JPH07505076A - 血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板因子に富む生物接着剤の調製方法及びその適用本発明の目的は、凝固性ヒ ト血漿蛋白質を含有する生物接着剤を製造することである。本発明に従って得ら れる生物接着剤は、特に、血小板由来の成長因子を含有する。

トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物又はフィブリノーゲン溶液が、特に止血作用 を発揮しながら生組織の結合を可能とする接着物質の製造中に用いられるという ことは知られている。例えば、仏国特許第２　４　、４　８　９　０　０号明細 書に見ることができる。この接着物質は、一般に゛生物接着剤”と呼ばれており 、手術で用いられている。

生物接着剤は、生理的条件下で凝固工程の最終段階を再現することを可能とする 。そのために、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含んだ溶液を、使用の直 前に、処置する生組織上で、トロンビン及びカルシウムイオンを含んだ溶液と混 合する。トロンビン及びカルシウムイオンの存在下で、フィブリノーゲンはフィ ブリンに転化する。フィブリンモノマーは相互に結合し、フィブリンポリマーを 形成し、これらのポリマーは活性化された第ＸＩＩＩ因子の作用によって架橋結 合される。カルシウムイオンの存在下でトロンビンの作用により活性化された第 ＸＩＩＩ因子は、トランスアミダーゼであり、ネットワークの形成を伴ったフィ ブリン鎖間のペプチド結合を形成する。

本明細書において、”生物接着剤”なる語は、トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮 物（高濃度物：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を意味する。だが、実際、正確にはそ のような濃縮物が接着剤を構成するのは、トロンビンとカルシウム塩の存在下（ 又は、それが含有するプロトロンビンの活性化の後）のみである。

フィブリンネットワークの形成が、生物接着剤の止血活性を引き起こす。更に、 フィブリンは、特にフィブロネクチン及びコラーゲンを通して周辺組織に接着す る。加えて、活性化第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン及びフィブロネクチンビボで は、プラスミンと呼ばれる蛋白分解酵素の作用でフィブリンクロットが徐々に消 失し、このことによって接着結合の持続が制限されることが知られている。しか しながら、例えばα−２−アンチプラスミン又はアプロチニン等のプロテアーゼ インヒビター、さもなければε−アミノカプロン酸をそれらに加えることによっ て生物接着剤の作用の持続を増強することは可能である。

生物接着剤の適用は非常に多く、特に手術においては、出血を避けるため、縫合 糸の代わりに、又は、縫合を補強するために適用できる。

しかしながら、従来の生物接着剤は搬痕形成を促進することができる特異活性を 有していない。

搬痕形成が、創傷に存在するターゲット細胞に直接作用するある種の成長因子に よって、特に促進されるということが知られている。これらの成長因子は、増殖 や分化、更には細胞遊走（走化性）さえを引き起こす。血小板は、血液中の成長 因子の主要な供給源の一つである。

インビボでは、細胞の損傷中、血小板アクチベーターの作用でトロンビンを含む 血小板は顆粒中に包含された成長因子を放出する。活性化血小板の上清は、非常 に多様な分子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミン グ成長因子−β、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板因子−４、血小板由来血管 内皮細胞増殖因子、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、インシュリン様成長因子 −１、結合組織活性化ペプチドＩＩＩ、β−トロンボグロブリン、上皮細胞成長 因子、プラスミノーゲン、フォンウィルブランド因子、フィブリノーゲン、セロ トニン、ヒスタミン、アデノシン　ジー又はトリーホスフェート、フィブロネク チン、ビトロネクチン、血小板第Ｘ１ｌｌ因子、蛋白分解性又は解糖系酵素、ア ラキドン酸の代謝産物等を含む。特に、Ｈ，Ｌ、　ｌｏｎｇ　＆　Ｓ、Ｍ、　１ ａｈｌ　”ペプチド成長因子及びそれらのレセプター″５ｐｏｒｎ　＆　Ｒｏｂ ｅｒｔｓ編、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、ｐ、５１０　 ；　Ｒ，Ａ、Ｔｅｒｋｅｌｔａｕｂ　＆　Ｍ、Ｈ。

Ｇｉｎｓｂｅｒｇ”創傷修復の分子及び細胞生物Ｃ１ａｒｋ　＆　ｌｌｅｎｓｏ ｎ編。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、３８　に見ることがで きる。

血小板抽出液は、高い分裂誘発活性を含んでおり、又その鍛痕形成能が知られて いる。特に、Ｄ、　Ｋｎｉｇｈｔｏｒｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、、　１９６．３７９−３８８　（１９８２）　；　Ｄ、ｌ ［Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、”創傷治癒における成長因子及びその他の特徴 ”、Ｂａｒｂｕｌ。

Ｐｉｎｅｓ、　Ｃａｄｗｅｌｌ　Ｈｕｎｔ　１ｉｉｉ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ ｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９８８、　ｐ、３０３−３１７　；米国特 許第４７６０１３１号明細書、及びＰＣＴ特許出願　Ｗｏ　８６１０３１２２、 Ｗｏ　８８１０３４０９、Ｗｏ　８９１０５６５６４：見ることができる。

今、トロンビン−凝固性蛋白質及び血小板因子を互いに合わせることを可能とす る方法により、特に廠痕形成を促進する改善された生物接着剤を得ることができ ることを見いだした。

トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物の調製方法は知られている。原料は血漿、即 ち血液から血液細胞を除いたものからなる。言い換えれば、それは血小板が激減 された製造物である。その方法は、エタノールで（Ｃｏｈｎ法）又は寒冷沈降物 の製造によってフィブリノーゲンを沈降させることを必須の工程として含む。寒 冷沈降′物の調製は、血漿を凍結し、次いで０℃を越えた６℃未満の温度、一般 には１℃〜４℃で融解することからなる。特にフィブリノーゲン及びフィブロネ クチンを含有する残存の固形画分は寒冷沈降物と呼ばれ、遠心分離により液両分 から分離できる。寒冷沈降物の容量は、一般に開始原料の血漿の容量の１／２５ 〜１／１００である。それ故、寒冷沈降物製造の条件下で不溶性の血漿蛋白質は 、寒冷沈降操作により２５〜１００倍に濃縮される。しかし、このようにして得 られた調製物は、成長因子は少ない。特に、公知の工業的方法によって°　調製 された生物接着剤は、注目すべき分裂促進活性は含有していない。

今、得られる液画分と寒冷沈降物の間に血小板因子の一様な分布が通常期待され るようなときに、開始原料製造物として血小板に富む血漿を用いることにより、 寒冷沈降物製造の条件下で通常可溶性である多くの血小板因子が、該寒冷沈降物 中に非常に高い比率で保持されるようになることが見いだされた。

本発明の方法は、二つの分離した調製を行う必要なく、トロンビン−凝固性蛋白 質濃縮物の止血及び接着特性、及び血小板抽出液の廠痕形成活性を合わせ持った 製造物を得ることを可能とした。

このように、本発明の方法によって、寒冷沈降物中のＰＤＧＦの濃度比は一般に １０より大きい。ＰＤＧＦの収率は、一般に、開始原料血漿中に存在する１０６ 血小板当たり２０ｎｇより大きい。

それ故、本発明の主体は、少なくとも一つの血小板由来成長因子を含むことによ って特徴づけられる、トロンビン−凝固性蛋白質の濃縮物を含有する生物接着剤 である。

前記成長因子は、特にＰＤＧＦである。

本発明に従って得られる生物接着剤は、一般に少なくとも２０　ｎ　ｇ　／　ｍ 　ｌ　、多くの場合は少なくとも５０　ｎ　ｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含有する。一 般に、前記生物接着剤は２０〜６００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含有する。

本発明による生物接着剤は、血小板抽出液中に通常存在する他の製造物、特にβ −トロンボグロブリン、タイプ１プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター （ＦＡＩ−１）、血小板第Ｘ１ｌｌ因子（第ＸＩＩＩ因子−Ａ）を含んでもよい 。例えば、少なくとも１０μｇ　／　ｍ　１　ｓ特に１０〜３００μｇ　／　ｍ 　Ｉのβ−トロンボグロブリン、少なくともｌμｇ／ｍｌ、特に５〜４０μｇ／ ｍｌのＦＡＩ−１を含む。第ＸＩＩＩ因子−８に対する第ＸＩＩＩ因子−Ａの比 は、通常血漿中のこれらの因子の比の少なくとも１゜２倍、特に１．２〜４倍で ある。

本発明の生物接着剤は、例えば、 蛋白質　二６０〜２００　ｇ／ｌ フィブリノーゲン　：３０〜１５０　ｇ／ｌ、特に５０〜１００　ｇ／ｌ フィブロネクチン　二６〜１４　ｇ／１１特に８〜１２ｇ／ｌ 第ＸＩＩＩ因子　＝１０〜６０　血漿等価単位アルブミン　：１０〜３８　ｇ／ ｌ特に１８〜血漿等価単位とは、プールした血漿中に存在する第ＸＩＩＩ因子の 通常の血漿濃度に相当する。

蛋白質濃度は、ビウレット法によって決定される。フィブリノーゲンの濃度は重 量法によって、フィブロネクチン及びＦＡＩ−１の濃度は仕様書に従いＥＬＩＳ Ａ試験（Ｓｔａｇｏ）によって、第ＸＩＩＩ因子活性は仕様書に従いペプチド基 質（ベリクロム　Ｆ　ＸＩＩＩ　試薬、ベーリング社）中のグリシンエチルエス テルの取り込みによって起こるアンモニア放出試験によって、第ＸＩＩＩ因子− Ａ及び第ＸＩＩＩ因子−８は特異的な抗血清（Ｓｔａｇｏ）を用いたラウレル法 によって決定される。アルブミンの濃度は、仕様書に従ってセルロースアセテー ト（５ｅｂｉａ）上で電気泳動することにより決定される。アルブミンを示す泳 動バンドの蛋白質量は、デンシトメーター分析により決定される。

本発明の生物接着剤は、血液凝固の内因経路又は外因経路を活性化することによ って凝固特性を与えるのに十分な量の凝固性因子を含む。生物接着剤は、例えば 、プロトロンビンの通常の血漿濃度の０．５〜１．５倍のプロトロンビンを含む 。これは仕様書に従って、特異的抗血清（Ｓｔａｇｏ）を用いたラウレル法又は 時間測定法（Ｓｔａｇｏ欠損Ｉ　Ｉ　ＳＳｔａｇｏ　）によって決定した。

生理緩衝液で１／２に希釈した上記生物接着剤溶液は、１／２〜１／６に希釈し た通常血漿のそれと同等のクイックタイムを有している。ここでいうクイックタ イムとは、血液凝固の外因経路を活性化する能力を調べるものである。

それは、仕様書に従いトロンボプラスチンを含む、′ネオブラスチン″　（商標 、Ｓｔａｇｏ　）試薬を用いて決定される。

生理緩衝液で１／２に希釈した上記生物接着剤溶液は、１：１〜１：４に希釈し た通常血漿のそれと同等のカオリンタイムを有している。カオリンタイムとは、 血液凝固の内因経路を活性化する能力を調べるものである。それは、試験中にセ ファ゛リンを省略した以外は仕様書に従いＣ，Ｋ。

ＰＲＥＳＴ試薬（Ｓｔａｇｏ）を用いて決定される。

本発明の生物接着剤は、常法によって示すことができる分裂誘発特性を与えるの に十分な量の血小板因子を含有する。

本発明の生物接着剤の分裂誘発活性は、例えば、１／４０００に希釈したものが （一般には、１１５０００に希釈した場合でも）、定常期へと刺激された３Ｔ３ 細胞によるトリチウムラベルチミジンの取り込み測定試験において、０．１ｎｇ ／ｍｌのＰＤＧＦを含んだ溶液のそれと少なくとも同等の分裂誘発活性を有する ようなものである。

このような試験は、例えば、ＢＡＲＴ　Ｃ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ、２９．１６６−１７２　（１９９０）に記 載されている。

３Ｔ３細胞は、Ｓ　ｗ　ｉ　ｓ　ｓ　マウス　胚芽細胞である（細胞株　ＡＴＣ ＣＣＣＬ　９２）。サブクローニングによって得られた細胞株もまた入手できる （Ｎ　Ｉ　Ｈ／３　Ｔ３、ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５８）。

本発明の生物接着剤は、血小板に富む血漿由来の寒冷沈殿物を含むことが必須で ありうる。そして本発明は、血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いること によって特徴づけられる、凍結血漿から寒冷沈殿物を調製し回収するところの生 物接着剤の調製方法に関するものである。

言い換えれば、本発明の方法は、寒冷沈殿物を調製する前に血小板に富む血漿を 調製することによって特徴づけられる。血漿における血小板の濃縮操作は、常法 に従って、特に、集めた血液の遠心によって行える。

血小板に富む血漿はまた、１ｍｌ当たり少なくとも５×１０　の血小板、特に１ ｍｌ当たり１×１０８〜ＩＸ１０９の血小板、例えば１ｍｌ当たり約１×１０８ 〜５×１０８の血小板を含む。

寒冷沈殿物の製造条件は通常の条件である。例えば、凍結は一１５℃以下の温度 、例えば−１５〜−６０℃で行う。

製造物は、少なくとも製造物全てが熱平衡になるのに十分な時間この温度に維持 される。この時間は、例えばおよそ１２〜７２時間になる。

次いで、血漿を、０℃を超えるが全凍結製造物が液化する温度未満の温度で融解 する。この工程は、一般に１〜６℃、特に４℃近辺で行われる。融解温度で温度 する期間（ま、熱平衡に到達するのに十分な時間であり、例えば、１２〜２４時 間である。

その後、寒冷沈殿物を液両分から分離する。そのために、融解血漿を、再凍結し ないのに十分高い温度で、かつ寒冷沈殿物の液化を防ぐのに十分低い温度で遠心 し、次０で、上清を公知の方法で除く。そして遠心沈殿物を構成する寒冷沈殿物 を回収する。寒冷沈殿物の容量は、一般に、開始原料血漿容量の１／２５〜１／ １００となる。

一般に、遠心は１〜６℃の間の温度で行う。

得られた寒冷沈殿物から成る上記生物接着剤をすぐ；こ使用することを望まない 場合は、例えば−２０℃で、それを再凍結することができる。

上記生物接着剤をすぐに使用する予定の場合は、それを十分な温度、通常は３２ 〜３８℃で加熱し液化するのが好ましい。

本発明による血小板因子に富む生物接着剤の製造方法の簡便さは、この方法を、 自己生物接着剤、すなわちあるドナー由来の血漿から得てこのドナーに用いる生 物接着剤の製造に適用することを可能とする。この方法の利点の一つは、血漿に おける血小板の濃縮を含む全ての操作を、ドナーから血液を集めるために用いる バッグシステム中で行えるということである。

もちろん、上記の生物接着剤は、種々の同定されたドナー由来の血漿から調製す ることができる。

本発明の方法の開始原料製造物は、血小板に富む血漿である。このような血小板 に富む血漿の調製は、それ自体公知である。例えば、それは以下の方法によって 製造することができる。献血中に集めたトリプルバッグシステム（例えば、マコ ーファーマ）中の全血を、ジヨウアン（Ｊｏｕａｎ）Ｋｉｌｏ遠心機で４分間、 ３０００Ｘｇで遠心する。

血小板に富んだ上清血漿をトリプルバッグシステムのトランスファーバッグ３に 、血漿抽出機を用いて注入する。前記バッグ３は、チューブをシールすることに より残りのシステムから分離される。このバッグをトロンビン−凝固性蛋白質の 濃縮物の本発明の製造のために用いることができる。

本発明の主体はまた、上記方法によって得ることができる生物接着剤を用いるこ とである。

この使用は、それ自体公知の方法に従って行える。この使用の原則は、フィブリ ノーゲンの転化によりフィブリンの形成を起こすことからなる。この転化は、ト ロンビンの作用によって達成される。トロンビンは、それ自体公知の方法に従っ て、外部より加えたトロンビンであってもよい。

そのために、上記のようにして得た生物接着剤をトロンビン及びカルシウムイオ ンを含有する水性溶液と混合して、フィブリノーゲンをフィブリンに転化させる ことによって凝固反応を開始する。

特に、０．５〜５０ＯＮＩＨＵ／ｍｌのトロンビン及び例えば５〜１００ｍＭ、 特に２０〜６０ｍＭの濃度の（特に、塩化カルシウムの形で）カルシウムイオン を含有する水性溶液を用いることができる。

トロンビン溶液との混合は、その部位、即ち処置される組織上で行うのが好まし い。

一般に、液化した寒冷沈殿物及びトロンビン水性溶液は５：１〜１：２の容量比 で混合する。

所望により、プラスミン阻害剤又は類似物（例えば、α−２−アンチプラスミン 、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸）を最終的な接着剤 、又はそれらを混合する前の成分の一つに加えてもよい。

本発明の生物接着剤にプロトロンビン及び他の凝固性因子を存在させることも好 ましく、そして凝固の内因経路又は外因経路を活性化することができる。

それ故、本発明の主体は、特に上記のようにして得られる生物接着剤の使用であ り、この使用は、内在のプロトロンビンの活性化を助ける少なくとも一つの薬剤 を該生物接着剤に添加することによって特徴づけられる。凝固の現象はまた、好 ましくは３７℃に近い温度で上記工程を行うことによって開始する。

そのためには（例えば５〜１００ｍＭ、特に２０〜６０ｍＭの）カルシウムイオ ンを含んだ水性溶液を単に上記生物接着剤に添加すればよい。

この凝固を加速することを望む場合は、上記工程を以下に示す様にして、活性化 剤を用いて行うこともできる。

内因経路の活性化のためには、生物接着剤を（例えば５〜１００ｍＭ、特に２０ 〜６０ｍＭの）カルシウムイオンを含む水性溶液と混合し、それを凝固第ＸＩＩ 因子の少なくとも一つの公知の活性化剤、更に一般的には生物接着剤に不溶性で 負の荷電を持った固体表面又は化合物（例えばパウダー形状）、例えば、シリケ ート、（特にカオリン）、シリカ、シリカガラス、例えばサンゴ骨格から得られ るアラゴナイト等のカルシウムカーボネートの結晶、トリカルシウムジシトレー トの結晶等と接触させることができる。

単純な繰り返し実験により決定されうる十分な時間後に、上記生物接着剤を上記 不溶性化合物から濾過により分離する。例えば、上記工程はフィルターを備えた カラムで行う凝固の外因経路の活性化のためには、生物接着剤を（５〜１００ｍ Ｍ、特に２０〜６０ｍＭの）カルシウムイオンを含む水性溶液、及び組織トロン ボプラスチン（例えば動物由来のもの）又は遺伝子工学によって製造したトロン ボプラスチンと混合する。

それ故、本発明によって得られる生物接着剤の重要な利点の一つは、それが外部 よりのトロンビンの添加なしに接着剤の凝固を開始するのに十分な量のプロトロ ンビンを含有し、それによって不慮の汚染のリスクが減少すると言うことである 。それ故、本発明の方法は特に自己製造物の使用という現在の要求に適応できる ものである。

本発明の生物接着剤は、特に外傷性又は外科手術の創傷の処置、移植片（特に皮 膚又は骨の移植片等）の適合及び保持に用いることができる。本発明の生物接着 剤はまた、人工移植部材、例えば、人工骨、骨接合部材及び義歯の固定、骨充填 物質、特にカルシウムカーボネートをベースとした吸収性充填物質（例えば、サ ンゴ骨格又はビンクタダーマルガリチヘラ貝（Ｐｉｎｃｔａｄａ　ｍａｒｇａｒ ｉｔｉｆｅｒａ　５ｈｅｌｌ）をベースとしたもの）、ヒドロキシアパタイト又 はポリ乳酸等の生分解性ポリマーの固定及び保持に用いることもできる。

実施例１ 血小板濃縮ヒト血漿を上記のようにして調製した。

このようにして得た濃縮血漿は１ｍｌ当たり１５４×１０６の血小板を含んでい る。

前記血小板濃縮血漿２３０ｍ１の入ったトランスファーバッグを冷却チャンバー 中にて、−４０℃で７２時間装いた。次いで、その血漿の入ったバッグを冷蔵庫 中にて、４℃で２０時時間−た。その後、そのバッグをやはり４℃の温度で、１ 分光たり３，０００回転で２０分間遠心した。

遠心後、バッグを水平にし、採取管をはめ、上清をアスピレーションで吸引した 。

バッグに入っている固形残留物は、寒冷沈殿物であり、使用するまで一２０℃の 温度にて再凍結して保存できる。

寒冷沈殿物をすぐに使用する場合は、バッグを水浴中、例えば３７℃に置く。１ ５分間温直置後残った溶液を回収する。容量は約３ｍｌであった。

得られた製造物を分析した。結果を下記表１に示す。

実施例２ 実施例１と同様の方法により操作を行った。処理した血漿の容量は２５０ｍ１で あった。血漿は、最初は１ｍｌ当たり２５６Ｘ１０６の血小板を含んでいた。寒 冷沈殿物の液化により回収された最終溶液の容量は５ｍｌであった。

分析結果を表１に示す。

融解した血漿の遠心後に得られた遠心上清のＰＤＧＦの濃度は、たった５、９ｎ ｇ／ｍｌであった。

表１の結果と比較することにより、実質的に全てのＰＤＧＦが寒冷沈殿物中にあ るということが分かる。

表　１ （１）ブラッドフォード法（バイオラッド社製の試薬　照会番号５００−０００ ６）によって決定した。

（２）ＰＤＧＦ：血小板由来成長因子はＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験によって測定した。

（３）ＥＬＩＳＡ試験によって測定した（Ｓｔａｇｏ、　Ｆｒａｎｃｅ　。

照会番号０４１９）。

（４）液化した寒冷沈殿物の一容量を５０ＯＮＩＨＵのトロンビン及び５０ｍＭ の塩化カルシウムを含む溶液の一容量と混合することによって決定した。

（５）比活性は以下の方法により決定した。対照において得られた放射能は２０ ００ｃｐｍであった。実施例１では、４０００ｃｐｍで、蛋白濃度が０．００９ ６ｍｇ／ｍｌであった。比較として、同じ方法により測定したチスコル（Ｔｉｓ ｓｕｃｏｌ　；　Ｉ　Ｍ　Ｍ　Ｕ　Ｎ　０社によって販売されている生物接着剤 の商標名）の比活性は０．２２であった。

分裂促進活性の測定方法は以下の通りである。

線維芽細胞を６月齢の幼児の包皮から分離した。

細胞を１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ＧｉｂＣＯ社）に懸濁した。９ ６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、１ｍｌ当たり４０，０００ 細胞を含んだ懸濁液２００μｍを播種した。５％のＣＯ２を含む雰囲気下、３７ ℃で３日間培養後、培地を８％新生児牛血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｇ　ｉ　ｂ　 ｃ　ｏ社）と交換した。

更に３日間培養後、５０μ■のトロンビン−凝固性蛋白質溶液（試料）を加えた 。各試料を、種々の希釈率でＤＭＥＭ中に希釈し、３回試験した。対照ウェルに はＤＭＥＭ５０ａｌを播種した。そのマイクロプレートを前記と同じ条件で２４ 時間培養した。培養終了の６時間前に、１０μＣｉ　／　ｍ　ｌのトリチウムチ ミジン溶液を５０μｌを各ウェルに加えた。培養後、ウェルを生理溶液で洗浄し た。その後、エチレンジアミンテトラアセテート存在下で０．２５％のトリプシ ン溶液（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ社の溶液）を用いて、細胞をウェルから剥がした。

′スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）”タイプ細胞回収装置を用いて、細胞をフィル ター上に集めた。次いで、そのフィルターを乾燥し、シンチレーション液の存在 下で放射能を測定した。

比活性の決定： 前記ウェル中の試料の蛋白質濃度（ｍｇ／ｍｌで表す）をＸ軸、対応する放射能 をＹ軸としてグラフにプロットした。対照ウェルの２倍の放射能レベルを与える 試料の蛋白質濃度を、捕間法によりグラフから決定した。この濃度の逆数を試料 の比活性と呼ぶ。

実施例３ 実施例１と同様の方法により操作を行った。分析結果（数回の実験の平均値）を 表２に示す。

表　２ 実施例４ 生物接着剤を実施例１と同様の方法により調製した。チューブ中で、順次、生物 接着剤１５０μ１１生理食塩水１５０μｍ、２５ｍＭ塩化カルシウム水溶液３０ ０μｍ、及びカオリン懸濁液３００μｍ又はサンゴ粉末懸濁液３００μｌ又は生 理食塩水３００μｍのいずれかを混合した。前記チューブを水浴中、３７℃で温 室した。チューブ中に凝塊の出現が認められた。

カオリンの存在下では、凝塊は温室の４分後に形成した。

カオリンの代わりにサンゴ粉末の存在下では、凝塊は７分で形成した。（生理食 塩水を単に加えることによって得られる）カオリン又はサンゴを加えない調製物 は９分後に凝固した。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板に富む血漿を開始原料血漿として用いることを特徴とする、生物接着 剤の構成要素となる寒冷沈殿物を凍結血漿から調製し回収することによる、生物 接着剤の調製方法。
2. ２．前記濃縮血漿が１ｍ１当たり少なくとも５０×１０６の血小板を含むことに よって特徴づけられる請求の範囲１記載の方法。
3. ３．前記開始原料血漿が１ｍ１当たり１ｘ１０８〜１×１０９、特に１×１０８ 〜５×１０８の血小板を含むことによって特徴づけられる前記請求の範囲２に記 載の方法。
4. ４．前記接着剤を液形態で得るために、前記寒冷沈殿物を加熱することによって 特徴づけられる前記請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。
5. ５．回収血液から始めて、血小板に富む血漿をまず調製することを特徴とする前 記請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の方法。
6. ６．前記血漿をあるドナーから得、そして前記方法の全ての操作を血液を集める ために用いたバッグの系の中で行うことを特徴とする前記請求の範囲のいずれか 一つに記載の方法。
7. ７．内在のプロトロンビンの活性化に適した薬剤を前記接着剤に添加することを 特徴とする、前記請求の範囲のいずれか一つに記載の方法によって得られる生物 接着剤の使用。
8. ８．前記薬剤がカルシウムイオンを含む水性溶液であることを特徴とする請求の 範囲７記載の生物接着剤の使用。
9. ９．前記薬剤がカルシウムイオンの存在下でのトロンボプラスチンであることを 特徴とする請求の範囲７記載の生物接着剤の使用。
10. １０．前記薬剤がカルシウムイオンの存在下での凝固第ＸＩＩ因子の活性化剤で あることを特徴とする前記請求の範囲７に記載の生物接着剤の使用。
11. １１．前記活性化剤が生物接着剤に不溶性で負の荷電を持っている固形化合物か ら選ばれることを特徴とする前記請求の範囲１０に記載の生物接着剤の使用。
12. １２．前記固形化合物がシリケート、シリカガラス、カルシウムカーボネート又 はトリカルシウムジシトレートから選ばれることを特徴とする前記請求の範囲１ １に記載の生物接着剤の使用。