KR20050044725A

KR20050044725A - 저장-안정성 피브린 밀봉제

Info

Publication number: KR20050044725A
Application number: KR1020047008700A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 제이 울버튼
Original assignee: 크리스토퍼 제이 울버튼
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2005-05-12
Also published as: JP2005517638A; US20050118156A1; WO2003047530A3; CA2473727A1; CN1617735A; EP1461053A2; IL162369A0; AU2002346648A1; WO2003047530A2

Abstract

보충되고 보충되지 않으며, 바로 사용할 수 있고 즉시 입수가능한 피브린 밀봉제(FS)가 제공되는바, 이는 바로 사용할 수 있고 저장에 안정하며 농축된 액체 피브리노겐 제제로부터 제조된다. 그렇게 제조된 FS 생성물은 조직에 적용될 때 혈액 손실을 방지하는데 필요한 탄성, 신장강도 및 접착성을 제공하여 많은 다른 치료 및 비치료적 적용에 대하여 상처 치료를 촉진한다. 또한 본 발명의 보충되고 보충되지 않으며 저장에 안정한 FS 생성물을 제조하기 위한 키트 및 방법, 이를 위한 사용 및 전달 방법이 제공된다.

Description

저장-안정성 피브린 밀봉제{STORAGE-STABLE FIBRIN SEALANT}

본 발명은 보충적 또는 비보충적인 피브린 밀봉제(fibrin sealants)에 관한 것으로서, 특히 즉시 사용가능하도록 응축된 섬유소원 조합제 (preparations)인 보관 및 저장안정성을 갖춘 즉시 사용가능한 피브린 밀봉제와 상기 피브린 밀봉제를 만드는 방법 그리고 혈액 손실, 상처 치료 및 다른 많은 치료법적 또는 일반적인 응용 사용법에 관한 것이다.

인간의 몸 속에에서의 응고체, 즉 혈액 응고체는 복잡한 캐스케이드 현상을 통해 발생한다. 상기 캐스케이드 현상의 마지막 단계에서 모너모 형태의 섬유소원은 트롬빈과 작용하며, 칼슘 이온이 존재할 경우 활성화된 제 8인자와 작용하여 가교피브린폴리머를 포함하는 피브린 응고체를 형성한다. 최근에, 섬유소원, 트롬빈 및 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 생물학적 밀봉제들이 개발되었고, 그것은 자연 응고의 마직막 단계를 모방하여 피브린 응고체를 만든다. 그리하여, 생물학적 밀봉제, 피브린 또는 조직아교, 생물학적 접착제, 수술용 접착제, 또는 기타등등 의 피브린 또는 티슈 밀봉제로 알려진 섬유소원을 기초로 한 물질 (이후 "피브린 밀봉제" 또는 "FS"로 칭함)은 살아있는 조직을 결합하는데 사용될 수 있으며, 또한 예를 들어, 조직, 기관, 근육, 뼈 및 피부에 있는 내상 또는 외상을 봉합하고 지혈작용을 하여 혈액의 손실을 줄일 수 있도록 결합을 유지시키는 데에 사용된다 (FR-2448900 실례 참고). 상기 접착제는 주로 수술시에 사용된다. 특히 출혈을 예방하거나 멈추고, 봉합실을 갈거나 증원하는 경우, 예를 들어 폐 또는 위장관 수술시에 피부 조직편을 제거된 조직에 밀봉할 때 이식용 조직편을 제자리에 잡아둘 경우, 또는 보철물등의 부품을 붙일 경우에 사용된다.

FS 생성물(products)은 일반적으로 다음과 같은 물질로부터 생산된다. (1) 파이브로넥틴, 섬유소원 응축물, 제 8인자, von willebrand factor 및 미량의 알부민; (2) 트롬빈 (예를 들어 사람 또는 솟과의 동물) 또는 트롬빈과 같은 물질의 활성제 성분; (3) 칼슘이온(즉, CaC12)과 같은 트롬빈 활성제. 그러나, 각 FS의 정확한 조성물은 시작 물질로 사용되는 특정한 혈장편의 한 기능이다. 예를 들어, 상업적으로 조제되는 FS 생성물은 흔히 솟과의 동물 성분을 함유한다. 캐나다, 유럽 및 유용가능한 어느곳에서나, 상업적으로 생산되는 FS는 전형적으로 억제제 (aprotinin)를 안정제로 함유한다. 그럼에도 불구하고, 장력 강도 (tensile strength)와 마지막 섬유소원 응축제 사이의 직접적인 관계가 증명되었으며 (일본 특허실용신안공보, Kokai 번호, Sho 61-293443), 상기 응축된 섬유소원의 유용성은 종래의 FS 생성물의 조제에 중요한 요소이다.

오스트리아 특허 75097/87에는 섬유소원 수용액, 제 8원소, 제 3 항트롬빈과 같은 트롬빈 억제제, 프로트롬빈 요소, 칼슘 이온 및 필요한 경우 플라스민 억제제를 함유하는 한 성분 접착제(adhensive)에 관한 설명이 있다. 미국 특허 4,427,650 과 4,427,651 (Stroermann)에는 향상된 상처 폐포(wound closure)와 치료를 위한 가루형 또는 분무형이며, 섬유소원, 트로민 그리고/또는 프로트로민, 그리고 섬유소 분해 억제제(fibrinolysis inhibitor)를 함유하고, 또한 혈소판(platelet)과 같은 다른 성분을 함유할 수도 있는 농축 플라즈마 유도체(enriched plasma derivative)의 조제에 관한 설명이 있다. 미국 특허 4,627,879 및 4,928,603(Rose et al.)에는 섬유소원과 제 8원소를 함유하는 동결침전물 현탄액(cryoprecipitated suspensions)을 조제하기 위한 방법과 하나의 FS를 조제하기 위한 그것의 사용방법이 기재되어 있다. 일본 특허 1-99565에는 상처 치료를 위한 피브린(Fibrin) 접착제의 조제를 위한 도구가 기재되어 있다.

PCT 문서 WO91/09641에는 섬유소원과 부가 트롬빈(Thrombin)을 함유하는 피브린 접착제에 관한 설명이 있다. 상기 FS는 부가 트롬빈을 함유하는데, 이것은 트롬빈 활동을 억제하는 방법으로 조제되고, 한 실시예에서는 칼슘 이온을 포함하지 않으며, 이는 사용전까지 첨가되지 않는다. 그러나, 상기 FS는 칼슘 이온을 첨가하지 않더라도, 대략 90초이후에 자연적으로 응고하는 경향이 있다. 칼슘 이온이 첨가되었을 경우에는, 2초내로 응고 되었다. 다른 실시예에서는, 트롬빈 활동을 억제하기 위하여 5.5 이하의 pH로 상기 생성물을 산성화하여 상기 아교가 천천히 응고 되었다. 상기 사용법은 사용시 상기 억제 효과를 없애기 위하여 산을 증가시키는 수단을 제공한다.

또한, 미국 특허 4,932,942에서 밀러외 몇명, 그리고 PCT 공개공보 WO 91/09641FS에서 몰스외 몇명에 의한 FS 배달 방법(delivery system)이 개재되어 있다. FS 생성물은 유럽에서 Immuno AG(비엔나, 오스트리아)와 behringwerke AG(독일) 그리고 다른 곳에서 (미국 특허 4,377,572 및 4,298,598 참조) 오랜 세월동안 상업적으로 판매되었다. 그러나, 미국을 제외한 다른 나라에서 사용된 FS 생성물은 특정한 위험을 가지고 있다고 주장되어, 미국의 식약청에서는 미국내에서의 사용을 허가 하지 않았다. 예를 들어, 위에서 설명한 바와 같이, 상기 유럽에서 유용되는 FS 생성물은 억제제(aprotinin)와 소의 트롬빈(bovine trombin)과 같은 인간이 아닌 기원을 가지는 단백질을 함유한다. 결과적으로, 어떤 사람은 인간이 기원이 아닌 단백질 첨가물에 대한 알러지 반응을 일으키는 위험을 갖는다. 미국 특허 6,183,498 에서는 생물학적 접착제의 사용이 염증성 조직 반응을 일으키는 것으로 보고되었다.

더우기, 혈청의 비활성화(heat inactivation)가 FS에 있는 모든 바이러스를 비활성화시키는데에 사용된 경우, 그 과정은 변성 단백질을 형성하는 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 유럽식의 혈청 비활성화 방법은 최근에 유럽에서 유행성인 뇌증(bovine spongiform encephalopathy-"광우병")을 야기시키는 프리온(prion)을 비활성화 시키지 않는다. 따라서, 외국의 FS 생성물에 사용된 상기 소의 단백질은 병을 가지고 있을수 있으며, 상기 생성물이 의도된 목적대로 사용될때에 사람이 감염될수 있는 위험이 있다.

Alterbaum의 (미국 특허 4,714,457) 및 몰스(Morse)외 몇명의 (미국 특허 5,030,215)에는 소의 단백질이 사용되지 않은 자가조직의(autologous) FS를 조제하기 위한 방법이 나타나 있다. PCT 공개공보는 WO94/07548에는 트롬빈을 첨가하지 않고 카올린(kaolin)과 같은 응고 활성제인 recalcified glue에 첨가함으로써 응고시킬 수 있는 혈소판 인자들이 농축된 FS에 관하여 설명한다. 그러나, 상기 활성제는 상기 아교가 사용되기 전까지는 혼합되지 않기 때문에, 응고 시간이 확시치 않고 예상하거나 조정하기가 어렵다. 왜냐하면, 상기 섬유소원 응축물은 매우 점착성의 생성물이고, 다루기 힘들기 때문이다. 게다가, 응고가 활성화와 동시에 이루어지므로, 활성된 아교로부터 상기 활성제를 분리하는것이 어렵다.

그럼에도 불구하고, FS 생성물은 안전한 지혈(hemostasis), 상처부위 및/또는 조직 부분으로 상기 밀봉재의 점착성, 강한 점착성 및/또는 상처 밀봉, 그리고 상처 치료과정에서 상기 점착제의 완전한 재흡수성(resorbability)을 제공한다 (Byrne외 Br.J.Surg. 78:841-843(1991)). 가장 바람직한 접착을 위하여, 바로 사용가능한 조직 접착제에는 대략 15 내지 60mg/ml의 섬유소원의 농축물이 필요하다 (MacPhee, personal communication). 상기 FS 생성물의 병상 사용은 (예를 들어, Blood Review 5:240-244(1991)의 Brennamm; Trasfusion 30:741-747의 Gribble외 몇명; J. Oral Maxillofac. Surg 43:605-611 (1985)의 Matras; J. Surg. Res. 48:165-181(1990)의 Lerber외 몇명에 의하여) 재검토되었다.

Baxter/Hyland(엘에이, 캘리포니아)는 미국 적십자사와 공동으로 미국에서 첫번째로 승인된 상업적인 피브린 밀봉제를 개발하였다(MacPhee 외 몇명의 미국 특허 6,054,122; 6,117,245; 및 6,197,325 참조). 이 FS 생성물은 소의 단백질을 가지지 않으므로, 유럽에서 유용하는 생성물을 압도하는 장점을 가진다. 예를 들면, 상기 FS 생성물은 인간의 트롬빈을 함유하고, 억제제를 함유하지 않으므로, 알레르기 유발성을 낮춘다. 게다가, 더 적은 알레르기성의 변성 단백질을 생성하는 용매 청정 방법에 의하여 바이러스가 원인이 되어 비활성화된다.

제조 기준으로부터, FS의 피브리노겐 성분은, 잇따른 분화에 의하여, 노출시에 또는 활성화된 트롬빈과 혼합할 시에 피브린 밀봉재(fibrin sealant) 또는 응고를 형성하는 조성물을 산출하기 위해 냉침전법(cryoprecipitation)에 의하여 플라스마로부터 제조될 수 있다. 종래 기술에서, 피브리노겐 및 트롬빈 농축물은 사바로 사용하기 전에 CaCl₂ 용액과 혼합되고 재구성되어야만 하는 동결건조된 형태로 저장된다. 혼합시에, 조성물들은 조직표면상에 응고되고 가교 피브린 응고를 형성하는 조직에 도포된다. 피브리노겐 농축물에 있는 인자 ⅩⅢ는 가교 촉매작용을 한다.

미국특허 제5,290,552호에 따르면, 초기 외과 접착 제제는 동결건조물들(lyophilates)이 매우 제조되기가 어려운 높은 피브리노겐 함량(약 8-10%)을 필수적으로 포함하였다. 실제로, 농축된 피브리노겐의 냉침전법은 액체 용액에서는 매우 불안정한 것으로 알려져 있으므로, 사용할 때까지 -20℃ 이하에서 저장하는 것을 필요로 하였다(http://www.tissuesealing.com/us/products/ biological/monograph.cfm); 즉, 수용성 형태로 농축된 피브리노겐은 자발적인 응고를 하기 쉽다. 결론적으로, Tissucol과 같은 상용으로 구매가능한 동결건조되고 또는 심하게 동결된 피브리노겐 농축물들은 액화되어야만 한다, 즉, 도포하기 전에 동결건조로부터 천천히 해동(용융)되거나 재구성되어야 한다. 그러나, 양 액화공정은 상당한 노력이 들고 생명이 위급한 상황에 있는 이미 상처입은 환자에 도포될 수 있는 FS 제품에 사용될 수 있기 전에 상당한 시간지연이 있게 된다.

따라서, 상당한 노력이 동결건조된 피브리노겐 조제물의 용해도를 향상시키기 위해 행해졌다. 예를 들어, 한 제조업체는 가열없이 상당한 교반을 제공하기 위해 단백질의 바이알에 추가된 자석 교반기의 사용을 필요로 한다. 이는 상당한 혼합없이 동일한 제품에 대해 얻어지는 용해시간보다 용해시간을 더 빠르게 하나, 단지 사용하기 위한 피브리노겐을 얻는데 30-60분의 제조시간을 여전히 필요로 한다.

미국특허 제5,962,405호는 피브리노겐의 저장안정적인 동결건조되거나 심하게 동결된 액체 조제물을 제공하는데, 상기 조제물들은, 바람직하게는 가열 및/또는 교반장치와 같은 추가적인 수단을 사용하지 않고도, 적어도 70㎎/㎖의 피브리노겐 농도를 갖는 바로 사용할 수 있는 조직 접착 용액을 제조하기 위해 바로 사용할 수 있는 피브리노겐 및/또는 조직 접착 용액에 재구성되고 액화될 수 있다. 조제물은 피브리노겐과 조제물의 용해도를 향상시키고, 또는 액화 온도를 낮추며, 실온에서 바로 사용할 수 있는 조직 접착 용액의 점성도를 감소시키는 적어도 하나의 추가적인 물질을 포함한다. 그러나, 액화 온도가 낮추어지므로, 상기 특허 제5,962,405호는 심하게 동결된, 농축된 피브리노겐 용액이, 앞서 요구되는 37℃의 따뜻한 조건과는 반대로, 20℃ 내지 23℃(실온)의 주위온도에서 유리해질 수 있다고 주장한다. 그럼에도 불구하고, 본 방법은 심하게 동결된 상태들 하에서(-15℃ 에서 -25℃이하로 유지되는 온도)의 저장을 필요로 하며, 제조에서도 액화시키기 위해 15분이나 시간이 걸린다.

상술한 티셀(Tisseel) 피브린 밀봉재(Baxter)에 대한 지침은 피브리노겐 및 트롬빈 성분들의 조제가 적어도 15분에서 발생하는 것을 나타낸다. 백스터(Baxter)사의 밀봉재 단백질 농축물(피브리노겐)은 동결건조된 분말로서 제공되며, 상기 분말은 섬유소용해(fibrinolysis) 억제제 용액과 혼합함으로써 재구성된다. 또한 동결건조된 농축물로서 되는 백스터사의 트롬빈 성분은 칼슘 클로라이드 용액을 사용하여 재구성된다. 백스터 키트에서 각 성분의 조제는 선택적으로 제공된 피브리노덤(Fibrinotherm) 가열 및 교반장치를 사용하여 반자동화될 수 있다. 단백질 제조공정을 수용하기 위해, 각각의 밀봉재 단백질 농축물 바이알은 최적의 생리적 온도(37℃)에서 균일한 혼합을 위해 주문형 크기의 교반웰(stirring well)에 끼워지는 자석 교반막대를 포함한다.

그러나, 단백질 성분을 천천히 액화시키는데 대한 필요성은 FS 조제의 형성에서 상당한 지연을 야기할 뿐만 아니라, 일단 피브리노겐이 용해된 후에 그 불안정성으로 인해 때이른 자가 응고 경향을 초래하므로 상당한 문제를 일으킨다. 실제로, 일단 제조된 후에, 백스터 지침은, 임의의 사용되지 않은 밀봉재가 폐기되어야만 하는 후에, 재구성된 용액들이 그들 각각의 바이알에 또는 주사기에 단지 최대 4시간 동안만 유지될 수 있다. 결과적으로, 백스터 FS는 임의의 유용한 시간 길이동안 바로 사용할 수 있는 상태로 저장될 수 없다.

사용전에 동결건조되거나 심하게 동결된 피브리노겐 제품을 재구성하거나 액화시키는 필요성을 극복하기 위한 한 가지 방책으로서, 실온에서 용해가능한 특히 농축된 조제물인, 소정의 피브리노겐 조제물이 도입되었다. 그러나, 불행히도, 이러한 종래 제품들은 세포독성(Beriplast, Biocol. Bolheal HG-4)이 있는 것으로 판명되었다.

또 다른 방안으로, 수용성 용액에서 피브리노겐의 때이른 응고 경향을 지연시키기 위해, 미국특허 제5,985,315호는 활동이 칼슘 이온들에 의존하지 않는 적어도 하나의 활성화된 응고인자의 추가를 갖는 피브리노겐을 포함하는 생물학적 기활성화된 접착제를 제공한다. 기활성화된 접착제(preactivated adhesive)는 수용성 용액에 안정적이다. 즉, 용액은 20℃ 온도에서 적어도 한 시간동안 자발적으로 응고되지 않는다; 그러나, 단순히 칼슘 이온들을 첨가함으로써 약 5분내에 응고될 수 있다. 어떠한 추가적인 활성제도 필요하지 않다. 따라서, 결과적으로 발생한 생물학적 접착제는 응고를 달성하기 위해 트롬빈이나 프로트롬빈을 첨가할 필요가 없다.

그러나, 불행하게도 5분은 매우 느린 응고 시간이어서, 생성된 피브린 밀봉제를 문합술, 혈관, 폐 손상의 기공 또는 실질 조직 또는 기관지 조직에 대한 손상과 같은 출혈이 있거나 박동하는 상처의 어떤 타입에 사용하는 것을 불가능하게 한다.

따라서, 의학적 관점에서 볼 때, 즉시 사용가능하고, 생물학적인 조직 접합제들의 빠른 사용은 특히 외과 응급 상황에서 필수적이다. 외상 치료에서의 지속적인 발전에도 불구하고, 군인 및 민간인 모두의 상당수의 인구가 매 년 치명적이거나 심각한 출혈을 격고 있다. 적절한 장비와 훈련을 갖추고 이들의 상처의 구명 조치를 완수할 수 있는 사람들이 있을 때 부상자가 발생하면 놀랄만한 수의 사망을 막을 수 있다. 따라서, 훈련된 의료 요원뿐만 아니라 훈련되지 않은 개인들조차 외상 환자의 출혈을 빠르게 감소시킬 수 있게 하는 개량되고, 사용하기 쉬우며, 야외에 준비된 지혈제에 대한 필요가 있다. 이런 필요의 효과는 두 배인데, 상당수의 외상성 사망을 예방할 수 있으며, 사용가능한 혈액 공급에 대한 수요가 감소될 수 있다.

심각한 자연재해 또는 인재에 의해 많은 수의 피해자들이 발생했을 때, 인근 병원들 및 진료소들은 외상 치료를 요하는 환자들의 수에 당황하게 될 수 있다. 주로 혈액 및 혈액 제품에 대한 최종 요구는 지역에서 사용가능한 공급량을 초과하며, 많은 경우, 지원 요구도 훈련된 의료 요원의 수를 초과하게 된다. 그러나, 즉시 사용가능하고, 자가봉쇄적 FS 제제를 사용하면 인근 의료 요원 및 재난 구조 요원들이 확실한 치료가 가능할 때까지 환자들에게 임시적인 치료를 할 수 있다. 이런 즉시 사용가능하고, 저장이 안전한 FS 제제(들)은 응급 조치 요원들 및 앰뷸런스 및 구조 차량을 위한 귀중한 도구가 될 것이다. 그 결과로, 즉시 사용가능하고, 저장이 안전한 FS 제제들로 의료 지원이 제공될 수 있을 때까지 누구나 환자들을 치료할 수 있거나 자가 치료를 할 수 있어서, FS는 가정, 차량 또는 사무실 또는 대중 교통수단용 응급 장치로서 귀중하다.

이상적으로는, 상기 FS 제품은 위험과 지원 요원들에 대한 부담을 초소화하기 위해 이 제제에서 가능하면 적은 조작을 필요해야 한다. 현재, 피브리노겐계 FS 제제들은 친액성이고, 과냉각된 농축물 또는 음성적으로 지혈을 변형시킬 수 있는 다른 성분들과의 혼합물로서만 사용할 수 있거나 인간 환자들에 안전하게 사용할 수 있는 피브리노겐 성분들 요한다. 따라서, 본 발명 전까지 고농도에도 불구하고, 액상으로 사용할 수 있으며, 인간 또는 동물에 사용하기 위한 즉시 사용가능한 FS 제품으로 쉽게 가공할 수 있으며, 부작용의 위험없이 안전하고 효과적인 저장이 안전한 수용성 피브리노겐 용액으로부터 빠르게 제조되는 즉시 사용가능한 FS 조성물에 대한 요구가 존재하고 있다.

본 발명은 즉시 사용가능하고, 저장이 안전한 농축 액체 피브리노겐 제제들로부터 제조된 보충된 및 보충되지 않는, 즉시 사용가능하고 바로 사용할 수 있는 피브린 밀봉제("FS")를 제공한다. 이렇게 제조된 FS 제품은 조직에 사용될 때 혈액 손실을 막고, 상처 치료를 촉진시키며, 많은 다른 치료적 및 비치료적 사용을 위해 필수적인 탄력성, 인장 강도 및 접착력을 제공한다. 본 발명은 보충된 및 보충되지 않는, 저장이 안전한 본 발명의 FS 제품을 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

보충된 및 보충되지 않는, 저장이 안전한 본 발명의 FS 제품들은 이들 제제에 사용되는 성분들이 저장이 안전하고 즉시 사용가능하기 때문에 즉시 사용가능한 형태로 바로 사용할 수 있다는 점에서 독특하다. 구체적으로, 본 FS의 피브리노겐 성분은 생체적합적이며, FS를 빠르고 쉽게 제조하도록 적절한 농도에서 액체 형태로 사용할 수 있게 존재한다. 살균되고, 저장이 안전한 피브리노겐은 수용성이고 완전히 용해되며, 안정성은 pH와 온도에 의존하고, 생물학적 활성(즉, 트롬빈과 칼슘 이온에 노출되거나 강하게 혼합될 때 빠르게 피브린 덩어리를 형성할 수 있는 능력)을 가지고 있다. 이렇게 제조되고 저장된, 즉시 사용가능한 농축된 인간 피브리노겐 용액은 중화될 수 있고 생체적합하고 즉시 사용가능한 FS 조성물의 제조에 추가 단계들 또는 공정들 없이 사용될 수 있다.

피브린 밀봉제들의 장점들의 하나는 가교 피브린 제품들이 상처를 밀봉한 후에 발생하는 자연적인 생체흡수이다. 플라스미에 의한 세포 용해의 결과로 이 작용은 신체로부터 피브린 밀봉제를 자연스럽게 제거시키고 필요한 경우, 더 빠르게 제거하기 위한 방법을 제공한다. FS 제품의 뛰어난 접착력 및 탄력성과 함께 이런 작용은 일단 환자가 오면 병원 직원에 의해 처리될 수 있는 응급 치료로서 또는 외과적 치료에 대한 보조 치료로서의 FS 제품들의 가치와 다양성에 기여한다. 편리하게도 이 FS 제품은 노출된 상처들에 직접 사용할 수 있으며 다른 붕대 또는 봉합제들과 함께 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 분리된 조직들 사이에 강하지만 유연성이 있는 생물학적으로 적합한 결합을 빠르게 형성할 수 있는 즉시 사용가능한 FS 조성물을 제공하거나, 상처 또는 조직의 원치않는 노출을 코팅하고 밀봉하거나, 이식용 조직편을 사용하거나, 보철 물질을 코팅하거나, 주위 조직 또는 순환계에 첨가 화합물을 전달하는 것이다. 생성된 결합, 덮개 또는 밀봉은 방수되는 것이 바람직하다. 이런 조성물은 인간 또는 동물 환자의 생체내 뿐만 아니라 생체외에서 조직에 대한 의도된 목적에 대해 효과적이다. 또한 본 발명의 목적은 조직 부위에 조성물을 위치시키는 것을 용이하게 하기 위해 원하는 활용에 따라 점도 및/또는 중합 시간이 변형될 수 있는 FS 조성물들을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 분리된 조직을 결합하는 방법, 방수 밀봉을 형성하기 위해 상처 또는 조직을 밀봉 또는 코팅하는 방법, 이식용 조직편을 사용하는 방법 또는 특히 외과 치료 동안 처리가 쉬운 FS 조성물을 사용하는 보철 물질을 코팅하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이런 FS 제품들을 제제화하는 방법뿐만 아니라 생체내 또는 생체외에서 상처를 밀봉하고, 이식용 조직편을 사용하고, 보철물들을 코팅하거나 주위 조직 또는 순환계에 첨가 화합물들을 전달하기 위해 FS 제품들을 사용하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 목적은 인스턴트 FS 성분들과 최종 FS 제품들을 조직 또는 상처 부위에 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특유한 장점은 수용액으로서 저장이 안전한 피브리노겐 성분을 포함하는 성분들의 즉시 사용가능성이다. 따라서, 상기 성분들은 FS 제품을 형성하기 위해 조직 또는 상처 부위에 사용되기 바로 전 또는 사용과 동시에 결합된다. 상기 성분들이 즉시 사용가능한 상태로 저장되며, 전달을 쉽게 하기 위해 사실 분리되어 안전하게 주사기의 배럴(barrel) 내에 저장될 수 있기 때문에 이중 주사 전달 장치들은 인스턴트 FS 조성물의 상기한 성분들을 사용하여 동일한 결과들을 나타내며 쉽게 사용될 수 있다.

다른 방식에서, 상기 성분들은 단일 배럴 주사기 내의 분리된 부분에서 분리되어 안전하게 저장될 수 있어서, 플런저(plunger)를 압축하는 것과 같은 작용은 미리 측정된 성분들이 혼합되도록 벽이 열리게 할 수 있다. FS 조성물의 전달은 즉시 하나의 출구 또는 바늘로부터 조직 또는 상처 부위로 향하게 되어 피브린 덩어리의 중합 및 가교가 상기 부위에서 직접 일어나게 한다. 또 다른 방식에서, 주사 장치들(단일 또는 다중 배럴)은 표준 주사 기술을 사용하여 대형 저장 용기들로부터 저장이 안전한 성분들을 추출하는데 사용될 수 있고, 이 성분들 및 혼합된 FS 조성물은 피브린 중합 및 가교가 상처 부위에서 발생하는 동안 상기한대로 전달된다.

다른 목적은 적어도 두 개의 바이알을 포함하는 인스턴트 FS 조성물의 간단한 전달을 위한 장비들을 제공하는 것이다. 첫 번째 바이알은 활성 트롬빈 또는 트롬빈 유사 조성물과 같은 활성 용액과 혼합될 때 FS를 형성하는데 적합한 농도로 저장이 안전한 피브리노겐의 수용액을 포함하고, 두 번째 바이알은 첫 번째 바이알에서 저장이 안전한 피브리노겐과 혼합될 때 FS를 형성하는데 적합한 농도로 활성 용액(바람직하게는 트롬빈)을 포함한다. CaCl₂는 첨가되어 피브린 중합이 일어나게 하는 유효량으로 적어도 두 개의 바이알의 하나의 내용물들과 함께 저장되거나, CaCl₂ 성분은 다른 바이알에 공급된다. 안정제 및/또는 인자 XIII(Factor XIII), 및/또는 성장 인자, 약물, 항생물질 등과 같은 다른 첨가들과 같은 다른 성분들은 하나 이상의 다른 바이알들에 제공되거나 이런 다른 성분들이 첨가되어 적어도 두 개의 바이알의 내용물들과 함께 저장된다.

그러나, 본 발명에 제공된 장비들의 바이알은 주사 장치의 몸통을 포함하는 것으로 표현된다. 따라서, 한 실시예에서, 인스턴트 FS 조성물이 혼합되어 전달될 때까지 피브리노겐 성분 및 활성제 성분이 분리되어 있는 동안, 장비는 단일 분리 바이알 또는 다중 바이알 주사기에 제공된 상기 성분들을 포함한다.

본 발명의 다른 다른 목적들, 장점들 및 신규한 특징들은 발명의 상세한 설명, 실시예 및 도면들에서 일부 나타날 것이며, 일부는 다음을 검토하면 당업자에게 명백해질 것이며, 또한 본 발명을 실시에 의해 알 수 있을 것이다.

본 발명은 즉시 사용가능하고, 저장이 안전한 농축 액체 피브리노겐 제제들로부터 제조된 보충된 및 보충되지 않은, 저장이 안전한 피브린 밀봉제("FS")를 포함한다. 본 FS는 성분들이 저장이 안전하고 즉시 사용가능하여서 바로 사용할 수 있기 때문에 신규하다. 특히, 피브리노겐 성분은 수 일, 수 주, 수 개월 또는 그 이상의 기간 후에도 "저장이 안전한" 즉시 사용가능한 수용액이고, 액상으로 안전하게 존재하고, 연속적으로 덩어리가 되지 않으며(즉, 트롬빈/Ca²⁺와 같은 활성제하에서도 "연속된 덩어리"를 형성하지 않는다), 생물학적 활성을 가진다(즉, 트롬빈 및 Ca²⁺에 노출되거나 강하게 혼합시에 피브린 덩어리를 빠르게 형성하는 능력). 따라서, 개시된 방법들은 피브리노겐을 포함하는 FS 성분들이 수 일의 기간 동안 즉시 사용가능한 수용액으로 저장되고 활성이며 안전하게(저장이 안전한) 존재하는 조건하에서 실행된다.

본 발명의 FS 조성물은 비감염성이며 다양한 외과 치료를 위한 고인장 강도, 탄력성, 유연성, 방수성, 점도 및 접착력을 가진 조직 결합을 제공한다. 이 조성물은 이식 장치들의 강도 및 내수성을 향상시키고, 물질 이식 장치의 위브(weave)의 구멍을 밀봉하고, 혈전형성을 감소시키기 위해 이식 장치들을 코팅하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 다르게 정의하지 않으면, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 포함된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 FS 조성물은 피브린 모노머의 임의의 형태로부터 제조된 피브린 폴리머를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, FS 피브린 폴리머는 "즉시" 또는 제제의 저장이 안전한 피브린노겐 성분을 활성화하고 몇 초 후에 형성된다.

피브리노겐의 피브린으로의 효소적 변형은 2 단계 공정이다. 첫 번째, 활성 트롬빈 또는 트롬빈 유사 분자가 내부 촉매에 영향을 받기 쉬운 가용성 모노머인 피브린 I를 형성하기 위해 피브리노겐 분자의 외부 A 및 B 말단 펩티드에 엉겨붙는다. 활성 인자 XIII(프로트롬빈의 트롬빈으로서의 변환에 의해 상향조절됨)는 피브리노겐 모노머들에서 아미노산의 한 쌍 사이에 아마이드 결합의 형성을 촉매화하여, 최종 가교된 불용성 피브린 II 매트릭스를 생성한다. 분열은 피브리노겐의 분자량을 340,000 달톤에서 334,000달톤으로 약간 감소시키나, 공정은 결합되고 가교된 피브린 덩어리를 형성하기 위해 필수 중합 부위를 노출시킨다. 잭슨, Ann. Rev. Biochem.49:765-811(1980); 퓨리에 등., Cell 53:505-518(1988) 참조.

활성 트롬빈 및 인자 XIII의 효소적 활성화를 통한 피브리노겐의 피브린으로의 변형은 엄격한 생리적 조건하에서 발생한다. 천연 피브린의 뛰어난 응고성을 가진 매트릭스의 외인성 발생은 이들 필수 생리 조건들이 충족되는 것이 필요하다. 한 실시예에서 본 발명의 FS는 전달 시에 두 개의 활성화 또는 자가 활성화 성분들의 혼합에 의해 활성화된다. 제 1 성분은 농축 피브리노겐 제제이며, 어떤 실시예에서는, 아프로티닌과 같은 프로테아제 억제제를 더 포함한다. 비록 제 2 활성제 성분들은 추가 성분들이 필요없는 접합 부위에서 충분하게 사용가능하지만, 제 1 성분은 트롬빈 또는 트롬빈 유사 등가체 및 CaCl₂와 같은 칼슘을 포함하는 제 2 활성제 성분과 균일하게 혼합된다. 두 성분들의 각각 및 여기에 첨가된 임의의 화합물은 생리적 섬유생성(fibrinogenesis)이 FS 제품에서 가능하면 유사하게 복제되도록 하기 위해 선택되고 제조된다.

피브린 모노머들의 비제한적인 예들은 피브린 I 모노머, 피브린 II 모노머 또는 des BB 피브린 모노머 또는 이의 조합을 포함한다. 기술적으로 "FS 조성물"이란 용어는 피브린 덩어리를 형성하기 몇 초 전에 피브리노겐과 활성 트롬빈 또는 트롬빈 유사 활성제(뿐만 아니라 다른 필수 및/또는 첨가 성분들)의 혼합물을 의미하는 것으로 사용된다. 일단 FS 피브린 덩어리가 비가역적으로 형성되면, "FS 제품" 또는 간단히 "피브린 밀봉제" 또는 "FS"라는 용어로 사용된다. 그럼에도 불구하고, FS 조성물에서 FS 제품으로의 변형이 단지 몇 초 내에서 일어나고, "조성물"에서 "제품"으로의 밝은 선 변화없는 연속적인 응고 과정이기 때문에, 상기 용어들은 반드시 상호교환 가능하다. 더욱 중요한 것은, 상기의 용어는 FS 조성물 내의 성분들의 혼합물로부터 생성된 FS 제품 내의 최종 FS 덩어리로의 일시적 변환을 나타내는데 사용된다.

또한, 본 발명을 위해, "피브린 폴리머"는 피브린 모노머의 중합에 의해 얻은 임의의 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 피브린 I 모노머의 피브린 폴리머로의 변형은 변형 단계가 어떻게 실행되는 가에 따라 가교 또는 비가교된 피브린 I 폴리머 및/또는 가교 또는 비가교된 피브린 II 폴리머를 생성할 수 있다.

중합하는 동안 전달, 위치 검출 및 안전성이 선택된 FS 활용을 위한 필수 밀봉력, 탄력성 및 강도를 제공하는데 적절하도록 FS 조성물의 성분들의 점도뿐만 아니라 FS 성분들의 활성화에 의해 형성된 FS 피브린 제제의 점도는 변형될 수 있다. 이런 특성들은 손상되거나 약화된 조직들이 봉합 또는 공지된 비봉합 치료보다 손상되거나 약화된 조직들의 더 빠르고, 더 효과적인 외과 치료를 제공한다. 용액의 형태, 가장 바람직하게는 수용액의 형태로 상처 부위에 제공된 FS 제품들은 접합된 조직을 함께 유지하는데 필수적인 인장 강도를 반드시 제공하여 분리된 조직을 결합하거나 조직 또는 보철 또는 이식 표면에 방수이고, 유연한 밀봉을 제공하게 한다.

선택적으로, 점도 변형제 및/또는 결합 향상제는 필요에 따라 하기와 같이 조성물에 첨가될 수 있다. 생성된 조성물은 뛰어난 강도와 우수한 처리 특성들을 갖는 FS 제품을 제공한다. 상기 조성물은 강하고, 균일하며, 탄력있는 접합 또는 코팅을 형성함으로써 레이저 접합에 특히 적절하다.

본 발명의 FS 조성물은 전장(full-length) 분자들을 포함하는 천연 또는 합성 펩티드들, 효소적으로 활성 변형되거나, 쪼개어지거나, 단축되는 그 돌연변이들, 또는 그 가교 유도체들(Coller et al., J. Clin. Invest. 89:546-555(1992)), 뿐만 아니라 그 혼합물들로부터 선택되는 단백질 성분들을 포함한다. 펩티드들 중에는 단순 단백질들, 결합 단백질들 및 그 혼합물들이 포함된다. 이러한 단백질들의 예로는 구형 단백질 및 섬유상 단백질들 또는 구조 단백질들을 포함한다. 구형 단백질들의 예로는 합성 또는 천연 혈청 단백질들, 그 천연 또는 합성 유도체들, 염들, 효소적으로나, 화학적으로나 또는 다른 식으로 변형되거나, 쪼개어지거나, 단축되거나 또는 가교되거나, 산화되거나 또는 가수분해되는 유도체들 또는 그 서브유닛들 및 그 혼합물들을 포함한다.

FS 조성물은 성분들의 적용 및 농도에 따라 유동성 액체로부터 졸에서 점성 겔까지에 이르는 형태로 제조된다. 예를 들어, 조성물은 바람직하게는 분리된 조직들을 접합시키기 위한 점성 겔의 형태로 사용되며, 상기 겔은 조직을 함께 보호하기 위해 내구성이 있는, 불용성(water insoluble)의 비가역적으로 가교된 응고(clot)로 빠르게 중합화된다. 한편, 조직들 또는 인공재료들(prosthetic materials)상에 방수제나 밀봉재(resistant seal)의 형성은 점성이 덜한 조성물을 사용하여 가장 효율적으로 달성될 수 있다. 어떤 경우에는 저장안정성(storage-stable) 피브리노겐 성분의 활동으로 접합을 자발적으로 형성하게 될 것이다. 다른 경우에는, 에너지 및/또는 포톤들로 조성물을 활성화시키는 것이 필요할 수 있다.

순간 피브린 밀봉재의 성분들

저장안정성 피브리노겐 성분

본 발명의 FS 조성물의 특징들이 정의되고 대상 FS가 제조되는 본래의 성분들에 의하여 유사한 적용들에 사용될 수 있는 종래 기술의 조성물들과 구별된다.

본 발명의 FS의 바람직한 실시예의 주요 성분은 고도로 농축된 피브리노겐 용액이다. 본 FS 조성물의 핵심은 의도한 용도의 쉘프 레이디(shelf-ready) 순간 이용가능성(availability)이며, 이는 저장안정성, 바로 사용할 수 있는 수용성 피브리노겐 성분을 사용한 제조에 의하여 가능해지며, 예를 들어, 미국 특허출원 연속번호 제10/267,104호 및 제10/263,987호를 참조하고, 상기 내용은 참조문헌으로 본 명세서에 합체되어 있다.

저장안정성 피브리노겐 성분은 본래 혈장(blood plasma)으로부터 분리되고 정화되거나, 세포배양 기술에 의하여 생산되거나, 재조합으로 제조되거나, 또는 새롭게 분리되거나, 또는 동결건조되거나 심하게 동결된 플라스마 유도(plasma-derived) 조제로부터 새롭게 제조되든지 간에 임의의 피브리노겐 조제로부터 제조될 수 있다. 소스(source)에 무관하게, 피브리노겐 조제물들은 일단 농도 및 성분들이 등가로 제조된 후에 필수적으로 동일한 방식으로 처리되고 사용된다. 피브리노겐 성분의 저장 안정성은 피브리노겐의 본래 소스와는 무관하다; 실제로, 저장방법 및 수용성 용액의 조건들로 피브리노겐 용액이 안정적으로 유지되게 하는 반면에 그 밖의 것들은 적절한 저장안정성 피브리노겐 용액을 만들지 못하였다.

바로 사용할 수 있는 피브리노겐 용액에 트롬빈/Ca⁺⁺을 첨가한 후에, 점성도에서의 급격한 증가와 나타나는 액체 운동에서의 감소를 "겔"이라고 한다. 겔 상태에서, 피브리노겐 용액은 더 이상 자유롭게 유동하지 않지만, 흔들림(agitation)으로 인해 강제로 움직여 질 수 있다. 이러한 측정은 주관적이지만, 측정된 검사로는 단지 ±2초이다.

"응고(clot)" 형성은 흔들림으로 인해 액체가 고형화된 재료로부터 넘어서 유출되게 할 수 없는 피브리노겐 용액의 갑작스러운 고형화이다. 이동불가능한 물질은 주로 거시적으로는 불투명한 백색이며 점소성(viscoplastic)이 된다. 대표적인 생리학적이거나 비생리학인 피브린 응고의 스캐닝 전자 마이크로그래프(SEM) 사진이, 예를 들어, Redl 등의 논문인 Medizinische Welt 36:769-76(1985)에 도시되어 있다. 응고는 일반적으로 시험관 벽에 부착되며 관의 뾰족한 태핑에 의하여 고체표면상에서 제거될 수 없다. 이러한 측정은 겔 형성보다 덜 주관적이며, 측정된 불확실도는 급격하게 설정된 샘플들(8-12초)에 대해 단지 ±1초이지만, 더 천천히 응고되는 샘플들(100초 이상)에 대해서는 더 커질 수 있다.

피브리노겐 성분 제조하기

피브리노겐 성분이 동결건조되거나 심하게 동결된 혈장유도 제제로부터 제조될 때, 피브리노겐 제제가 동결건조되거나 심하게 동결되는 시간의 길이는, 신선하게 제조된 피브리노겐 용액의 생물학적 활동이 신선한 플라스마로부터 분리되고 정화된 피브리노겐의 비교 샘플과 동일하고 자발적 응고화가 용액에서 야기되지 않는 한, 본 발명의 FS 조성물의 제조에 있어 요인이 아니다.

피브리노겐 성분이 전혈(whole blood)로부터 제조될 때, 대표적으로는 100㎖의 혈액이 항응고제(anticoagulant)를 함유하는 상용으로 구매가능한 표준 혈액낭에 수집된다. 임의의 항응고제, 예를 들어, 헤파린(heparin), EDTA, 히루딘(hirudin), 시트레이트(citrate) 또는, 직간접으로, 트롬빈의 형성을 방지할 수 있는 다른 시약들이, 제한 없이, 사용될 수 있다. 시트레이트가 바람직하며, 주로 사용으로 구매가능한 피브리노겐 조제물에서 발견된다. 그런 후 피브리노겐 성분을 함유하는 플라스마가 전혈로부터 분리된다.

현재 구매가능한, 상용의 피브리노겐은 분리 및 정화공정에 사용되는 염을 함유한다. 실시예들에서 언급한 바와 같이, 이는 소듐 시트레이트(sodium citrate) 및 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 포함하나, 피브리노겐 정화 공정의 잔여 부분들인 이러한 염들의 존재는 결과적으로 생성된 제제의 저장안정도 및 현 FS 조성물의 제조에 있어 그 유효성에 영향을 끼치는 것으로 나타나지 않는다. 저장안정성이 있고, 바로 사용할 수 있는 피브리노겐 용액은 비교가능한, 신선하게 제조된 피브리노겐 용액의 특징들을 유지할 때에만 유효하므로, 피브리노겐 정화공정의 효과는 본질적으로 양쪽에 대해 동일하고 본 발명과는 관련성이 없다. 그럼에도 불구하고, 극히 큰 농도의 시트레이트 및/또는 소듐은 저장된 피브리노겐 조제물의 응고에 영향을 끼칠 수 있다.

FS 성분들의 제한없는 소스들로는 혈액, 바람직하게는 포유동물 혈액, 더 바람직하게는 인간 혈액, 혈장이 선호되는 피브리노겐 및 재조합 피브리노겐을 분비하는 세포 배양조직들(cell cultrues)이다. 혈액은, 예를 들어, 전혈을 포함하는 임의의 혈액 형태일 수 있다. 또한, 혈액은 (환자 자신의 혈액 생성물에서 나온) 자가 피브린 밀봉재(autologous fibrin sealant)를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 자가 피브리노겐(autologous fibrinogen)은 미국특허 출원연속번호 제10/267,104호 및 제10/263,987호의 저장안정적인 방법들을 사용하여 의사 또는 수의사에 의하여 더 나중에 사용하기 위해 제조되고 저장될 수 있다.

임의의 분리기술, 예를 들어, 침전, 원심분리 또는 여과 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 원심분리 이용에서, 혈액은 원심분리에 적합한 용기에 옮겨지고, 3,000g로 실온에서 10분간 원심분리된다. 투명한 상층액 플라스마(대략 50㎖)를 따라내고 세포 성분들을 버린다. 그러나, 혈소판(platelets)에 풍부한 플라스마를 얻는 것이 필요하면, 더 낮은 g 포스(force), 예를 들어, 20분 동안 500g로 실행될 수 있다. 플라스마를 포함하는 상층액은 표준 기술에 의하여 제거될 수 있다. 그런 후 피브리노겐이, 예를 들어, 미국특허 출원연속번호 제10/267,104호 및 제10/263,987호에 따라, 본 발명의 FS를 제조하는데 요구될 때까지, 결과적으로 생긴 플라스마로부터 분리되고 안정성을 유지하기 위해 처리된다.

일 실시예에서, 플라스마 유도 피브리노겐 성분은 여과에 의하여 전혈로부터 제조된다. 여과는 플라스마로부터 혈액 세포들을 분리하는 적절한 필터를 통하여 전혈을 통과시킴으로써 실행될 수 있다. 필터는 양호한 단백질 투과를 보이는 미소다공성 막(micorporous membrain)인 것이 바람직하다. 상술한 바와 같이, 100㎖ 전혈이 적절한 항응고제를 함유하는 혈액낭에 수집되고, 그런 후 혈액은 연동식 펌프(peristaltic pump)에 의하여 양호한 단백질 투과를 보이는 필터를 통하여 재순환된다. 막을 가로지르는 압력강하가 플라스마에 생겨 이를 통과하는 플라스마가 힘을 받는 반면에, 세포 성분들은 재순환하는 혈액에 남아있다. 상술한 바와 같은 또 다른 공정으로 플라스마(50㎖)가 수집된다.

다른 실시예에서, 피브리노겐을 분비할 수 있는 임의의 세포 배양이 본 발명에 사용될 수 있다. 배양 및 유지 공정은 포유동물 세포배양에 대한 표준 문헌들에 의하여 상술된 바와 같이 필연적으로 실행된다. 예를 들어, HEPG2 세포들이 이 용도로 사용될 수 있다(예를 들면, Liu 등의 논문, Cytoechnology 5:129-139(1991) 참조). 세포들은 10% 소 혈청을 함유하고 5% CO₂로 완충처리되고 약 37℃로 유지되는 배지(Minimal Essential Medium)에서 1:4 내지 1:8의 분리비율로 플라스크에 심어졌다. 24-36시간 후에 배지를 제거하고 적절한 단백질분해효소(protease) 억제제(inhibitor) 및 2IU/㎖ 헤파린을 함유하는 혈청이 없는 배지로 대치하였다. 추가로 24시간 주기동안 혈청이 없는 배지를 3번 연속하여 교체하며 배양을 계속하였다. 혈청이 없는 대조 배지(conditioned media)를 10분간 3,000g로 원심분리시켜 임의의 세포 부스러기들을 제거하였고, 투명한 상층액은 피브리노겐을 포함하였으며, 상기 피브리노겐은 공지된 방법을 사용하여 요망하는 바에 따라 더 농축될 수 있다.

본 FS 조성물의 피브리노겐 성분은 또한 재조합 DNA 기술(예를 들어, Roy 등의 논문, J. Biol. Chem. 266:4758-4763(1991)참조)로부터 제조될 수 있다. Roy 등의 논문은 피브리노겐의 모든 3가지 사슬들(chanis)을 표현하기 위한 방법을 개시하고, COS 세포들이 트롬빈 유도 응고를 형성할 수 있는 형태의 사슬들을 발현하고, 모으고, 분비하는 것을 개시하고 있다. 제조된 후에, 세포 부스러기들은 세포 배양을 위해 사용될 때 상술한 바와 같이 원심분리나 여과에 의하여 제거되고, 그런 후 피브리노겐은 농축될 수 있다.

본 발명에 사용되는 저장안정성 피브리노겐 성분의 세포 배양 또는 재조합 기술에 의한 제조는 플라스마 오염물에 의한 바이러스 오염이 제거되기 때문에 어떤 실시예에서 바람직할 수 있으며, 최종 FS에서 다른 조성물들의 존재를 통하여 더욱 완벽하게 조절된다. 예를 들어, 인자 ⅩⅢ가 종종 플라스마로부터 피브리노겐 조제물에 있게 된다. 그러나, 일부러 추가되지 않는다면, 어떠한 인자 ⅩⅢ도 세포 배양에 의하여 제조된 피브리노겐에 있지 않으므로, FS 조성물에 추가되는 그 양을 허용하여 피브린 기준에 대한 가교(cross-linking)가 정확하게 정량화되게 한다.

본 발명의 바람직한 실시예들로는 제조 과정에서 원(原) 피브리노겐 산물에, 또는 90% 이상의 단백질 순도를 가지며 95% 이상의 응고가능한 단백질인 최종 농축된 피브리노겐 제조에, 또는 그 사이의 임의의 피브리노겐의 농축에 적용될 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예들에서, 인간 피브리노겐 제제는 53% 단백질 순도 및 95% 응고가능한 단백질을 가진 반면에, 소의 피브리노겐 제제는 61% 단백질 순도 및 97% 응고가능한 단백질을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 둘 다는 본 발명의 FS 조성물의 조제에 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 저장안정성 피브리노겐 조제물은, 비록 고도로 농축되어 있으나, 보충되거나 보충되지 않는, 바로 사용할 수 있는 FS 조성물의 조제에 사용하는데 특히 적합한 피브리노겐을 만드는 수용성 용액에 용해된 채로 있다. 바로 사용가능한 FS 조성물을 제조하는데 사용될 때, 피브리노겐은 선택적으로 10-85㎎/㎖의 농도, 더 바람직하게는 15-75㎎/㎖의 농도, 더욱 더 바람직하게는 30-70㎎/㎖의 농도, 가장 바람직하게는 40-65㎎/㎖의 농도로 저장된다. 더욱이, 본 발명의 저장안정성 수용액에서 피브리노겐의 농도, 또는 피브리노겐 함유 단백질은 대개 2 내지 10 w/v%, 바람직하게는 4-7 w/v% 범위에 이른다. 피브리노겐의 농도는 (1% 피브리노겐 용액의 흡광으로서 14를 사용하여) 280㎚에서의 단백질 흡광도 측정에 의하여 결정된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 저장안정성 피브리노겐은 생물학적으로 활성적이며(즉, 트롬빈 및 Ca 이온들이 있을 때의 응고), 신선한 샘플들과 동일한 특징을 본질적으로 갖는다. 이는 FS 조성물들이 제조되고 사용될 때 신선하게 제조된 피브리노겐을 사용하여 형성된 동일한 형태의 제어된 피브린 응고를 야기한다. 피브리노겐(및 트롬빈) 농도는 응고 형성 시간, 응고 세기, 응고 접착성 및 이에 따른 지혈(hemostatis)에 기여한다. 논의를 위해, 이런 형태의 응고를 본 명세서에서는 그 과정을 "자발적인 응고"와 구별하기 위해 간단히 "피브린 응고"라고 하며, 자발적인 응고는 불안정하고, 농축된 피브리노겐 용액에서, 심지어 트롬빈이 없거나 또 다른 활성제에서도 발생할 수 있다.

그러나, 상기 용어들은 본 명세서에서 단지 동일한 양의 피브리노겐과 Ca⁺⁺이 강력하게 혼합될 때 조성물의 활동이 피브린 응고의 급속한 형성에 의해 빠르게 나타나는 저장안정성 피브리노겐 용액으로부터 제조된 FS 조성물들을 종래 기술의 피브리노겐 용액에서 불안정도를 나타내는 자발적인 응고와 구별하기 위한 용도로만 사용된다. 종래기술의, 수용성 피브리노겐 용액들은 매우 불안정한 것으로 알려져 있고, 저장시에 자발적으로 응고되는 경항이 있으며, 종래 인식된 방법들의 사용으로는 바로 사용할 수 있는 액체형태의 피브리노겐 저장을 심지어 하루나 이틀만에 쓸 수 없게한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 사용전에, 저장안정성 피브리노겐은 폴리머, 플라스틱 또는 플라스틱 계열의 용기에 저장되지만, 더 바람직하기로 상기 플라스틱 용기는 폴리프로필렌(ploypropylene)이다. 유리는 자발적인 응고 형성을 강화시키므로 피브리노겐이나 혈소판을 저장하는데 사용되지 않는다.

본 발명의 피브리노겐 용액들은 활성제(activator) 용액에 노출될 때 생리학적 피브린 구조를 형성하는데 이상적으로 적합하며, 피브린 응고가 급격히 형성된다. 이는, 하기에 설정된 바와 같이, (예를 들어, 2.5유닛/㎎ 피브리노겐(100유닛/㎖) 트롬빈 및 시트레이트를 통한 3-6mM 초과 CaCl₂ 또는 용액에 첨가될 수 있는 다른 키레트들(chelators)을 포함하는) 동일한 양의 트롬빈/CaCl₂ 용액을 갖는 저장된 피브리노겐 용액을 혼합함으로써 증명된다. 결과적으로 생성된 응고가 생리적 피브린 구조를 나타내면, 생리적 조건하에서, 즉, 대략 0.15 pH 및 대략 중성 pH의 이온세기 하에서, 새로이 제조되거나 새로 분리되고 정화된 인간 피브리노겐상에 트롬빈의 작용에 의하여 응고가 형성될 때 대표적인, 공간 분기된 피브릴(fibril) 구조를 가지게 된다.

종래 실험들은 바람직한 조건하에서 본 발명의 수용성 피브리노겐 용액들이, 실온(~23℃)에 저장되거나 냉장(~4℃)될 때, 적어도 97일 동안 pH 6.3 내지 8.0에서 안정적(활성적이며 자발적으로 응고되지 않음)으로 유지됨을, 연속한 관찰 및 검사에 의하여, 증명되었다. 실제로, 상기 성분은 상당한 활동 상실없이 (즉, 혼합시에 피브리노겐/트롬빈 피브린 응고들이 여전히 급속하게 형성됨) 유지되었던 농축된 단백질에 대한 알려진 심하게 동결되거나 동결건조된 조제물과 비교하면, 매우 장시간 동안, 심지어 피브리노겐 제품의 최초 저장 후에 수년간, 안정적인 것으로 나타났다. 따라서, "장기간 저장"은 (1년 이상동안 동결건조되고 그런 후 또 1년 이상 ~4℃에 저장한다고 가정하면) 적어도 3일간, 바람직하게는 적어도 3주간, 더 바람직하게는 적어도 10주, 더욱더 바람직하게는 적어도 6개월, 더욱더 바람직하게는 적어도 1년, 및 가장 바람직하게는 적어도 2년 동안 단백질 활동의 상당한 상실없이 현재 개시된 조건들하에서 바로 사용할 수 있는 형태로 피브리노겐 용액, 바람직하게는 인간 피브리노겐 용액의 저장을 의미한다.

환자를 위해 본 발명의 방법에 따른 FS 적용에서 '인간' 피브리노겐을 사용하는 것이 바람직하지만, 안정적으로 저장되고, 바로 사용할 수 있으며, 다른 종들, 가장 바람직하게는 다른 포유동물 종에서 나온 수용성 피브리노겐 용액들의 사용이 또한 적용될 수 있다. 실제로, 포유동물 종들이 갖는 저장된 인간 피브로노겐의 사용과 관련된 어떠한 종들의 호환성 문제도 나타나지 않았다. 예를 들어, 환자의 인간 피브리노겐은, 예를 들어, 임의의 포유동물 종내에 또는 포유동물 종상에 사용하기 위한 생물학적으로 호환성 있는 조직 접착제를 제조하기 위해 수용성 용액에서 잇따라 저장 사용될 수 있다. 그러나, 본 인간 피브리노겐 조제의 유리한 적용은 인간 환자에 바로 사용할 수 있는 적용가능성에 있다고 이해된다.

피브리노겐 저장 조건 : 온도 및 pH

당업자라면 본 발명을 통해서 저장 안정성 피브리노겐 성분의 최적의 온도 및 pH을 알 수 있거나 또는 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 수성계 젤이 또한 본 발명에 사용될 수 있는데, 이는 수성계 젤이 그에 포함된 피브리노겐을 완전히 가용화하고, 그 제제가 충분히 유동적이어서 상용화된(ready to use) 생물학적 조직 접착제 또는 본 명세서에 개시된 저장 방법을 따르는 다른 적용물을 빠르게 제조할 수 있는 경우에 가능하다. 본 FS 발명의 열쇠는 피브리노겐 성분이 상용화된 유동체 형태로 저장된다는 사실이다. 그 상용화된 형태에서, 피브리노겐은 동결건조된 제제로서 저장되지 않고, 또한 급속냉동 상태로 저장되지도 않는다.

저장 중에 용액의 온도는 그 안에 포함된 피브리노겐이 안정한 상태(즉, 불활성상태나 자발적 응고상태가 아닌 상태)로 유지되는 한 특별히 한정되지는 않는다. 본 발명의 피브리노겐 용액의 저장을 위한 바람직한 온도는 1 내지 25℃이고, 보다 바람직하게는 약 4 내지 23℃이다. 냉각된 경우에 최적의 온도는 약 4℃±1℃이고, 그 온도에서 제품이 적어도 1년 동안 안정하다는 것이 입증되었다(자료는 미개시). 저장이 실온에서 이루어지는 경우 최적의 온도는 약 20 내지 25℃이고, 보다 바람직하게는 약 22 내지 24℃이고, 가장 바람직하게는 23±1℃이고, 그 온도에서 제품이 적어도 3개월 동안 안정하다는 것이 입증되었다(자료는 미개시). 또한, 이전에 동결된 샘플(적어도 1년 이상 동안)은 적어도 추가적인 몇년 동안 4℃에서 안정되게 저장되었고, 제품이 적어도 2년 동안 상용화된 형태로 사용이 가능하게 되었다.

수성 피브리노겐 용액의 pH값은 저장 동안 바람직하게는 대략 pH 6.0 내지 8.2, 더욱 바람직하게는 6.2 내지 8.0, 더더욱 바람직하게는 6.3 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.5 내지 7.36으로 조절된다. 그리고, 소의 피브리노겐은 pH 7.24에서, 인간의 피브리노겐은 pH 6.32 내지 7.13이 가장 바람직하게 실증된다.

저장 안정성 피브리노겐 용액의 pH는 저장되는 버퍼에 의해 결정된다. 비록 다른 공지된 생리적 수용가능한 버퍼가 저장 안정성 피브리노겐을 제조하는데 사용될 수 있지만, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 피브리노겐 용액의 pH가 예정된 범위내에 있어서 그 활성이 유지되고 자발적인 응고가 발생되지 않는 한, 저장 안정성 피브리노겐 용액은 히스티딘 버퍼에서 제조된다. 적절한 버퍼는 예를 들면, 0.1M, 다음과 같은 pH 범위를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다: 히스티딘 pH 6.0 또는 7.2 내지 7.24; 트리스 pH 8.16; 글리신 pH 9.3; 또는 카보네이트 pH 9.05 내지 9.31 또는 pH 9.86 내지 9.9.

특정 피브리노겐 용액의 저장을 위한 최적의 pH는, 실시예와 표에서 알 수 있듯이, 부분적으로 물질이 저장되는 온도에 의해 결정된다. 그러나, 본 명세서에 개시된 것을 고려하여, 당업자는 계획된 저장 온도 및 조건을 기초로 하여 피브리노겐 용액의 최적의 pH를 선택할 수 있을 것이고, 그 결정 인자는 그 안에 포함된 단백질이 안정한 상태(즉, 불활성 또는 자발적 응고가 아닌 상태)로 유지되는지 여부라는 것을 알 수 있을 것이다.

예를 들면, 실온(~ 23℃)에서 저장된 상용화된 인간 피브리노겐은 pH 6.3 내지 7.1, 바람직하게는 약 pH 6.32에서 최적으로 유지되어, 저장된 제제가 중화되거나 또는 트롬빈/Ca⁺⁺ 에 노출된 경우 빠르게 응고할 수 있게 된다. 상용화된 인간 피브리노겐이 냉각(~ 4℃)하에 저장된 경우, 최적의 pH는 pH 6.32 내지 8.0, 바람직하게는 약 pH 6.3 내지 7.5에서 최적으로 유지되어, 저장된 제제가 중화되거나 또는 트롬빈/Ca⁺⁺ 에 노출된 경우 빠르게 FS응고를 형성할 수 있게 된다(표 2 참조).

유사하게, 실온(~ 23℃)에서 저장된 상용화된 소 피브리노겐은 pH 6.5 내지 9.0, 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 8.2에서 최적으로 유지되어, 저장된 제제가 중화되거나 또는 트롬빈/Ca⁺⁺ 에 노출된 경우 빠르게 응고할 수 있게 된다. 상용화된 소 피브리노겐이 냉각(~ 4℃)하에 저장된 경우, 최적의 pH는 pH 6.5 내지 9.0, 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 8.2, 가장 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.07에서 최적으로 유지되어, 저장된 제제가 중화되거나 또는 트롬빈/Ca⁺⁺ 에 노출된 경우 빠르게 응고할 수 있게 된다(표 1 및 2 참조).

활성제 성분, 예로 트롬빈 또는 트롬빈 유사 효소

본 발명에서 "활성제"는 트롬빈 또는 트롬빈 유사 효소이다. "트롬빈 유사 효소"는 트롬빈을 포함하고, 피브리노겐으로부터 피브린을 형성시키도록 촉매화할 수 있는 효소를 의미한다.

포유류 혈액원의 트롬빈, 바람직하게는 환자에 사용하기 위한 인간 혈액원의 트롬빈에 더하여, 상기 효소는 피브리노겐 성분에 대하여 하기 기술한 바와 같이, 셀 배양 또는 재조합 방법에 의해 생산될 수 있고, 유리될 수 있다. 소 트롬빈은 팍케-데이비스(Parke-Davis)와 같은 다양한 출처원로부터 용이하게 상업적으로 얻을 수 있다.

트롬빈은 피브리노겐에 대해 촉매로 작용하여 피브린, 불용성 폴리머를 제공한다. 트롬빈은 피브리노겐의 중합을 촉매화하기에 충분한 양으로 FS 조성물에 존재한다. 트롬빈은 또한 인자 XIII, 피브린에 공유 교차 결합을 촉매화하는 플라즈마 단백질을 활성화하여, 결과물이 불용성 응고가 되도록 한다.

트롬빈 또는 트롬빈 유사체와 택일사항인, 트롬빈 유사 효소의 주된 원천은 파충류 응고제, 예로 뱀 독( Pirkle et al., Thrombosis and Haemostasis, 65(4):444-450(1991) 참조)으로부터 정제된다. 바라직한 트롬빈 유사 효소는 의도적으로 제한되지 않고, 안크로드(ancrod) 또는 바트록소빈(batroxobin), 특히 B.Moojeni, B.Maranhao 및 B.atrox 및 Ancrod로부터 얻어지고, 특히 A.rhodostoma로부터 얻어진다. 트롬빈 유사 효소의 선택에 따라서, 그러한 트롬빈 유사 효소는 비록 트롬빈과 다른 비율이지만, 피브린을 형성하는 피브리노펩타이드 A를 방출할 수 있다.

본 FS 제제의 저장 안정성 피브리노겐 성분이 인간 혈액, 예로 상처 부위와 접촉하게 되면, 환자 자신의 트롬빈 및 인자 XIII는 피브린 폴리머가 교차 결합된 피브린 폴리머로 전환되기에 충분하게 된다. 따라서, 내생 프로트롬빈 및 인자 XIII는 피브린 모노머 또는 비교차 결합된 피브린을 포함하는 조성물 성분으로서 발명의 FS에 사용될 수 있다. 그러나, 충분한 양의 내생 트롬빈 및 인자 XIII가 통상적으로 유효 피브린 봉합을 생산하기에 적당한 반응속도에서 저장 안정성 피브리노겐 성분을 교차결합된 피브린으로 전환하기에 충분한 양으로 유지되지 않는다는 것을 알아야 한다. 더 큰 상처에서, 더 많은 혈류는 내생 물질을 씻어내어 응고는 발생되지 않는다. 동일한 반응속도에서, 비교차 결합된 피브린을 교차 결합된 피브린으로 전환시키는 것보다, 피브리노겐을 교차 결합된 피브린으로 전환시키는 데에 보다 많은 트롬빈이 필요한 것 같다.

본 발명의 FS 조성물에서 트롬빈 성분의 농도는, 용액에서 40mg 피브리노겐에 대해서 150㎍ 트롬빈과 같은 작은 농도에서, 용액에서 피브리노겐과 트롬빈이 같은 비율로 되는 범위까지 가능한데, 이는 적용물, 주변조건(예로, 온도, pH, 혼합), 및 소정의 중합속도에 따라 결정된다. 피브리노겐 성분보다 FS조성물에서, FS조성물 ml에 대해서 약 4 내지 500 유닛의 트롬빈이 첨가된다. 또한, 트롬빈 성분이 상처 부위에서 제공될 수도 있다. 그러나, 피브리노겐 성분의 중합은, 더 많은 트롬빈이 용액에서 피브리노겐 각각의 분자를 활성화할 수 있는 한, 트롬빈 단독 첨가에 의해서 중합의 증가가 가능하지 않은 최대 지점까지 더 빠르게 진행할 것이다.

칼슘 이온의 출처원, 예로 CaCl₂는 본 FS 조성물에서 트롬빈 성분이 피브리노겐 성분을 활성화하기 전에 트롬빈 성분을 활성화 하는데 필수적이다. 그러나, 칼슘 이온은 저장된 트로빈 성분에 포함될 수 있다. 선택적으로, CaCl₂는 중합전에 FS 조성물에 첨가될 수 있거나, 충분한 양의 칼슘 이온이 상처 부위에서 간단하게 내생적으로 이용될 수 있다.

인자 XIII 결여 FS 제제에서, 인자 XIII는 피브린의 교차결합을 활성화하기 위해 최적으로 첨가된다. 활성화된 인자 XIII는 FS 조성물 ml에 대해서 약 1.0 내지 20 유닛의 인자 XIII의 최종 농도로, FS 조성물에 첨가될 수 있다. 선택적으로, 인자 XIII는 상처부위에서 혈액 또는 바디 유체에 의해 공급될 수 있거나, 또는 동일한 몸에서 유도된 플라즈마를 첨가하여 공급될 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 활성제 효소는 지지체에 고정된다. 이것은 적절한 기술로 수행될 수 있다. 예로, 지지체를 유도할 수 있는 다양한 활성 화학제는 디아조늄기, 이소시아네이트기, 산 염화물기, 산 무수물기, 설포닐 염화물기, 디니트로 플루오로페닐기, 이소티오시아네이트기, 하이드록실기, 아미노기, n-하이드록시숙신이미드기, 트리아진기, 히드라지노기, 카보디이미드기, 실란기 및 시아노겐 브롬화물이다. 예로, Dean, 친화 크로마토그래피--실용접근(in Affinity Chromatography-- A practical Approach), 존슨 및 미들 (Eds)(1991) IRL 출판 옥스포드 참조. 낮은 pH값, 예로 pH 4-6이 효소 저하를 방지하기 위해서 효소 커플링에 사용될 수 있다.

실리카를 사용할 수도 있지만, 아가로제(Agarose)가 지지체로 사용될 수 있다. 일반적으로, 지지체는 연속적으로 리간드의 작용기, 예로 -OH, -NH₂, -SH, -COOH, -CHO 와 반응하여 공유결합을 형성하는 고 반응 화합물에 의해 활성화된다.

본 발명의 다른 실시예에서, FS 조성물은 에너지 및/또는 광자의 적용을 통해 활성화된다. 에너지는 바람직하게는 전자기 스펙트럼에서 파장을 갖고, X-레이, 자외선, 가시광선, 적외선, 및 전파로부터 선택된다. 전자소작(electrocautery)과 같은 전기적으로 가열되는 프로브, 또는 팁에서 가스 압축을 통해 가열되거나 또는 가열된 가스 또는 액체를 팁을 통해 통과시켜 가열되는 프로브와 직접 접촉시켜 발산된 열 에너지가 사용될 수 있다.

초음파 주파수 또는 마이크로파 범위의 전파의 음성 에너지 또한 사용될 수 있다. 상기 에너지는 연속적 또는 불연속적으로, 좁거나 또는 넓은 밴드의 전자기 파장 범위로 발산된다. 광자원의 예로는 연속적 또는 불연속적으로 발산되는, 단색광 및 다색광, 간섭성 또는 비간섭성 광을 포함한다. 비연속성 에너지 및/또는 광자 발산의 예는 싱글 및/또는 멀티플 펄스 행렬(train) 발산을 포함한다. 광자는 극성 또는 비극성으로, 직접 또는 반사되어, 내부 또는 외부 간섭하에 또는 비간섭하에, 발산될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 레이저가 사용될 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니고, 자외선, 가시광선, 적외선 범위의 것도 사용될 수 있다.

트롬빈 및 칼슘 이온이 강력히 교반하면서 첨가되는 경우에 응고가 발생하지 않는 상용성 인간 피브리노겐의 저장된 용액은 "트롬빈-무반응성"이라 칭한다. 트로빈 무반응성 제제는 (물과 유사한 점도를 갖는)유체로 남게 된다. 그러나, 그러한 트롬빈 무반응성 피브리노겐 샘플을 SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크리아미드 겔 전기 이동)로 분석한 결과, 상기 피브리노겐 단백질이 비가역적으로 저분자 단편으로 손상되었다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기 제제는 더 이상 활성 피브리노겐을 포함하지 않고, 본 발명에 해당하지 않게 된다.

보충물 및 첨가물

언급된 바와 같이, 본 발명의 FS 조성물은 조성물의 최종 용도에 따라서 추가적으로 점도 조절제 및/또는 결합 증진제를 포함할 수 있다. 예로, 점도 조절제를 첨가하면 FS 조성물이 치료되거나 봉합된 조직에 특히 적합한 점도를 갖게 된다. 고 점도를 갖는 조성물은 바람직하게는 분리된 조직을 결합하는데 사용될 수 있는 반면에, 저 점도 조성물은 연속적인 조직 집단 및 Gortex™ 관 접목 등의 보철 재료에 물이 스며들지 않도록 봉합하기 위한 코팅을 형성하는데 적합하다. 그러한 점도 조절제는 특별히 한정되지 않고, 히알루로닉산 및 그의 염(예로, 소듐 히알루로네이트 또는 소듐 콘드로이틴)과 같은 비-세포 매트릭스 물질; 또는 프룩토스, 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 아가로스, 알지닉 산 또는 펙틴과 같은 당류; 글리세린과 같은 다중알콜; 콜라겐 및 카세이네이트와 같은 단백질 겔; 또는 그 혼합물을 포함한다.

또한, 결합 증진제가 조성물의 결합력을 향상하기 위해서 사용될 수 있다. 그러한 결합 증진제는 (i) 저장 안정성 피브리노겐 성분과 혼합하기 전에 활성제 성분에 첨가될 수 있거나, (ii) 중합전에 활성화된 피브리노겐/피브린 혼합물에 첨가될 수 있거나, (iii) 또는 FS 물질의 적용에 앞서 상처 표면에 분산될 수 있다. 결합증진제는 일반적으로 충전된 글리코스아미노글리칸, 올리고당 및 다당류, 다중 알콜, 및 극성 염료와 같은 극성 화합물에서 선택된다. 많은 이들 화합물은 또한 점도 조절제로 작용할 수 있다. 그러한 극성 화합물의 예는 특별히 제한되지 않고, 히알루로닉산, 콘드로이틴 설페이트, 카복시메틸-셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 글리세린, 인도시아닌 그린, 및 플루오르에센 소듐을 포함한다. 칼슘과 같은 다가 양이온은 또한 알부민과 같은 FS 조성물, 히알루로닉산 및 콘드로이틴 설페이트와 같은 글리코스아미노글리칸의 단백질 성분에 음으로 충전된 모이어티에 결합함으로써, 결합력을 증진시킬 수 있다.

점액 접착제(mucoadhesives)는 상처 표면이 위장 및 폐 기관과 같은 뮤신을 포함하는 경우에 유효한 결합증진제이다. 점액 접착제는 카복시메틸셀룰로오스 및 소듐 알지닉산염을 포함한다. 하이드록시 그룹을 고농도로 포함하고 있는, 고 콜라겐 함유량을 갖는 상처 표면에 이들 물질을 사용하면 결합 형성을 용이하게 할 수 있다. Robinson et al., Ann. NY Acad, Sci. 507:307-314(1987)에 보고된 바와 같이, 스웰링(swelling) 및 수소 결합 모두에 고밀도로 충전하는 것이 바람직하며, 그 경우 소정의 조직 표면에 견고한 부착이 가능하게 된다. 당업자에게 자명한 점액 접착제가 또한 사용될 수 있다.

상기 조성물은 또한 필요에 따라 추가적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항산화제, 삼투압제, 및 방부제를 포함할 수 있다. pH 조절제의 예는 특히 한정되는 것은 아니고, 아세트산, 보릭산, 하이드로클로릭산, 소듐 아세테이트, 소듐 바이설페이트, 소듐 보레이트, 소듐 카보네이트, 소듐 시트레이트, 수산화나트륨, 질산나트륨, 인산나트륨, 아황산나트륨, 황산을 포함한다. 계면활성제의 예는 특히 한정되는 것은 아니고, 벤잘코늄 클로라이드를 포함한다. 항산화제의 예는 바이설페이트를 포함한다. 삼투압제의 예는 염화나트륨을 포함한다. 방부제의 예는 클로로부탄올, 솔베이트, 벤잘코늄 클로라이드, 티메로살, 메틸파라벤, 프로필파라벤, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), 및 폴리쿠아드를 포함한다.

일반적으로, pH 조절제, 계면활성제, 항산화제, 삼투압제, 및 방부제는 0.001 내지 5 중량%의 농도로 존재한다.

조성물의 성분들은 소정의 목적에 접합하도록 원하는 결합력 및 점도를 부여하는 양으로 서로 결합된다. 일반적으로, FS 조성물에서 펩타이드의 양은 약 1 내지 99중량%의 범위이고, 바람직하게는 약 5 내지 80 중량% 범위이고, 더욱 바람직하게는 6 내지 70중량% 범위이고, 더욱더 바라직하게는 6 내지 50 중량% 범위이고, 가장 바라직하게는 8 내지 35중량% 범위이다. 당류가 존재한다면, 당류는 약 0.1 내지 70중량% 범위로 결합될 수 있다. 글리코스아미노글리칸이 존재한다면, 이는 약 0.1 내지 20중량% 범위이다. 다중알콜이 존재한다면, 이는 약 0.1 내지 90중량% 범위로 첨가될 수 있다.

점도변화제와 접합향상제와 같은 첨가제의 양은 일반적으로 불과 약 65중량%이다.

FS 조성물의 점도는 수행중인 특정 외과적 행위에 맞게 선택된다. 분리된 조직들의 접합을 위해서는, 약 1,000 에서 1,000,000 센티푸아즈(centipoise)까지의 점도가 유리하며, 특히 약 20,000 에서 200,000 센티푸아즈까지의 범위가 바람직하다. 상기 바람직한 범위의 점도를 갖는 FS 조성물은 피하주사기 또는 이중주사기에 의해 분출하고 주사기 끝을 움직여 상처부위 여기저기에 펴바름으로써 분리된 조직들 위에 용이하게 놓여질 수 있다. 그 점도 범위 내에서는, FS 조성물은 조직들로부터 유출되지 않고 고정된 상태로 유지되며, 심지어 조직 접합부를 형성하기 위하여 에너지가 가해질 때에도 마찬가지이다.

본 발명의 FS 조성물의 점도는 조직 또는 보철 재료를 밀봉하기 위한 수밀(watertight) 코팅의 형성을 필요로 하는 응용분야의 경우 더 낮은 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서는, 코팅을 위한 바람직한 점도는 10 에서 1,000 센티푸아즈의 범위에 있다. 더 낮은 점도는 조성물을 펴바르는 즉각적인 능력을 가능하게 함으로써 코팅중인 조직 또는 재료를 효과적으로 덮도록 하기 위하여 선호된다.

히알루론산, 또는 기타 비뉴튼 유체가 FS 조성물에 첨가되면, 점도는 감소하면서 전단력이 증가한다. 따라서, FS 조성물의 점도는 조성물이 상처표면에 도포될 때 전단력을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 매우 두꺼운 FS 조성물이 빠른 또는 높은 전단변형율(shear rate)로 이식용 조직편(graft)을 통하여 주입되어, 이식용 조직편이 의사 가소성(pseudoplasticity)으로 알려진 성질을 활용하는 물질로 코팅되는 전이상(transit phase) 동안 점도를 감소시킨다. 이렇게 하면, 중합 공정 중에 전단력을 받지 않는 위치들에서의 접합에 있어서, 고점도의 FS 물질이 이상적인 것으로 된다. 조성물이 주입될 때, 전단력은 크고 점도는 감소하여 주입을 용이하게 한다. 조직에 놓여진 후에, 전단력은 0으로 떨어지고, 따라서 조성물의 점도는 빠르게 증가한다. 그 결과, 조성물은 조직상에 국한된 상태로 있게 된다.

본 발명의 일부 실시예들에서는, 상기한 바와 같이 피브리노겐 용액이 저장 시간의 길이 전체에 걸쳐 유지되고 자발적인 엉김이 야기되지 않는 한, FS 조성물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 성장인자(growth factor), 약제(drugs), 혈액 인자(blood factor) 또는 기타 화합물(들) 또는 이들의 혼합물들 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로 된 임의의 개수의 화합물들로 보충되고, 또한 상기 임의의 개수의 화합물에 대한 운송매질(carrier vehicle) 또는 전달매질(delivery vehicle)로서 작용한다. 예를 들어, FS 조성물 또는 저장안정성(storage-stable) 피브리노겐 성분과 같은 FS 조성물의 일 성분을 성장인자로 보충함으로써, FS 조성물은 사람 환자 또는 동물 피험체에, 특히 상처부위에 사용될 때 상처의 치유, 조직의 재생 등의 촉진, 증진 또는 향상시킬 수 있다.

보충물은, 첨가제의 특성, FS 중합 속도, 성분들간의 상호작용 등에 따라, 피브리노겐 성분 또는 트롬빈 성분과 혼합되거나, 또는 이들의 조합과, 또는 최종 FS 조성물과 혼합될 수 있다. 이러한 보충물들의 투약량은 통상적인 피브린 실란트(sealant)에 이용되는 양과 동일한 것으로 생각된다.

최상의 결과로는, 보충된 FS 조성물은 운송매질 또는 전달매질로 사용될 때, (1) 성장인자(들), 약제(들), 또는 기타 첨가제(들) 또는 성분(들)의 생물학적 작용을 강력하게 하거나, 자극하거나 또는 중개하고; (2) 조제품(preparation) 내의 성장인자를 억제 또는 파괴하게 될, 보충된 FS 조성물 또는 여기에 사용되는 저장안정성 피브리노겐 성분의 하나 이상의 첨가제(들) 또는 성분(들)의 작용을 감소시키며; (3) 본 발명의 FS 조성물 또는 저장안정성 피브리노겐 성분으로부터의 첨가제 또는 성분의 전달이 연장될 수 있도록 하고; 또한 (4) 기타 바람직한 성질을 보유하도록 작용한다. 의도된 첨가제(들) 또는 보충물(들)은 이들의 변종, 유도체, 끝이 잘린 형태 기타 변형된 형태를 모두 포함하는 것이며, 이들은 이들이 유래된 화합물 또는 조성물의 생물학적 작용(들) 또는 그 부분집합과 유사한 생물학적 작용(들) 또는 그 부분집합을 보유한다.

둘 이상의 첨가제 또는 성분이 본 발명의 FS 조성물에 의해 동시에 첨가되거나 또는 공급될 수 있다. 이러한 첨가제(들) 및/또는 성분(들)의 농도는 목적에 따라 FS 조성물 내에서 변할 것이지만, 그 농도는 이러한 화합물(들) 및/또는 조성물(들)이 의도된 또는 명시된 목적을 달성할 수 있게 할 정도로 충분해야만 한다. 이러한 첨가될 보충물(들)의 양은, 여러 농도를 시험하고 어느 농도가 의도된 목적 및 사용 위치에 대하여 효과적인지를 선택함으로써, 당해 기술분야의 통상적인 기술에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 염료, 추적자, 표지 등이 또한, 예를 들어 뒤이어 일어나는 FS 조성물의 전달을 검사하기 위해 첨가될 수 있다.

보충된 FS 조제품은 예를 들어, 약제(들), 항체(들), 항응혈제(들), 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 및 인자 XIII과 같은 응고 인자들, 및 폰 빌레브란트 인자, 그리고 성장인자들, 및/또는 이러한 것들을 필요로 하는 인간 또는 동물 환자에게 본 발명만큼 능률적이고 효과적으로 작용하지 않을 기타 전달장치 또는 전달기구에 의해 현재 전달되는 기타 화합물들을 포함한다. 백혈구 또는 내피 개체수를 보충하거나 늘리거나, 백혈구, 내피 세포 등의 효소접촉반응을 억제하거나, 또는 새로운 펩타이드를 조절하는데 사용되는 여러 성분들이 첨가될 수 있다. 생물학적으로 중요한 화합물들은, 한정함이 없이, EGF, TGFα, TGFβ, TGF-I 및 TGF-Ⅱ, FGF, PDGF 등의 성장인자들; IFN-α, IFNβ, IL-2, IL-2 IL-3, IL-6, 조혈인자 등의 사이토킨; 면역 글로불린; 인슐린, 코르티코스테로이드, 호르몬 등의 신진대사 물질을 포함한다. 기타 물질들은 예를 들어 중합체, 유리, 금속, 세라믹, 이들의 복합물질 등, 생리학적으로 사용가능한 이형플라스틱 물질들과 같은 구조 물질들을 포함한다.

기타 물질들, 예를 들어 피브로넥틴, 아프로티닌 같은 피브린 분해반응 억제제, 알파-2-안티플라스민, PAI-1, PAI-2, 6-아미노헥산산, 4-아미노메틸시클로헥산산, 또는 콜라겐이 또한 첨가될 수 있다.

FS 물질은 자가이식된 것이든, 배양된 것이든, 또는 변형된 것이든, 또한 동종이식이든 이종이식이든, 상피세포, 표피세포, 섬유아세포, 조골세포, 간엽세포, 간세포, 췌장세포(예를 들어, 마크로파지, 혈소판, T세포, B세포, 과립구, 단핵세포, 각질세포 등) 같은 세포들, 또는 배양되고 변형된 세포들과 혼합되어 치료 또는 성장 향상 물질을 전달한다.

치과 또는 정형외과에서 사용하는 경우, 자연산이든 합성이든 무기질 미네랄 또는 무기질 미네랄의 혼합물을, 바람직하게는 하이드록시아파타이트 또는 뼛가루나 뼛조각에서 발견되는 미네랄을 포뮬레이션에 첨가할 수 있다. 미네랄은 원하는 유동 특성 또는 의도된 용도 및 용처에 따라 피브리노겐 성분과의 체적비가 약 1:2에서 약 4:1까지로 존재한다. 탈무기질골(Demineralized bone matrix: DBM)은 조골단백질(bone morphogenetic proteins: BMP)로 알려진, 오스테오제닌(osteogenin)을 포함하는 골유도 단백질과 골 모세포들의 증식을 조절하는 성장인자들의 근원이다(예를 들어, 하우슈카(Hauschka) 외, J. Biol. Chem. 261:12665-12674(1986) 및 카날리스(Canalis) 외, J. Clin. Invest. 81:277-281(1988) 참조). 불행하게도, DBM 물질들은 입상 골수 자가이식과 겸비되지 않는 한 임상에 거의 사용되지 않고, 수용자의 뼈 안에 외과적으로 위치되어 치료효과를 발생시킬 수 있는 DBM의 품질에는 한계가 있다. 게다가, DBM 분말과 오스테오제닌은 이들의 골유도 잠재력이 표현되기 전에 조직 유체에 의해 씻겨나가버릴 수도 있다. 더욱이, 조직 유체의 DBM으로 채워진 골 공동 내로의 침투 또는 부드러운 조직이 상처 베드 안으로 무너지는 것은 DBM과 오스테오제닌의 골유도 성질에 크게 영향을 미칠 수 있는 두 가지 요인이다. 부드러운 조직이 상처 베드 안으로 무너지는 것은 마찬가지로 오스테오콤퍼턴트 줄기세포의 상처 베드 내로의 적절한 이동을 억제할 수 있다.

FS는 또한 "사다리"로 작용할 수 있는데, 이 사다리는 세포들이 상처 부위 내로 이동하여 새로운 조직을 생성하는데 이용할 수 있다. 추가적으로, 생육가능 조골세포들이 기증자 위치로부터 획득하여 이식에 사용하기 위하여 조성물에 포함될 수 있다. 입자형태의 다른 뼈 복원 재료들이 사용될 수 있다. 적합한 이형플라스틱 재료들 중에는 폴리락트산과 폴리글리콜산, 폴리메티크릴레이트, 폴리HEMA, 바이오글래스, 세레비탈(cerevital) 및 다른 유리들, Al, Ti, CoCr 및 기타 금속, Al₂O₃ 및 기타 세라믹들 등과 이들의 조성물 및 복합물들이 있다. 이들은 뼈 미네랄에 대한 것과 동일한 체적대체적비로 사용될 수 있다. 조직 회복 위치에 따라 단백질 입자들 또는 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 알부민 등으로부터 만들어진 비드들과 같은 다른 복원 재료들도 또한 사용될 수 있다. 리포솜 또한 포함될 수 있다.

상기한 바와 같이 FS 조성물은 감염을 감소 또는 예방하기 위한, 예를 들어 젠타마이신, 세포탁심, 네바세틴 및 시소마이신 등의 항생제, 라니티딘과 항암제 같은 히스타미닌 H₂-길항제(거스도프(Gersdorff) 외, Laryngoscope 95:1278-80(1985); 에덜레(Ederle) 외, Ital. J. Gastroenterol. 23:354-56(1991); 론파드(Ronfard) 외, Burns 17:181-84(1991); 사쿠라이(Sakurai) 외, J. Control. Release 18:39-43(1992); 몬덴(Monden) 외, Cancer, 69:636-42(1992); 그레코(Greco), J. Biomed. Materials Res. 25:39-51(1991); 크램(Kram) 외, J. Surgical Res. 50:175-178(1991) 참조). 항생제는, 액체라면 FS의 액체성분에 포함되거나 또는 중합반응 전의 FS 조성물 내에 포함될 수 있고, 분말 형태라면 액체 성분에 부유하게 할 수 있다. 약 배출 시스템에서 사용하기 위한 광범위한 항생제의 치료투약 레벨은 잘 알려져 있다(예를 들어, G. D. Winter, D.F. Gibbons, H. Plank(Eds.) 저, Biomaterials, 존와일리&선즈, 뉴욕(1980), pp.669-676 참조). 항미생물제는 구강내와 같은 노출된 상처회복부위에, 또는 화상과 같이 위험에 노출된 상처부위에 사용되는 조성물에 특히 유용하다.

크로모포어 및 지시자 조성물(Chromophores and Indicator Compositions)

일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 내인성 또는 외인성 크로모포어를 더욱 포함하여 재료를 온혈동물 체내에 위치시키는 동안의 시각화를 용이하게 한다. 크로모포어의 사용은 상처부위를 표적을 겨누기 위해 FS를 시각화할 수 있게 한다. 이는 또한 원하는 사용 부위로부터 이동된 임의의 물질을 식별하는 신속한 수단을 제공하고, 곧 이어서 셀룰로스 스폰지, 거즈 패드, 또는 기타 흡수 재료를 사용하여 이물질을 제거할 수 있게 한다. 헤모글로빈과 같은 내인성 크로모포어의 사용은 크루거(Krueger) 외, Lasers Surg. Med. 5:55-60(1985)에 개시되어 있다. 생물학적 접착제의 배치를 돕는 외인성 크로모포어의 사용은 이미 설명되었다(예를 들어, 나사두크(Nasaduke) 외, Ann. Ophth. 18:324-327(1986) 참조).

사용될 수 있는 크로모포어에는 플루오레세인 아이소씨어사이어네이트, 인도사이어나인 그린, 질화은, 로즈 벵갈, 나일 블루 및 에반스 블루와 같은 은 화합물, 큐-스위치(Q-Switch^TM)(코닥, 인크), 수단 Ⅲ, 수단 블랙 B 및 인디아 잉크가 있다. 크로모포어는 조성물 총중량 기준으로 약 0.01에서 50중량%의 농도를 나타내는 것이 바람직하다. 당업자에게 명백한 기타 유형의 크로모포어들 또한 사용될 수 있다.

이러한 물질들은 조성물의 흡수특성을 변경시켜 조성물이 낮은 에너지 레벨에서 에너지를 흡수하게 한다. 이것은 에너지 흡수 화합물에 의해 선택적으로 흡수되는 특정 파장의 전자기 스펙트럼을 이용하여 물질을 가열할 수 있게 한다. 예를 들어, 이것은 본 발명의 조성물에 의해 에너지가 흡수되지 않을 특정 레이저를 이용하여 물질을 가열할 수 있게 하며, 레이저를 이용하여 조성물이 표적에 접합될 수 있게 한다. 특정 파장에서 최대 광흡수 점을 갖는 염료의 선택과 이를 레이저 광선과 같은 광원으로부터 방출되는 빛의 파장과 일치시키는 것은 코팅 또는 밀봉 부위에서 조성물의 선택적인 활성화를 허용하며, 동시에 인접한 조직에 대한 바람직하지 못한 동반 열 상해의 위험을 현저히 감소시킨다.

인도시아닌 그린 또는 플로우레신과 같은 외인성 염료, 헤모글로민 및 멜라민과 같은 내인성 발색단 등이 이런 목적을 위해 특히 적합하다. 또한 이들 염료들은 접착력, 혈액 강도 및/또는 점도를 증가시킬 수 있다. 이런 염료들은 조성물의 총중량을 기초로하여 약 0.01내지 50중량%으로 조성물에 존재하는 것이 바람직하다.

카오트로픽제(chaotropic agent)

FS 제품 피브린의 형성을 지연시키는 것이 바람직한 경우에는, 활성제와 피브리노겐의 접촉에 의해 형성되는 피브린 모노머의 연속 중합을 막기 위해 카오트로픽제가 첨가된다. 상기 카오트로픽제는 이런 피브리노겐 조성물과 혼합된 후에 변형 피브리노겐 용액을 형성하기 위해 약 1 내지 2분 동안 교반된다. 피브리노겐은 상기한대로 피브리노겐 모노머로 변환될 수 있으나, 중합은 지연될 것이다.

적절한 카오트로픽제는 예를 들어, 우레아, 브롬화나트륨, 염산 구아니딘, KCNS, 요오드화 칼륨 및 브롬화 칼륨을 포함한다. 카오트로픽제의 바람직한 농도는 약 0.2 내지 6.0몰이고 가장 바람직하게는 약 0.3 내지 약 2.0몰이다. 피브린 모노머가 연속적으로 중합되는 것을 막을 수 있는 최소량의 카오트로픽제를 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 칼슘 이온의 소스는 피브린 모노머의 중합을 원할 때까지 카오트로픽제에 첨가되지 않는다. 이것은 내인성 혈액 응고 인자에 의한 활성에 의해 피브리 모노머가 가교되지 않게 할 것이다.

만일 카오트로픽제가 피브리노겐 또는 트롬빈 성분들의 수용성 버퍼에 첨가되었다면, 생성된 피브린 조성물은 예를 들어, 증류수로 조성물을 희석함으로써 가교된 피브린으로 변형될 수 있다. 희석이 실행되어, 희석제의 최소량이 사용된다. 일반적으로, 희석 후의 카오트로픽제의 농도는 약 0.5 내지 약 0.1몰이어야 한다.

FS 조성물의 버퍼링

상처 부위에 사용하자마자, 한 실시예에서 FS 조성물은 약 5이하의 pH를 갖는 산 완충용액을 사용하여 산성으로 완충시키는 것이 바람직하다. 적절한 산성 버퍼 용액의 한정되지 않는 예들은 아세트산, 숙신산, 글루쿠론산, 시스테인산, 크로톤산, 아이타논산, 글루탐산, 포름산, 아스파라산, 아디프산 및 이의 염을 포함한다. 숙신산, 아스파라산, 아디프산, 아세트산의 염이 바람직하고, 아세트산 나트륨이 가장 바람직하다. 산 버퍼의 바람직한 농도는 약 0.02M 내지 약 1M이며, 바람직하게는 약 0.1M 내지 약 0.3M이다. 상기 바람직한 농도는 더욱 생물학적으로 접합가능한 조성물의 이온 강도를 제공한다.

따라서, 본 발명의 실시예에서, 피브린 모노머를 포함하는 조성물은 실질적으로 활성제 효소가 없다. 트롬빈이나 트롬빈 유사 효소 모두가 제거되는 것을 말하거나 또는 조성물에 남아있는 임의의 트롬빈 유사 효소가 바람직하지 않은 약제적 효과를 제공하는데 있어 불충분한 수준에 있는 것을 "실질적으로 없는"이라고 한다. 따라서, 실질적으로 없는 본 발명의 조성물들은 일반적으로 피브린 응고에서 발견되는 효소의 약 0 내지 10%, 바람직하게는 효소의 약 0 내지 2% 양의 활성제 효소를 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예는 앞선 정의에 따라 환자의 순간 FS 조성물을 제조하는 방법을 더 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예서, 본 발명의 FS 조성물은 적절한 알카라인 버퍼(alkaline buffer)를 사용하여 제조된다. 적절한 알카라인 버퍼의 비제한적인 예들로는 HEPES, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드(potassium hyddroxide), 칼슘 하이드록사이드, 소듐 바이카보네이트(bicarbonate) 및 포타슘 바이카보네이트와 같은 바이카보네이트 버퍼, 씨트르산의 트라이메탈(tri-metal) 염, 아세트산의 염과 황산의 염을 포함한다. 바람직한 알카라인 버퍼로는 0.5-0.75M 소듐 카보네이트 / 바이카보네이트 pH 10-10.5, 0.5-0.75M 소듐 바이카보네이트 / NaOH pH 10.0, 1.5M 글리씬(glycine)/ NaOH pH 10.0, 0.5-1.0M 비스 하이드로옥시에틸아미노에탄 술폰산(bis hydroxyethylaminoethane sulphonic acid, BES) pH 7.5, 1M 하이드록시에틸피페라진 프로판(hydroxyethylpiperazine propane) 술폰산(EEPS) pH 8.5, 0.5M 트리신(tricine) pH 8.5, 1M 모폴리노(morpholino) 프로판 술폰산(MOPS) pH 8.0, 1M 트라이스하이드록시메틸아미노에탄(trishydroxymethyl aminoethane) 술폰산(TES) pH 8.0 및 0.5M 싸이클로헥실아미노에탄(cyclohexyl aminoethane) 술폰산(CHES) pH 10.0을 포함하고; 0.5-0.75M 소듐 카보네이트 / 바이카보네이트 pH 10-10.5, 0.5-1.0M 비스 하이도록시에틸아미노에탄 술폰산(BES) pH 7.5, 1M 하이드록시에틸피페라진 프로판 술폰산(EEPS) pH 8.5 및 1M 트라이스하이드록시메틸 아미노에탄 술폰산(TES) pH 8.0이 가장 바람직하다.

사용되는 알카라인 버퍼의 양은 피브린을 중합화하기에 충분해야 한다. 피브린 모노머를 포함하는 조성물의 약 10 부 내지 약 1 부가 약 1 부의 알카라인 버퍼와 혼합되는 것이 바람직하다. 이러한 비율은, 바람직한 비율은 버퍼의 선택 및 피브린 모노머의 요망되는 "세기"에 따르지만, 약 9:1인 것이 가장 바람직하다.물론, 피브린 모노머의 요망 세기는 FS 조성물의 의도된 최종 용도에 의하여 결정된다.

FS 중합 활성화

피브린 단위체를 포함하는 조성물의 카오트로픽제(chaotropic agent)를 희석하거나 pH를 증가시키기 위해, 상기 조성물의 프로트롬빈 및 인자 XIII가 가교 피브린을 형성하기 위해 활성화되는 것이 바람직하다. 상기 활성화는 FS 조성물의 성분들을 칼슘 이온원과 접촉시킴으로써 행해질 수 있다. 칼슘 이온원은 피브리노겐 또는 트롬빈 완충제에 포함될 수 있다. 위에서 알 수 있는 바와 같이, 비한정적인 칼슘 이온원은 바람직하게는 약 30mM의 농도에서 염화 칼슘을 포함한다. 선택적으로, 덜 바람직하지만, 칼슘 이온은 상처에서의 피에 의해 공급될 수 있다.

탄산염/중탄산염 완충제가 사용되면, 칼슘 이온원은 용해화 단계 동안에 산 완충제에 첨가되어야 한다. 이는 염화 칼슘이 탄산염/중탄산염 완충제에 용해되지 않기 때문이다. 바람직하게 산 완충액에서의 칼슘 이온의 농도는 약 5 mM 내지 약 150 mM이고, 더욱 바람직하게는 약 5mM 내지 약 50mM이다.

제품 안전성

세포 배양에 의해 준비되지 않으면, FS 조성물은 혈장 단백질을 포함하고, 그 결과, 혈장 단백직을 오염시킬 수 있는 혈행성 병원체, 특히 간염 바이러스 또는 HIV로 인한 오염의 위험을 수반한다. 공지된 바이러스 불활성 방법을 사용하는 경우 큰 출혈 표면에 사용되더라도 상용 피브린 밀폐제로부터의 바이러스 전파의 보고는 없었다. 혼주 인체 혈장(pooled human plasma)으로부터의 혈장 유도체의 제조에 있어서, 바이러스는 분획 프로세스(fractionation process)의 일부로서 분배(partition)된다. 특정 바이러스는 일부 분획(fraction)들과는 분배되지만 다른 분획들과는 분배되지 않기 때문에, 일부 경우에 있어서 자체 분배가 특정 감염제의 혈장 유도체를 제거하기에 충분할 수도 있다. 그러나, AIDS 유행으로부터, HIV는 면역글루불린으로부터는 효과적으로 제거될 수도 있지만, 항혈우병 인자 농축물에 잔류할 수 있다는 것이 알려져 있다. 따라서, 모든 분획들이 오염되었고 강력한 불활성 방법이 사용되었다고 가정되는 것이 매우 중요하다.

다수의 바이러스 불활성 방책이 연구되어 왔고 종래 기술 문헌에 서술되어 있다. 예를 들면, 혈액제제 내의 바이러스 불활성 방법은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 투석, 초미세여과법, 2단계 증기 가열(누적), 고 온도 및 압력 멸균, 트리(n-부틸) 인산염 또는 트윈(Tween) 80과 같은 용매 세척제(solvent detergent), 프소랄렌 유사체와 같은 광화학물, 저온살균(가열), 방사선 노출, 및 자외선광 치료를 포함한다. 고온 가열 및 스팀 방법에 의한 바이러스 불활성은 본 피브리노겐 용액을 포함한 생물학적 활성 단백질 용액에 대해 실현불가능하지만, 나노여과(nanofiltration)는, 본 발명의 인체 피브리노 용액과 같은 성분들의 불활성을 야기하는 단계가 없는, 인체 피브리노겐 용액을 무균 저장 컨테이너에 담는 단계 이전의 선택적 처리이다.

5 로그 만큼 감염도를 줄이는 바이러스 불활성 방법은 제제(preparation)가 더 이상 감염성이 아니다는 것을 보장해야 한다. 예를 들면, 티씰(Tisseel) VH 피브린 밀폐제의 제조에서 사용되는 증기 가열 프로세스는 2 단계 프로세스의 각 증기 가열 단계에 대해 적어도 6.4 로그 감소 유닛만큼 바이러스 역가(titer)를 감소시켜서 오염 위험을 무시할만큼으로 줄이는 것으로 알려졌다. 다양한 세척 단계들이 본 기술분야에서 공지된 방법으로 안정화 첨가제를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 종래 기술의 피브린 밀폐제 조성물들로 바이러스 불활성을 효과적으로 제공하기 위해 공지된 방법들이 사용될 수도 있고 본 발명의 인스턴트 FS 제품을 위해 동등하게 효과적일 것이다.

FS 조성물을 준비하고 사용하는 방법

본 발명의 FS 조성물을 형성하는 방법은, 일반적으로 양호하게 형성된 조성물을 생기게 하는 후술되는 준비 기술을 포함한(그러나 이에 한정되는 것은 아님) 다수의 방법으로 행해질 수 있다. 상기 준비는 22.5℃ 내지 30℃ 이하에서 일반적으로 행해진다. 초기에, 피브리노겐 및 활성제 성분들은 적절한 농도로 멸균 수양액으로 형성된다. 이전에는 불가능했던 본 발명의 장점은 수양액이 결합된 때의 본 발명의 FS 조성물을 형성하는 활성 또는 능력에 있어서 큰 변화없이 몇일, 몇주 또는 몇달 동안 안정적으로 저장될 수 있다는 것이다. FS 조성물이 필요할 때, 피브리노겐 성분은 FS의 의도된 목적에 따라서 CaCl₂, 인자 XIII 및 다른 첨가제들을 또한 포함할 수 있는 활성제 성분과 결합된다. 성분들은 조성물의 최종 사용 용도에 의해 결정되는 비율로 결합된다. 주요 성분들의 분자들의 혼합을 향상시키기 위해, 졸 또는 겔 형태까지 다음의 실시예에서 서술되는 바와 같이 강력하게 교반하거나 진동시킴으로써 내부적으로 또는 외부적으로 조성물을 휘젓는 것이 일반적으로 바람직하다.

다른 실시예에서, 물질의 점성, 결합성, 또는 가시성을 향상시키기 위한 첨가제들이 상기 성분들이 결합된 후에 첨가될 수도 있다. pH 조절제, 안정제, 단백분해효소 억제제, 표면활성제, 항산화제, 삼투제(osmotic agent), 보존제 등과 같은 성분들이, 그 자체가 FS에 영향을 미치지 않지만 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)의 환자 또는 조직으로의 전달을 위해 첨가되는 성분들과 함께 이 시기에 첨가될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 향균제가 피브리노겐으로 전혀 첨가되지 않고, 오히려 무균상태가 공지된 기술을 사용하여 보존된다. 그러나, 다른 실시예에서, 향균제가 예시되는 정도로 첨가되어, 장기간 저장 동안의 피브리노겐 용액 성분의 미생물 오염을 막는다. 임의의 알려진 생리적 향균제일지라도, 피브리노겐 용액의 활성이 저장 기간동안 유지되고, 자발적 응고가 발생되지 않고, 인체 사용에 금지되지 않는 한, 본 발명의 목적을 위해 허용될 수 있다.

따라서, 인체 프브리노겐과 같은, 저장 안정 피브리노겐으로부터 준비된 본 발명의 인스턴트 피브린 밀폐제는, 임의의 공지된 방법으로 사용될 수 있다. 여기서, 상기 생물학적으로 준비되거나 보충되거나 보충되지 않은 조직 부착제들은, 성형 재건 수술에서 연조직 대치제 또는 연조직 확대제와 같이; 봉합을 사용하지 않거나 더 적은 봉합으로 수신 부위에 피부 이식을 부착시키기 위하거나, 뼈 치료 및 재건에 있어서 이식된 무손상 골모세포를 위한 성장 기질과 같이, 항생제, 항신 생물제, 마취제 등의 전달과 같은 주입 목적을 포함한 예컨대 약리학적으로 또는 미용 용도로 사용된다. FS는 또한, 소골 복원, 신경 연결, 또는 봉합에 의한 회복이 불가능하거나 바람직하지 못한 다른 상황과 같은, 또는 상처 드레싱과 같은 응용을 위해 사용될 수 있다.

FS는, 상처 치료, 응고, 및 피브리노겐빈혈을 위한; 수술 또는 수술후 후유증의 억제를 위한; 코팅 인공삽입물을 위한; 드레싱가능한 상처 치료를 위한, 그리고 안전하고 지속되는 지혈, 즉 환자 내에서의 액체 및/또는 기체 유출 방지 등을 위한 외과적 조치 및 기술에 의해 결정되는 여러 방식으로 적용될 수도 있다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예들은 본 발명의 인스턴트 FS 조성물의 직접적 사용 방법을 제공하여, 예컨대 제한없이 조직 또는 장기를 연결하고, 지혈하고, 상처를 치료하고, 수술 상처를 봉합하고, 혈관 수술에서 사용하고, 말단의 심장 동맥 연결, 좌심실 봉합 라인들, 대동맥적개 및 도관 부위의 구멍 출혈, 재수술에서 발생되는 근육밖 기본 출혈의 확산, 정맥 출혈 부위로부터의 삼출을 봉합하기 위해 지혈하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한, 다크론 봉합 및 삽입 이전의 다른 이식 및 코팅 인공삽입물, 비장 간, 및 다른 실질 기관에서의 지혈, 기관 및 기관지 연결 및 폐의 공기 누출 또는 열창의 봉합, 기관지 전단끝, 기관지 샛길 및 식도 샛길의 봉합; 무봉합 꿰맴없음 치료, 및 뇌내 AVM, 간 AVM의 혈관 방사선에 있어서의 색전술, 결장의 혈관형성이상, 식도 정맥류, 소화 궤양에 부수적인 "펌핑" 위창자 출혈의 봉합 등에 유용하다. 본 발명은 각막 이식, 코피, 편도절제, 치아 뽑기, 및 다른 응용에 지혈을 제공하기 위해 더욱 사용될 수 있다.

전술한 응용들 각각에 있어서, 환자 정상 조직에 손상이 있다. 손상의 위치 또는 FS의 적용 부위는 본 명세서에서 일괄적으로 "상처 부위"로 언급된다. 하지만 이것이 언제나 그것 자체로 상처가 될 수 있는 것은 아니다. 예컨대, 공기 누출(air leakage)이 반드시 상처일 필요도 인공삽입물의 삽입일 필요도 없다. 그러나, 간략함을 위해, 이들은 본 명세서에서 "상처"로 일괄적으로 언급된다. 왜냐하면, 이들 각각이 정상 조직에서의 손상에서 일어나고, 본 발명의 FS 조성물의 적용에 의해 봉합되고 치료되기 때문이다.

본 발명의 바람직한 실시에 있어서, FS 조성물이 형성되어 "순간적으로" 즉 상처 부위와의 접촉과 동시에 변환되거나, 300초 내에, 바람직하게는 180-240초 내에, 더 바람직하게는 150-180초 내에, 한층 더 바람직하게는 100-150초 이내에, 가장 바람직하게는 100초 이내에 피브린 단위체가 형성하여 중합 또는 부분적 중합 피브린으로 변환되고/되거나 비가교 피브린이 가교 피브린으로 변환된다. 실제로, 인스턴트 FS 덩어리는 일반적으로 60초 이하에서, 30초 이하에서 더 자주 형성되고, 본 명세서에서 제공된 실시예에서는, FS 덩어리는 8 내지 30초에서, 9초 내지 12초에서 일관성있게 형성된다.

따라서, "순간적으로" 또는 "동시에"는 또한, 저장 안정 피브리노겐 성분의 활성화에 있어서, 300초 이내에, 바람직하게는 180-240초 이내에, 더 바람직하게는 150-180초 이내에, 한층 더 바람직하게는 100-150초 이내에, 더 한층 더 바람직하게는 100초 이내에, 한층 더 한층 더 바람직하게는 60초 이내에, 더 한층 더 한층 더 바람직하게는 8 내지 30초에, 전형적으로는 9 내지 12초에 발생하는 피브린 형성 단계를 언급한다. 그러나, 가장 긴 시간일지라도, 본 발명의 FS는 어떤 종래 기술 제제와 비교하더라고 "순간적"이다. 왜냐하면, 피브리노겐은, 다른 성분(들)이 냉동 건조 또는 냉동된 형성들로부터 또는 신선한 혈액 또는 혈장 샘플로부터 상기 성분(들)의 별도 혼합 및 준비 또는 난이한 측정 및 시간 소비가 없는 것처럼, 수양에서 언제나 사용 가능하기 때문이다.

한 바람직한 실시예에 있어서, 중합이 상기 언급된 시간 범위 내에서 완료하기 위해서는 일부 추가적 시간이 걸릴 수 있지만, 상처 부위에서 피브린 형성 단계 및 접촉 단계는 "동시에" 즉 같은 시점에 발생한다. 그러나, FS 조성물 성분의 피브린으로의 변환 단계는 활성 및/또는 접촉의 60초 이내에, 바람직하게는 30초 이내에, 더 바람직하게는 15초 이내에, 한층 더 바람직하게는 10초 이내에, 가장 바람직하게는 0-10초 이내에 일어난다. 그렇지 않으면, FS 조성물은 의도된 부위로부터 흘러 내릴 수 있다.

마지막으로, "순간적으로" 및 "동시에"는, 변환 단계가, (저장 안정 피브리노겐이 활성에 기인하는) 모든 피브린 단위체가 중합되거나 가교 피브린으로 변환되는 접촉 단계보다 많이 앞서는 것은 아니지만 접촉 단계 이전에 시작하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 본 실시예는, 저장 안정 피브리노겐 성분이 상처부위에 결과적으로 생겨난 결합 조성물의 적용 이전에 주사기 타입의 디바이스 내에서 칼슘 이온의 존재 하에 트롬빈 또는 트롬빈 유사 효소로의 노출에 의해 활성화될 때 일어날 수 있다. 모든 결과 피브린이 중합되고 접촉 단계 이전에 가교 피브린으로 변경된다면, 조성물은 임의의 유동성을 보유하지도 않고 만족스러운 밀폐제를 형성하지도 않고 더 이상 상기 목적으로 사용될 수 없다. 저장 안정 피브리노겐 성분이 FS 피브린 조성물로 변환되기 위해 약 30초 이내의 시간이 이상적으로 걸리기 때문에, 카이오트로픽제와 같은 성분이 변환을 지연하기 위해 첨가되지 않는다면, 변환 단계는 30초 이상 바람직하게는 많아야 3-10초 이상 접촉 단계에 앞서서 시작되어서는 안된다. 본 발명은 FS 조성물의 최대 양이 적당한 부위에서 중합되는 한편 동시에 훌륭한 피브린 덩어리를 형성하는 것을 보장하기 때문에 바람직하다. 결과적으로, 저장 안정 피브리노겐에서 준비된 본 발명의 FS 조성물은 밀폐제 형성의 준비에 있어서 많은 가능한 변수들을 제거하여, 밀접하게 제어되는 조건하에서 상처 부위에 FS조성물의 순간적 응용이 가능하도록 한다.

FS 전달(Delivery)

본 발명의 FS 제품은 사용 이전에 적어도 2개의 성분들을 혼합함으로써 편리하게 형성된다. 제 1 성분은 사용 준비 완료(ready-to-use) 수양액 내의 저장 안정 피브리노겐을 포함하고, 제 2 성분은 전형적으로 트롬빈 또는 트롬빈 유사 할성제 및 칼슘 이온인 활성자 성분이다. 인자 XIII 및/또는 다른 첨가 성분들 또한 본 명세서 내의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 2개의 주사기 시스템을 사용하여 편리하게 전달된다. 여기서 주사기들은 약 1mm 또는 그 이하의 직경 개구를 갖는 주사기 대 주사기 연결구에 의해 결합된다. 단순하고, 일반적으로 사용가능한 기구로써 실질적 균일성이 달성될 수 있다.

종래 기술에서의 FS 응용은 이중 주사기 디바이스를 포함한다. 이는 흐름이 상처로 향하게 하기 위해 일반적으로 큰 바늘을 사용하여 피브리노겐 및 트롬빈이 단일 포트에서 배출될 때 피브리노겐과 트롬빈을 혼합한다. 그러나, 상기 전달 시스템은 바늘과 튜브에 막힘을 유발할 수 있는 덩어리를 형성하는 것으로 알려져 있다. 공지된 이중 주사기 시스템은 채우고 사용하기에 불편하고, 피브리노겐 및 트롬빈 성분이 제대로 혼합되지 않으면, 그 결과 생기는 덩어리는 강도 및 탄성이 부족할 수 있다. 많은 상처 부위들이 상당한 양의 액체를 부위에서 누설시키기 때문에, 부적절하게 형성된 피브린은 비효율적으로 되거나 흘러버릴 수 있다. 그러나, 이러한 문제는 본 발명에 의해 극복될 수 있다. 왜냐하면, 안정된 피브리노겐이 혼합, 계측, 또는 시간 지연 없이 수양액 내에 사용 준비 완료 형태로 저장되고, 이는 바로 펜 타입의 주사기 전달 디바이스에 저장될 수 있기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 성분들은 중합 직전에 혼합된다. 상기 성분들은 부착의 최종 준비를 단순화하기 위한 적절한 체적으로 상기 성분들을 혼합하는 것을 가능하게 하는 농도로 형성될 수 있고, 바람직하게 상기 체적들은 실질적으로 동일하다. 편리하게, 폐기 가능 팁을 갖는 이중 배럴(barrel) 주사기 홀더가 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 두개의 성분들이 전술한 바와 같이 2개의 주사기들을 사용하여 혼합될 수 있고, 상기 성분들은 상처 부위에 직접 적용되고 상기 부위에서 혼합이 일어난다. 그러나, 바람직하게, 상기 성분들은 전달 이전에 철저히 혼합되거나, 전달 프로세스 op의 일부로서 부위로의 전달 시점에 FS 조성물을 형성한다.

이중 배럴 주사기는 Y 형태일 수 있고 따라서 저장 안정 조성물로부터의 FS 조성물의 혼합과 접촉 단계 직전 또는 이와 동시에 변환 단계의 활성화를 가능하게 한다. 선택적으로, Y 형태 이중 배럴 주사기 이외에, 2개의 개구를 갖는 이중 배럴 주사기가 사용될 수 있다. 이는 상처 부위의 동시 접촉과 저장 안정 성분들로부터 FS 중합체로의 변환을 가능하게 한다. 또다른 선택적 실시예에 있어서,이중 배럴 주사기의 저장 안정 성분들이 원하는 부위 상에 스프레이될 수 있다(클램 등, 미국 외과 의사, 57:381(1991)을 보라). 또다른 선택적 실시예에 있어서, 저장 안정 성분들은 천공되거나, 부러지거나, 녹여지거나, 단순히 제거되어 나중에 변환되는 FS의 전달 직전에 성분들의 혼합을 가능하게 하는 비-다공성(non-porous) 물질에 의해 분리되는 단일 배럴 주사기 내에 보관된다.

선택적으로, 피브리노겐은 주사기에 의해 전달되는 약물과 함께 사용되는 표준 약 전달 기술을 사용하여 큰 컨테이너로부터 전달 디바이스로 용이하게 적출될 수 있다.

피브린 밀봉제(sealant) 키트

본 발명에서는 적어도 두개의 바이알(vial)을 포함하는 인스턴트 FS 조성물의 전달에 사용할 준비가 된 키트가 더욱 제공된다. 하나의 바이알(vial)은 상술한 바와 같이 유리가 아니며, 활성용액과 혼합하였을 때 FS를 형성하기에 적당한 농축상태에서 저장 안정한 피브리노겐의 수용액을 함유한다. 활성용액으로는 트롬빈 또는 트롬빈-유사 조성물이 사용된다. 두번째 바이알은 활성 용액을 포함하고 있다. 이 활성용액은 첫번째 바이알에서 저장에 안정한 피브리노겐의 내용물들과 혼합하였을때 FS를 형성하기에 적절한 농도에서의 트롬빈인 것이 바람직하다. 본 명세서에서 "바이알"은 그 내부에 한 배럴의 주입기를 포함하며, 복수의 바이알들은 복수-배럴 주입장치를 포함한다.

두 개가 혼합되었을때 피브리노겐 성분을 중화시키기 위하여 활성용액의 pH는 조정될 수 있다. 그리고 중화용 완충액의 별개 바이알은 활성성분과 혼합되기 전에 피브리노겐 성분을 중화시키기 위하여 제공될 수도 있다.

염화칼슘(CaCl₂)과 같은 칼슘이온의 제공처는 피브린 중합화를 보장하기 위한 유효량으로 적어도 두개의 바이알중의 하나의 내용물에 저장되거나 첨가된다. 바람직하게는 상기 제공처는 트롬빈 활성 성분과 결합된다. 선택적으로, 상기 칼슘(CaCl₂) 성분은 첨가적 바이알에서 제공되기도 한다. 첨가 성분들 즉,안정제 및/또는 인자(Factor)ⅩⅢ, 및/또는 성장인자(growth factor), 약물, 항생제 등과 같은 첨가제들은 하나 이상의 첨가적 바이알들에 의해 제공된다. 그리고 그러한 첨가성분들은 적어도 두개의 바이알의 내용물에 저장되거나 첨가되어 있다.

발명의 바람직한 실시예에서, 저장에 안정한 피브리노겐 성분은 약 75 - 115 ㎎/㎖의 범위내의 농도에서 제공된다. 그리고, 트롬빈은 거의 500IU/㎖에서 제공된다. 존재할 때 CaCl₂는 대략 40mmol/liter에서 제공되고, 아프로티닌(aprotinin)과 같은 피브리놀리시스(fibrinolysis) 억제자는 존재할 때 대략 3000KIU/㎖에서 제공된다. 존재한다면 첨가 성분들은 그것들이 첨가된 목적에 의해 정해진 적당한 농도에서 제공된다. 예를 들어, FS 성분 자체를 안정화하려는 경향의 항미생물(antimicrobial) 성분은 본 명세서에서 구체화된 것과 같이 낮은 농도에서 제공된다. 반면에 FS가 적용되는 환자에 느리게 방출 전달되는 경향이 있는 항미생물 성분은 상당히 높은 농도에서 제공된다. 그런 양 또는 농도는 의학 제제의 기술분야에서 숙련자들에게 잘 알려져 있고, 결정되어질 수 있다. 마찬가지로 그러한 개개인은 두개 이상의 특정 성분들 또는 첨가제들이 금기사항 없이 단일 바이알에서 저장되거나 결합되는지, 또는 동일한 성분들이나 첨가제들이 각각의 바이알에서 따로 제공된다면 더욱 독립적으로 활성적이거나 저장성이 안정한 상태로 남아 있게 되는지를 알 수 있을 것이다.

본 발명은 실시예를 통하여 더욱 잘 설명된다. 그러나 실시예들은 본 기술분야의 숙련자들에게 설명의 목적으로 제공되고, 제한하려는 의도는 아니다. 더욱이 실시예들은 첨부된 청구항들의 범위를 제한하도록 구성되지 않는다. 그리하여, 본 발명은 다음의 실시예들로 제한되는 것이 아니라 본 명세서에서 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 모든 변경들을 포함하여 해석되어야 한다.

실시예 1: 실온 및 중성 pH에서 수용액에 저장된 피브리노겐을 사용하는 조제물들에 대한 FS 응집 분석

피브리노겐의 저장에 안정하고 바로 사용할 수 있는(ready-to-use) 수용액으로부터 FS 조성물을 빠르게 제조할 수 있는 능력을 평가하기 위하여 오랜 시간동안 수용액에 저장되어진 피브리노겐을 사용하여 제조된 피브린 밀봉제의 응집 활성(clotting activity)이 평가되어졌다.

소(Bovin) 피브리노겐, 소(Bovin) 트롬빈, 완충용액, 염화칼슘, 수산화나트륨 그리고 염산은 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.)로부터 구입하였다. 인간 피브리노겐은 53%의 단백질(95% 응집될 수 있는)과 47% 염을 함유하는 것으로 규명되었다. 소 피브리노겐은 61%의 단백질(97% 응집될 수 있는)과 39%의 염을 함유하는 것으로 규명되었다.

표준 연구 등급의 피브리노겐은 단리 및 정제 공정에서 사용된 염을 함유한다. 이것은 시트르산나트륨과 염화나트륨을 포함한다. 따라서, 피브리노겐 40㎎/㎖용액은 예를 들어 피브리노겐에 더하여 54mM의 시트르산나트륨과 419mM의 염화나트륨을 함유한다. 또한, 비록 본 발명의 바람직한 실시예에서 어떤 항미생물제도 피브리노겐에 첨가되지 않고, 알려진 기술을 사용하여 살균(sterility)이 유지되더라도 항미생물제로서 각각의 샘플에 아지드화나트륨(sodium azide)(0.025%)이 첨가되었다.

응집분석은 일반적으로 Los Angeles, CA April 13-15,1989 (in Liss, New York, 1990)의 최근 혈우병 보호 향상에 관한 절차 심포지움에서의 Kasper와 일치한 다음과 같은 방법으로 이루어졌다. 각각의 피브리노겐 샘플의 부분표본(Aliquots) (100㎕)은 4㎖ 폴리프로필렌 시험관에 첨가되었다. 각각의 샘플은 0.1M의 수산화나트륨, 0.2M의 히스티딘(histidine) 완충액(pH 6.0) 또는 0.1M 염산(상당한 부피를 사용한 선행 연구에서 결정된)을 사용하여 중화(pH 7.0 - 7.5)되었다. 트롬빈은 1M 염화칼슘(피브리노겐 조제물에서 시트르산나트륨에 비해 칼슘이 3-6mM 과량)을 가지고 200units/㎖로 제조되었다. 상기 트롬빈 조제물은 0.1M 히스티딘 완충액(pH 7.2)을 가지고 최종 100units/ml의 트롬빈 농도(피브리노겐의 mg 당 트롬빈 2.5 units)로 희석된다. 모든 샘플들은 실온(23±2˚C) 에서 평가 분석되었다.

응집은 반응 시간에 따라서 측정되었다. 상기 반응은 트롬빈 100㎕이 피브리노겐 샘플(100㎕)에 첨가될 때 일어났고, 상기 혼합물은 격렬하게 혼합되었다. 시간은 상기 용액이 점성 겔(혼합된 액체가 상당히 느릴 때)로 바뀔 때와 고체 덩어리(혼합 후에 모든 액체가 운동을 멈추었을 때)로 바뀔 때 기록되었다. 고체 덩어리를 형성하는데 까지의 걸린 시간은 겔이 형성된 시간의 2배 정도가 되곤 했다.

기술된 절차에 따라서, 응집분석 매뉴얼이 25˚C에서 저장된 피브리노겐 용액들을 중화하고, 트롬빈(125 units/㎎ 피브리노겐)을 첨가하고, 피브리노겐 용액에서 시트르산염에 비해 3-5mM 많은 염화칼슘을 첨가함으로써 수행되어졌다. 상기 조제물은 격렬하게 혼합되었고, 덩어리를 형성하는데 요구되는 시간은 상술한 바와 같이 측정되었다.

pH 7.24의 히스티딘 완충액에서 실온(~23˚C)의 수용액에서 저장된 소 피브리노겐을 사용하는 응집 결과는 다음과 같다: 3일 동안 저장된 피브리노겐을 사용해서 9초 내에 형성된 덩어리, 36일 동안 저장된 피브리노겐을 사용해서 10초 내에 형성된 덩어리, 72일(10주 이상) 동안 저장된 피브리노겐을 사용해서 9.5초내에 형성된 덩어리. 따라서, 응집 분석 결과들은 조제물서 FS 덩어리를 형성하는데 걸리는 시간에 대하여 일치한다. 상기 조제물은 수용액(산성도가 중성인)에서 사용준비가 되어 오랜 시간 동안 실온에서 저장된 피브리노겐으로 부터 조제되었다.

실시예 2: 두 온도 및 일련의 pH 값에 저장된 피브리노겐 용액을 사용하는 FS 응집 분석(clotting assay)

피브리노겐의 저장에 안정하고 바로 사용할 수 있는(ready-to-use) 수용액으로부터 FS 조성물을 빠르게 제조할 수 있는 능력을 평가하기 위하여 응집 활성(clotting activity)이 일련의 pH 값(pH 6.50-pH 9.87)에 걸쳐 실온(~23℃) 및 저온(4℃)에서 오랜 시간동안 수용액에 저장되어진 피브리노겐을 사용하여 제조된 피브린 밀봉제로부터 평가되어졌다. 피브리노겐의 똑같은 용액들이 실시예 1에서의 안정성 연구에서 기재된 바와 같이 응집 분석에서 평가되어졌다.

응집 결과는 각각 0.1M 완충액:히스티딘, pH 6.0 또는 7.2; 트리스 pH 8.16의 하나에서 저장되어 각각 제조된 소 피브리노겐(39㎎ 단백질/㎖)의 표 1 및 인간 피브리노겐(40㎎ 단백질/㎖)의 표 2에 나타내어진다.

표 1 : 23℃ 및 4℃에 저장된 소 피브리노겐에 대한 응집 시간

일수로의 시간	온도 ℃	응집 시간(초)
일수로의 시간	온도 ℃	pH 6.5	pH 7.36	pH 8.2	pH 9.04	pH 9.87
4	23	12	13	15	12	210
4	4	10	9	15	10	응집되어짐
7	23	10	10	11	11	240
7	4	11	10	10	10	응집되어짐
22	23	9	10	10	>300	>300
22	4	부분 응집	부분 응집	응집되어짐	응집되어짐	응집되어짐
97	23	10	100	>300	>300	응집되어짐
97	4	응집되어짐	응집되어짐	응집되어짐	응집되어짐	응집되어짐

NT=시험안함. "응집되어짐"은 트롬빈의 추가 없이 자발적인 응집을 나타냄.

표 2: 23℃ 및 4℃에 저장된 인간 피브리노겐에 대한 응집 시간

일수로의 시간	온도℃	응집 시간(초)
일수로의 시간	온도℃	pH 6.32	pH 7.13	pH 8.04	pH 8.79	pH 9.43
4	23	10	10	11	12	120
4	4	10	10	9	10	응집되어짐
7	23	10	10	9	11	240
7	4	10	9	8	9	12
22.	23	10	8	10	>300	>300
22.	4	10	8	9	NT	NT
97	23	30	>300	>300	>300	>300
97	4	18	10	10	11	>300
149	23	NT	>300	>300	NT	NT
149	4	15	135	30	>300	>300

상술한 명세서에서 인용된 특허, 특허출원 및 공보들 각각과 모두는 전체적으로 참조로서 본 명세서에 삽입되어진다. 상술한 명세서는 어떤 바람직한 실시예로서 기술되어졌고 많은 설명들이 예시를 목적으로 보여졌지만 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자들에게 다양한 개량과 추가적인 실시예가 적용될 수 있고 본 명세서에서 기술된 부분들이 발명의 성질 및 범위를 변경시키지 않고 상당히 변화될 수 있다는 것은 자명하다. 그러한 개량, 균등한 변경 및 추가적인 실시예 역시 첨부된 특허청구범위의 범위내에 있다.

본 명세서의 내용 중에 포함됨

Claims

저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분 및 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분으로부터 제조되어진 바로 사용할 수 있고 즉시 입수가능한 피브린 밀봉제(FS) 조성물.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 피브리노겐 및 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분의 중합화 전, 중합화 동안 또는 중합화 바로 후에 첨가되어진 피브린 밀봉제(FS) 조성물.
제1항 또는 제2항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 생체외에서(in vitro) 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 생체내에서(in vivo) 사용하는 방법.
저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분과 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분을 결합하고, 상기 성분들을 피브린 겔 또는 졸을 형성할 때까지 함께 혼합하는 것을 포함하는 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 제조하는 방법.
저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분과 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분을 결합하고, 적어도 하나의 추가 성분을 상기 결합된 성분들에 첨가하며, 상기 성분들 모두를 피브린 겔 또는 졸을 형성할 때까지 함께 혼합하는 것을 포함하는 제2항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 제조하는 방법.
저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액이 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 전달하기 바로 전까지 모든 다른 성분들로부터 별도로 저장되어지는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 전달하는 방법.
제7항에 있어서, 피브린 밀봉제(FS) 조성물이 저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분은 하나의 배럴에 별도로 저장되어 있고 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분은 두번째 배럴에 저장되어 있는 이중 배럴 주입기로부터 전달되고, 상기 성분들이 주입기로부터 전달되면 혼합되어 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하는 방법.
제8항에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분은 이중 배럴 주입기 장치의 두번째 배럴에 저장되어진 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분과 함께 저장되고 상기 성분들은 전달되면 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하도록 모두 함께 혼합되는 방법.
저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분 및 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분은 구멍 나거나, 깨지거나 용해되거나 단순히 제거되는 비다공성 물질에 의해 분리된 단일 배럴 주입기에 별도로 저장되어져 주입기로부터 전달되거나 전달되기 바로 전에 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하도록 상기 성분들을 혼합하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 전달하는 방법.
피브린 밀봉제(FS) 조성물의 제조, 전달 및 사용에 대한 한 세트의 지시; 및 저장에 안정한 피브리노겐 용액의 수용액을 포함하는 유리가 아닌 바이알을 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 제조하고 전달하기 위한 키트.
제11항에 있어서, 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분을 포함하는 바이알을 더 포함하는 키트.
제11항 또는 제12항에 있어서, 성분들을 혼합하여 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하는 수단을 더 포함하고 이로부터 피브린 밀봉제 조성물이 전달되는 키트.
제12항 또는 제13항에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 두번째 바이알에 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분과 함께 저장되고, 전달되면 성분들이 모두 함께 혼합되어 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하는 키트.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바이알이 이중 배럴 주입기의 한 배럴을 형성하는 키트.
구멍 나거나, 깨지거나 용해되거나 단순히 제거되는 비다공성 물질에 의해 분리되어져 주입기로부터 전달되거나 전달되기 바로 전에 피브린 밀봉제 조성물을 형성하도록 상기 성분들을 혼합하는 (1) 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 제조하고 전달하고 사용하기 위한 한 세트의 지시; (2) 저장에 안정하고 수성인 피브리노겐 용액 성분 및 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분을 포함하는 유리가 아닌 주입기를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 제조하고 전달하기 위한 키트.
제16항에 있어서, 성분들을 혼합하여 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하는 수단을 더 포함하고 이로부터 피브린 밀봉제(FS) 조성물이 전달되어지는 키트.
제16항 또는 제17항에 있어서, 적어도 하나의 추가 성분이 수용액인 활성화된 트롬빈 또는 트롬빈-유사 성분과 함께 저장되어지고, 전달되면 성분들이 함께 혼합되어 피브린 밀봉제(FS) 조성물을 형성하는 키트.