CN114146096B - 一种富含细胞因子的条件血清的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含细胞因子的条件血清的制备方法和应用，该条件血清的制备方法包括以下步骤：取新鲜血液，离心，取PRP部分冻融加离心得到富血小板因子血浆，其余部分加入无菌玻璃小珠进行恒温振荡孵育，离心过滤后得到富含IL‑1Ra的条件血清，将富血小板因子血浆和富含IL‑1Ra的条件血清混合，得到富含细胞因子的条件血清。通过该方法制备的富含细胞因子的条件血清，血小板因子和IL‑1Ra得到充分富集，含量大大提高，且同时具有修复组织损伤、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效，可用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种富含细胞因子的条件血清的制备方法及应用。
背景技术
关节炎泛指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者可能导致关节残疾，非常影响患者的生活质量。
炎性关节炎(Inflammatory Arthritis，IA)的病因及发病机制目前尚未完全明确，但是许多证据已经表明，一些细胞因子尤其是白细胞介素-1(IL-1)在IA关节发病的慢性炎性过程中具有重要作用，白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)近年来亦被用于IA的治疗。
现有的富含血小板(L-1Ra)I的条件血清的制备方法是用硫酸铬(CrSO4)包被过表面的医疗级玻璃小珠与新鲜血液混合刺激，37℃静置24小时后提取血清，即可得到富含IL-1Ra等抗炎因子的条件血清给患者进行回输治疗。
但是，现有技术获得的条件血清中IL-1Ra单位含量较低，且单纯的富含抗炎因子的条件血清在修复组织损伤、促进愈合、恢复功能等方面的功效不明显。
富血小板血浆(PRP)法在受损或退化的组织部位进行注射，以试图达到修复组织损伤、及恢复功能的目的，并发症极少，是相对安全的治疗方式，但是，传统制作的血小板浓厚血浆不能同时治疗发炎和退化，因此，有进一步改善的空间。研究得知外周血液中IL-1Ra主要来源于白细胞层，PRP在制备过程中是没有提取白细胞层，制备富血小板因子的血清，可以改善传统制作的PRP所无法达到的治疗功效，其优点为血清中可同时包含生长因子与IL-1Ra，优化传统相关技术。与富血小板血浆技术不同，富细胞因子的血清在制备时已经活化了血小板和免疫细胞，能够在制备过程中就获得足够量的细胞因子和生长因子，使用时得到最高的生物效力。最原始的自体血清制备方法是用硫酸铬(CrSO4)包被过表面的医疗级玻璃小珠与新鲜血液混合刺激，37℃静置24小时后提取血清，即可得到富含大量白细胞介素1受体拮抗物、抗炎因子等多种细胞因子的血清给患者进行回输治疗。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，一方面，本发明提供一种富含IL-1Ra的条件血清的制备方法，可大大提高IL-1Ra的含量。进一步，本发明还提供一种富血小板因子条件血清及其制备方法，该条件血清同时包含富血小板因子血浆与富含IL-1Ra的条件血清，能够同时达到修复组织损伤、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效目的，且本发明在同一个血样中完成PRP和IL-1Ra的充分富集，操作简便，节约成本。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
S1、将新鲜血液装入采血管，充分摇匀；
S2、将步骤S1装有新鲜血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液一；
S3、将上清液一用无菌滤器过滤，收集滤液一，获得富含细胞因子的条件血清一；
或，
A、将新鲜血液装入采血管，充分摇匀；
B、将步骤A装有新鲜血液的采血管进行低速离心使血液分层，吸取收集上清中的PRP层，获得PRP粗提液，剩余血液置于采血管备用，将所述PRP粗提液进行冻融处理后离心，收集PRP上清液，无菌过滤后，收集的滤液为富血小板因子血浆；将装有剩余血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液二；
C、将上清液二用无菌滤器过滤，收集滤液二，将步骤B所述富血小板因子血浆和所述滤液二混合，获得富含细胞因子的条件血清二。
步骤S1或步骤A中，所述采血管中不添加抗凝剂。
步骤S1中，在所述采血管中，加入无菌玻璃小珠。
步骤B中，装有剩余血液的采血管中加入无菌玻璃小珠，然后放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液二。步骤S1或步骤B中，无菌玻璃小珠按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤S2或步骤B中，所述恒温振荡孵育的条件为35-38℃；转速为60-120r/min，振荡孵育的时间为12-24h。
步骤B中，所述低速离心的条件为，离心力为500×g～800×g，离心时间为7-9min。
步骤B中，所述冻融处理为-80℃-210℃环境下冷冻12-24h后，再解冻融化。
优选的，所述冻融处理为-80℃或液氮环境下冷冻12-24h后，在37℃解冻融化。
步骤S2或步骤B中，所述无菌过滤器为0.22μm无菌滤器。
本发明还提供一种如上所述的方法制备的条件血清。
本发明所述条件血清在用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗中的应用，也属于本发明的保护范围。
作为本发明的又一实施方式，一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
(1)材料的准备：准备无抗凝剂的普通玻璃采血管；
(2)富含IL-1Ra条件血清的制备：将新鲜的血液装入无抗凝剂的普通玻璃采血管，充分缓慢摇匀，保证新鲜血液充分接触玻璃采血管，将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内，进行24h的恒温振荡孵育，用离心机以2500-3500r/min的转速，离心8-10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra的条件血清。
作为本发明的又一实施方式，一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备无抗凝剂的普通玻璃采血管和医疗级玻璃小珠，按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中；
(2)将新鲜血液装入采血管，充分缓慢摇匀，保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触，将装有血液和玻璃小珠的采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内，进行24h的恒温振荡孵育，再用离心机以2500-3500r/min的转速，离心8-10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra的条件血清。
作为本发明的又一实施方式，一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备无菌玻璃采血管；
(2)PRP制备：将新鲜血液，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分，上清是贫血小板血浆PPP)，保留剩余的血液备用，将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后2500-3500r/min离心8-10min，进一步收集上清液PRP，将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤，收集的滤液为富血小板因子血浆；
(3)富含IL-1Ra血清的制备：PRP采集后，将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀，将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以2500-3500r/min离心8-10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，滤液为富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清。
作为本发明的又一实施方式，一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠；
(2)PRP制备：将新鲜血液装入采血管，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层，-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后2500-3500r/min离心8-10min，收集上清PRP，使用0.22μm无菌滤器过滤，收集的滤液为富血小板因子血浆；
(3)富含IL-1Ra条血清的制备：PRP采集后，将剩余血液充分缓慢摇匀，按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中，保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触，将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以2500-3500r/min离心8～10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的条件血清的制备方法，可显著提高IL-1Ra的含量，从而增强条件血清治疗组织发炎和退化的功效；
2、和现有技术的静置孵育相比，本发明采用振荡培养，可增大血液与玻璃小珠的接触面积，从而使血液与玻璃小珠充分接触进行特异性刺激，产生大量细胞因子，使细胞因子充分富集；
3、本发明提供的富血小板因子条件血清及其制备方法，使血液中的生长因子和抗炎因子充分富集，能够同时达到修复组织损伤、促进愈合、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效目的，更适用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗；
4、本发明提供的制备方法可在同一个血样中完成血小板因子和IL-1Ra的充分富集，操作简便，节约成本。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例3的制备方法流程示意图；
图2为(实施例1和实施例3和对比例1、对比例3)不加玻璃珠的情况下比较振荡-静置，有PRP-无PRP的情形；
图3为(实施例2和实施例4和对比例2、对比例4)加玻璃珠的情况下比较振荡-静置，有PRP-无PRP的情形。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
<第一方面>
本发明提供一种富含IL-1Ra的条件血清的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将新鲜血液装入含无菌玻璃小珠的玻璃采血管，充分摇匀；
步骤S2、将装有全血的玻璃采血管放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液；
步骤S3、将步骤S2的上清液用无菌滤器过滤，获得的滤液即为富含IL-1Ra的条件血清。
步骤S1中无菌玻璃小珠按每3mL全血加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤S2中恒温摇床培养箱的温度为37℃、转速为60-120r/min，振荡孵育的时间为12-24h。
步骤S2中离心转速为2500-3500r/min，离心时间8-10min。
步骤S3中无菌滤器为0.22μm。
<第二方面>
本发明提供一种富血小板因子条件血清及其制备方法，包括如下步骤：
步骤a)将全血低速离心使血液分层；
步骤b)吸取PRP层，进行冻融处理后离心，收集上清，无菌过滤后，收集滤液得到富血小板因子血浆；
步骤c)剩余血液加入无菌玻璃小珠后充分摇匀，放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清，无菌过滤后即得到富含IL-1Ra的条件血清；
步骤d)将富血小板因子血浆和富含IL-1Ra的条件血清混合，得到富含细胞因子的条件血清
步骤a)中离心力为500×g-800×g，离心时间为7-9min。
步骤b)中冻融处理为-80℃或液氮环境下冷冻12-24h后，在37℃解冻融化。
步骤b)中离心转速为2500-3500r/min，离心时间8-10min。
步骤b)无菌滤器为0.22μm。
步骤c)中无菌玻璃小珠按每3mL全血加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤c)中恒温摇床培养箱的温度为37℃、转速为60-120r/min，振荡孵育的时间为12-24h。
步骤c)中离心转速为2500-3500r/min，离心时间8-10min。
步骤c)中无菌滤器为0.22μm。
实施例1
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养
(2)材料的准备：准备无抗凝剂的普通玻璃采血管；
(2)富含IL-1Ra条件血清的制备，将新鲜的血液装入无抗凝剂的普通玻璃采血管，充分缓慢摇匀，保证新鲜血液充分接触玻璃采血管，将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内，进行24h的恒温振荡孵育，用离心机以3500r/min的转速，离心10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra的条件血清。
实施例2
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠
(1)准备无抗凝剂的普通玻璃采血管和医疗级玻璃小珠，按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中；
(2)将新鲜血液装入采血管，充分缓慢摇匀，保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触，将装有血液和玻璃小珠的采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内，进行24h的恒温振荡孵育，再用离心机以3500r/min的转速，离心10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra的条件血清。
实施例3
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+PRP(流程图如图1)
(1)准备无菌玻璃采血管；
(2)PRP制备：将新鲜血液，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分，上清是贫血小板血浆PPP)，保留剩余的血液备用，将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后3500r/min离心10min，进一步收集上清液PRP，将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤，收集的滤液为富血小板因子血浆；
(3)富含IL-1Ra血清的制备：PRP采集后，将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀，将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以3500r/min离心10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，滤液为富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清；
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
实施例4
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠；
(2)PRP制备：将新鲜血液装入采血管，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层，-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后2500r/min离心8min，收集上清PRP，使用0.22μm无菌滤器过滤，收集的滤液为富血小板因子血浆；
(3)富含IL-1Ra条血清的制备：PRP采集后，将剩余血液充分缓慢摇匀，按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中，保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触，将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速60r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以2500r/min离心8～10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清；
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
实施例5
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管；
(2)PRP制备：将新鲜血液，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分，上清是贫血小板血浆PPP)，保留剩余的血液备用，将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后3500r/min离心10min，进一步收集上清液PRP，将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，收集的滤液为富血小板因子血浆
(3)富含IL-1Ra血清的制备：富血小板因子血浆采集后，将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀，将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以3500r/min离心10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，收集滤液，得到富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清。
实施例6
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠；
(2)PRP制备：将新鲜血液装入采血管，600g离心8min后，吸取收集上清中的PRP层，-80℃冷冻24h后，在37℃解冻后～3500r/min离心10min，收集上清PRP，使用0.22μm无菌滤器过滤，收集的滤液为富血小板因子血浆；
(3)富含IL-1Ra条血清的制备：PRP采集后，将剩余血液充分缓慢摇匀，按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中，保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触，将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育24h后，用离心机以3500r/min离心8～10min，将多余的红细胞沉淀去除，最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清，即得到富含IL-1Ra血清；
(4)富含细胞因子的条件血清：将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合，得到富含细胞因子的条件血清；
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
对比例1
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养。
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例2
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+玻璃小珠。
本对比例与实施例2的区别仅在于，步骤(2)中，恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例3
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+PRP
本对比例与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中，恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例4
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+玻璃小珠+PRP
本对比例与实施例4的区别仅在于，步骤(2)中，恒温振荡孵育替换为静置培养。
实施例5IL-1Ra含量测定
采用Elisa试剂盒对实施例1-4，以及对比例1-4制备的血清中IL-1Ra的含量进行检测；以及采用Elisa试剂盒对实施例3、4，以及对比例3-4制备的血清中PRP含量进行测试。
图2为(实施例1和实施例3和对比例1、对比例3)不加玻璃珠的情况下比较振荡-静置，有PRP-无PRP的情形。
采血后就离心过滤得到的血清IL-1Ra检测值为94.58pg/mL，37℃静置24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为135.8pg/mL，37℃静置24h加PRP后制备得到的血清IL-1Ra检测值为108.43pg/mL，单独的PRP的IL-1Ra检测值为171.31pg/mL，即含量都非常低，接近于无。
37℃下120r/min摇床振荡24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为1683.13pg/mL，37℃下120r/min摇床振荡24h后加入PRP制备得到的血清IL-1Ra检测值为1773.17pg/mL，证明摇床振荡的步骤可显著提高血清中IL-1Ra的含量；
图3为(实施例2和实施例4和对比例2、对比例4)加玻璃珠的情况下比较振荡-静置，有PRP-无PRP的情形。
同样的，采血后就离心过滤得到的血清IL-1Ra检测值为180.67pg/mL，单独的PRP的IL-1Ra检测值为171.31pg/mL，即含量都非常低，接近于无。
现有技术加入玻璃珠后37℃静置24h制备得到的血清IL-1Ra检测值为4833.18pg/mL，在现有技术基础上加上120r/min摇床振荡24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为6640.64pg/mL，同样证明摇床振荡的步骤可显著提高血清中IL-1Ra的含量。
加入玻璃珠后37℃静置24h制备得到的含PRP的血清IL-1Ra检测值为5351.19pg/mL，加入玻璃珠后37℃加上120r/min摇床振荡24h制备得到的含PRP的血清IL-1Ra检测值为13157.65pg/mL，在玻璃珠、摇床振荡、PRP三种促进因素的共同作用下，IL-1Ra的含量出现巨大增长。
试验结果表明：
实施例1(无抗凝剂的普通玻璃采血管与新鲜血液混合，37℃摇床振荡24小时后，离心提取上层血清，用0.22μm无菌滤器过滤后)得到无玻璃溶解物残留的安全性更高的富含IL-1Ra的条件血清。
实施例3的方法制备的血清同时包含PRP与IL-1Ra，能够同时达到修复组织损伤、恢复功能、治疗发炎和退化的功效的目的，且在同一个血样中完成PRP和IL-1Ra的分离，操作简便，节约成本，使得PRP和IL-1Ra得到充分富集；
实验采用Elisa试剂盒检测IL-1Ra的含量，与用现有的含玻璃小珠的采血套装与新鲜血液混匀后37℃静置24h提取的富含细胞因子条件血清比较，富血小板因子条件血清一中，IL-1Ra含量由4833.2pg/mL提高到5351.2pg/mL；富血小板因子条件血清二中，IL-1Ra含量由6640.64pg/mL提高到13157.65pg/mL；IL-1Ra含量与空白对照N组和PRP组比较均明显得到提高；如图2。与空白对照N血清组和单纯PRP组比较，富血小板因子条件血清三中，IL-1Ra含量无明显变化；富血小板因子条件血清四中，IL-1Ra含量由1683.13pg/mL提高到1773.17pg/mL；IL-1Ra含量与空白对照N组和PRP组比较均明显得到提高；如图3。
以上数据结果显示了本发明的优点，本发明制备的得到富血小板因子条件血清均可提高IL-1Ra的含量，其中富血小板因子条件血清二可很大程度提高IL-1Ra的含量；将静置的制备方法改为摇床可明显提高富血小板因子条件血清中IL-1Ra的含量，得到同时包含生长因子和IL-1Ra的富血小板因子条件血清。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (4)
1.一种富含细胞因子的条件血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将新鲜血液装入采血管，充分摇匀；
S2、将步骤S1装有新鲜血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液一；
S3、将上清液一用无菌滤器过滤，收集滤液一，获得富含细胞因子的条件血清一；
步骤S1中，在所述采血管中，加入无菌玻璃小珠；
或，
A、将新鲜血液装入采血管，充分摇匀；
B、将步骤A装有新鲜血液的采血管进行低速离心使血液分层，吸取收集上清中的PRP层，获得PRP粗提液，剩余血液置于采血管备用，将所述PRP粗提液进行冻融处理后离心，收集PRP上清液，无菌过滤后，收集的滤液为富血小板因子血浆；将装有剩余血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液二；
步骤B中，装有剩余血液的采血管中加入无菌玻璃小珠，然后放置于恒温摇床培养箱内，恒温振荡孵育，然后离心，将红细胞沉淀去除，收集上清液二；
C、将上清液二用无菌滤器过滤，收集滤液二，将步骤B所述富血小板因子血浆和所述滤液二混合，获得富含细胞因子的条件血清二；
无菌玻璃小珠按每3mL血液加入30-60颗的比例加入采血管中；
所述恒温振荡孵育的条件为35-38℃；转速为60-120r/min，振荡孵育的时间为12-24h。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤S1或步骤A中，所述采血管中不添加抗凝剂。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤B中，所述低速离心的条件为，离心力为500×g~800×g，离心时间为7-9min。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤B中，所述冻融处理为-80℃或液氮环境下冷冻12-24h后，在37℃解冻融化。
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