JPS6153567A - ヒメハブ毒からの血清分離用血液凝固促進剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液を凝固させて血清を分離するに当って有
用な血清分離用血液凝固促進剤を、ヒメハブ毒から分離
採取して製造する方法に関するものである。

（従来の技術） 現在、人の血清成分の分析検査は、種々の疾病を診断す
るのに重要な手段である。血′ｍｌｔ、分析するために
は、まず血液を凝固させ、血ｔｒｔを遠心分離しなけれ
ばならないが、従来のような血液を室温または３７Ｃに
放置する方式によると、凝固に４５〜６０分間を要する
。さらに、腎臓病患者は人工透析後、血清を検査しなけ
ればならないが、その血液は、透析前に血液内に投与さ
れた抗凝固剤（ヘパリン）のため凝固しにく＼、血清の
方に線維素原がら線維素が生成析出して、分析中に自動
診断装置のノズルが詰り、故障したりすることが少なく
ない。

蛇毒に含まれるトロンビン様酵素は、抗凝固剤の影響を
受けずく血液凝固を促進するので、上記の問題を解決す
るにはきわめて有効であり、すでに外国では、ボスロツ
プス属の毒蛇の毒からトロンビン様酵素を有効成分とす
るレプチラーゼＲという血液凝固促進剤が開発されてい
る。

（発明が解決しようとする問題点） 上記レプチラーゼＲという血液凝固促進剤はすでに市販
されているが、本邦での市販価格は著しく高いという大
きな欠点がある。

（問題点を解決するための技術手段） 本発明者らは、上記の問題点を解決するため検対した結
果、本邦産のヒメ・・プの蛇毒から独自の方法により和
製したトロンビン様酵素を用いれば、レブチラーゼＲと
同程度の血液凝固促進能力を発揮できる血清分離用血液
凝固促進剤を、きわめて安価に提供できることを見出し
たのである。

本発明に用いるヒメハブは、奄美、沖縄群島に多数生息
し、捕獲も容易であるところから安価に得ることができ
る。

本発明方法をその工程図を示して説明する。

本発明の工程図 ↓採毒 ↓峨心分陪 ↓凍結乾燥 ↓溶解 ↓透析 ↓遠心分離 ↓メンブランフィルターによる濾過 ↓―縮 ↓バイオゲルｐ−１００ゲル濾過 ↓濃縮 ↓再ゲル濾過 ↓水圧対する透析（脱塩） ↓凍結乾燥 ↓安定化剤、防腐剤、賦形剤の添加 ↓メンブランフィルタ−による濾過 ↓分注 ↓凍結乾燥 まず、ヒメハブを生きたまま保定し、シャーレ上に蛇毒
を吐出させ、これを多量に集めて、冷却遠心機により４
Ｃ前後で遠心分離し、その上清を凍結乾燥する。この乾
燥粗毒をトロンビン様酵素の精製のための出発材料とす
る。

乾燥粗沿はトロンビン様酵素の精製の際に、必要量を食
塩−トリス緩衝液に溶解する。さらに、同緩衝液に透析
後、透析内液を遠心分離して得られる上清を、孔径０．
４５μのメンブランフィルタ−を通す。この濾過液は、
牛フィブリノーゲンを用いてトロンビン様活性を測定す
ると、強い活性を示すが、朱だ溶血活性のほか種々のタ
ンパク質を含有しているので、これをまず、ＤＥ−，５
２セルロース（商品名）を充填したカラムに通液する。

つぎに、溶出液の食塩濃度を直線的に高めて吸着したタ
ンパク質を溶出すると、トロンビン様活性が高く、出血
活性を有しない両分を得る、しかし、この両分は未だ夾
雑タンパク質を多く含有しているので、きらばバイオゲ
ルｐ−１００（商品名）ゲル濾過を２回行ない、純度の
高いトロンビン様酵素画分を得る。この精製トロンビン
様酵素液を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、安定化
剤、防腐剤、賦形剤を含む溶液の添加および無［濾過の
処理を施し、バイアルに分注して再度、凍結乾燥する。

このようにして得られる製剤は、下記のごとき性状を有
するもので、トロンビン様作用を有する優れた血液凝固
促進剤であり、従来の市販の血液凝固促進剤に劣らない
凝固能を示し、臨床診断上、価値あるものである。

（※ａ） １１１分子量３４，０００ダルトンの高純度　トロンビ
ン様酵素を有効成分として含む。１バイアル中の組成は
次のとおりである。

（※ｂ） トロンビン様酵素　　　　　　　５０μ２ゼラチン氷解
物　　　　　　　　　２１ｎＱバラヒドロキシ安息香酸
メチル　　１　ｍ９グリシン　　　　　　　　　　　５
０　ｍｑ（※ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（
※ｂ）ミクロ・キエルダール法により測定する１２（蒸
留水に対して易溶である、 （３１１バイアルに蒸留水１．０−を加えて溶解した液
は、−摘（約３０μｔ）で人の正常部またはヘパリン加
面５ｒｎｔを２０〜２５分間で凝固させることができる
。

（４１溶血活性を示さない。

（５１血清検査値への影響がない。

（６）室温で安定である。

（発明の効果） 本発明によれば、従来の市販の血液凝固促進剤に劣らな
い凝固能を有する血清分離用血液凝固促進剤がきわめて
安価に得られる、 （実施例） 本発明の実施例を挙げて説明する。

ヒメハブの凍結乾燥粗毒５．ＯＳ’　ｆ、０．０５　Ｍ
食塩−０，０５Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ８，５）　３０
ｒｒｔに溶解し、これを同緩衝液１ｔに対して２回透析
し、透析内液を遠心して得られる上１″ｉｔをさらに孔
径０．４５μのメンブランフィルタ−を通す。

この濾過液をＤＥ−５２セルロースを充填したカラム（
φ２．６ｘ１０ｍ）に吸着させ、室温で溶出速度４０　
ｍ６１時にて、トリス緩衝液の濃度を一定にして、食塩
濃度を０．０５　Ｍからｏ、ｓ　Ｍまで直線的に高めて
溶出を行ない、牛フィブリノーゲンを用いてトロンビン
様活性の高い両分を採取する。

この酵素液をダイア７０−ＰＭ−１ｏメンブランフィル
タ−（商品名）の限外濾過で１０ｒｎｔまで濃縮し、０
．０５Ｍトリス緩衝液（１）Ｈ７，５）で平衡化したバ
イオゲルｐ−１００カラム（φ２．６×７０遍）で、溶
出速度１６．２ｍ／／時にてゲル濾過を行なう。溶出液
のトロンビン様活性の高い画分を採取して、限外濾過で
の縮し、同−灸件で再ゲル濾過を行なう、トロンとン様
活性画分を水に対して透析した後、凍結乾燥する。この
凍結乾燥物を０．２％ゼラチン氷解物−０，１％バラヒ
ドロキシ安息香酸メチル−５％グリシン溶液で溶解する
、この溶解液を孔径０．４５μのメンブランフィルタ−
に通した後、バイア〜に１ｄずつ分注して凍結乾　　　
（燥する。

このようにして得られる製剤は、血ｍ検査値への影響が
ない実質的に使用可能な血清分離用血液凝固促進剤であ
る。

手　続　補　正　？（方式） ％式％ １　事件の表示 特願昭５９−１７５１２２号 ２　発明の名称 ヒメハブ毒からの血清分離用血液凝固促進４Ｊの製造法 ３　補正をする者 事件との関係・特許出願人 群馬県新田郡藪塚本町大字藪塚湯ノ入３５１８財団法人
　日本蛇族学術研究所 ４代理人 昭和５９年１１月２７日 ６　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の棚 南面の簡ＰＡな説明の（閘 ７　補正の内容 明細外の記載を次のとおシ補正する。

ｉｌ＋、第６頁９行の 「本発明方法を・・・・・・・・・・・・説明する。」
を下記のとおり補正する。

「本発明方法を図面に示す工程図にしたがって説明する
。」 １２Ｉ、第３頁１０行〜第４頁終行の本発明の工程図に
関する記載を削除する。

（３１、第９頁２行の次に下記の記載を挿入する。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明方法の工程図である。」 （４）、別紙のとおり図面を補充する、↓採番 ↓退心分肛 ↓（ネも孔縁 ↓膠解 ↓透析 ↓違、（・弁部 ↓メンズヲンフィルター＋Ｃ、Ｋ　；Ｓ　’Ｊ’　ｌ。 ↓Ｓ槁 ↓パイオグ゛ルＦ−１００ゲルナ過 ↓沫謁 ↓　再ゲルｆＪＦＬ ↓水に対する透性（脱塩つ ↓　づＬ詩東月に ↓安定化々１、防塵剤、１戊形剤の添加↓ノンブ２ンフ
イノンクーによる戸流 ↓づ２１ン）− １↓躾９煉 １江【ＦはｖＩ口

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マムシ科ハブ属に属する毒蛇ヒメハブの蛇毒から、血液
   凝固を促進する酵素を有効成分とする血清分離用血液凝
   固促進剤を分離採取することを特徴とする血清分離用血
   液凝固促進剤の製造法。