリンは、特にフィブロ
ネクチン及びコラーゲンを通して周辺組織に接着する。
加えて、活性化第XIII因子は、フィブリン及びフィブロ
ネクチン間にペプチド結合を形成し、これによって接着
性を補強する。
インビボでは、プラスミンと呼ばれる蛋白分解酵素の
作用でフィブリンクロットが徐々に消失し、このことに
よって接着結合の接続が制限されることが知られてい
る。しかしながら、例えばα−２−アンチプラスミン又
はアプチニン等のプロテアーゼインヒビター、さもなけ
ればε−アミノカプロン酸をそれらに加えることによっ
て生物接着剤の作用の持続を増強することは可能であ
る。
作用でフィブリンクロットが徐々に消失し、このことに
よって接着結合の接続が制限されることが知られてい
る。しかしながら、例えばα−２−アンチプラスミン又
はアプチニン等のプロテアーゼインヒビター、さもなけ
ればε−アミノカプロン酸をそれらに加えることによっ
て生物接着剤の作用の持続を増強することは可能であ
る。
生物接着剤の適用は非常に多く、特に手術において
は、出血を避けるため、縫合糸の代わりに、又は、縫合
を補強するために適用できる。
は、出血を避けるため、縫合糸の代わりに、又は、縫合
を補強するために適用できる。
しかしながら、従来の生物接着剤は瘢痕形成を促進す
ることができる特異活性を有していない。
ることができる特異活性を有していない。
瘢痕形成が、創傷に存在するターゲット細胞に直接作
用するある種の成長因子によって、特に促進されるとい
うことが知られている。これらの成長因子は、増殖や分
化、更には細胞遊走（走化性）さえを引き起こす。血小
板は、血液中の成長因子の主要な供給源の一つである。
用するある種の成長因子によって、特に促進されるとい
うことが知られている。これらの成長因子は、増殖や分
化、更には細胞遊走（走化性）さえを引き起こす。血小
板は、血液中の成長因子の主要な供給源の一つである。
インビボでは、細胞の損傷中、血小板アクチベーター
の作用でトロンビンを含む血小板は顆粒中に包含された
成長因子を放出する。活性化血小板の上清は、非常に多
様な分子、例えば、血小板由来成長因子（PDGF）、トラ
ンスフォーミング成長因子−β、塩基性線維芽細胞成長
因子、血小板因子−４、血小板由来血管内皮細胞増殖因
子、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、インシュリン様
成長因子−１、結合組織活性化ペプチドIII、β−トロ
ンボグロブリン、上皮細胞成長因子、プラスミノーゲ
ン、フォンフウィルブランド因子、フィブリノーゲン、
セロトニン、ヒスタミン、アデノシン、ジ−又はトリ−
ホスフェート、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血
小板第XIII因子、蛋白分解性又は解糖系酵素、アラキド
ン酸の代謝産物等を含む。特に、H.L.Wong ＆ S.M.Wahl
“ペプチド成長因子及びそれらのレセプター"Sporn ＆
Roberts編,Springer−Verlag.Berlin,p.510;R.A.Terkel
taub ＆ M.H.Ginsberg“創傷修復の分子及び細胞生物Cl
ark ＆ Henson編,Plenum Press,New York,p.38に見るこ
とができる。
の作用でトロンビンを含む血小板は顆粒中に包含された
成長因子を放出する。活性化血小板の上清は、非常に多
様な分子、例えば、血小板由来成長因子（PDGF）、トラ
ンスフォーミング成長因子−β、塩基性線維芽細胞成長
因子、血小板因子−４、血小板由来血管内皮細胞増殖因
子、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、インシュリン様
成長因子−１、結合組織活性化ペプチドIII、β−トロ
ンボグロブリン、上皮細胞成長因子、プラスミノーゲ
ン、フォンフウィルブランド因子、フィブリノーゲン、
セロトニン、ヒスタミン、アデノシン、ジ−又はトリ−
ホスフェート、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血
小板第XIII因子、蛋白分解性又は解糖系酵素、アラキド
ン酸の代謝産物等を含む。特に、H.L.Wong ＆ S.M.Wahl
“ペプチド成長因子及びそれらのレセプター"Sporn ＆
Roberts編,Springer−Verlag.Berlin,p.510;R.A.Terkel
taub ＆ M.H.Ginsberg“創傷修復の分子及び細胞生物Cl
ark ＆ Henson編,Plenum Press,New York,p.38に見るこ
とができる。
血小板抽出液は、高い分裂誘発活性を含んでおり、又
その瘢痕形成能が知られている。特に、D.Knighton et
al.,Ann.Surg.,196,379−388（1982）;D.M Carter et a
l.,“創傷治癒における成長因子及びその他の特徴",Bar
bul.Pines,Cadwell Hunt編,Alan R.Liss Inc.,New York
1988,p.303−317;米国特許第4760131号明細書、及びPCT
特許出願 WO 86/03122、WO 88/03409、WO 89/05656
に見ることができる。
その瘢痕形成能が知られている。特に、D.Knighton et
al.,Ann.Surg.,196,379−388（1982）;D.M Carter et a
l.,“創傷治癒における成長因子及びその他の特徴",Bar
bul.Pines,Cadwell Hunt編,Alan R.Liss Inc.,New York
1988,p.303−317;米国特許第4760131号明細書、及びPCT
特許出願 WO 86/03122、WO 88/03409、WO 89/05656
に見ることができる。
今、トロンビン−凝固性蛋白質及び血小板因子を互い
に合わせることを可能とする方法により、特に瘢痕形成
を促進する改善された生物接着剤を得ることができるこ
とを見いだした。
に合わせることを可能とする方法により、特に瘢痕形成
を促進する改善された生物接着剤を得ることができるこ
とを見いだした。
トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物の調製方法は知ら
れている。原料の血漿、即ち血液から血液細胞を除いた
ものからなる。言い換えれば、それは血小板が激減され
た製造物である。その方法は、エタノールで（Cohn法）
又は寒冷沈降物の製造によってフィブリノーゲンを沈降
させることを必須の工程として含む。寒冷沈降物の調製
は、血漿を凍結し、次いで０℃を越えた６℃未満の温
度、一般には１℃〜４℃で融解することからなる。特に
フィブリノーゲン及びフィブロネクチンを含有する残存
の固形画分は寒冷沈降物と呼ばれ、遠心分離により液画
分から分離できる。寒冷沈降物の容量は、一般に開始原
料の血漿の容量の1/25〜1/100である。それ故、寒冷沈
降物製造の条件下で不溶性の血漿蛋白質は、寒冷沈降操
作により25〜100倍に濃縮される。しかし、このように
して得られた調製物は、成長因子は少ない。特に、公知
の工業的方法によって調製された生物接着剤は、注目す
べき分裂促進活性は含有していない。
れている。原料の血漿、即ち血液から血液細胞を除いた
ものからなる。言い換えれば、それは血小板が激減され
た製造物である。その方法は、エタノールで（Cohn法）
又は寒冷沈降物の製造によってフィブリノーゲンを沈降
させることを必須の工程として含む。寒冷沈降物の調製
は、血漿を凍結し、次いで０℃を越えた６℃未満の温
度、一般には１℃〜４℃で融解することからなる。特に
フィブリノーゲン及びフィブロネクチンを含有する残存
の固形画分は寒冷沈降物と呼ばれ、遠心分離により液画
分から分離できる。寒冷沈降物の容量は、一般に開始原
料の血漿の容量の1/25〜1/100である。それ故、寒冷沈
降物製造の条件下で不溶性の血漿蛋白質は、寒冷沈降操
作により25〜100倍に濃縮される。しかし、このように
して得られた調製物は、成長因子は少ない。特に、公知
の工業的方法によって調製された生物接着剤は、注目す
べき分裂促進活性は含有していない。
今、得られる液画分と寒冷沈降物の間に血小板因子の
一様な分布が通常期待されるようなときに、開始原料製
造物として血小板に富む血漿を用いることにより、寒冷
沈降物製造の条件下で通常可溶性である多くの血小板因
子が、該寒冷沈降物中に非常に高い比率で保持されるよ
うになることが見いだされた。
一様な分布が通常期待されるようなときに、開始原料製
造物として血小板に富む血漿を用いることにより、寒冷
沈降物製造の条件下で通常可溶性である多くの血小板因
子が、該寒冷沈降物中に非常に高い比率で保持されるよ
うになることが見いだされた。
本発明の方法は、二つの分離した調製を行う必要な
く、トロンビン−凝固性蛋白質濃縮物の止血及び接着特
性、及び血小板抽出液の瘢痕形成活性を合わせ持った製
造物を得ることを可能にした。
く、トロンビン−凝固性蛋白質濃縮物の止血及び接着特
性、及び血小板抽出液の瘢痕形成活性を合わせ持った製
造物を得ることを可能にした。
このように、本発明の方法によって、寒冷沈降物中の
PDGFの濃度比は一般に10より大きい。PDGFの収率は、一
般に、開始原料血漿中に存在する106血小板当たり20ng
より大きい。
PDGFの濃度比は一般に10より大きい。PDGFの収率は、一
般に、開始原料血漿中に存在する106血小板当たり20ng
より大きい。
それ故、本発明の主体は、少なくとも一つの血小板由
来成長因子を含むことによって特徴づけられる。トロン
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物を含有する生物接着剤であ
る。
来成長因子を含むことによって特徴づけられる。トロン
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物を含有する生物接着剤であ
る。
前記成長因子は、特にPDGFである。
本発明に従って得られる生物接着剤は、一般に少なく
とも20ng/ml、多くの場合は少なくとも50ng/mlのPDGFを
含有する。一般に，前記生物接着剤は20〜600ng/mlのPD
GFを含有する。
とも20ng/ml、多くの場合は少なくとも50ng/mlのPDGFを
含有する。一般に，前記生物接着剤は20〜600ng/mlのPD
GFを含有する。
本発明による生物接着剤は、血小板抽出液中に通常存
在する他の製造物、特にβ−トロンボグロブリン、タイ
プ１プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PA
I−１）、血小板第XIII因子（第XIII因子−Ａ）を含ん
でもよい。例えば、少なくとも10μg/ml、特に10〜300
μg/mlのβ−トロンボグロブリン、少なくとも１μg/m
l、特に５〜40μg/mlのPAI−１を含む。第XIII因子−Ｓ
に対する第XIII因子−Ａの比は、通常血漿中のこれらの
因子の比の少なくとも1.2倍、特に1.2〜４倍である。
在する他の製造物、特にβ−トロンボグロブリン、タイ
プ１プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PA
I−１）、血小板第XIII因子（第XIII因子−Ａ）を含ん
でもよい。例えば、少なくとも10μg/ml、特に10〜300
μg/mlのβ−トロンボグロブリン、少なくとも１μg/m
l、特に５〜40μg/mlのPAI−１を含む。第XIII因子−Ｓ
に対する第XIII因子−Ａの比は、通常血漿中のこれらの
因子の比の少なくとも1.2倍、特に1.2〜４倍である。
本発明の生物接着剤は、例えば、 蛋白質 :60〜200g/l フィブリノーゲン :30〜150g/l、特に50〜100g/l フィブロネクチン :6〜14g/l、特に８〜12g/l 第XIII因子 :10〜60 血漿等価単位 アルブミン :10〜38g/l、特に18〜30g/l を含む。
血漿等価単位とは、プールした血漿中に存在する第XI
II因子の通常の血漿濃度に相当する。
II因子の通常の血漿濃度に相当する。
蛋白質濃度は、ビウレット法によって決定される。フ
ィブリノーゲンの濃度は重量法によって、フィブロネク
チン及びPAI−１の濃度は仕様書に従いELISA試験（Stag
o）によって、第XIII因子活性は仕様書に従いペプチド
基質（ベリクロム Ｆ XIII 試薬、ベーリング社）中
のグリシンエチルエステルの取り込みによって起こるア
ンモニア放出試験によって、第XIII因子−Ａ及び第XIII
因子−Ｓは特異的な抗血清（Stago）を用いたラウレル
法によって決定される。アルブミンの濃度は、仕様書に
従ってセルロースアセテート（Sebia）上で電気泳動す
ることにより決定される。アルブミンを示す泳動バンド
の蛋白質量は、デンシトメーター分析により決定され
る。
ィブリノーゲンの濃度は重量法によって、フィブロネク
チン及びPAI−１の濃度は仕様書に従いELISA試験（Stag
o）によって、第XIII因子活性は仕様書に従いペプチド
基質（ベリクロム Ｆ XIII 試薬、ベーリング社）中
のグリシンエチルエステルの取り込みによって起こるア
ンモニア放出試験によって、第XIII因子−Ａ及び第XIII
因子−Ｓは特異的な抗血清（Stago）を用いたラウレル
法によって決定される。アルブミンの濃度は、仕様書に
従ってセルロースアセテート（Sebia）上で電気泳動す
ることにより決定される。アルブミンを示す泳動バンド
の蛋白質量は、デンシトメーター分析により決定され
る。
本発明の生物接着剤は、血液凝固の内因経路又は外因
経路を活性化することによって凝固特性を与えるのに十
分な量を凝固性因子を含む。生物接着剤は、例えば、プ
ロトロンビンの通常の血漿濃度の0.5〜1.5倍のプロトロ
ンビンを含む。これは仕様書に従って、特異的抗血清
（Stago）を用いたラウレル法又は時間測定法（Stago欠
損II、Stago）によって決定した。
経路を活性化することによって凝固特性を与えるのに十
分な量を凝固性因子を含む。生物接着剤は、例えば、プ
ロトロンビンの通常の血漿濃度の0.5〜1.5倍のプロトロ
ンビンを含む。これは仕様書に従って、特異的抗血清
（Stago）を用いたラウレル法又は時間測定法（Stago欠
損II、Stago）によって決定した。
生理緩衝液で1/2に希釈した上記生物接着剤溶液は、1
/2〜1/6に希釈した通常血漿のそれと同等のクイックタ
イムを有している。ここでいうクイックタイムとは、血
液凝固の外因経路を活性化する能力を調べるものであ
る。それは、仕様書に従いトロンボプラスチンを含む、
“ネオプラスチン”（商標、Stago）試薬を用いて決定
される。
/2〜1/6に希釈した通常血漿のそれと同等のクイックタ
イムを有している。ここでいうクイックタイムとは、血
液凝固の外因経路を活性化する能力を調べるものであ
る。それは、仕様書に従いトロンボプラスチンを含む、
“ネオプラスチン”（商標、Stago）試薬を用いて決定
される。
生理緩衝液で1/2に希釈した上記生物接着剤溶液は、
1:1〜1:4に希釈した通常血漿のそれと同等のカオリンタ
イムを有している。カオリンタイムとは、血液凝固の内
因経路を活性化する能力を調べるものである。それは、
試験中にセファリンを省略した以外は仕様書に従いC.K.
PREST試薬（Stago）を用いて決定される。
1:1〜1:4に希釈した通常血漿のそれと同等のカオリンタ
イムを有している。カオリンタイムとは、血液凝固の内
因経路を活性化する能力を調べるものである。それは、
試験中にセファリンを省略した以外は仕様書に従いC.K.
PREST試薬（Stago）を用いて決定される。
本発明の生物接着剤は、常法によって示すことができ
る分裂誘発特性を与えるのに十分な量の血小板因子を含
有する。
る分裂誘発特性を与えるのに十分な量の血小板因子を含
有する。
本発明の生物接着剤の分裂誘発活性は、例えば、1/40
00に希釈したものが（一般には、1/5000に希釈した場合
でも）、定常期へと刺激された3T3細胞によるトリチウ
ムラベルチミジンの取り込み測定試験において、0.1ng/
mlのPDGFを含んだ溶液のそれと少なくとも同等の分裂誘
発活性を有するようなものである。
00に希釈したものが（一般には、1/5000に希釈した場合
でも）、定常期へと刺激された3T3細胞によるトリチウ
ムラベルチミジンの取り込み測定試験において、0.1ng/
mlのPDGFを含んだ溶液のそれと少なくとも同等の分裂誘
発活性を有するようなものである。
このような試薬は、例えば、HART C.E.et al.,Bioche
mistry vol.29,166−172（1990）に記載されている。
mistry vol.29,166−172（1990）に記載されている。
3T3細胞は、Swiss マウス 胚芽細胞である（細胞株
ATCC CCL 92）。サブクローニングによって得られ
た細胞株もまた入手できる（NIH/3T3、ATCC CRL 165
8）。
ATCC CCL 92）。サブクローニングによって得られ
た細胞株もまた入手できる（NIH/3T3、ATCC CRL 165
8）。
本発明の生物接着剤は、血小板に富む血漿由来の寒冷
沈殿物を含むことが必須でありうる。そして本発明は、
血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることによ
って特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し
回収するところの生物接着剤の調製方法に関するもので
ある。
沈殿物を含むことが必須でありうる。そして本発明は、
血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることによ
って特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し
回収するところの生物接着剤の調製方法に関するもので
ある。
言い換えれば、本発明の方法は、寒冷沈殿物を調製す
る前に血小板に富む血漿を調製することによって特徴づ
けられる。血漿における血小板の濃縮操作は、常法に従
って、特に、集めた血液の遠心によって行える。
る前に血小板に富む血漿を調製することによって特徴づ
けられる。血漿における血小板の濃縮操作は、常法に従
って、特に、集めた血液の遠心によって行える。
血小板に富む血漿はまた、1ml当たり少なくとも５×1
07の血小板、特に1ml当たり１×108〜１×109の血小
板、例えば1l当たり約１×108〜５×108の血小板を含
む。
07の血小板、特に1ml当たり１×108〜１×109の血小
板、例えば1l当たり約１×108〜５×108の血小板を含
む。
寒冷沈殿物の製造条件は通常の条件である。例えば、
凍結は−15℃以下の温度、例えば−15〜−60℃で行う。
製造物は、少なくとも製造物全てが熱平衡になるのに十
分な時間この温度に維持される。この時間は、例えばお
よそ12〜72時間になる。
凍結は−15℃以下の温度、例えば−15〜−60℃で行う。
製造物は、少なくとも製造物全てが熱平衡になるのに十
分な時間この温度に維持される。この時間は、例えばお
よそ12〜72時間になる。
次いで、血漿を,0℃を超えるが全凍結製造物が液化す
る温度未満の温度で融解する。この工程は、一般に１〜
６℃、特に４℃近辺で行われる。融解温度で温置する期
間は、熱平衡に到達するのに十分な時間であり、例え
ば、12〜24時間である。
る温度未満の温度で融解する。この工程は、一般に１〜
６℃、特に４℃近辺で行われる。融解温度で温置する期
間は、熱平衡に到達するのに十分な時間であり、例え
ば、12〜24時間である。
その後、寒冷沈殿物を液画分から分離する。そのため
に、融解血漿を、再凍結しないのに十分高い温度で、か
つ寒冷沈殿物の液化を防ぐのに十分低い温度で遠心し、
次いで、上清を公知の方法で除く。そして遠心沈殿物を
構成する寒冷沈殿物を回収する。寒冷沈殿物の容量は、
一般に、開始原料血漿容量の1/25〜1/100となる。
に、融解血漿を、再凍結しないのに十分高い温度で、か
つ寒冷沈殿物の液化を防ぐのに十分低い温度で遠心し、
次いで、上清を公知の方法で除く。そして遠心沈殿物を
構成する寒冷沈殿物を回収する。寒冷沈殿物の容量は、
一般に、開始原料血漿容量の1/25〜1/100となる。
一般に、遠心は１〜６℃の間の温度で行う。
得られた寒冷沈殿物から成る上記生物接着剤をすぐに
使用することを望まない場合は、例えば−20℃で、それ
を再凍結することができる。
使用することを望まない場合は、例えば−20℃で、それ
を再凍結することができる。
上記生物接着剤をすぐに使用する予定の場合は、それ
を十分な温度、通常は32〜38℃で加熱し液化するのが好
ましい。
を十分な温度、通常は32〜38℃で加熱し液化するのが好
ましい。
本発明による血小板因子に富む生物接着剤の製造方法
の簡便さは、この方法を、自己生物接着剤、すなわちあ
るドナー由来の血漿から得てこのドナーに用いる生物接
着剤の製造に適用することを可能とする、この方法の利
点の一つは、血漿における血小板の濃縮を含む全ての操
作を、トナーから血液を集めるために用いるバッグシス
テム中で行えるということである。
の簡便さは、この方法を、自己生物接着剤、すなわちあ
るドナー由来の血漿から得てこのドナーに用いる生物接
着剤の製造に適用することを可能とする、この方法の利
点の一つは、血漿における血小板の濃縮を含む全ての操
作を、トナーから血液を集めるために用いるバッグシス
テム中で行えるということである。
もちろん、上記の生物接着剤は、種々の同定されたド
ナー由来の血漿から調製することができる。
ナー由来の血漿から調製することができる。
本発明の方法の開始原料製造物は、血小板に富む血漿
である。このような血小板に富む血漿の調製は、それ自
体公知である。例えば、それは以下の方法によって製造
することがてきる。献血中に集めたトリプルバッグシス
テム（例えば、マコ−ファーマ）中の全血を、ジョウア
ン（Jouan）K110遠心機で４分間、3000×ｇで遠心す
る、血小板に富んだ上清血漿をトリプルバッグシステム
のトランスファーバッグ３に、血漿抽出機を用いて注入
する。前記バッグ３は、チューブをシールすることによ
り残りのシステムから分離される。このバッグをトロン
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物の本発明の製造のために用
いることができる。
である。このような血小板に富む血漿の調製は、それ自
体公知である。例えば、それは以下の方法によって製造
することがてきる。献血中に集めたトリプルバッグシス
テム（例えば、マコ−ファーマ）中の全血を、ジョウア
ン（Jouan）K110遠心機で４分間、3000×ｇで遠心す
る、血小板に富んだ上清血漿をトリプルバッグシステム
のトランスファーバッグ３に、血漿抽出機を用いて注入
する。前記バッグ３は、チューブをシールすることによ
り残りのシステムから分離される。このバッグをトロン
ビン−凝固性蛋白質の濃縮物の本発明の製造のために用
いることができる。
本発明の主体はまた、上記方法によって得ることがで
きる生物接着剤を用いることである。
きる生物接着剤を用いることである。
この使用は、それ自体公知の方法に従って行える。こ
の使用の原則は、フィブリノーゲンの転化によりフィブ
リンの形成を起こすことからなる。この転化は、トロン
ビンの作用によって達成される。トロンビンは、それ自
体公知の方法に従って、外部より加えたトロンビンであ
ってもよい。そのために、上記のようにして得た生物接
着剤をトロンビン及びカルシウムイオンを含有する水性
溶液と混合して、フィブリノーゲンをフィブリンに転化
させることによって凝固反応を開始する。
の使用の原則は、フィブリノーゲンの転化によりフィブ
リンの形成を起こすことからなる。この転化は、トロン
ビンの作用によって達成される。トロンビンは、それ自
体公知の方法に従って、外部より加えたトロンビンであ
ってもよい。そのために、上記のようにして得た生物接
着剤をトロンビン及びカルシウムイオンを含有する水性
溶液と混合して、フィブリノーゲンをフィブリンに転化
させることによって凝固反応を開始する。
特に、0.5〜500NIH U/mlのトロンビン及び例えば５
〜100mM、特に20〜60mMの濃度の（特に、塩化カルシウ
ムの形で）カルシウムイオンを含有する水性溶液を用い
ることができる。
〜100mM、特に20〜60mMの濃度の（特に、塩化カルシウ
ムの形で）カルシウムイオンを含有する水性溶液を用い
ることができる。
トロンビン溶液との混合は、その部位、即ち処置され
る組織上で行うのが好ましい。
る組織上で行うのが好ましい。
一般に、液化した寒冷沈殿物及びトロンビン水性溶液
は5:1〜1:2の容量比で混合する。
は5:1〜1:2の容量比で混合する。
所望により、プラスミン阻害剤又は類似物（例えば、
α−２−アンチプラスミン、アプロチニン、ε−アミノ
カプロン酸又はトラネキサム酸）を最終的な接着剤、又
はそれらを混合する前の成分の一つに加えてもよい。
α−２−アンチプラスミン、アプロチニン、ε−アミノ
カプロン酸又はトラネキサム酸）を最終的な接着剤、又
はそれらを混合する前の成分の一つに加えてもよい。
本発明の生物接着剤にプロトロンビン及び他の凝固性
因子を存在させることも好ましく、そして凝固の内因経
路又は外因経路を活性化することができる。
因子を存在させることも好ましく、そして凝固の内因経
路又は外因経路を活性化することができる。
それ故、本発明の主体は、特に上記のようにして得ら
れる生物接着剤の使用であり、この使用は、内在のプロ
トロンビンの活性化を助ける少なくとも一つの薬剤を該
生物接着剤に添加することによって特徴づけられる。凝
固の現象はまた、好ましくは37℃に近い温度で上記工程
を行うことによって開始する。
れる生物接着剤の使用であり、この使用は、内在のプロ
トロンビンの活性化を助ける少なくとも一つの薬剤を該
生物接着剤に添加することによって特徴づけられる。凝
固の現象はまた、好ましくは37℃に近い温度で上記工程
を行うことによって開始する。
そのためには（例えば５〜100mM、特に20〜60mMの）
カルシウムイオンを含んだ水性溶液を単に上記生物接着
剤に添加すればよい。
カルシウムイオンを含んだ水性溶液を単に上記生物接着
剤に添加すればよい。
この凝固を加速することを望む場合は、上記工程を以
下に示す様にして、活性化剤を用いて行うこともでき
る。
下に示す様にして、活性化剤を用いて行うこともでき
る。
内因経路の活性化のためには、生物接着剤を（例えば
５〜100mM、特に20〜60mMの）カルシウムイオンを含む
水性溶液と混合し、それを凝固第XII因子の少なくとも
一つの公知を活性化剤、更に一般的には生物接着剤に不
溶性で負の荷電を持った固体表面又は化合物（例えばパ
ウダー形状）、例えば、シリケート、（特にカオリ
ン）、シリカ、シリカガラス、例えばサンゴ骨格から得
られるアラゴナイト等のカルシウムカーボネートの結
晶、トリカルシウムジシトレートの結晶等と接触させる
ことができる。単純な繰り返し実験により決定されうる
十分の時間後に、上記生物接着剤を上記不溶性化合物か
ら濾過により分離する。例えば、上記工程はフィルター
を備えたカラムで行うことができる。
５〜100mM、特に20〜60mMの）カルシウムイオンを含む
水性溶液と混合し、それを凝固第XII因子の少なくとも
一つの公知を活性化剤、更に一般的には生物接着剤に不
溶性で負の荷電を持った固体表面又は化合物（例えばパ
ウダー形状）、例えば、シリケート、（特にカオリ
ン）、シリカ、シリカガラス、例えばサンゴ骨格から得
られるアラゴナイト等のカルシウムカーボネートの結
晶、トリカルシウムジシトレートの結晶等と接触させる
ことができる。単純な繰り返し実験により決定されうる
十分の時間後に、上記生物接着剤を上記不溶性化合物か
ら濾過により分離する。例えば、上記工程はフィルター
を備えたカラムで行うことができる。
凝固の外因経路の活性化のためには、生物接着剤を
（５〜100mM、特に20〜60mMの）カルシウムイオンを含
む水性溶液、及び組織トロンボプラスチン（例えば動物
由来のもの）又は遺伝子工学によって製造したトロンボ
プラスチンと混合する。
（５〜100mM、特に20〜60mMの）カルシウムイオンを含
む水性溶液、及び組織トロンボプラスチン（例えば動物
由来のもの）又は遺伝子工学によって製造したトロンボ
プラスチンと混合する。
それ故、本発明によって得られる生物接着剤の重要な
利点の一つは、それが外部よりのトロンビンの添加なし
に接着剤の凝固を開始するのに十分な量のプロトロンビ
ンを含有し、それによって不慮の汚染のリスクが減少す
ると言うことである。それ故、本発明の方法は特に自己
製造物の使用という現在の要求に適応できるものであ
る。
利点の一つは、それが外部よりのトロンビンの添加なし
に接着剤の凝固を開始するのに十分な量のプロトロンビ
ンを含有し、それによって不慮の汚染のリスクが減少す
ると言うことである。それ故、本発明の方法は特に自己
製造物の使用という現在の要求に適応できるものであ
る。
本発明の生物接着剤は、特に外傷性又は外科手術の創
傷の処置、移植片（特に皮膚又は骨の移植片等）の適合
及び保持に用いることができる。本発明の生物接着剤は
また、人工移植部材、例えば、人工骨、骨接合部材及義
歯の固定、骨充填物質、特にカルシウムカーボネートを
ベースとした吸収性充填物質（例えば、サンゴ骨格又は
ピンクタダ−マルガリチヘラ貝（Pinctada margaritife
ra shell）をベースとしたもの）、ヒドロキシアパタイ
ト又はポリ乳酸等の生分解性ポリマーの固定及び保持に
用いることもできる。
傷の処置、移植片（特に皮膚又は骨の移植片等）の適合
及び保持に用いることができる。本発明の生物接着剤は
また、人工移植部材、例えば、人工骨、骨接合部材及義
歯の固定、骨充填物質、特にカルシウムカーボネートを
ベースとした吸収性充填物質（例えば、サンゴ骨格又は
ピンクタダ−マルガリチヘラ貝（Pinctada margaritife
ra shell）をベースとしたもの）、ヒドロキシアパタイ
ト又はポリ乳酸等の生分解性ポリマーの固定及び保持に
用いることもできる。
実施例１ 血小板濃縮ヒト血漿を上記のようにして調製した。
このようにして得た濃縮血漿は1ml当たり154×106の
血小板を含んでいる。
血小板を含んでいる。
前記血小板濃縮血漿230mlの入ったトランスファーバ
ッグを冷却チャンバー中にて、−40℃で72時間置いた。
次いで、その血漿の入ったバッグを冷蔵庫中にて、４℃
で20時間置いた。その後、そのバッグをやはり４℃の温
度で、１分当たり3,000回転で20分間遠心した。遠心
後、バッグを水平にし、採取管をはめ、上清をアスピレ
ーションで吸引した。
ッグを冷却チャンバー中にて、−40℃で72時間置いた。
次いで、その血漿の入ったバッグを冷蔵庫中にて、４℃
で20時間置いた。その後、そのバッグをやはり４℃の温
度で、１分当たり3,000回転で20分間遠心した。遠心
後、バッグを水平にし、採取管をはめ、上清をアスピレ
ーションで吸引した。
バッグに入っている固形残留物は、寒冷沈殿物であ
り、使用するまで−20℃の温度にて再凍結して保存でき
る。
り、使用するまで−20℃の温度にて再凍結して保存でき
る。
寒冷沈殿物をすぐに使用する場合は、バッグを水浴
中、例えば37℃に置く。15分間温置後、残った溶液を回
収する。容量は約3mlであった。
中、例えば37℃に置く。15分間温置後、残った溶液を回
収する。容量は約3mlであった。
得られた製造物を分析した。結果を下記表１に示す。
実施例２ 実施例１と同様の方法により操作を行った。処理した
血漿の容量は250mlであった。血漿は、最初は1ml当たり
256×106の血小板を含んでいた。寒冷沈殿物の液化によ
り回収された最終溶液の容量は5mlであった。
血漿の容量は250mlであった。血漿は、最初は1ml当たり
256×106の血小板を含んでいた。寒冷沈殿物の液化によ
り回収された最終溶液の容量は5mlであった。
分析結果を表１に示す。
融解した血漿の遠心後に得られた遠心上清のPDGFの濃
度は、たった5.9ng/mlであった。
度は、たった5.9ng/mlであった。
表１の結果と比較することにより、実質的に全てのPD
GFが寒冷沈殿物中にあるということが分かる。
GFが寒冷沈殿物中にあるということが分かる。
（１）ブラッドフォード法（バイオラッド社製の試薬
照会番号500−0006）によって決定した。
照会番号500−0006）によって決定した。
（２）PDGF:血小板由来成長因子はELISA試験によって測
定した。
定した。
（３）ELISA試験によって測定した（Stago,France、照
会番号0419）。
会番号0419）。
（４）液化した寒冷沈殿物の一容量を500NIH Ｕのトロ
ンビン及び50mMの塩化カルシウムを含む溶液の一容量と
混合することによって決定した。
ンビン及び50mMの塩化カルシウムを含む溶液の一容量と
混合することによって決定した。
（５）比活性は以下の方法により決定した。対照におい
て得られた放射能は2000cpmであった。実施例１では、4
000cpmで、蛋白濃度が0.0096mg/mlであった。比較とし
て、同じ方法により測定したチスコル（Tissucol;IMMUN
O社によって販売されている生物接着剤の商標名）の比
活性は0.22であった。
て得られた放射能は2000cpmであった。実施例１では、4
000cpmで、蛋白濃度が0.0096mg/mlであった。比較とし
て、同じ方法により測定したチスコル（Tissucol;IMMUN
O社によって販売されている生物接着剤の商標名）の比
活性は0.22であった。
分裂促進活性の測定方法は以下の通りである。
線維芽細胞を６月齢の乳児の包皮から分離した、 細胞を10％の牛胎児血清を含むDMEM培地（Gibco社）
に懸濁した。96ウェルのマイクロタイタープレートの各
ウェルに、1ml当たり40,000細胞を含んだ懸濁液200μｌ
を播種した。５％のCO2を含む雰囲気下、37℃で３日間
培養後、培地を８％新生児牛血清を含むDMEM培地（Gibc
o社）と交換した。
に懸濁した。96ウェルのマイクロタイタープレートの各
ウェルに、1ml当たり40,000細胞を含んだ懸濁液200μｌ
を播種した。５％のCO2を含む雰囲気下、37℃で３日間
培養後、培地を８％新生児牛血清を含むDMEM培地（Gibc
o社）と交換した。
更に３日間培養後、50μｌのトロンビン−凝固性蛋白
質溶液（試料）を加えた。各試料を、種々の希釈率でDM
EM中に希釈し、３回試験した。対照ウェルにはDMEM50μ
ｌを播種した。そのマイクロプレートを前記と同じ条件
で24時間培養した。培養終了の６時間前に、10μCi/ml
のトリチウムチミジン溶液を50μｌを各ウェルに加え
た。培養後、ウェルを生理溶液で洗浄した。その後、エ
チレンジアミンテトラアセテート存在下で0.25％のトリ
プシン溶液（Gibco社の溶液）を用いて、細胞をウェル
から剥がした。“スカトロン（Skatron）”タイプ細胞
回収装置を用いて、細胞をフィルター上に集めた。次い
で、そのフィルターを乾燥し、シンチレーション液の存
在下で放射能を測定した。
質溶液（試料）を加えた。各試料を、種々の希釈率でDM
EM中に希釈し、３回試験した。対照ウェルにはDMEM50μ
ｌを播種した。そのマイクロプレートを前記と同じ条件
で24時間培養した。培養終了の６時間前に、10μCi/ml
のトリチウムチミジン溶液を50μｌを各ウェルに加え
た。培養後、ウェルを生理溶液で洗浄した。その後、エ
チレンジアミンテトラアセテート存在下で0.25％のトリ
プシン溶液（Gibco社の溶液）を用いて、細胞をウェル
から剥がした。“スカトロン（Skatron）”タイプ細胞
回収装置を用いて、細胞をフィルター上に集めた。次い
で、そのフィルターを乾燥し、シンチレーション液の存
在下で放射能を測定した。
比活性の決定： 前記ウェル中の試料の蛋白質濃度（mg/mlで表す）を
Ｘ軸、対応する放射能をＹ軸としてグラフにプロットし
た。対照ウェルの２倍の放射能レベルを与える試料の蛋
白質濃度を、捕間法によりグラフから決定した。この濃
度の逆数を試料の比活性と呼ぶ。
Ｘ軸、対応する放射能をＹ軸としてグラフにプロットし
た。対照ウェルの２倍の放射能レベルを与える試料の蛋
白質濃度を、捕間法によりグラフから決定した。この濃
度の逆数を試料の比活性と呼ぶ。
実施例３ 実施例１と同様の方法により操作を行った。分析結果
（数回の実験の平均値）を表２に示す。
（数回の実験の平均値）を表２に示す。
実施例４ 生物接着剤を実施例１と同様の方法により調製した。
チューブ中で、順次、生物接着剤150μｌ、生理食塩水1
50μｌ、25mM塩化カルシウム水溶液300μｌ、及びカオ
リン懸濁液300μｌ又はサンゴ粉末懸濁液300μｌ又は生
理食塩水300μｌのいずれかを混合した。前記チューブ
を水浴中、37℃で温置した。チューブ中に凝塊の出現が
認められた。
チューブ中で、順次、生物接着剤150μｌ、生理食塩水1
50μｌ、25mM塩化カルシウム水溶液300μｌ、及びカオ
リン懸濁液300μｌ又はサンゴ粉末懸濁液300μｌ又は生
理食塩水300μｌのいずれかを混合した。前記チューブ
を水浴中、37℃で温置した。チューブ中に凝塊の出現が
認められた。
カオリンの存在下では、凝塊は温置の４分後に形成し
た。カオリンの代わりにサンゴ粉末の存在下では、凝塊
は７分で形成した。（生理食塩水を単に加えることによ
って得られる）カオリン又はサンゴを加えない調製物は
９分後に凝固した。
た。カオリンの代わりにサンゴ粉末の存在下では、凝塊
は７分で形成した。（生理食塩水を単に加えることによ
って得られる）カオリン又はサンゴを加えない調製物は
９分後に凝固した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−38217（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−51513（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−110556（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501628（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61L 25/00 A61L 27/00 A61K 6/00 ＷＰＩＬ（ＤＥＲＷＥＮＴ)
Claims (13)
- 【請求項１】血小板に富む血漿を開始原料血漿として用
いることを特徴とする、生物接着剤の構成要素となる寒
冷沈殿物を凍結血漿から調製し回収することによる、生
物接着剤の調製方法。 - 【請求項２】前記濃縮血漿が1ml当たり少なくとも50×1
06の血小板を含むことによって特徴づけられる請求の範
囲１記載の方法。 - 【請求項３】前記開始原料血漿が1ml当たり１×108〜１
×109の血小板を含むことによって特徴づけられる前記
請求の範囲２に記載の方法。 - 【請求項４】前記接着剤を液形態で得るために、前記寒
冷沈殿物を加熱することによって特徴づけられる前記請
求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項５】回収血液から始めて、血小板に富む血漿を
まず調製することを特徴とする前記請求の範囲１〜３の
いずれか一つに記載の方法。 - 【請求項６】前記血漿をあるドナーから得、そして前記
方法の全ての操作を血液を集めるために用いたバッグの
系の中で行うことを特徴とする請求の範囲１〜５のいず
れか一つに記載の方法。 - 【請求項７】内在のプロトロンビンの活性化に適した薬
剤を前記寒冷沈殿物に添加すること、及びトロンビンを
加えないことを特徴とする、請求の範囲１〜６のいずれ
か一つに記載の方法。 - 【請求項８】前記薬剤がカルシウムイオンを含む水性溶
液であることを特徴とする請求の範囲７記載の方法。 - 【請求項９】前記薬剤がカルシウムイオンの存在下での
トロンボプラスチンであることを特徴とする請求の範囲
７記載の方法。 - 【請求項１０】前記薬剤がカルシウムイオンの存在下で
の凝固第XII因子の活性化剤であることを特徴とする前
記請求の範囲７に記載の方法。 - 【請求項１１】前記活性化剤が、生物接着剤に不溶性で
負の荷電を持っている固形化合物から選ばれることを特
徴とする前記請求の範囲10に記載の方法。 - 【請求項１２】前記固形化合物がシリケート、シリカ、
シリカガラス、カルシウムカーボネート及びトリカルシ
ウムジサイトレートから選ばれることを特徴とする前記
請求の範囲11に記載の方法。 - 【請求項１３】十分な時間後に、生物接着剤が上記不溶
性の固形化合物から分離されることを特徴とする請求の
範囲11又は12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR92/11643 | 1992-09-30 | ||
| FR9211643A FR2696095B1 (fr) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | Colle biologique à base de protéines coagulables par la thrombine, enrichie en facteurs plaquettaires, sa préparation et son application. |
| PCT/FR1993/000954 WO1994007548A1 (fr) | 1992-09-30 | 1993-09-30 | Procede de preparation d'une colle biologique enrichie en facteurs plaquettaires et application |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07505076A JPH07505076A (ja) | 1995-06-08 |
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Family
ID=9434039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6508780A Expired - Lifetime JP2987207B2 (ja) | 1992-09-30 | 1993-09-30 | 血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0615454B1 (ja) |
| JP (1) | JP2987207B2 (ja) |
| AT (1) | ATE198714T1 (ja) |
| DE (1) | DE69329875T2 (ja) |
| DK (1) | DK0615454T3 (ja) |
| ES (1) | ES2156875T3 (ja) |
| FR (1) | FR2696095B1 (ja) |
| PT (1) | PT615454E (ja) |
| WO (1) | WO1994007548A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE19781869T1 (de) * | 1996-04-30 | 2000-03-16 | Medtronic Inc | Verfahren zur Herstellung eines autologen Fibrin-Blutstillungsmittels |
| DE19781869B4 (de) * | 1996-04-30 | 2006-10-12 | Medtronic, Inc., Minneapolis | Verfahren zur Herstellung eines autologen Fibrin-Klebers und autologer Fibrin-Kleber |
| WO2000062828A1 (en) | 1996-04-30 | 2000-10-26 | Medtronic, Inc. | Autologous fibrin sealant and method for making the same |
| CN1059597C (zh) * | 1996-08-08 | 2000-12-20 | 陈素兰 | 神经损伤修复制剂 |
| DE19719652A1 (de) * | 1997-05-09 | 1998-12-03 | Merckle Gmbh | Tissue-Faktor zur Förderung von Wundheilung |
| US6168788B1 (en) | 1997-09-26 | 2001-01-02 | Leon Wortham | Fibrin glue without fibrinogen and biosealant compositions and methods |
| US20040092451A1 (en) * | 1997-10-17 | 2004-05-13 | Lou Blasetti | Precipitation of growth-factor-enriched fibrinogen concentrate from platelet rich plasma |
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