CN117752857A - 一种复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种生物复合材料,所述复合材料选自以下任一:a)由包括蛋白与骨粉的材料复合而成,所述蛋白和骨粉的质量比为(0.4~2):(3.75~10);b)由包括蛋白与磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(1.25~5);c)由包括蛋白、骨粉和磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白、骨粉和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(3.75~10):(1.25~5);所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型。该复合材料可以有效的促进了人工损伤的大鼠颅骨愈合,证明该复合材料对骨组织的再生创伤愈合有促进作用。
Description
技术领域
本说明书涉及再生医学领域,特别涉及一种复合材料及其应用。
背景技术
由外伤、感染、肿瘤等原因导致的大段骨缺损是骨科临床常见疾病。其治疗棘手,致残率高,一直是骨科医师面临的难题。传统的治疗方法包括带或不带血供的自体骨移植(游离腓骨移植及髂骨移植等)、人工骨移植和同种异体骨移植等。然而,上述各种治疗方法在临床应用中均存在诸多的问题:(1)自体骨移植存在来源有限及供区并发症的问题;(2)异体骨及人工骨均存在爬行替代过程缓慢、修复周期长、感染风险高等问题;(3)同种异体骨移植还存在免疫排斥、传播疾病的风险。利用各种生物材料联合干细胞及各种生长因子修复骨缺损的骨组织工程技术是近年来的一个研究热点。尽管各种新材料层出不穷,功能不断优化,并且在动物实验中具有一定的效果。但这些生物材料与临床应用之间还有很远的距离。
牵张成骨技术(distraction osteogenesis)是目前临床上治疗大段骨缺损最有效、最常用的方法之一,特别是对于伴有感染、畸形、局部软组织条件差或合并糖尿病等基础疾病的复杂病例目前,已经报道的促进牵张成骨区骨再生、矿化的方法主要包括生长因子、激素、干细胞移植及体外震波等物理方法。尽管有研究发现体外震波能缩短牵张成骨的治疗周期,但其临床治疗效果尚不明确。动物实验显示局部应用生长因子、细胞因子及激素能够促进延长区骨再生,但存在治疗费用高、不易获取、潜在毒性的缺点,限制了其临床应用。干细胞移植在促进组织再生修复中具有广泛的应用前景。其中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在骨组织再生修复中具有重要的促进作用。但干细胞移植存在免疫排斥、潜在致瘤可能及移植细胞成活率低、分化方向不确定等缺陷和不足。
发明内容
为了解决上述技术问题,本申请提供了一种新型复合材料,可以有效的促进人工损伤的大鼠颅骨愈合,证明该复合材料对骨组织的再生创伤愈合有促进作用。该复合材料避免了直接利用动物来源的骨质和蛋白,完全是体外合成制备,具有成本低,污染可能性小,免疫原性小,易制备,产品组分容易固定的特点。
本申请提供一种复合材料,所述复合材料选自以下任一:a)由包括蛋白与骨粉的材料复合而成,所述蛋白和骨粉的质量比为(0.4~2):(3.75~10);b)由包括蛋白与磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(1.25~5);c)由包括蛋白、骨粉和磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白、骨粉和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(3.75~10):(1.25~5);所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型。
本申请还提供上述的复合材料的制备方法,所述制备方法选自以下任一:制备方法Ⅰ:将蛋白、钙盐水溶液和磷酸盐水溶液混合后反应,获得沉淀即为复合材料;所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型;制备方法Ⅱ:将牙釉蛋白变体溶液和骨粉混合,得复合材料;所述牙釉蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请还提供一种组合物,所述组合物包括上述复合材料中b)所述的复合材料,以及骨粉。
本申请还提供上述的复合材料、制备方法或组合物在制备骨再生、牙周组织再生或骨嫁接材料修饰的产品中的应用。
本说明书提出的复合材料带来的有益效果包括但不限于:本发明专注牙釉蛋白(amelogenin)及其相关的多种多肽,利用其自生聚合的特点,在一定浓度盐离子(Ga2+,H2PO4 -)溶液环境中调节相应的pH生成蛋白高分子聚合物。蛋白高聚物同时促进磷酸钙形成类似骨微观结构的羟基磷灰石微晶。羟基磷灰石微晶和蛋白高聚物的复合物做为一种新型的生物材料,对骨、牙周组织、牙釉、关节等骨质组织的促生长和助修复作用。本发明研究发现该产品有效的促进了人工损伤的大鼠颅骨愈合,证明该产品对骨组织的再生创伤愈合的确有促进作用,比市面现有的产品作用更好。该产品避免了直接利用动物来源的骨质和蛋白,完全是体外合成制备,具有成本低,污染可能性小,免疫原性小,易制备,产品组分容易固定的特点。该产品的特点是做为一种蛋白和盐,微观上多孔的复合材料,可以提供细胞更近天然,更易吸附的表面。也提供了高的骨质生长需要的磷离子和钙离子等必须的成分。同时牙釉蛋白的浓度在材料中可以达到非常高,远远高于Emdogain或Osteogain,可以做为促细胞生长的因子。因此牙釉蛋白,多肽及复合物样品可以促进骨细胞,成骨细胞生长分化,增强细胞粘附性。这些因素共同促进了细胞的分化生长和骨或牙矿物的沉积。本发明以大鼠颅骨为例,证实用这类样品可以促进大鼠颅骨的生长修复。实验证明了其在临床上的应用前景。可以用于包括,但不局限于,骨,牙骨修复伤断愈合,表面修饰,骨嫁接材料的修饰,牙龈修复,牙周组织再生等方面。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明,这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的,其中:
图1为根据本申请一些实施例所示的牙釉蛋白的质谱检测结果,(A)-(D)分别是H176,H148,LRAP,M44蛋白或多肽的质谱检测结果;
图2为根据本申请一些实施例所示的透射电镜和选区衍射实验表征,在特定条件下人源全长牙釉蛋白H176调控无机矿物磷酸盐转化生成定向的羟基磷灰石晶体;
图3为根据本申请一些实施例所示的牙釉蛋白调控无机矿物盐转化生成羟基磷灰石晶体的晶体衍射(XRD)实验检测结果;
图4为根据本申请一些实施例所示的1-1牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图5为根据本申请一些实施例所示的1-2牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图6为根据本申请一些实施例所示的1-3牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控低浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育矿化形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图7为根据本申请一些实施例所示的1-4牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控低浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图8为根据本申请一些实施例所示的1-5牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图9为根据本申请一些实施例所示的2-1牙釉蛋白(H148牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图10为根据本申请一些实施例所示的2-2牙釉蛋白(H148牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图11为根据本申请一些实施例所示的3-1牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图12为根据本申请一些实施例所示的3-2牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)或多肽调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料的扫描电镜图;
图13为根据本申请一些实施例所示的3-3牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图14为根据本申请一些实施例所示的3-4牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)溶液混合Bio-oss骨粉形成的复合材料的扫描电镜图;
图15为根据本申请一些实施例所示的复合材料4(M44牙釉蛋白)的透射电镜(上)与扫描电镜(下)微观表征图像;
图16为根据本申请一些实施例所示的比对空白对照,Bio-oss骨粉修复和不同复合材料修复后的术后新骨形成的BV/TV(相对骨体积:骨体积/组织体积)定量分析图,注:材料1组:人源全长牙釉蛋白H176复合材料;材料2组:人源牙釉蛋白亚型H148复合材料;材料3组:鼠源牙釉蛋白亚型LRAP复合材料;材料4组:鼠源牙釉蛋白亚型M44复合材料;编号和前复合材料制备方法对应;
图17为根据本申请一些实施例所示的比对空白对照,Bio-oss骨粉修复和不同复合材料修复后的术后新骨形成的BV/TV(相对骨体积)(A)和BMD(骨密度)(B)定量分析图;注:*P<0.05,材料1组:人源全长牙釉蛋白H176复合材料,材料3组:鼠源牙釉蛋白亚型LRAP复合材料;
图18为根据本申请一些实施例所示的比对空白对照,Bio-oss骨粉修复和复合材料3修复后的术后颅骨标本的3D micro-CT图像(A)和新骨形成的BV/TV(相对骨体积)(B)和BMD(骨密度)(C)定量分析图,注:*P<0.05,材料3组:鼠源牙釉蛋白亚型LRAP复合材料;
图19为根据本申请一些实施例所示的不同脏器(心、肝、脾、肺、肾)的毒理学检测。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例,对于本领域的普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明,图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示,除非上下文明确提示例外情形,“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数,也可包括复数。一般说来,术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素,而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列,方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是,前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反,可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时,也可以将其他操作添加到这些过程中,或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请提供一种复合材料,所述复合材料选自以下任一:a)由包括蛋白与骨粉的材料复合而成,所述蛋白和骨粉的质量比为(0.4~2):(3.75~10);b)由包括蛋白与磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(1.25~5);c)由包括蛋白、骨粉和磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白、骨粉和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(3.75~10):(1.25~5);所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型。
在一些实施例中,所述蛋白和骨粉的质量比可以为(0.6~1.8):(4~9)。在一些实施例中,所述蛋白和骨粉的质量比可以为(0.8~1.6):(5~8)。在一些实施例中,所述蛋白和骨粉的质量比可以为(1~1.4):(6~7)。在一些实施例中,所述蛋白和骨粉的质量比可以为(1~1.2):(6~7)。在一些实施例中,所述蛋白和骨粉的质量比可以为1:5。
在一些实施例中,所述蛋白和磷酸钙的质量比可以为(0.6~1.8):(1.5~4.5)。在一些实施例中,所述蛋白和磷酸钙的质量比可以为(0.8~1.6):(2~4)。在一些实施例中,所述蛋白和磷酸钙的质量比可以为(1.0~1.4):(2.5~3.5)。在一些实施例中,所述蛋白和磷酸钙的质量比可以为(1.2~1.4):(3~3.5)。
在一些实施例中,所述骨粉可以为Bio-oss骨粉。
在一些实施例中,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体可以来源于哺乳动物。在一些实施例中,优选的,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体可以来源于人或鼠。在一些实施例中,更优选的,所述牙釉蛋白变体可以为去除C端片段的人源牙釉蛋白或只含N端和C端的鼠源牙釉蛋白。在一些实施例中,进一步优选的,所述牙釉蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述牙釉蛋白变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任一所示。
在一些实施例中,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体与组成天然釉质和骨质的羟基磷灰石晶体结构相同。在一些实施例中,在微米尺度上,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体排列延伸成片状、板状以及多孔腔结构。在一些实施例中,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体排列有序,定向生长。
在一些实施例中,由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的牙釉蛋白形成的复合材料中,蛋白多聚形成高聚物,所述高聚物部分以纤维状形态存在,对应的磷酸钙中羟基磷灰石晶体能够沿着纤维状的牙釉蛋白延伸定向生长。
在一些实施例中,由SEQ ID NO.3所示的牙釉蛋白变体形成的复合物中,羟基磷灰石晶体在微米尺度上延伸成多孔腔结构。
在一些实施例中,由SEQ ID NO.4所示的牙釉蛋白变体形成的复合物中,羟基磷灰石晶体延伸生成薄膜状结构。
本申请还提供上述的复合材料的制备方法,所述制备方法选自以下任一:
制备方法Ⅰ:
将蛋白、钙盐水溶液和磷酸盐水溶液混合后反应,获得沉淀即为复合材料;
所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型;
制备方法Ⅱ:
将牙釉蛋白变体溶液和骨粉混合,得复合材料;所述牙釉蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,蛋白、钙盐水溶液和磷酸盐水溶液混合后可以得混合反应液。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,混合反应液中还可以包括骨粉。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,所述蛋白与骨粉的质量比可以为(1.6~8):(5~40)。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,所述蛋白与骨粉的质量比可以为2:5。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,获得混合反应液后,调节混合反应液的pH值可以为5.0~8.5。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,混合反应液的pH值可以为6.0~7.6。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,混合反应液的pH值可以为6.0。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,反应温度可以为37℃,反应时间可以为0.5~9天。例如,所述制备方法Ⅰ中,反应时间可以为0.5、1、2、3、4、5、9、7、8、9天。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,反应时间可以为1~7天。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,反应时间可以为7天。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,反应后采用离心获得沉淀。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,离心转速可以为259000g,时间可以为1h以上。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,混合反应液的具体配制可以包括以下步骤:
①将等量的蛋白分别与等体积的100~150mM钙盐水溶液和70~150mM磷酸盐水溶液混合,对应得到混合液a和混合液b,蛋白在混合液a和混合液b中的浓度相同,且浓度为0.1~100mg/mL;
②将步骤①中混合液a和混合液b混合,得到混合反应液。
在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,混合反应液的具体配制可以包括以下步骤:
①将等量的蛋白分别与等体积的130~133.6mM钙盐水溶液和83.6~130mM磷酸盐水溶液混合,对应得到混合液a和混合液b,蛋白在混合液a和混合液b中的浓度相同,且浓度为0.2~100mg/mL;
②将步骤①中混合液a和混合液b混合,得到混合反应液。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体溶液可以为牙釉蛋白变体水溶液。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体在牙釉蛋白变体水溶液中的浓度可以为70-90mg/mL。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体在牙釉蛋白变体水溶液中的浓度可以为80mg/mL。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(0.5~1.5):(3~7)。在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(0.6~1.4):(3.5~6.5)。在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(0.7~1.3):(4~6)。在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(0.8~1.2):(4.5~5.5)。在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(0.9~1.1):(5~5.5)。在一些实施例中,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为(1~1.1):(5~5.5)。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅱ中,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比可以为1:5。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,磷酸盐可以为可溶性磷酸盐。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,磷酸盐可以为磷酸二氢盐。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,磷酸二氢盐可以为KH2PO4。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,钙盐可以为可溶性钙盐。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,钙盐可以为CaCl2。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,蛋白在混合反应液中的浓度可以为0.2~80mg/mL。例如,蛋白在混合反应液中的浓度可以为0.2、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80mg/mL。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,优选的,蛋白在混合反应液中的浓度可以为1mg/mL。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体可以来源于哺乳动物。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体可以来源于人或鼠。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,亚型牙釉蛋白变体可以为去除C端片段的人源牙釉蛋白或只含N端和C端的鼠源牙釉蛋白。在一些实施例中,进一步优选的,所述制备方法Ⅰ中,牙釉蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,牙釉蛋白变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任一所示。
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,钙盐在混合反应液中的终浓度可以为1mM~50mM。例如,钙盐在混合反应液中的终浓度可以为1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50mM。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,钙盐在混合反应液中的终浓度可以为2.5mM~33.4mM。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,钙盐在混合反应液中的终浓度可以为3.3mM;
在一些实施例中,所述制备方法Ⅰ中,磷酸盐在混合反应液中的终浓度可以为1.0mM~20.9mM。例如,磷酸盐在混合反应液中的终浓度可以为1.0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、20.9mM。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围,此处不再赘述。在一些实施例中,优选的,所述制备方法Ⅰ中,磷酸盐在混合反应液中的终浓度可以为1.5mM~20.9mM。在一些实施例中,更优选的,所述制备方法Ⅰ中,磷酸盐在混合反应液中的终浓度可以为2.1mM。
本申请还提供一种组合物,所述组合物包括上述复合材料中b)所述的复合材料,以及骨粉。
在一些实施例中,所述复合材料与骨粉的质量比可以为7:5。在一些实施例中,所述牙釉蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请还提供上述的复合材料、制备方法或组合物在制备骨再生、牙周组织再生或骨嫁接材料修饰的产品中的应用。
在一些实施例中,所述的骨可以为颅骨。在一些实施例中,所述骨可以为动物身体其他部位的骨,例如躯干骨和四肢骨。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实验材料与实验试剂:
实验所需用品为12mL透明样品瓶,10mL标准瓶(广口)透明瓶,四氟磁力搅拌子(9*5mm,橄榄形),熔点毛细管,牛骨粉(Geistlich Bio-oss)。实验所需试剂为133.6mM的CaCl2溶液,83.6mM的KH2PO4溶液,1M的KOH溶液,0.1M的KOH溶液,0.01M的HCl溶液与0.001M的HCl溶液,所有的试剂都是用Milli-Q超纯水配制并用0.2μm的滤头进行过滤。上述试剂在制备样品前通入高纯氮气2h,并且在样品制备过程中通过毛细管全程在溶液中通入氮气。
实验检测仪器:
双靶小分子X射线单晶衍射仪,D8 Venture,Bruker
氦离子聚焦离子束显微镜,ORION Nanofab,Zeiss
低电压高分辨生物扫描智能电子显微镜,GeminiSEM 460,Zeiss
120kV透射电子显微镜,Talos L120C,捷克FEI
透射电子显微镜,JEM-1400plus,日本电子
实施例1-蛋白序列
本发明涉及到4种牙釉蛋白及其mRNA选择性剪切转录亚型,包括全长人源牙釉蛋白H176,去除C端片段的人源牙釉蛋白H148,鼠源只含N端和C端的剪切变体LRAP和M44。由于构建片段特殊的酶切位点,导致最终蛋白片段序列前面增加1个甘氨酸(G)。
H176(SEQ ID NO.1):
GMPLPPHPGHPGYINFSYEVLTPLKWYQSIRPPYPSYGYEPMGGWLHHQIIPVLSQQHPPTH
TLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQHHQPNLPPPAQQPYQPQPVQPQPHQ
PMQPQPPVHPMQPLPPQPPLPPMFPMQPLPPMLPDLTLEAWPSTDKTKREEVD
H148(SEQ ID NO.2):
GMPLPPHPGHPGYINFSYEVLTPLKWYQSIRPPYPSYGYEPMGGWLHHQIIPVLSQQHPPTH
TLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQHHQPNLPPPAQQPYQPQPVQPQPHQ
PMQPQPPVHPMQPLPPQPPLPPMFP
LRAP(SEQ ID NO.3):
GMPLPPHPGSPGYINLSYEVLTPLKWYQSMIRQPPLSPILPELPLEAWPATDKTKREEVD
M44(SEQ ID NO.4):
GMPLPPHPGSPGYINLSYEPLSPILPELPLEAWPATDKTKREEVD
实施例2-蛋白表达与纯化
根据现有技术,本发明构建体外大肠杆菌原核蛋白表达系统,选择pET系列质粒,携带T7启动子。在适当条件的菌生长和一定浓度IPTG的诱导下,蛋白表达量极高。
蛋白纯化分为前期的初步纯化,即His标签蛋白结合的Ni-NTA柱进行目的蛋白与其他蛋白的分离;与后期的精细纯化,即根据蛋白不同的疏水性选择反相C4液相色谱疏水柱对目的蛋白进行进一步的分离纯化,并进行质谱检测,发现可以得到95%纯度以上的目的蛋白,如图1。
实施例3-细菌内毒素检测
本发明中涉及到的大肠杆菌表达蛋白通过ToxinSensor凝胶法内毒素检测试剂盒(GenScript)定量检测革兰氏阴性菌的内毒素,灵敏度为0.25EU/mL。将鲎变形细胞溶解物(LAL)与LAL试剂水混合,加入不同浓度的牙釉蛋白溶液(1-1*10-6mg/mL)。同时设立三组对照组实验进行比较,分别为阳性对照,阴性对照,以及加入阳性试剂的检测蛋白溶液,并确保最终体积相同。37℃孵育一定时间后,若存在内毒素,溶液会发生凝胶化,若无内毒素则保持溶液状态。经过检测发现阳性对照组,加入阳性试剂的蛋白检测溶液均发生溶液凝胶化,而不同浓度牙釉蛋白检测溶液均未发生溶液凝胶化,说明纯化得到牙釉蛋白中细菌的内毒素的含量少于0.25EU/mL,符合《中华人民共和国药典》中提到生物制剂细菌内毒素不超过0.5EU/mL的限制。
实施例4-复合材料1(H176牙釉蛋白)制备
1-1牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料
具体制备方法:将冻干蛋白(H176牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL与4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积的溶液混合形成8mL蛋白终浓度1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mM CaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液180μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
1-2牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入40mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(H176牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mMCaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液160μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分羟基磷灰石矿物晶体)重量为15mg左右(包含配置溶液前加入的Bio-oss骨粉与自生羟基磷灰石矿物晶体)。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
1-3牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控低浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育矿化形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明瓶瓶底加入适量Bio-oss骨粉(40mg)。将冻干蛋白(H176牙釉蛋白)粉末溶解于0.001M的HCl溶液中,配成蛋白浓度为2mg/mL母液待用。用0.001M的HCl溶液梯度稀释成8mL蛋白终浓度为0.2mg/mL的蛋白溶液,用枪头吸取130mMCaCl2溶液156μL滴加到蛋白溶液中,CaCl2溶液终浓度为2.5mM。搅拌5min后,继续滴加130mM KH2PO4溶液150μL至KH2PO4终浓度为1.5mM。继续搅拌,待pH值稳定后加入1mL 0.1MKOH溶液调节pH值至7.6,放入37℃恒温箱孵育24h。将孵育24h的蛋白溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为0.4mg左右,磷酸钙(主要成分羟基磷灰石矿物晶体)重量为12mg左右(包含配置溶液前加入的Bio-oss骨粉与自生羟基磷灰石矿物晶体)。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
1-4牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控低浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入40mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(H176牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的低浓度矿物离子(3.3mMCaCl2,2.1mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液10μL调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分羟基磷灰石矿物晶体)重量为12mg左右(包含配置溶液前加入的Bio-oss骨粉与自生羟基磷灰石矿物晶体)。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
1-5牙釉蛋白(H176牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入5mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(H176牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的低浓度矿物离子(3.3mMCaCl2,2.1mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液180μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右(包含配置溶液前加入微量的Bio-oss骨粉)。每份样品与5mg Bio-oss骨粉混合均匀,用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
实施例5-复合材料2(H148牙釉蛋白)制备
2-1牙釉蛋白(H148牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料
具体制备方法:将冻干蛋白(H148牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积的溶液混合形成8mL蛋白终浓度1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mM CaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液210μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
2-2牙釉蛋白(H148牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入40mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(H148牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mMCaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液180μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分羟基磷灰石矿物晶体)重量为15mg左右(包含配置溶液前加入的Bio-oss骨粉与自生羟基磷灰石矿物晶体)。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
2-3牙釉蛋白(H148牙釉蛋白)与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入40mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(H148牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。用超纯水梯度稀释成8mL终浓度为1mg/mL的纯蛋白溶液,加入透明样品瓶中,放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,溶液中加入的Bio-oss骨粉10mg。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
实施例6-复合材料3(LRAP牙釉蛋白)制备
3-1牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料
具体制备方法:将冻干蛋白(LRAP牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积的溶液混合形成8mL蛋白终浓度1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mM CaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液200μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
3-2牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐与Bio-oss骨粉共孵育形成的复合材料
具体制备方法:配制溶液前在透明样品瓶中加入5mg Bio-oss骨粉。将冻干蛋白(LRAP牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的低浓度矿物离子(3.3mMCaCl2,2.1mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液200μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右(包含配置溶液前加入微量的Bio-oss骨粉)。每份样品与5mg Bio-oss骨粉混合均匀,用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
3-3牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料
具体制备方法:将冻干蛋白(LRAP牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液200μL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积溶液混合形成8mL蛋白终浓度为1mg/mL的低浓度矿物离子(3.3mM CaCl2,2.1mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液200μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右。每份样品与5mgBio-oss骨粉混合均匀,用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
3-4牙釉蛋白(LRAP牙釉蛋白)溶液混合Bio-oss骨粉形成的复合材料
具体制备方法:取8mg冻干蛋白(LRAP牙釉蛋白)粉末溶解于100μL Milli-Q超纯水中,取25μL体积即质量为2mg的纯蛋白溶液,加入10mg Bio-oss骨粉混匀,用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
实施例7-复合材料4(M44牙釉蛋白)制备
4-1牙釉蛋白(M44牙釉蛋白)调控高浓度矿物盐形成的复合材料
具体制备方法:将冻干蛋白(M44牙釉蛋白)粉末溶解于Milli-Q超纯水中,配成蛋白浓度为4mg/mL母液待用。取两支离心管,1支离心管中加入133.6mM CaCl2溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;1支离心管中加入83.6mM KH2PO4溶液2mL、4mg/mL蛋白溶液1mL和适量超纯水,补齐至4mL;将两份等量体积的溶液混合形成8mL蛋白终浓度1mg/mL的高浓度矿物离子(33.4mM CaCl2,20.9mM KH2PO4)溶液,涡旋30s,混合均匀后加入透明样品瓶中,滴加1M KOH溶液210μL左右调节样品pH值到6.0,待pH稳定后放入37℃恒温箱孵育。将孵育1周左右的样品溶液用桌面超速离心机在259000g,20℃的条件下离心1h,收取样品沉淀待用。材料使用前将样品沉淀混合均匀,分成4等份,每份样品包含蛋白重量为2mg左右,磷酸钙(主要成分自生羟基磷灰石矿物晶体)重量为5mg左右。每份样品用于填充一个直径为5mm颅骨孔洞缺损。
实施例8-材料微观表征
实验中制备了4组不同牙釉蛋白亚型复合材料进行观察与比较,每组实验中根据蛋白的特性,设置了不同的离子浓度与pH值进一步表征观察与比较。同时增设含有骨粉的对照组,比对有无骨粉对复合材料的微观特性产生的影响。4种蛋白序列在图1,质谱鉴定结果在图2。
透射电镜和选区衍射实验表征,在特定条件下人源全长牙釉蛋白H176具有调控无机矿物盐离子转化生成定向的羟基磷灰石晶体的特性(如图2)。晶体衍射(XRD)实验进一步检测到,在pH6.0,高浓度矿物离子的条件下,4种牙釉蛋白均可以将溶液中的不定型的矿物盐转化生成定向的羟基磷灰石晶体(如图3)。
研究中通过透射电镜(TEM)与扫描电镜(SEM)实验进行复合材料的微观表征(如图4-图15),发现不同复合材料微观表征构象有所不同。
在pH值为6.0,高浓度矿物离子的条件下,4种牙釉蛋白均可以调控溶液中的无机盐离子转化生成羟基磷灰石晶体,但相对应的牙釉蛋白的复合材料表征有所不同。人源全长牙釉蛋白H176复合材料中的羟基磷灰石晶体相对更有序,沿着纤维状的牙釉蛋白延伸定向生长;H148样品中羟基磷灰石晶体相对变细变长;鼠源LRAP样品中羟基磷灰石晶体在微米尺度上延伸成多孔腔结构;鼠源M44样品中的羟基磷灰石晶体排列相对无序,延伸生成大片的薄膜状结构。
在同样的pH值和矿物离子浓度条件下,制样时加入一定量的骨粉晶体,材料中的矿物晶体排列形成片状结构。加入的骨粉晶体越多,聚合生成片状结构越多,在微米尺度上呈现相对较多的板状结构。
研究表明,牙釉蛋白在一定的pH值与离子浓度条件下能够调控羟基磷灰石的生成。不同的牙釉蛋白亚型,在一定的实验条件下,调控无定形的矿物盐生成特定表征构象的矿物晶体结构。当加入定量骨粉晶体,以骨粉晶体为晶核,牙釉蛋白调控的矿物晶体生成类骨粉结构,排列堆积成有一定力学参数的更高层次的结构。在微观尺度上,复合材料中的羟基磷灰石晶体呈现致密有序,定向生长的特性。在更高的尺度上,材料中的羟基磷灰石晶体排列延伸成独特的片状,板状以及多孔腔结构,更接近天然的骨质结构,便于骨质缺损的填充。复合材料中独特的蛋白高聚体与矿物晶体形成独特的空间构象,易于富集体内促骨生长相关因子,吸附相关的骨细胞。并且牙釉蛋白具有促矿化,促进骨细胞分化和增殖的功能特性,更便于体内的骨组织的合成与修复。
实施例9-损伤大鼠颅骨修复实验及结果
1.材料
1.1实验动物
Sprague-Dawley(SD)大鼠,8周龄,雄性,体重约180-200g。于标准饲养中饲养1周后,手术前禁食禁水12h。
1.2实验材料
注射用青霉素,生理盐水,Bio-oss骨粉(Geistlich,Wolhusen,Switzerland),酒精,多聚甲醛。
1.3实验器械
大鼠操作台、耳标体重秤、注射器、环钻、眼科镊、眼科剪、手术刀、纱布、骨膜剥离器、缝线、持针器、血管钳、巴氏管、直尺、推子、碘伏棉球、无菌手术巾、电热毯等。
2.方法
2.1实验分组
将试验用SD大鼠随机分组,每只大鼠2个缺损,每组4只大鼠,具体分组情况如下:
(1)Control组缺损内不植入任何生物材料;
(2)Bio-oss组缺损内植入Bio-oss骨粉10mg;
(3)材料1-1组缺损内植入生物复合材料7mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg)
(4)材料1-2组缺损内植入生物复合材料17mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg,Bio-oss10mg(孵育一周))
(5)材料1-3组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白0.4mg,磷酸钙1mg,Bio-oss10mg(孵育1天))
(6)材料1-4组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙1mg,Bio-oss10mg(孵育一周))
(7)材料1-5组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg,Bio-oss5mg(使用前加入混匀))
(8)材料2-1组缺损内植入生物复合材料7mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg)
(9)材料2-2组缺损内植入生物复合材料17mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg,Bio-oss10mg(孵育一周))
(10)材料2-3组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,Bio-oss 10mg(孵育一周))
(11)材料3-1组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙10mg);
(12)材料3-2组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg,Bio-oss5mg(孵育一周));
(13)材料3-3组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg,Bio-oss5mg(使用前加入混匀));
(14)材料3-4组缺损内植入生物复合材料12mg(牙釉蛋白溶液2mg,Bio-oss 10mg(使用前加入混匀));
(15)材料4-1组缺损内植入生物复合材料7mg(牙釉蛋白2mg,磷酸钙5mg)
材料植入前都经过紫外杀菌消毒。
2.2实验步骤
应用2%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射麻醉,用量为0.2mL/100g。麻醉成功后,剃净大鼠头部毛发。
(1)碘伏棉球消毒,铺无菌巾单,于大鼠头部正中作一长约2.5cm左右的切口,切开皮肤、皮下组织、骨膜可见颅骨正中线,将骨膜向两侧分离,显露双侧顶骨,用环钻于一侧顶骨正中作直径为5mm的全层颅骨缺损,然后用同样方法在另一侧顶骨正中作5mm全层颅骨缺损。
(2)缺损形成后按照实验分组植入不同生物材料。
(3)分层缝合两侧骨膜、皮下组织及皮肤。
(4)闭合手术切口后,用碘伏和酒精消毒创口,以40万单位/鼠的剂量肌肉注射青霉素钠。
(5)将大鼠放置于温暖干燥处,待苏醒后放归鼠笼。
(6)术后三天,每天以20万单位/鼠的剂量肌肉注射青霉素钠,同时观察大鼠的术后饮食、排便、精神状态和活动情况。如发生伤口裂开或感染,则应及时予以清创和缝合。
(7)取材时间:4周。将大鼠安乐死,取颅骨,置于4%多聚甲醛溶液中固定48小时,随后保存于75%酒精中。
2.3检测指标
(1)进行Micro CT扫描,主要检测指标有骨体积/组织体积(BV/TV),骨密度(BMD)等。
(2)组织学检测:将大鼠颅骨固定完成后用流动水对组织进行冲洗,随后在10%的乙二胺四乙酸(EDTA)中进行脱钙。脱钙结束后对组织进行HE染色,Masson染色。
2.4毒理学检测
(1)取材:4周大鼠安乐死,取颅骨的同时,针对各组织部位(心、肝、脾、肺、肾)规范化取新鲜组织,并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块,将组织块放入4%多聚甲醛中固定。
(2)组织学检测:清洗固定组织表面的多聚甲醛溶液,依次用不同梯度的乙醇进行脱水,用石蜡包埋进行切片,对切片进行HE染色。
2.5实验结果
前面的研究在微观表征体外合成的复合材料,发现不同亚型的牙釉蛋白调控溶液中的无机离子转化生成矿物晶体,与天然釉质和骨质的组成成份羟基磷灰石晶体结构相同。并且在微米尺度上,牙釉蛋白高聚结构进一步稳定羟基磷灰石晶体排列延伸成不同的片状,板状与多孔腔结构,衍生出多种功能和用途的新生生物复合材料。
为了确认牙釉蛋白相关复合材料及衍生的无机矿物成份的功能性,同时开展了大鼠颅骨修复实验。实验中设立了空白对照组,临床上常用的Bio-oss骨粉填充材料对照组。首先直接植入复合材料,即不加任何骨粉材料做支撑物,对照植入等同质量的Bio-oss骨粉对照组。通过对实验中新骨生成的关键参数BV/TV(相对骨体积)的定量分析(如图16),复合材料1-1,2-1和3-1较空白与Bio-oss对照组,新骨生成量较多即颅骨修复效果较好。说明牙釉蛋白H176复合材料,蛋白H148复合材料,蛋白LRAP复合材料的骨修复效果较好,而蛋白M44复合材料较空白组有一定的恢复能力。相对鼠源牙釉蛋白LRAP复合材料突出的修复性能,实验中进一步调整人源牙釉蛋白H176和H148复合材料中的相关成份,以期提高修复性能。实验结果表明,制备复合材料初始加入一定量(40mg)骨粉,复合材料中的矿物晶体会以骨粉晶体为晶核,排队堆积成偏板状的构象,同时增强复合材料的机械性能与力学参数,1-2与2-2的复合材料均较初始1-1与2-1材料促新骨生长能力强。经过初步筛选,确定人源牙釉蛋白H176复合材料与鼠源牙釉蛋白LRAP复合材料的促骨生长性能较强。
通过对复合材料初步的比较,筛选到人源牙釉蛋白H176,H148复合材料与鼠源牙釉蛋白LRAP复合材料具有显著的促骨生长能力,修复颅骨效果较好。为了进一步定量比较复合材料与空白,Bio-oss骨粉对照组的骨修复性能,实验中进一步调整复合材料中的部分参数。前面的实验证明,在制备材料的初始加入定量的骨粉晶体,会促进材料中生成的羟基磷灰石晶体衍生成类骨粉的板状结构,并且会提高材料的力学参数,使得材料具有一定的机械支撑功能。因此选择有显著成骨性能的LRAP材料中进行比较,实验设计了初始中加入微量的骨粉晶体的材料3-2,与初始不加入骨粉的材料3-3,但在填充骨损伤部位时加入等量(5mg)的骨粉做支撑。通过对新骨生成标志参数BV/TV(相对骨体积)与BMD(骨密度)进行定量分析(如图17),发现材料3-2与3-3均较空白组与Bio-oss骨粉对照组成骨能力显著增强。3-3LRAP复合材料中的无机矿物羟基磷灰石晶体具有很高的仿生性能。LRAP蛋白高聚体调节羟基磷灰石晶体延伸生长的多孔腔结构(3-3)应该类似板状结构(3-2),适合吸附骨细胞,而无机晶体表面附着的牙釉蛋白LRAP本身具有促进骨细胞增殖和分化的功能。因此多种因素共同促进新骨生成,修复骨缺损的部分。相对比LRAP蛋白复合材料组,H176蛋白复合材料组虽然进行了同样的参数修改,较空白与Bio-oss骨粉组成骨能力强,但略差于LRAP材料组的修复性能。
为了进一步验证实验结果,再次植入LRAP蛋白组3-3复合材料进行颅骨修复实验。比对修复后4w的术后颅骨标本的3D micro-CT图像(如图18A),通过对骨密度的分析,剥离分开植入材料与新生骨质,以及进一步的BV/TV的定量分析(如图18B),可以确定牙釉蛋白LRAP复合材料3-3就有显著的成骨能力,大面积修复缺损的颅骨组织。
在前期的研究中,不仅发现牙釉蛋白能够自组装成高聚体调控和稳定生成的矿物羟基磷灰石晶体,同时LRAP牙釉蛋白溶液对骨粉具有极强的吸附性能,结合LRAP蛋白是Wnt信号通路等促成骨关键因子,制备了复合材料3-4,即在骨粉支撑物的表面滴加LRAP蛋白溶液。实验结果表明,对骨粉表面进行生物改性,同样能显著提高促成骨性能(如18C)。
为了确定牙釉蛋白复合材料的安全性能,同时对脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行毒理检测(如图19)。根据H&E染色结果,发现术后4W各组脏器(心、肝、脾、肺、肾)的生理结构完整,未见病理器质性损伤,说明体内应用各组材料均不会产生相关毒副作用。
综合上述结果,实验初筛到4种牙釉蛋白相关复合材料,人源牙釉蛋白H176与H148,鼠源牙釉蛋白LRAP与M44,相对临床上常用的Bio-oss骨粉植入材料,均有一定的促成骨能力。经过进一步改进制备实验相关参数,发现LRAP蛋白复合材料3-3具有显著提高新骨生成能力,促骨修复。为了便于临床上骨缺损不同的症状,还设计了一种液态的复合材料3-4,同样具有显著的成骨能力。同时两种材料3-3与3-4不仅可以通过不同的症状对症使用,也可以交叉使用,进一步提高性能。
上文已对基本概念做了描述,显然,对于本领域技术人员来说,上述详细披露仅仅作为示例,而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明,本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议,所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时,本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此,应强调并注意的是,本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外,本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字,应当理解的是,此类用于实施例描述的数字,在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明,“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地,在一些实施例中,说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值,该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中,数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值,在具体实施例中,此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后,应当理解的是,本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此,作为示例而非限制,本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地,本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (12)
1.一种复合材料,其特征在于,所述复合材料选自以下任一:
a)由包括蛋白与骨粉的材料复合而成,所述蛋白和骨粉的质量比为(0.4~2):(3.75~10);
b)由包括蛋白与磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(1.25~5);
c)由包括蛋白、骨粉和磷酸钙的材料复合而成,所述蛋白、骨粉和磷酸钙的质量比为(0.4~2):(3.75~10):(1.25~5);
所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型。
2.如权利要求1所述的复合材料,其特征在于,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体来源于哺乳动物,优选的,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体来源于人或鼠,更优选的,所述牙釉蛋白变体为去除C端片段的人源牙釉蛋白或只含N端和C端的鼠源牙釉蛋白,进一步优选的,所述牙釉蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述牙釉蛋白变体氨基酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任一所示。
3.如权利要求1所述的复合材料,其特征在于,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体与组成天然釉质和骨质的羟基磷灰石晶体结构相同;
和/或,在微米尺度上,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体排列延伸成片状、板状以及多孔腔结构;
和/或,所述复合材料b)和c)中,磷酸钙中羟基磷灰石晶体排列有序,定向生长。
4.如权利要求2所述的复合材料,其特征在于,
由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的牙釉蛋白形成的复合材料中,蛋白多聚形成高聚物,所述高聚物部分以纤维状形态存在,对应的磷酸钙中羟基磷灰石晶体能够沿着纤维状的牙釉蛋白延伸定向生长;
和/或,由SEQ ID NO.3所示的牙釉蛋白变体形成的复合物中,羟基磷灰石晶体在微米尺度上延伸成多孔腔结构;
和/或,由SEQ ID NO.4所示的牙釉蛋白变体形成的复合物中,羟基磷灰石晶体延伸生成薄膜状结构。
5.如权利要求1~4任一项所述的复合材料的制备方法,其特征在于,所述制备方法选自以下任一:
制备方法Ⅰ:
将蛋白、钙盐水溶液和磷酸盐水溶液混合后反应,获得沉淀即为复合材料;
所述蛋白为牙釉蛋白、牙釉蛋白变体和/或牙釉蛋白亚型;
制备方法Ⅱ:
将牙釉蛋白变体溶液和骨粉混合,得复合材料;所述牙釉蛋白变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
6.如权利要求5所述的复合材料的制备方法,其特征在于,
所述制备方法Ⅰ中:
蛋白、钙盐水溶液和磷酸盐水溶液混合后得混合反应液;
和/或,混合反应液中还包括骨粉,优选的,所述蛋白与骨粉的质量比为(1.6~8):
(5~40),更优选的,所述蛋白与骨粉的质量比为2:5;
和/或,获得混合反应液后,调节混合反应液的pH值为5.0~8.5,优选的,pH值为6.0~7.6,更优选的,pH值为6.0;
和/或,反应温度为37℃,反应时间为0.5~9天,优选1~7天,更优选7天;
和/或,反应后采用离心获得沉淀,优选的,离心转速为259000g,时间为1h以上;
和/或,混合反应液的具体配制包括以下步骤:
①将等量的蛋白分别与等体积的100~150mM钙盐水溶液和70~150mM磷酸盐水溶液混合,对应得到混合液a和混合液b,蛋白在混合液a和混合液b中的浓度相同,
且浓度为0.1~100mg/mL;
②将步骤①中混合液a和混合液b混合,得到混合反应液;
和/或,所述制备方法Ⅱ中:
牙釉蛋白变体溶液为牙釉蛋白变体水溶液,优选的,牙釉蛋白变体在牙釉蛋白变体水溶液中的浓度为70-90mg/mL,更优选的,牙釉蛋白变体在牙釉蛋白变体水溶液中的浓度为80mg/mL;
和/或,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比为(0.5~1.5):(3~7),优选的,牙釉蛋白变体与骨粉的质量比为1:5。
7.如权利要求6所述的复合材料的制备方法,其特征在于,
所述制备方法Ⅰ中:
磷酸盐为磷酸二氢盐,优选的,磷酸二氢盐为KH2PO4;
和/或,钙盐为CaCl2;
和/或,蛋白在混合反应液中的浓度为0.2~80mg/mL,优选的,蛋白在混合反应液中的浓度为1mg/mL;
和/或,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体来源于哺乳动物,优选的,所述牙釉蛋白和/或牙釉蛋白变体来源于人或鼠,更优选的,所述牙釉蛋白变体为去除C端片段的人源牙釉蛋白或只含N端和C端的鼠源牙釉蛋白,进一步优选的,所述牙釉蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任一所示。
8.如权利要求6所述的复合材料的制备方法,其特征在于,
所述制备方法Ⅰ中:
钙盐在混合反应液中的终浓度为1mM~50mM,优选的,钙盐在混合反应液中的终浓度为2.5mM~33.4mM,更优选的,钙盐在混合反应液中的终浓度为3.3mM;
和/或,磷酸盐在混合反应液中的终浓度为1.0mM~20.9mM,优选的,磷酸盐在混合反应液中的终浓度为1.5mM~20.9mM,更优选的,磷酸盐在混合反应液中的终浓度为2.1mM。
9.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括权利要求1~4任一项所述复合材料中b)所述的复合材料,以及骨粉。
10.如权利要求9所述的组合物,其特征在于,所述复合材料与骨粉的质量比为7:5;所述牙釉蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
11.如权利要求1~4任一项所述的复合材料、权利要求5~8任一项所述的制备方法或权利要求9~10任一项所述的组合物在制备骨再生、牙周组织再生或骨嫁接材料修饰的产品中的应用。
12.如权利要求11所述的应用,其特征在于,所述的骨为颅骨。
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