KR20070060148A

KR20070060148A - 세포배양용 인간 혈청

Info

Publication number: KR20070060148A
Application number: KR1020077010082A
Authority: KR
Inventors: 고지 스즈키; 세이신 다나카
Original assignee: 가부시끼가이샤 제이엠에스
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2007-06-12
Also published as: CA2587885C; CA2587885A1; KR20100024522A; WO2006054448A1; US8679838B2; JPWO2006054448A1; EP1820852A1; EP1820852A4; CN101061218A; US20100167402A1; US20090075355A1; KR101016504B1

Abstract

줄기세포의 증식을 효율적으로 촉진할 수 있는 증식인자를 다수 포함한 혈청을 제공한다. 채혈 20분 이내의 혈소판 잔존률이 전체 혈소판량의 20% 이하이고, 세포증식인자의 방출률이 20% 이상인 세포배양용 인간 혈청.

Description

세포배양용 인간 혈청{Human serum for cell culture}

기술분야

본 발명은, 세포배양용 인간 혈청에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포증식인자를 다량 포함하는 세포배양용 인간 혈청에 관한 것이다.

본 출원은 2004년 11월 19일에 출원된 일본 특허출원 제 2004-335344호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 출원의 내용은 인용에 의해 본 출원에 포함된다.

배경기술

현재, 재생의료분야에 있어서는, 대상자로부터 채취한 줄기세포를 체외에서 증식 또는 분화시킨 후 대상자에 이식함으로써 대상자의 조직 재생을 촉진시키는 연구가 이루어지고 있다. 줄기세포는 각종 조직이나 기관으로 분화하는 다분화능을 가지며, 재생의료의 열쇠를 쥔 세포로서 주목받고 있다.

줄기세포의 체외배양증식의 경우, 배지에 혈청을 첨가하면 효과적인 것이 알려져 있지만, 인간의 치료를 목적으로 하는 경우에는 인간 이외의 동물을 유래로 하는 혈청을 이용하는 것은 안전상의 문제로부터 피해야하므로, 인간 유래, 특히 대상자로부터 채취한 혈액으로 조제한 혈청을 사용하는 것이 요구된다. 또한, 혈 액검사와 비교하면, 재생의료의 분야에 있어서의 줄기세포의 배양에는 비교적 보다 많은 혈청이 요구된다.

이와 같은 혈청을 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 유리 분말로 이루어진 혈액응고촉진 고체가 수용된 채혈관을 이용하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 1 참조). 또한, 혈청중에 혼입하는 피브린(fibrin) 등의 응고물질을 신속하게 분리시키기 위해, 유리 분말과 혈액을 접촉시켜 증식인자를 다종다량으로 포함한 혈청을 용이하게 회수하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 2 참조). 또한, 인간 혈장을 원료로 하여 제조하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 3 참조). 또한, 혈장에 칼슘 화합물 및 유리 비즈를 첨가하여 증식인자를 얻는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 4 참조).

특허문헌 1 : 일본국 특허공개 제 2000-000228 호 공보

특허문헌 2 : 일본국 특허공개 평 4-83165 호 공보

특허문헌 3 : 일본국 특허공개 제 2001-275662 호 공보

특허문헌 4 : 일본국 특허공개 제 2004-269409 호 공보

발명이 해결하고자 하는 과제

그러나, 특허문헌 1 및 2에 개시되어 있는 방법은, 혈액의 검사를 목적으로 하는 용량이 적은 채혈관을 이용하기 때문에, 줄기세포의 배양에 필요한 양의 혈청을 조제하기 위해서는, 몇 번이나 조제조작을 수행하지 않으면 아니되므로 실용으로는 적합하지 않다. 또한, 특허문헌 3에 개시되어 있는 방법은, 항응고제로서 트 롬빈(thrombin)을 사용하므로, 생물유래의 제품을 이용함에 따른 감염 리스크가 잔존한다고 하는 면에서 바람직하지 않다. 또한, 특허문헌 4에 기재된 방법의 경우, 세포증식인자를 소량밖에 함유하지 않는 혈장을 원료로 하고 있어, 수득된 혈청은 충분한 세포증식인자를 포함하지 않기 때문에, 줄기세포를 효율좋게 배양할 수 없다.

이상의 과제를 감안하여, 본 발명은 줄기세포의 증식을 효율적으로 촉진할 수 있는 증식인자를 많이 함유한 혈청을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

보다 구체적으로는, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.

(1) 혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분과 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로서, 채혈 20분 이내의 혈소판 잔존률이 전체 혈소판량의 0%을 초과하고 20% 이하이며, 세포증식인자의 방출률이 20% 이상 100% 이하인 세포배양용 혈청.

(1)의 발명에 따르면, 채혈 20분 이내의 혈소판 잔존률을 전체 혈소판량의 0%를 초과하고 20% 이하로 함으로써, 세포증식인자의 방출을 신속하게 촉진하는 것이 가능해진다. 또한, 세포증식인자의 방출률을 20% 이상 100% 이하로 함으로써, 줄기세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해진다. 또한, 적어도 혈액유래의 핵성 성분과 혈소판을 포함하는 유동체를 사용함으로써, 혈장으로부터 조제되는 양 보다도 많은 증식인자를 포함하는 혈청을 생성하는 것이 가능해지고, 소 태아 혈청 과 동등한 세포증식 효과를 가진 혈청을 제조할 수 있다.

여기서, 「혈장」이란, 혈구(적혈구, 백혈구, 혈소판)와 액체 성분인 혈장(혈청)으로 이루어진 전혈(全血), 및 이들 중 적어도 1종을 포함한 액체(예를 들어 성분 헌혈로 채취된 혈액)를 말한다. 또한, 「혈청」이란, 채취한 혈액을 방치하면 유동성이 저하하고, 그 후에 빨간 응고 덩어리(혈병)로부터 분리되는 담황색 액체를 말한다. 본 발명에서의 「혈청」이란, 혈병으로부터 분리되지 않는 점에서 생성방법이 일반적인 혈청과는 다르나, 거기에 포함되는 응고인자나 증식인자가 실질적으로 일반적인 혈청과 동등한 세포배양에 유용한 혈액중의 액성 성분을 말한다. 또한, 「혈액유래의 액성 성분」이란, 혈구 이외의 혈액성분 또는 혈구 이외의 혈액성분에 항응고제 등의 약제를 첨가한 혼합액을 말한다. 또한, 「세포증식인자」란, 혈소판 증식인자(PDGF), 트랜스포밍　증식인자(TGF-β1), 혈관내피 증식인자(VEGF), 인슐린양 증식인자(IGF), 간세포 증식인자(HGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 등을 말한다.

또한, 「세포증식인자의 방출률」이란, 진공채혈관에 채혈된 소정량의 혈액으로부터 조제한 혈청중 세포증식인자의 양을 잠재량(100% 방출)으로 하고, 이 잠재량에 대한 세포증식인자의 비율을 말한다.

(2) 혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분과 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로써, 상기 세포증식인자의 함유량은 혈장으로부터 조제된 인간 혈청보다도 많은 세포배양용 인간 혈청.

(2)의 발명에 따르면, 본 발명에 따른 인간 혈청의 세포증식인자의 함유량 을, 혈장으로부터 조제한 경우보다도 많게 함으로써, 줄기세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해진다. 여기서, 「혈장」이란, 채취한 혈액에 헤파린이나 CPD 등의 항응고제를 첨가한 후에 원심분리하여 수득된 상등액을 말한다. 「혈장으로부터 조제된 인간 혈청」이란, 대상자로부터 채취한 혈액을 혈소판이 완전히 침전하는 원심분리조건(예, 4,400 g×5 분 이상)하에서 혈장을 조제하고, 이 혈장에 포함되는 응고인자를 제거하는 것에 의해 수득된 인간 혈청을 말한다.

(3) 혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분과 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로서, 상기 세포증식인자의 함유량은, 방치에 의해 조제된 인간 혈청보다도 많은 세포배양용 인간 혈청.

(3)의 발명에 따르면, 본 발명에 따른 인간 혈청의 세포증식인자의 함유량을 방치에 의해 조제한 경우보다도 많게 함으로써, 줄기 세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능해진다. 여기서, 「방치에 의해 조제된 인간 혈청」이란, 대상자로부터 채취한 혈액을 가소성 용기내에서 약 1 시간 실온에서 방치한 후, 원심분리하여 수득된 인간 혈청을 말한다.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포증식인자가 PDGF-BB 또는 TGF-β1 중 적어도 하나를 포함하는 세포배양용 인간 혈청.

(4)의 발명에 따르면, 상술한 세포증식인자 중 세포증식능이 더 높은 PDGF-BB 또는 TGF-β1 중 적어도 하나를 포함하게 함으로써, 줄기 세포를 더욱 효율적으로 증식시키는 것이 가능해진다. 또한, PDGF-BB는 세 형태의 PDGF(PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC) 중 어느 하나를 말한다.

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포증식인자는 상기 유동체를 유리 가공체에 접촉시키는 것에 의해 수득되는 것인 세포배양용 인간 혈청.

(5)의 발명에 따르면, 유동체중의 혈소판이 활성화되어 세포증식인자를 방출하기 위해서는, 상기 유동체를 이물질과 접촉시킬 필요가 있다. 본 발명에서는, 이러한 이물질을 유리 가공체로 함으로써, 폴리에틸렌 펠렛의 경우보다도 효율적으로 세포증식 인자를 방출시키는 것이 가능해진다. 여기서, 「유리 가공체」란, 유리 분말, 유리 비즈 등을 말한다. 유리 가공체의 형상은, 적혈구의 파괴(용혈)나 본 발명에 따른 혈청을 조제할 때 사용하는 장치의 파손을 억제한다는 측면에서 대략 구형상으로 하는 것이 바람직하다.

또한, 혈소판 및 혈액응고인자 등의 피활성화 인자를 신속히 활성화시키기 위해, 유리 가공체의 표면을 이산화규소 화합물로 이루어진 층으로 형성하는 것이 바람직하다. 이산화규소 화합물로는, 유리, 실리카, 규조토, 카올린 등에서 선택된 적어도 1종 이상을 사용할 수 있는데. 이들에 한정되는 것은 아니다.

(6) (5) 항에 있어서, 상기 유리 가공체가 유리 비즈인 세포배양용 인간 혈청.

(6)의 발명에 따르면, 유리 가공체를 유리 비즈로 제조함으로써, 유동체 중의 혈소판을 더욱 활성화시키는 것이 가능해진다. 그중에서도, 다공질의 유리 비즈는, 유동체와의 접촉면적이 크기 때문에 더욱 바람직하다. 또한, 유리 비즈의 표면적은 유동체 1 ㎖에 대하여 0.1 ㎟/㎖ 내지 25 ㎟/㎖인 것이 바람직하다.

(7) (1) 내지 (6) 항 중 어느 한 항에 있어서, 외기에 접촉되지 않고 조제되 는 것인 세포배양용 인간 혈청.

(7)의 발명에 따르면, 인간 혈청이 외기에 접촉되지 않게 조제되도록 함으로써, 조제된 혈청이 세균이나 미생물 등에 의해 오염될 위험성도 낮아진다. 이로써, 안정성이 높은 혈청을 조제할 수 있고, 안전성을 한층 더 확보할 수 있게 된다. 또한, (7)의 발명에 따른 인간 혈청은, 외기에 접촉되지 않는 형태의 장치를 사용하여 조제되는 것이 바람직하다.

(8) (1) 내지 (7) 항 중 어느 한 항에 있어서, 재생의료방법에 사용하는 세포배양용 인간 혈청.

(8)의 발명에 따르면, 세포배양용 배지에 사용함으로써, 대상자로부터 채취한 줄기 세포를 접종하여 배양할 때, 세포를 더욱 조속히 배양하는 것이 가능해진다. 또한, 자기혈청으로 세포를 배양하는 것이 가능하기 때문에, 부작용 등이 일어날 가능성이 적고, 안전성 측면에서도 우수하다.

발명의 효과

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포배양용 인간 혈청은 세포증식인자를 대량 함유하기 때문에, 종래의 혈청보다도 효율적으로 줄기세포를 배양하는 것이 가능해진다. 또한, 이 인간 혈청을 재생의료에 사용하면, 대상자의 조직 및 기능을 안전하고도 확실하게 재생할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 본 발명에 따른 세포배양용 인간 혈청을 조제하는 혈청조제장치를 나타낸 도면이다.

도 2는, 본 발명에 따른 세포배양용 인간 혈청을 조제하는 순서를 나타내는 도면이다.

도 3은, 혈청조제장치의 혈액저장부(10)를 진탕시키는 도면이다.

도 4는, 진탕시간과 각 시료중 혈소판 잔존률을 나타낸 도면이다.

도 5는, 진탕시간과 각 시료중 PDGF-BB의 방출률과의 관계를 나타낸 도면이다.

도 6은, 진탕시간과 각 시료중 TGF-β1의 방출률과의 관계를 나타낸 도면이다.

발명을 실시하기 위한 형태

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 세포배양용 인간 혈청은, 세포증식인자를 포함하는 혈청을 조제하는 혈청조제공정 및 조제된 혈청의 존재하에 세포를 배양하는 배양공정을 포함하는 세포배양방법을 위한 혈청을 조제하는 세포배양용 혈청조제장치에 의해 조제되는 것이 바람직하다.

이 혈청조제장치는, 적어도 응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분과 혈소판을 포함하는 유동체를 저장하는 혈액저장부를 가지며, 이 혈액저장부는 세포배 양공정에 적합한 혈청을 생성하는 혈청생성기능을 가진 세포배양용 혈청조제장치인 것이 바람직하다. 또한, 이 혈청조제장치는, 폐쇄계 즉, 외기에 접촉하지 않고 혈청을 조제할 수 있는 장치인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 혈청생성기능이란, 유동체중의 혈소판을 활성화시킴으로써, 혈청중의 증식인자 함유량을 증가시켜 혈청의 회수능을 높이는 기능을 말하며, 유동체 보다도 비중이 큰 응고촉진고체에 의해 부여된다.

구체적으로는, 하기에 나타낸 혈청조제장치에 의해 조제되는 것이 바람직하나, 특별히 이 장치로 한정되지 않는다.

〈혈청조제장치〉

도 1에 나타낸 혈청조제장치(1)는, 혈액저장부(10), 성분수용부(20)를 주된 요소로 하여 구성되어 있다. 그 가운데, 혈액저장부(10) 및 성분수용부(20)는 가소성을 가진 수지재료, 예를 들어 연질 폴리염화비닐로 이루어진 2 장의 시트가 외연부(11a)에서 융착됨으로써 자루형상으로 형성된 본체부(11)와, 본체부(11)의 내부에 삽입된 유리 가공체(12)로 구성되어 있다.

본체부(11)내에 있어서, 응고촉진체가 되는 유리 가공체(12)는 본체부(11)의 내부에서 유동가능한 상태로 설정되어 있으며, 예를 들어 소다 글래스(Soda Glass)로 이루어진 대략 구형상으로 되어 있다. 또한, 유리 가공체(12)의 표면적이 0.1 ㎟/㎖ 이상의 관계가 되는 표면적인 것이 바람직하다. 이와 같은 범위로 함으로써, 혈액중의 혈소판 및 응고인자의 활성화가 촉진된다.

또한, 저장가능한 혈액량에 대한 유리 가공체(12)의 표면적을 0.1 ㎟/㎖ 이상 25.0 ㎟/㎖ 이하로 한 경우에는, 활성화 촉진공정 및 원심분리공정에 있어서의 용혈의 억제와, 혈소판 및 응고인자의 활성화 촉진과의 양립이 가능해진다.

또한, 혈액저장부(10)의 본체부(11)의 상연단(上緣端)에는, 그의 접속구(接續口)에 2 개의 튜브(41, 42)가 기밀접속되어 있다. 그 중 튜브(41)는 혈액을 도입하기 위한 도입로 역할을 하기 때문에, 타단에는 채혈침(30) 또는 채혈침과 접속가능한 접속부가 접속되어 있다. 이와 같은 구조로 함으로써 채취된 혈액을 외기에 접촉함없이 혈청으로 조제하는 것이 가능해진다.

혈액저장부(10)에 기밀접속된 또 다른 일방의 튜브(42)는, 튜브(43∼46, 51∼56) 및 분기체(分岐體)(61∼65)를 통해 각 자류형상체(21∼26)에 접속되어 있다. 이들은 분리된 혈액성분을 도출하기 위한 도출로의 역할을 담당한다. 이들 튜브(41∼46, 51∼56)는 유연성을 가진 수지재료, 예를 들어 연질 폴리염화비닐 등의 재료로 구성되어 있다. 여기서, 성분수용부(20)의 자루형상체(21∼26)와 각 튜브(51∼56)도 용제접착, 열융착 또는 초음파용착 등에 의해 기밀접촉되어 있다.

〈혈청조제공정〉

상기한 구성을 가진 혈액조제장치(1)를 이용한 혈청조제공정에 대해 도 2 및 도 3을 이용하여 설명한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 혈청조제장치(1)를 이용한 혈액분리조작은 크게 나누어 7 개의 공정(S1∼S7)으로 구성되어 있다.

우선, 조작의 제 1 단계로는, 상기 도 1에서의 채혈침(30)을 대상자(환자)에게 찔러 혈액을 채취한다. 이 때, 채혈침(30)으로부터 채취된 혈액은 튜브(41)를 통해 하방에 위치하는 혈액저장부(10)에 저장된다(저장공정 S1). 여기서, 혈액저장부(10)에 채취된 혈액이 성분수용부(20) 쪽으로 흘러들어가지 않도록 클램프 등을 이용하여 혈액저장부(10)의 근원측에서 경로를 폐쇄하고 있다. 저장공정(S1)은, 채혈시 환자의 몸상태 등을 고려하여 소요량을 채취하고 종료된다. 여기서 말하는 소요량은 환자의 체격이나 몸상태에 문제가 없는 경우 200 ㎖ 내지 600 ㎖ 정도를 말한다.

다음으로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 저장공정(S1)을 개시후, 그와 병행하도록 혈액저장부(10)를 진탕시킨다(활성화촉진공정 S2). 도 3에 나타낸 바와 같이, 채취된 혈액을 저장한 혈액저장부(10)는 진탕장치(100)에 의해 부드럽게 교반되고, 내부에 수납된 유리 가공체(12)와 접촉하게 된다. 그리고, 혈액중에 포함되어 있는 혈소판 및 응고인자가 유리 가공체(12)의 표면에서 응고하고, 응고시 활성화된 혈소판으로부터, 이를 유래로 하는 증식인자가 방출된다(또한, 이 활성화촉진공정을 저온하에서 수행하면 혈소판의 응집촉진에 효과적이다). 저장공정(S1)후, 채혈대상자로부터 채혈침(30)을 빼고, 채혈침(30)과 혈액저장부(10)를 연결하고 있는 튜브(41)의 일부를 용단(溶斷)하고 동시에 그의 용단끝을 용착한다(용단공정 S3).

한편, 대상자로부터 분리된 혈액저장부(10)는 성분수용부(20) 및 이들 사이를 연결하는 각 튜브(42∼46, 51∼56), 또한 분기체(61∼65) 등과 함께 활성화촉진공정(2)을 거쳐 컴팩트하게 모아져 원심분리기에 배치된다(원심분리공정 S4). 혈 액저장부(10)에 대한 원심분리의 조건은, 저장된 혈액의 양 및 분리하는 성분의 종류에 따라 설정되는 것이나, 예를 들어 2,250 g×10 분, 4 ℃로 설정된다. 또한, 이 때, 튜브(42)는 저장공정(S1)시와 동일하게 파단가능한 격벽 또는 클램프에 의해 경로가 폐쇄된 상태로 보존되어 있다.

용단공정(S3) 및 원심분리공정(S4)은 항응고제를 미리 첨가하여 채혈하는 경우에는 활성화촉진공정(S2) 이전에 수행할 수도 있다. 이 경우, 원심분리는 하기의 조건으로 행하는 것이 바람직하다.

전혈의 원심분리 : 4,400 g×4∼6 분, 2,250 g×10 분

다혈소판혈장(PRP)의 원심분리 : 1,100 g×4∼6 분

도 2로 되돌아가서, 활성화촉진공정(2)으로부터 원심분리공정(S4)에서 활성화된 혈구성분을 비롯한 피활성화인자는, 괴상화되어 혈액으로부터 분리된다(분리공정 S5). 또한, 분리공정(S5)에 있어서, 혈액저장부(10) 내에서 분리추출된 혈청(71)은 혈액저장부(10)를 가압함으로써, 각 포대형상체(21∼26)의 전부 또는 일부에 대해 순차적으로 소분되어 간다(도출공정 S6).

도 2에 나타낸 바와 같이, 포대형상체(21)에 소요량의 혈청이 충진된 후, 튜브(51)를 용단 및 용착한다(용단공정 S7). 이 용단 및 용착은, 원심분리공정(S4) 이전에 튜브(42)를 용단 및 용착한 것과 동일한 방법을 이용하여 실시된다. 또한, 혈청이 내부에 충진된 포대형상체(21)에 대해서는 예를 들어 냉동보존 등의 보존처리가 실시된다.

이 도출공정(S6) 및 용단공정(S7)을 포대형상체(21∼26)의 각각에 대해 순차 적으로 실시하고, 포대형상체(21∼26) 모두 또는 일부에 혈청이 충진된 시점에서 혈정조제조작을 종료한다. 추가로, 필요에 따라, 적혈구를 생리식염수, CPD액, ACD-A액 등의 항응고제나 MAP액 등과 같은 혈액보존액으로 세정희석하여, 윤혈용 혈액으로서 보존할 수도 있다.

실시예

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉

유리 비즈를 5 개(φ:4 ㎜, 50 ㎟) 넣은 용기에 신선한 인간 혈액 20 ㎖를 넣고, 멀티쉐이커(MMS-300 동경요리기기제)에 의해 진탕하였다. 진탕개시 10, 20, 30, 60 분후에 혈액 1 ㎖를 항응고제가 든 샘플링 튜브에 샘플링하고, 원심분리에 의해 혈청을 분리하였다. 또한, 동일한 대상자로부터 CPD 첨가 혈액을 채취하고, 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장에 염화칼슘을 첨가후, 37℃하에서 피브린을 석출시켜 혈청을 조제하였다. 유리 비즈가 든 용기로부터 조제된 혈청과, CPD 첨가 혈액으로부터 분리된 혈장으로부터 조제된 혈청에 대해 증식인자(PDGF-BB, TGF-β1)을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 또한, 증식인자의 측정은, R&D SYSTEMS사 제품 테스트 킷트와 마이크로플레이트 리더(Multiscan BICHROMATIC Labsystem사 제품)를 이용하여 실시하였다.

[표 1]

혈청 유래의 차이에 따른 증식인자 함유량의 차이

혈청의 유래	유리 비즈 5 개 함유 용기 유래				CPD 첨가 혈장 유래
진탕시간	10분	20분	30분	60분	CPD 첨가 혈장 유래
PDGF-BB	40.5 pg/㎖	753.7 pg/㎖	1677.2 pg/㎖	1677.2 pg/㎖	<32.5 pg/㎖
TGF-β1	21.2 ng/㎖	24.4 ng/㎖	26.4 ng/㎖	29.6 ng/㎖	1.5 ng/㎖

유리 비즈 5 개가 든 용기에서 조제된 혈청의 경우, PDGF-BB 함유량은 진탕시간의 경과와 함께 상승하고, 60분후에 혈청 1 ㎖ 당 1677.2 pg이 방출되었다. 이때, 동일한 대상자의 혈장유래 혈청중에 포함되어 있는 PDGF-BB 량은 검출한계인 32.5 pg/㎖ 미만이었다. TGF-β1은, 유리 비즈 5 개가 든 용기에서 조제된 혈청의 경우 진탕 개시 10분에서 이미 혈청 1 ㎖ 당 21.2 ng의 TGF-β1이 방출되었고, 그 후에도 경시적으로 완만하게 방출량이 증가하고, 60분후에 29.6 ng/㎖에 도달하였다. 한편, 동일 대상자의 혈장유래 혈청에서 TGF-β1 방출량은 혈청 1 ㎖ 당 1.5 ng 이었다.

〈실시예 2〉

유리 비즈를 포함하지 않은 채혈용기(시료 3), 유리 비즈를 5 개 포함하는 채혈용기(시료 1), 폴리에틸렌 펠렛을 20 개 포함하는 채혈용기(시료 2)인 3 종의 용기를 준비하였다. 각 용기에 동일 대상자 유래의 신선한 혈액을 20 ㎖씩 넣고, 멀티쉐이커(MMS-300, 동경요리기기제)에 의해 진탕하였다. 진탕개시 10분, 20분, 30분, 60분후에 혈액 1 ㎖를 항응고제가 든 샘플링 튜브에 샘플링하고, 혈구 카운트 장치(다항목 자동혈구 계수장치 K-4500 시스맥스사 제품)를 이용하여 혈소판의 수를 계측하였다.

또한, 각 시료를 원심분리하여 혈청을 분리하고, 혈청중의 증식인자(PDGF-BB, TGF-β1)를 측정하였다. 증식인자의 측정은 R&D SYSTEMS사 제품 테스트 킷트와 마이크로플레이트 리더(Multiskan BICHROMATIC Labsystem사 제품)를 이용하여 실시하였다.

또한, 동일 대상자로부터 시판 임상검사용 진공채혈관(베노젝트II 테르모사 제품)으로 혈액을 채취하고, 1 시간 실온방치후 혈청을 분리하고 마찬가지로 증식인자의 정량을 실시하였다. 혈소판수에 대해서는 채혈직후의 값을 100% 했을 때의 값을 혈소판 잔존률로서 나타내었다. 각 증식인자에 대해서는, 이 진공채혈관으로 조제한 혈청중의 증식인자량을 혈소판중의 증식인자의 잠재량으로 규정하고, 각 진탕시간에서 얻은 혈청중의 증식인자량을 상기 잠재량에 대한 비를 방출률로 하여 나타내었다.

[혈소판수]

도 4는, 진탕시간과 각 시료중의 혈소판 잔존률을 나타낸 도면이다. 진탕개시후 20분 이내에 시료 1중의 혈소판 잔존률은 약 2% 정도까지 저하하였다. 한 편, 시료 2의 경우, 시료 1 보다 약간 늦은 진탕개시후 30분이내에 감소하였다. 또한, 시료 3의 경우, 진탕개시직후는 급격히 감소한 반면, 진탕개시후 60분에 겨우 혈소판 잔존률이 2% 이하까지 감소하는 것으로 나타났다.

[PDGF-BB의 방출률]

도 5는, 진탕시간과 각 시료중의 PDGF-BB의 방출률의 관계를 나타낸 도면이다. 시료 1은 진탕개시후 경시적으로 PDGF-BB가 급격히 방출되었고, 1 시간 진탕후에는 혈청중 잠재량의 약 90%가 방출되었다. 나머지 2 개의 시료의 경우, 혈소판수가 감소하였음에도 불구하고, PDGF-BB의 방출량은 혈청중 잠재량의 20%도 방출되지 않았다.

[TGF-β1의 방출률]

도 6은, 진탕시간과 각 시료중 TGF-β1의 방출률 관계를 나타낸 도면이다. 시료 1의 혈청중에는, 진탕개시 10분후부터 혈청중 잠재량의 70% 가까운 양의 TGF-β1가 방출되었다. 나머지 2 개의 시료의 경우도, 그의 방출량이 증가하는 경향이 있는 것으로 확인되었지만, 60분후에도 그의 방출률은 혈청중 잠재량의 40% 정도에 머물렀다. 이상의 결과로 부터, 혈책중 혈소판을 제거함에 있어서, 폴리에틸렌 펠렛도 유리 비즈와 동일한 역할을 나타내나 혈소판을 활성화시킬 수 없음을 나타낸다.

Claims

혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분 및 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로서, 채혈 20분 이내의 혈소판 잔존률이 전체 혈소판량의 0%를 초과하고 20% 이하이며, 세포증식인자의 방출률이 20% 이상 100% 이하인 세포배양용 인간 혈청.
혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분 및 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로서, 상기 세포증식인자의 함유량이 혈장으로부터 조제된 인간 혈청보다도 많은 세포배양용 인간 혈청.
혈액응고인자를 포함하는 혈액유래의 액성 성분 및 혈소판을 포함하는 유동체로부터 수득되는 세포배양용 인간 혈청으로써, 상기 세포증식인자의 함유량이 방치에 의해 조제된 인간 혈청보다도 많은 세포배양용 인간 혈청.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포증식인자가 PDGF-BB 또는 TGF-β1 중 적어도 하나를 포함하는 세포배양용 인간 혈청.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포증식인자는 상기 유동체를 유리 가공체에 접촉시킴으로써 수득되는 것인 세포배양용 인간 혈청.
제 5 항에 있어서, 상기 유리 가공체가 유리 비즈인 세포배양용 인간 혈청.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 외기에 접촉하지 않고 조제되는 것인 세포배양용 인간 혈청.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 재생의료방법에 사용하는 세포배양용 인간 혈청.