CN105358161A

CN105358161A - 使用蛋白质溶液治疗疼痛

Info

Publication number: CN105358161A
Application number: CN201480027408.6A
Authority: CN
Inventors: K·欧肖内西; J·E·伍德尔-马伊; J·C·希金斯; M·D·利奇
Original assignee: Biomet Biologics LLC
Current assignee: Biomet Biologics LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2016-02-24
Also published as: CA2916080A1; EP3881852B1; WO2014149270A1; US10143725B2; EP3351253B1; US20140271870A1; AU2014238367A1; CA2916080C; AU2014238367B2; EP3351253A1; EP3881852A1; EP2968410A1

Abstract

使用蛋白质溶液治疗疼痛的方法，所述蛋白质溶液包含IL-1ra、sTNF-R1、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-1RII的两种或多种。组合物还可以含有白细胞和血小板。

Description

使用蛋白质溶液治疗疼痛

背景技术

本技术涉及治疗疼痛的方法，包括与损伤和炎症性疾病相关的疼痛。特别地，方法包括使用含细胞因子的溶液，包括源自血液和其它组织的这种溶液。

疼痛可以描述为与实际或潜在的组织损伤或疾病相关的不愉快的感觉，是美国咨询医生的最常见的原因。在基础水平，疼痛是身体的报警机制，以避免暴露于潜在的有害环境或生理刺激或使所述暴露最小化。然而，疼痛——特别是慢性疼痛——可以显著影响生活质量，包括幸福感和工作能力。

疼痛可以由伤害，或各种潜在疾病的任一种引起。例如，伤害性疼痛由可能引起组织伤害的刺激(如热、冷、力学作用和化学物)对外周神经的刺激引起。神经性疼痛由神经系统自身的损伤引起。

疼痛可以表征为急性或慢性。急性疼痛通常由疾病、炎症或组织伤害引起，在潜在原因清除或治疗后消退。因此，急性疼痛通常是短暂的，并且有自身限制性。另一方面，慢性疼痛可能本身是疾病，并且可以与慢性潜在病症如关节炎和神经病相关。

对于疼痛有各种治疗。很多治疗着眼于清除潜在的疼痛刺激，另外的阻断疼痛感知。着眼于疼痛感知的治疗包括麻醉药和镇痛药。镇痛药包括鸦片剂(如吗啡和可待因)、对乙酰氨基酚、非类固醇抗炎药(如阿司匹林、布洛芬和萘普生)。

然而，很多这样的治疗可能存在副作用，并且可能有受限制的长期利用，因为潜在的病症变得严重。因此需要开发治疗疼痛的新疗法，特别是改进功效和降低副作用的疗法。

发明内容

本技术提供用于治疗疼痛的方法和治疗性组合物。方法包括治疗与骨关节炎相关的疼痛疾病、与滑膜炎相关的疼痛、骶髂关节疼痛、背部疼痛、与手术后注射相关的疼痛、与肌腱注射相关的疼痛、与运动医学过程相关的疼痛、与挫伤相关的疼痛、与肌肉拉伤相关的疼痛、与肺气肿相关的疼痛或与创伤性损伤后骨关节炎相关的疼痛。在各种实施方式中，方法包括将血液来源的组合物施用到疼痛位置，所述施用通过如将所述组合物直接注射到疼痛位置的组织进行。所述组合物包含选自IL-1ra、sTNF-R1、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-1RII的至少两种蛋白质，其中各蛋白质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。例如，组合物可以包含：

(a)至少约10,000pg/ml的IL1-ra；

(b)至少约1,200pg/ml的sTNF-RI；和

(c)蛋白质，选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-1RII及其混合物，其中所述蛋白质的浓度高于正常血液中所述蛋白质的基线浓度。

在一些实施方式中，所述组合物进一步包含选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-1RII及其混合物的蛋白质，其中所述蛋白质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。所述组合物可以包含白细胞、血小板和其组合。

本技术还提供制备用于治疗哺乳动物对象中的疼痛疾病的组合物的方法，包括：

(a)从所述对象获得包含细胞因子生成细胞如白细胞的液体；

(b)分级分离所述液体以产生包含白介素-1受体拮抗剂的蛋白质溶液；

(c)将所述自体的蛋白质溶液施用到所述对象中的疼痛的位置。

所述包含细胞因子生成细胞的液体可以包括全血、骨髓抽吸物、脂肪组织、尿液、其部分和其混合物。例如，分级分离可以包括将血液置于容器，可操作以将所述血液分离为两或多个部分的分离器；以及离心所述分离器以产生富血小板血浆部分。所述富血小板血浆可以与固相提取材料如聚丙烯酰胺珠接触，以形成所述自体的蛋白质溶液。

附图说明

图1的框图描述生成抗炎性细胞因子组合物的方法；

图2是分级分离装置的图；

图3显示在离心之前(图3A)和之后(图3B)激活样品产生抗炎性细胞因子的装置；

图4是产生血凝块的装置的图；

图5是能产生抗炎性细胞因子组合物的单一装置的图；

对应的参考数字指示附图数个视图中的对应部分。应指出，本文所列图意在举例说明本技术材料、组合物、装置和方法的一般特征，以用于描述某些实施方式的目的。这些图不一定精确反映任意给定实施方式的特征，且不必定用于完整定义或限制本技术范围内的特定实施方式。

发明详述

下列技术描述仅示例一种或多种发明的组合物性质、制造和应用，且不意在限制本申请或所述其他申请中要求权利的任何特定发明的范围、实施和应用，所述其他申请可能提交要求对本申请的优先权，或其中公开的专利。在本详细描述的结尾处提供关于术语和短语的非限制性讨论，用于协助理解本技术。

本技术涉及使用包含蛋白质(包括白介素-1受体拮抗剂和其他细胞因子)的组合物治疗疼痛。在各种实施方式中，治疗人或其它哺乳动物对象中的疼痛疾病的方法包括：

(a)从一个或多个哺乳动物对象获得含细胞因子生成细胞的液体(“细胞因子细胞悬液”，如下进一步所讨论)；

(b)分级分离液体以生成含一种或多种蛋白质如白介素-1受体拮抗剂的蛋白质溶液；和

(c)将所述蛋白质溶液施用到所述对象中的疼痛位置。

蛋白质组合物

本技术提供治疗人或其它哺乳动物对象中的疼痛的方法，所述方法使用包含溶解、悬浮或另外携带从而以生理学可接受介质形式递送给哺乳动物对象的蛋白质的组合物(本文称为“蛋白质溶液”)。在各种实施方式中，所述组合物包含产自正常哺乳动物对象全血的蛋白质(如细胞因子)。所述组合物还包含活细胞，包括血小板、白细胞、和其组合。

在各种实施方式中，所述蛋白质溶液包含至少2种选自以下的蛋白质：IL-1ra(白介素-1受体拮抗剂)、sTNF-RI、sTNF-RII(可溶性肿瘤坏死因子受体2)、IGF-I(胰岛素样生长因子1)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、PDGF-AB(来源于血小板的生长因子AB)、PDGF-BB(来源于血小板的生长因子BB)、VEGF(血管内皮生长因子)、TGF-β1(转化生长因子βΙ)、sIL-lRII(可溶性白介素受体II)，其中所述组合物中各蛋白质的浓度大于正常血液中所述蛋白质的浓度。为清晰起见，所述蛋白质溶液可包含来自所述组的3种或更多蛋白质。尽管所述组合物中每一种蛋白质浓度可大于正常血液中其各自浓度，但不必定2种以上蛋白质的浓度大于正常血液中其各自浓度。

在各种实施方式中，蛋白质溶液包括下列组分。

表1.蛋白质溶液示例性蛋白质组分

蛋白质浓度能用实施例4所示方法测量。

优选地，所述组合还包含活的白细胞、裂解的白细胞或两者。在优选组合物中，所述蛋白质溶液包含单核细胞、粒细胞和血小板。在各种实施方式中，蛋白质溶液包含下列组分。

表2.蛋白质溶液示例性细胞组分

应理解该浓度为种特异性。此外，应理解浓度可随着个体对象而变化。因此，在包括从含细胞因子生成细胞的血液或其它组织生成蛋白质溶液的方法中，所述蛋白质溶液的蛋白质和细胞浓度可与上述不同；上述值是浓度均值，如对象群体中所见。

在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种蛋白质或其它组分的浓度大于正常血液中该组分的浓度。(具有所述更高组分浓度的组合物被称为“富含”这些组分。)如本文所示，“正常”血液或其它组织中的组分浓度是获得组织的哺乳动物对象一般群体中所见浓度，例如正常全血中。应理解该浓度为种特异性。在抗炎性细胞因子组合物获自特定对象组织的方法中，蛋白质或细胞的“正常”浓度可以是进行加工获得蛋白质或细胞之前的个体血液中的浓度，所述对象是所述组合物待施用所述组合物的对象(即自体的程序，如下进一步描述)。

因此，在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种组分的浓度是正常血液中该组分浓度的大于约1.5倍、约2倍或约3倍。例如，相对于正常(全)血，组合物中的组分可具有更高浓度，如下所示：

·IL-1ra，浓度是至少约2.5倍、或至少约3倍或至少约5倍；

·sTNF-RI，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；

·sTNF-RII，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；

·sIL-lRII，浓度是至少约1.5倍、或至少约1.8倍或至少约2倍；

·EGF，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；

·HGF，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；

·PDGF-AB，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；

·PDGF-BB，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；

·TGF-β1，浓度是至少约3倍、或至少约4倍或至少约6倍；

·IGF-1，浓度是至少约1.2倍、或至少约1.4倍或至少约1.5倍；

·VEGF，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；

·白细胞，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；

·血小板，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；

·中性粒细胞，浓度是至少1.5倍、或至少2倍或至少3倍；

·单核细胞，浓度是至少3倍、或至少4倍或至少6倍；

·淋巴细胞，浓度是至少5倍、或至少8倍或至少10倍；和

·嗜碱性细胞，浓度是至少2倍、或至少4倍或至少6倍。

同样，所述蛋白质溶液中的红细胞浓度优选是正常血液中红细胞浓度的至少一半，或至少三分之一。

例如，蛋白质溶液可包含：

(a)至少约10,000pg/mlILl-ra；

(b)至少约1,200pg/mlsTNF-RI；和

(c)蛋白质，选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、和sIL-lRII以及其混合物，其中所述蛋白质的浓度大于正常血液中该蛋白质的基线浓度。另一示例中，蛋白质溶液包含：

(a)血小板，浓度为约到约；

(b)白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，浓度是正常血液中IL-1ra浓度的至少3倍；

(c)可溶性组织坏死因子因子-rl(sTNF-rl)，浓度是正常血液中IL-1ra浓度的至少2倍；

(c)白细胞，浓度是正常血液中白细胞浓度的至少2倍；和

(d)血小板，浓度是正常血液中血小板浓度的至少2倍。

在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的IL-1ra浓度优选是该蛋白质溶液中的白介素-lα浓度的至少5,000倍或至少10,000倍。IL-1ra:白介素-1β(IL-1β)浓度之比优选是至少100。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的IL-1ra浓度优选是该蛋白质溶液中的IL-1β浓度的至少1500倍或至少8000倍。sIL-lRII:白介素-1β(IL-1β)浓度之比优选大于1。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的sIL-lRII优选是该蛋白质溶液中的白介素-1β浓度的至少2000倍或至少45000倍。

在各种实施方式中，所述蛋白质溶液包含源自对象的一种或多种组分(如血小板)，根据本技术的治疗方法向所述对象施用所述溶液。因此，这类组分是“自体的”。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液(例如自体的蛋白质溶液)基本上由这样的自体的组分组成。在其它实施方式中，所述溶液的一或多种组分可以从非自体来源(即从与待施用所述溶液的对象通物种的对象)或异种来源(即从不是待施用所述溶液的物种的动物来源)获得。

制备蛋白质溶液的方法

蛋白质溶液可通过多种方法(包括混合个体组分)和方法的任一种制备，(其中一种或多种组分获自源材料。在各种实施方式中，所述蛋白质溶液通过分级分离细胞因子细胞悬液制备，从而生成含ILl-ra的蛋白质溶液。

通过细胞因子生成细胞接触提取物质来获得蛋白质溶液

在各种实施方式中，通过从含细胞因子生成细胞的组织获得一种或多种组分来制备蛋白质溶液。如本文所示，“细胞因子生成组织”是获自哺乳动物对象的组织，包含能生成细胞因子的细胞。这种细胞包括白细胞、脂肪基质细胞、骨髓基质细胞和其组合。应理解白细胞包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。用于本技术方法的白细胞优选包括单核细胞和中性粒细胞。本文所用的细胞因子生成组织包括血液、脂肪组织、骨髓、和其部分，如下进一步所讨论。

本文所用的血液包括全血、血浆、富血小板血浆、贫血小板血浆和血凝块。在优选实施方式中，本技术方法使用含白细胞和血小板的富血小板血浆(PRP)，包含通过沉淀全血产生的白膜层。本文所用的脂肪组织包括任何脂肪组织，包括白色和棕色脂肪组织，其可获自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织位置。本文所用的骨髓包括红髓和黄髓。在优选实施方式中，骨髓是获自红髓和黄髓的骨髓浓缩物，包括造血和间充质干细胞。如上所讨论，相对于根据本技术方法治疗的对象，用于本发明的血液、脂肪和骨髓组织可以来自自体或同种异体来源。

在一些实施方式中，方法包括分级分离液体(“细胞因子细胞悬液”)，所述液体包含能生成细胞因子如ILl-ra和sTNF-Rl的细胞。如上所讨论，这种细胞包括白细胞、脂肪基质细胞、骨髓基质细胞和其组合。在一些实施方式中，所述细胞因子细胞悬液是含白细胞的液体。应理解所述细胞因子细胞悬液包括细胞和胞外液体，无论细胞和液体的相对比例如何。在一些实施方式中，所述悬液可主要包括细胞，液体仅作为副成分，基本用于湿润细胞。在一些实施方式中，所述液体可包括两相，由以下构成：主要由液体组成的相和主要由细胞组成的相，仅在搅拌或其它混合后形成液体中的细胞的悬液。

如图1所示例，这种方法包括：

(a)获得细胞因子细胞悬液，如含白细胞的液体(步骤105、115或135，或其组合)；

(b)将组织与固相提取材料接触(步骤140)；和

(c)从固相提取材料分离含蛋白质的液体(步骤150)。

获得悬液105、115和135能包括产生含细胞液体的任意多种本领域已知方法。这类方法包括从组织和培养物分离。获得悬液可在所述方法中直接进行，其中健康护理人员或其他个体进行分离、加工、培养或其它方法以产生悬液，所述过程包括接触和分离步骤。在一些实施方式中，产生悬液的方法与接触和分离步骤同时进行，作为照护过程的一部分，如本文进一步所讨论。或者，获得悬液可以是间接的，仅涉及获取悬液以用于接触和分离步骤，其中产生悬液的加工处理之前由另一方完成。

在各种实施方式中，获得包括从血液、脂肪组织、骨髓抽吸物或其它含细胞因子生成细胞的组织中分离细胞因子细胞悬液，所述悬液包含白细胞或其它细胞因子生成细胞，如图1的步骤110、120和125所示例。方法可包括从2、3或更多组织来源获得细胞因子细胞悬液。

从血液获得细胞因子细胞悬液

在包括使用血液的实施方式中，血液可直接用于接触固相提取材料，如图1的步骤140所示例，或在优选实施方式中，可加工所述血液以提供成分血，如PRP。产生成分血的许多装置和方法为本领域已知，采用诸如离心和过滤等手段。

在各种实施方式中，本技术方法包括用离心产生作为细胞因子细胞悬液的PRP。这种方法一般包括将血液置于容器中，分离器可操作使血液分成2个或更多部分，并且离心分离器以产生富血小板血浆部分。这类装置可包括管和置有浮标的管，其中所述浮标的密度使得浮标能在管内组织离心后达到平衡位置，所述平衡位置在含白细胞的第一部分和第二部分之间，第二部分的白细胞浓度大于第一部分的白细胞浓度。这种方法还包括对管进行离心，从而所述浮标界定含白细胞的第一与第二部分之间的界面。然后，收集第二部分以进一步用于本技术方法。

本文所用的一个这种装置参见美国专利号7,992,725,Leach等,2011年8月9日公开。这类装置市售可得，如来自巴奥米特公司(BiometBiologies,LLC)(美国印第安纳州华沙)的GPSIII血小板浓缩和分离系统。所述装置能用于临床或实验室环境以从悬液或多组分组织材料中分离各部分，所述材料获自对象，如血液、骨髓抽吸物、脑脊液、脂肪组织。分离部分可包括血小板、贫血小板血浆、富血小板血浆和基质细胞。所述分离部分各自可在分离容器内具有平衡点或位置，当分离发生时可达到。例如，分离全血样品时，全血的白膜层(PRP)的平衡位置在红细胞之上。

分级分离装置200如图2所示例。分级分离装置200包括浮标210和容器壁215。对分离容器205进行离心时，浮标周界210a和容器壁215有间隙，允许浮标210在分离容器205内移动且材料能在浮标周界210a与容器壁215之间通过。或者，浮标210可具有开口，如中心或内置式开口或者沿着浮标高度的外围通道，这允许材料穿过浮标。

分离容器205中载有浮标210，浮标210的调谐密度配置成到达悬液的选定平衡位置。所述浮标的密度调整在约1.0g/cc-约1.10g/cc范围内，如约1.06g/cc。根据各种实施方式，浮标210能设立成纳入调谐密度且能由一种或多种材料形成以达到调谐密度。

如图2所示，分离过程发生后，收集区域220位于装置200内。收集区域220相对于浮标210定义，位于容器内分开或分离的中间部分225的平衡位置。选定部分的平衡位置能定义为相对于分开样品或材料的容器内其它部分，其在该容器内的位置。平衡位置还能相对于浮标210或容器12的X轴定义。然而，平衡位置可取决于样品内一定量选定部分的样品量。根据图12说明，部分230的平衡位置高于或比中间部分225的平衡位置更接近装置200的顶部235。因此，浮标210能调整，如包括选定密度或特定重力，从而相对于任何选定部分的平衡位置放置收集区域220。

在一些实施方式中，浮标210能包括收集端口240。收集端口240与进入端口245连通并与浮标上表面250之上的收集空间220连通，并且能位于浮标周界210a附近。在一些实施方式中，浮标未载有收集端口240，反而收集端口是回收装置，如经进入端口或装置200顶部插入的注射器。

根据各种实施方式，分离器255与浮标210偶联。根据各种实施方式，分离器与浮标的组合还能称为分离集合成员。例如，分离器255提供产生收集室220的方式且包括一个或多个间隔器260、265以使分离器255与浮标210位置分开，从而形成收集室220。分离器255载有回收端口270，连通回收端口245与收集端口240。间隔器260、265还能用作收集端口50与回收或回收端口245之间的回路275。回收端口245用作从收集室220回收经分离或第二部分310的结构。

含全血的装置200进行离心后，第一部分或顶端部分230可以是贫血小板血浆，中间部分225可以是富血小板血浆或血小板浓缩物，底端部分278可以是红细胞。因此，分级分离方法还包括从装置200回收所需部分。能提供多个端口205、245和280以允许进入装置200的任何合适室。进入端口205、245、280可以是允许从分离装置200外部连通该装置内部的任何方式，如卢尔锁端口、隔片、阀或其它开口。另外，收集通气管285允许经开口290移出收集区域220中的分离悬液，而不需移出分离器255之上的所述部分如血浆。即使没有收集通气管285，分离器上的部分能移出且收集区域可排入分离器上的区域。

采用分级分离装置200的方法可通过经进入端口245输入全血而开始。分级分离装置200置于离心机内并旋转，旋转时间适合分级分离全血。示例性时间段可以是约5分钟-约20分钟，速度为约320rpm-约5000rpm。此速度可产生约7.17xg-约1750xg(正常重力倍数)的选定重力。

可用于分离富血小板血浆的其它装置描述于例如美国专利5,585,007,Antanavich,1996年12月17日公开；美国专利号6,398,972,Blasetti等,2002年6月4日公开；美国专利号6,649,072,Brandt等,2003年11月18日公开；美国专利号6,790,371,Dolocek,2004年9月14日公开；美国专利号7,011,852,Sukavaneshvar等,2006年3月14日公开；美国专利号7,179,391,Leach等,2007年2月20日公开；美国专利号7,374,678,Leach等,2008年5月20日公开；美国专利号7,223,346,Dorian等,2007年5月29日公开；和美国专利号7,708,152,Dorian等,2010年5月4日公开。

除了血小板浓缩和分离系统，多种其它市售可得装置能用于分离富血小板血浆，包括Magellan^TM自体血小板分离器系统，可购自美敦力公司(Medtronic,Inc.)(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)；SmartPReP^TM，可购自Harvest技术公司(HarvestTechnologiesCorporation)(美国马萨诸塞州普利茅斯)；DePuy(美国印第安纳州华沙)；AutoloGel^TM法，可购自Cytomedix公司(Cytomedix,Inc.)(美国马里兰州罗克维尔)；GenesisCS系统，可购自EmCyte公司(EmCyteCorporation)(美国佛罗里达州迈尔斯堡)；和PCCS系统，可购自巴奥米特3i公司(Biomet3i,Inc.)(美国佛罗里达州棕榈滩花园)。

再次参考图1，获取自患者的血可在一个或多个步骤115、120、125和130中与抗凝剂混合，从而有利于加工。合适的抗凝剂包括肝素、枸橼酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗凝柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)和其混合物。例如，所述抗凝剂可置于用于从对象采血的注射器中，或可在抽取后与血液混合。

通过混合细胞与合适液体可制备含白细胞的液体，如步骤125所示，使用本领域已知方法。例如，白细胞可如下从全血分离：通过裂解红细胞或用密度梯度离心全血，其中白细胞沉淀到离心管底部。密度离心示例包括Ficoll-Paque^TMPlus(美国新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcareBio-Sciences))。一些情况下，密度离心可用于进一步分离单核细胞与多形核细胞。白细胞还可用过滤从全血制备；示例包括Acelere^TMMNC收获系统(美国密歇根州安阿伯市的颇尔生命科学(PallLifeSciences))。白细胞还能从骨髓获得。随后，白细胞悬于适当介质如血浆，从而维持其活力。

其它方法可用于产生富血小板血浆或含白细胞的其它液体。例如，全血能进行离心，而不需用浮标系统，全血可在多个阶段中离心，能使用连续离心法，还能用过滤。另外，含富血小板血浆的血液组分能如下生成：用慢速离心步骤分离血浆与红细胞以防止血小板成团。在其它实施方式中，从离心血液形成的白膜层可与剩余血浆分离并重悬形成富血小板血浆。

从脂肪组织获得细胞因子细胞悬液

在包括使用脂肪组织的实施方式中，所述脂肪组织可直接用于接触固相提取材料，如图1的步骤140所示例，或所述脂肪组织可处理成提供步骤110的经分离脂肪细胞。本方法还使用含脂肪来源干细胞的细胞部分。在一些实施方式中，脂肪组织源自通过躯干抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。基质细胞可用任何合适方法从脂肪组织和/或组织部分分离，包括本领域已知方法如机械和分解离心。基质细胞还可用酶消化分离。例如，基质细胞能从脂肪组织提取物中分离，通过超声波和/或酶消化处理，离心富集。分离自脂肪组织的基质细胞可洗涤和成团。

例如，在专用收集容器内通过躯干抽吸辅助肿胀吸脂术能收集脂肪组织，所述容器连接吸入软管和吸脂管。收集容器可具有纱布型网格，允许肿胀液通过并保留固体脂肪组织。收集脂肪组织后，收集容器从抽吸装置中移出并重新连接离心装置。过滤单元还可包含孔径约100微米的滤器。一旦含脂肪组织的收集容器连接离心装置，对组织进行超声波处理。超声波处理后，将完整设备插入离心桶并以例如300xg离心5分钟。离心后，收集容器与过滤单元一起分离且可弃去。随后，含基质细胞的团块能重悬于生物相容性溶液，如血浆、血浆浓缩物和富血小板血浆。

用于分离和/或分级分离脂肪组织及脂肪细胞的多种方法和装置包括以下专利所述的那些：美国专利号7,374,678,Leach,2008年5月20日公开；美国专利号7,179,391,Leach等,2007年2月20日公开；美国专利号7,992,725,Leach等,2011年8月9日公开；美国专利号7,806,276,Leach等,2010年10月5日公开；和美国专利号8,048,297,Leach等,2011年11月1日公开。诸如GPS^TM血小板浓缩系统的装置市售获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)，可用于分离脂肪细胞。

从骨髓获得含白细胞的液体

在包括使用骨髓的实施方式中，所述骨髓可直接用于接触固相提取材料，如图1的步骤140所示例，或可处理成提供步骤135的骨髓浓缩物。获得和浓缩骨髓的许多装置及方法为本领域已知。

一种分离和产生骨髓浓缩物(cBMA)的示例性过程如图6所示。一般，方法600可起始于步骤605，获得骨髓抽吸物体积。骨髓抽吸物(BMA)可以任何选定或一般已知方式获得。例如，选定骨区域如接近外科手术的部分，能用于获得骨髓抽吸物。一般，进入装置如注射器和针能用于进入选定骨的髓内区域。可从多个位置抽取小体积的选定部分以获得适当体积的BMA或选定BMA部分。

一旦步骤605获得选定体积的BMA，其可用重力分离器分离并浓缩。本文所用的分离器可操作分离多组分流体，所述流体一般包括混杂或混合在一起的不同密度的多种组分或成分，包括上述用于分离来自血液和脂肪组织的部分的那些。分离器可包括相对于BMA具有选定密度的浮标。这种分离器包括上述用于浓缩和分离来自血液和脂肪组织的部分的那些，包括以下专利所述的那些：美国专利号7,374,678,Leach,2008年5月20日公开；美国专利号7,179,391,Leach等,2007年2月20日公开；美国专利号7,992,725,Leach等,2011年8月9日公开；美国专利号7,806,276,Leach等,2010年10月5日公开；和美国专利号8,048,297,Leach等,2011年11月1日公开。诸如GPS^TM血小板浓缩系统的装置市售获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)，能用于分离脂肪细胞。例如，可用于在步骤610和615分级分离BMA的分离器和方法还描述于美国申请公开号2006/0278588,Woodell-May,2006年12月14日公开。根据各种实施方式，BMA可在步骤610中置于分离器内。一旦BMA置于分离器内，选定部分的BMA可在步骤615中与BMA分离。

一旦BMA置于分离器内，分离器在离心机中以约1,000-约8,000RPM范围旋转。这对分离器和BMA生成正常重力的约65-约4500倍的力，如本领域通常所计算。在此力作用下，BMA样品中密度较高的物质被推向管底部。因此，分离器能用于从骨髓样品移出有核细胞。在各种实施方式中，浓缩BMA的有核细胞浓度是BMA中有核细胞浓度的至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。

从血凝块获得含有白细胞的液体

在包括使用血液的其它实施方式中，含细胞因子生成细胞的液体陷于血凝块内。通过压缩(“挤压”)、血块破碎或离心能从血凝块产生细胞释放物。通过联合血或成分血与凝血剂，血凝块能用或未用抗凝剂且用或未用外源性凝血酶制备。合适的凝血剂包括凝血酶(如牛、重组人、混和人或自体)、自体凝血蛋白和聚乙二醇。钙可采用钙盐形式，如氯化钙。

在一些实施方式中，所述凝血剂包括凝血蛋白，其可以是来源于血液的凝血部分，所述血液获得自待治疗的患者。合适的凝血部分能通过如下方法获得：用钙溶液(如溶于乙醇的氯化钙)将全血或血浆加样到血分离装置；可选加热全血或血浆至少约20分钟，温度为至少约20℃；和分离凝血部分。通过离心加热的全血或血浆可完成分离。合适的分离装置作为Clotalyst^TM自体凝血酶收集系统(下文的“Clotalyst系统”)市售可得，由美国印第安纳州华沙的巴奥米特公司销售。

用图4的装置400生成凝血剂的示例性过程起始于将含氯化钙和乙醇的试剂经第一端口410注入主室405。玻璃珠也置于主室405。注入试剂后，第一端口410用第一替换帽415密封。将带抗凝剂的血液经第二端口420注入主室405。注入血液后，第二端口420用第二替换帽425密封。可选地，注射器和血分离装置400预热到约25℃的温度。

血组分分离装置400的内容物通过重复翻转装置400来混合，例如约12次，从而使血液接触玻璃珠。混合后，温育装置。温育过程采用一定温度和持续时间，从而允许装置400的内容物在约25℃加热约15分钟。完成温育阶段后，红细胞、血浆和玻璃珠的凝结团在主室405的第二末端406形成。完成温育后，充分振荡装置400以去除和破坏任何可能存在的凝胶。用非离心方法获得含有白细胞的液体

如上所述，含白细胞的液体能通过非离心方法如培养获得。如本文所示，“非离心方法”包括从组织获得含细胞因子生成细胞的组织部分的方法，而不采用离心。在一些实施方式中，方法是“非重力的”，其中基于密度以外的细胞物理、化学或物理化学性质，其中所述部分的白细胞浓度高于组织中的白细胞浓度。特别地，这种非重力方法不同于白细胞部分通过离心全血或其它组织而产生的方法。在一些实施方式中，所述非离心方法包括仅基于密度以外的所述白细胞性质的方法。非离心方法包括过滤、抗体结合和电泳法。

例如，如上所讨论，可通过过滤从全血、骨髓抽吸物或其它组织制备白细胞。获自血液、骨髓、脂肪组织或其它来源的白细胞和其它细胞因子生成细胞还能用本领域已知方法培养。然后，所述细胞悬于合适介质如血浆，从而维持其活力并促进与固相提取材料混合或其它接触。含所述细胞的液体还可通过压缩或破坏血凝块来生成，如上所述。

将含有白细胞的液体接触提取材料并分离蛋白质溶液

进一步参考图1的示例过程，温育细胞因子细胞悬液或另外与固相提取材料接触(步骤140)以生成含蛋白质的液体。随后，从固相提取材料分离此液体(步骤150)，作为本技术的蛋白质溶液。不意在限制本技术的范围、机制或功能，本文所用的固相提取材料浓缩液体体积白细胞中的细胞因子或其它蛋白质，在一些实施方式中，可活化、刺激或另外增加细胞因子生成，包括IL-1ra。因此，在一些实施方式中，方法包括用固相提取材料活化细胞因子细胞悬液。

固相提取材料能包括提供特定表面积以接触细胞的多种物质。固相提取材料可以是连续材料或不连续，且包括多种单独颗粒。例如，固相提取材料可采用多种珠、纤维、粉末、多孔材料或容器表面形式，所述容器包括含所述细胞的液体。固相提取材料可包括具有多种横截面形状的几何体，如球形、椭圆形或多边形等。固相提取材料还能包括类似海绵的连续多孔网络，或能包括多种个体多孔颗粒。相较非多孔材料，固相提取材料还可因多孔而提供更大的表面积。

在一些实施方式中，固相提取材料包括具有大长宽比的颗粒，例如其中颗粒为针样形状。固相提取材料还可形成为长纤维且可以是或采用类似玻璃棉的形式。

一些情况下，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞悬液的容器内壁。例如，固相提取材料可包括含有细胞因子细胞悬液的注射器腔。其它容器包括管如离心管，或血液分级分离装置或浓缩器组件，如本文他处所述。

固相提取材料是连续材料如多孔海绵样材料时，该固相提取材料使用的量足以在固相提取材料的孔或间隙内吸收或吸附或纳入基本完整液体体积的白细胞。固相提取材料是不连续材料如多种颗粒时，该固相提取材料能与含所述细胞的液体联合形成浆样组合物。从具有高固体部分的似膏体到具有低固体部分的易流动浆体，所述浆体的稠度可变，。

固相提取材料能提供大表面积与细胞接触。然而，一些情况下，固相提取材料能进一步处理以增加其表面积，例如通过物理或化学蚀刻或侵蚀固相提取材料表面。关于化学侵蚀，根据材料性质，能采用腐蚀剂修饰固相提取材料表面。经修饰表面可用碱或酸生成，例如色磺酸(chromosulphonicacid)，特别是约20％-约80％强度，优选约50％色磺酸。固相提取材料能用腐蚀剂温育约5分钟-约30分钟以化学蚀刻表面并增加表面积。然后，可洗涤固相提取材料去除腐蚀剂。例如，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞悬液的容器内壁，其中内壁蚀刻从而随后增加接触液体的表面积。

多种聚合物、金属、陶瓷和玻璃能用作固相提取材料。在一些实施方式中，固相提取材料包括吸湿材料。合适固相提取材料的示例包括玻璃、矿物、聚合物、金属和多糖。矿物包括刚玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯酰胺。金属包括钛。多糖包括葡聚糖和琼脂糖。优选的固相提取材料包含聚丙烯酰胺或基本由其组成，如下进一步所述。

例如，固相提取材料可包括玻璃的连续固相提取材料或多种玻璃颗粒、玻璃棉，金属如钛的连续固相提取材料、多种金属珠、金属粉末，和其组合。金属的连续固相提取材料能包括块状或其它三维形状，由带开口细胞结构的多孔金属或金属合金形成。固相提取材料可包括多个珠或多种尺寸的颗粒，包含大致球形珠。珠包括聚苯乙烯珠、聚丙烯酰胺珠、玻璃珠、金属(如钛)珠、或任何其它合适的珠。珠可以是适合容器和所用细胞因子悬液量的任何尺寸。一些情况下，珠尺寸范围可为约0.001毫米-约3毫米直径。珠尺寸足够小时，所述珠看上去更像粉末。

用作固相提取材料的聚丙烯酰胺珠能通过聚合丙烯酰胺单体而形成，使用本领域已知的可控和标准操作以生成由聚丙烯酰胺凝胶形成的相对均匀珠。一般，聚丙烯酰胺通过用合适双功能交联剂聚合丙烯酰胺来形成，最常见为Ν,Ν'-亚甲基双丙烯酰胺(双丙烯酰胺)。凝胶聚合通常用过硫酸铵起始，通过加入催化剂如Ν,Ν,Ν',Ν'-四甲基乙二胺(TEMED)来提高反应速率。在各种实施方式中，聚丙烯酰胺珠包括0.5微摩尔羧基/毫升珠，赋予轻微阴离子特性(负电荷)。所述珠通常还抗pH变化，且在许多水性和有机溶液中稳定。通过调整总丙烯酰胺浓度，聚丙烯酰胺凝胶可以广泛范围的孔径形成。此外，聚丙烯酰胺珠可以多种尺寸形成且能具有相对均匀的大小分布。珠尺寸范围为数微米直径到数毫米直径。例如，不同类型的Bio-Gel^TM聚丙烯酰胺凝胶珠(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-RadLaboratories))的粒径范围是小于约45μm-约180μm。聚丙烯酰胺珠还可获自法国爱森(SNFFloerger)(美国乔治亚州Riceboro)、皮尔斯公司(PierceBiotechnology,Inc.)(美国伊利诺伊州罗克福德)和聚合物公司(Polymers,Inc.)(美国阿肯色州费耶特维尔)。

一旦聚合，聚丙烯酰胺珠可干燥并以粉末样形式保存。干珠不溶于水，但再水合后能显著膨胀。再水合使聚丙烯酰胺珠恢复胶稠度，可为干燥状态尺寸的约2-约3倍。因此，干的聚丙烯酰胺珠(即使聚丙烯酰胺珠脱水)可用于吸收部分液体体积，包括小于珠孔径的溶质，且能用于浓缩IL-1ra和其它由白细胞生成的蛋白质。例如，联合干聚丙烯酰胺珠与血液和/或富血小板血浆可通过白细胞激活IL-1ra生成，并且随着干珠再水合和膨胀，还降低总液体体积。

不意在限制本技术的范围、机制或功能，已发现与固相提取材料接触的表面能激活细胞，一些情况下，固相提取材料协助分离和浓缩所得蛋白质溶液，所述溶液富含包括IL-1ra在内的细胞因子。例如，在多孔固相提取材料的情况中，含所述细胞的部分液体能进入孔并保留在其中。所述液体中的细胞可接触此额外表面积。在一些实施方式中，孔过小以至于细胞无法进入，但部分液体能进入孔。例如，液体能通过离心从固相提取材料和孔中移除。

固相提取材料优选用本领域已知技术灭菌，以防止细胞因子细胞悬液污染。例如，加热和加压灭菌法如高压灭菌法可根据固相提取材料的具体组成来使用。能使用替代方法如化学灭菌或辐照，其中固相提取材料可能受到高压灭菌过程的不利影响。

在一些实施方式中，所述细胞因子细胞悬液用固相提取材料温育一段时间以有效移出部分液体。温育可在约30秒-约72小时阶段内完成且可在约20℃-约41℃温度下完成。例如，温育可以是24小时或更少，10小时或更少，5小时或更少，2小时或更少，1小时或更少，30分钟或更少，15分钟或更少，10分钟或更少，5分钟或更少，4分钟或更少，3分钟或更少，2分钟或更少。温育可以是至少约15秒，至少约30秒，至少约1分钟，至少约90秒，至少约2分钟，至少约10分钟，或至少约30分钟。在一些实施方式中，温育是约1分钟-约3分钟。在一些实施方式中，温育在约37℃进行。在一些实施方式中，所述液体不温育，但只在必须时与固相提取材料接触以进行后续处理。所述接触可在周围条件下进行，例如约20-25℃的温度。

在一些实施方式中，搅拌所述细胞因子细胞悬液和固相提取材料以在接触期间更充分混合这些组分。所述搅拌可通过翻转、振荡、摇动、搅拌或涡旋液体和固相提取材料来完成。搅拌可增加液体内细胞与固相提取材料的接触。搅拌可进行一次，重复多次，定期重复，或可连续。当含所述细胞的液体用电磁场刺激时，还可搅拌该液体和固相提取材料。涉及用聚丙烯酰胺珠和其它固相提取材料生成富含蛋白质溶液的另外方面和特征参见：美国专利申请公开号2009/0220482,Higgins等,2009年9月3日公开；美国专利申请公开号2010/0055087,Higgins等,2010年3月4日公开；美国专利申请公开2011/0052561,Hoeppner,2011年3月3日公开；国际申请公开2012/030593,Higgins等,2012年3月8日公开；和美国专利申请公开2012/0172836,Higgins等,2012年7月5日公开。美国专利申请序列号13/840562,Binde等,《用于治疗炎症性疾病的方法和非免疫原性组合物》(MethodsandNon-ImmunogenicCompositionsforTreatingInflammatoryDiseases)；美国专利申请序列号13/841083Landrigan等；《用蛋白质溶液治疗炎症性呼吸道疾病》(TreatmentofInflammatoryRespiratoryDiseaseUsingProteinSolutions)；美国专利申请序列号13/837005,Woodell-May等；《治疗炎症性疾病的方法和非细胞组合物》(MethodsandAcellularCompositionsforTreatingInflammatoryDisorders)；美国专利申请序列号13/839280,Leach等,《用非离心法从组织制备细胞因子组合物的方法》(MethodsforMakingCytokineCompositionsfromTissueUsingNon-CentrifugalMethods)；美国专利申请序列号13/840129,Matusuka等,《用蛋白质溶液治疗胶原缺陷》(TreatmentofCollagenDefectsUsingProteinSolutions)；和美国专利申请序列号13/841103Landrigan等,《用蛋白质溶液治疗外周血管疾病》(TreatmentofPeripheralVascularDiseaseUsingProteinSolutions)；所有专利都通过引用纳入本文。

含白细胞的液体与固相提取材料接触可用合适容器或实现接触的其它装置进行。接触能在连续过程中进行，其中液体流越过或穿过固相提取材料，或液体和固相提取材料可包含于容器。如上所讨论，所述容器能包括固相提取材料，或仅用作保持珠或其它形式材料的容器。本技术所用的容器包括本领域已知的那些，如Plasmax^TMPlus血浆浓缩器，市售获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)，且可包括以下专利所述的那些装置和应用方法：美国专利号7,553,413,Dorian等,2009年6月30日公开；和美国专利号7,694,828,Swift等,2010年4月13日公开。

这类装置如图3A和3B所示，用于与聚丙烯酰胺凝胶珠固相提取材料示例性应用。装置300具有上室305和下室310。上室305具有端壁315，凝胶珠搅拌器325的搅拌器阀杆320沿着其延伸。装置300还具有沿着端壁315延伸并进入上室305的入口330。装置300还包括连通血浆浓缩物回路340的出口335。上室305基底包括滤器345，其上表面支撑干的浓缩聚丙烯酰胺珠350。

使用中，含白细胞的液体355和可选的血小板经入口330注入上室305并与聚丙烯酰胺珠350混合。流体355和聚丙烯酰胺珠350可通过旋转搅拌器阀杆320和凝胶珠搅拌器325来混合，以帮助混合流体355和聚丙烯酰胺珠350。然后，混合的流体355和聚丙烯酰胺珠350在所需温度下温育所需时间。随后，装置300进行离心，从而液体传到下室310，而聚丙烯酰胺珠350被滤器345保留，由此分离聚丙烯酰胺珠350与IL-1ra和其它蛋白质的所得溶液360，所述溶液收集于下室310。溶液360可经出口335从装置移出。

在一些实施方式中，蛋白质溶液能以某一方法制备，其中含白细胞的液体从组织中分离，随后在连续过程中接触固相提取材料。再次参考图1，在一些实施方式中，分离110、120、135和接触140用单一设备进行，本文称为单一分离和浓缩装置(“S/C装置”)。一个这种装置参见美国专利申请序列号13/434,245,O'Connell,2012年3月29日提交。

S/C装置包括分离区、第一浓缩区、第二浓缩区、浮标系统、入口、止回阀、第一回收端口和第二回收端口。图5显示S/C装置500能从全血产生抗炎性细胞因子组合物。例如，所述方法可起始于获得一定体积的全血，其经入口510注射填入S/C装置500的分离区505。浮标系统515位于分离区505内。浮标系统包括第一浮标组件520、第二浮标组件525以及连接第一浮标组件520与第二浮标组件525的第三浮标组件530。第一和第二浮标组件520、525之间的空间界定了浮标分离区535。各浮标组件的密度能根据所需成分血(作为分离结果)来选择。浮标系统515能包括选定浮标系统，如一般用于IIorIII重力血小板分离系统的浮标系统，所述重力血小板分离系统获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)。美国专利号7,845,499、美国专利号7,806,276和美国专利号7,992,725公开了浮标系统。

获得蛋白质溶液的方法包括离心旋转S/C装置500。离心力使浮标系统515能穿过全血，导致部分全血位于浮标分离区535。例如，此部分可包括富血小板血浆。使用回收注射器，选定部分能经第三浮标组件530从收集体积535中移出，第三浮标组件530界定与收集通道545相连的移出通道540。连接弯管550可与移出通道540互连，从而能经连接弯管550、移出通道540和浮标收集通道545形成真空。收集管555能与带回收弯管560的连接弯管550互连，回收弯管560从壁565延伸，壁565可以是浓缩区570的底壁。第二回收管575可首先与止回阀集合580和第一回收端口585相连。第一回收端口585能通过卢尔锁式连接或其它合适连接与回收注射器相连。

止回阀集合580确保移出部分以一个方向流动并防止移出部分再进入第二回收管575。此外，当材料从第一回收端口585推回止回阀集合580从而材料会进入浓缩区570时，止回阀580内的阀盘可朝着第二回收管575向下弯曲并关闭开口，从而打开止回阀集合580内的第二开口。第二开口使该部分能推入浓缩区570。

因此，成分血随后经第一回收端口285、止回阀集合580再注入浓缩区570的上体积588。向上体积588中的成分血加入聚丙烯酰胺珠590，该成分血和聚丙烯酰胺珠590可振荡混合。可选地，所述成分血和珠590能在方法操作前温育选定时间段。

所述方法包括离心旋转的第二步。第二次离心中，通过推动抗炎性细胞因子组合物通过滤器592并进入浓缩区570的低浓度区595，抗炎性细胞因子组合物与珠590分离。所述蛋白质溶液可经第三回收管596撤回并用第二回收注射器从第二回收端口598撤出。所述注射器能再次通过锁式连接与第二回收端口相连。

再次参考图1，液体与固相提取材料接触后，分离蛋白质溶液，如步骤150所示。通过抽出至少部分液体体积且留下珠，可完成分离。一些情况下，提取材料可在抽出蛋白质溶液前通过离心沉淀。分离还可由过滤进行，其中所述材料被滤器保留而蛋白质溶液通过滤器，例如用离心力或真空。如果采用干的聚丙烯酰胺珠与提取材料温育，液体体积可减少，因为珠在再水合后会膨胀，从而浓缩所得蛋白质溶液。为维持增加的浓度，分离步骤必须小心以防止挤压珠或液体从膨胀珠中脱离。例如，高离心力或高真空可能破坏珠和/或将液体抽离珠内部体积。

可选的电磁刺激

在液体与固相提取材料接触之前或期间，细胞因子细胞悬液能用电磁场刺激。因此，在一些实施方式中，刺激含所述细胞的液体可在液体接触固相提取材料之前进行。然而，优选至少部分接触步骤和至少部分刺激步骤在时间上重叠，从而含所述细胞的液体同时与固相提取材料接触并用电磁场刺激。

用电磁场刺激细胞因子细胞悬液可涉及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或电容耦合电磁场。在一些实施方式中，所述液体用偶联刺激线圈的电源刺激。经过线圈的电流产生脉冲磁场，其在液体中诱导脉冲电场。线圈可部分包围保持在容器内的液体，所述容器如管或注射器。线圈可并入保持细胞因子细胞悬液的容器或可移出。例如，塑料管能用整体式线圈形成或线圈能暂时偶联容器或置于容器内；例如，管能配置成使线圈可接到容器上。需要时，电源可偶联线圈以进行刺激步骤。

用电磁场刺激液体还可包括跨液体放置至少2个电极。然后，电能可应用于电极以电容耦合电极并在之间产生电磁场。因此，电磁场能穿过液体，从而增加细胞因子生成速度和/或量。在其它实施方式中，电极能用于产生直流电或者一个或多个线圈能用于产生脉冲电磁场。

刺激期间的电磁场强度可以是至少约0.5微伏/厘米，无论是由直流电、电容耦合电流或是脉冲电磁场生成。在直流电电极的情况下，电流振幅可以是约1-约200微安，在一些实施方式中，振幅可以是约20-约100微安。在其它实施方式中，电流可以是约20、约60或约100微安。然而，应理解电流振幅可以是其它合适量级。

刺激步骤中应用的电磁场可恒定或随着时间变化。例如，能应用正弦时变电磁场，采用跨液体放置的电极。这种正弦时变电磁场可具有约1伏-约10伏的跨电极峰值电压，在一些实施方式中，峰值电压可以是约5伏。产生的对应电场振幅可为约0.1微伏/厘米(mV/cm)-约100mV/cm，在一些实施方式中，可为约20mV/cm。正弦时变电场的频率可为约1,000Hz-约200,000Hz，在一些实施方式中，频率可为约60,000Hz。

应用于液体的电磁场还可以是脉冲电磁场。脉冲电磁场能用外部线圈和脉冲发生器诱导。在此方面，脉冲电磁场可具有约10微秒/脉冲-约2000微秒/脉冲的脉冲持续时间。在一个实施方式中，脉冲持续时间可以是约225微秒。脉冲可包括电磁爆发，其中爆发能包括1个脉冲-约200个脉冲。或者，电磁场可具有含约10脉冲-约30脉冲的爆发。就此而言，在一个实施方式中，各爆发能包括约20脉冲。

脉冲电磁场中爆发的频率可变。就此而言，在一些实施方式中，爆发能以约1Hz-约100Hz的频率重复，在其它实施方式中，能以约10Hz-约20Hz的频率重复。此外，爆发能以约1.5Hz、约15Hz或约76Hz的频率重复。爆发的持续时间可为约10微秒到多至约40,000微秒。在此方面，爆发的持续时间可为约4.5微秒。

产生电容耦合电磁场的合适装置包括髓刺激器(新泽西州帕西帕尼的EBI(EBI,L.P.))或DC刺激装置如XL脊柱融合刺激器(新泽西州帕西帕尼的EBI)。脉冲电磁场能用多种已知方法和设备生成，如用单线圈或一对亥姆霍兹线圈。例如，合适的设备包括EBI2001型(新泽西州帕西帕尼的EBI)和BTBS刺激线圈。关于直流电，电场可用任何已知产生直流电场的装置生成，例如Osteogen^TM植入式骨生长刺激器(新泽西州帕西帕尼的EBI)。可使用产生电磁场的其它合适设备。

根据液体与固相提取材料接触的需要，电磁刺激细胞因子细胞悬液可连续和/或重复。然而，应理解，用电磁场刺激液体的步骤包括不是与周围条件相关电场或电磁场(如通过偶然暴露于收音机、电话机、台式计算机或类似设备而产生的电磁场)的场，或除与周围条件相关电场或电磁场之外还包括其它场。

在一些实施方式中，如图1所示的接触和刺激步骤都在小于约1小时内进行。接触和刺激步骤还能在约20℃-约37℃的温度范围进行。在优选实施方式中，所述细胞因子细胞悬液的温度在接触和刺激步骤中保持约37℃。接触和刺激步骤之一或两者通常离体进行。

形成蛋白质溶液的其它方法

本技术提供形成蛋白质溶液组分的其它方法，如混合蛋白质和其它组分并且分离和浓缩蛋白质及组分，而不用固相提取材料。例如，如上所述，通过混合这些方法所制备蛋白质与从同种异体来源分离组织所制备的组分或溶液并用固相提取材料处理，能制备本技术的蛋白质溶液。

例如，多种方法提供非细胞或基本非细胞蛋白质溶液，包括一种或多种上述蛋白质。不意在限制本技术的范围、机制或功能，这种非细胞抗炎性细胞因子组合物可在某些应用中提供优势，只要其在施用对象中不产生免疫原性应答。

例如，特别地，蛋白质溶液可包括白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，除了上述方法以外，IL-1ra是合成或重组的，或分离自自体、同种异体或异种血液或其它生物来源。例如，Kineret^TM(阿那白滞素)是IL-1ra的重组、非糖基化形式，可获自安进公司(加利福尼亚州千橡市)。多种重组白介素-1抑制剂和治疗方法参见美国专利号6,599,873,Sommer等,2003年7月29日公开；美国专利号5,075,222,Hannum等,1991年12月24日公开；和美国申请公开号2005/0197293,Mellis等,2005年9月8日公开。另外，包括使用自身体液在内的从体液生成IL-1ra的方法参见美国专利号6,623,472,Reinecke等,2003年9月23日公开；美国专利号6,713,246,Reinecke等,2004年3月30日公开；和美国专利号6,759,188,Reinecke等,2004年7月6日公开。要生成同种异体抗炎性细胞因子组合物时，来自多个对象的多种来源IL-1ra可汇集在一起。

更一般地，制备非细胞蛋白质溶液的方法能包括在天然生成抗炎性细胞因子如IL-1ra的细胞培养物中培养细胞，或培养改造成产生这些细胞因子的细胞。天然生成抗炎性细胞因子的细胞的非限制性示例包括脂肪组织细胞、脂肪细胞、脂肪来源干细胞、基质细胞、骨髓细胞、间充质干细胞和血细胞。

在各种实施方式中，细胞系能改造成过量生成抗炎性细胞因子。抗炎性细胞因子的非限制性示例包括VEGF、TNF-α、IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII、PGDF-AB、PDGF-BB、IGF-I、EGF、TGF-β1、sIL-lRII和HGF。过表达抗炎性细胞因子的稳定真核细胞系能如下产生：用重组DNA转染真核细胞如哺乳动物细胞，所述重组DNA包括编码抗炎性细胞因子的基因和选择标记。或者，原核生物和酵母通过重组DNA转化能改造成过表达抗炎性细胞因子，所述重组DNA包括编码抗炎性细胞因子的基因和选择标记。转化和转染可用重组DNA分子进行，所述分子包括编码抗炎性细胞因子如IL-1ra的DNA序列和选择标记。真核和原核细胞能改造成组成型或经诱导过表达抗炎性细胞因子。在真核和原核细胞中表达抗炎性细胞因子如IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII和sILl-RII的方法参见美国专利号6,337,072,Ford等,2002年1月8日公开；和美国申请公开号2001/0053764,Sims等,2001年12月20日公开。

IL-1ra基因在人中转录时，mRNA可剪接成4个变体，产生4种翻译IL-1ra亚型。SEQIDNO:1、3、5和7分别是IL-1ra亚型1-4的cDNA，SEQIDNO:2、4、6和8分别是IL-1ra亚型1-4的氨基酸序列。IL-1ra亚型统称为“IL-1ra”。SEQIDNO:9是sTNF-RI的cDNA序列且SEQIDNO:10是sTNF-RI的氨基酸序列。SEQIDNO:11是sTNF-RII的cDNA序列且SEQIDNO:12是sTNF-RII的氨基酸序列。SEQIDNO:13是sIL-lRI的cDNA序列且SEQIDNO:14是sIL-lRI的氨基酸序列。SEQIDNO15和17分别是sIL-lRIIv1和sIL-lRIIv3的cDNA且SEQIDNO:16和18分别是sIL-lRIIv1和sIL-lRIIv3的氨基酸序列。IL-1RIIv2的cDNA序列是非编码序列；因此，其不包括在内。

为在原核培养物特定例如细菌中表达IL-1ra、sTNF-RI或sTNF-RII(一般称为“感兴趣蛋白质”)，将cDNA序列(SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15或17)克隆到适合细菌的表达载体中。表达载体应包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死细菌细胞的抗生素的非限制性示例包括氨苄青霉素、四环素、卡那霉素和氯霉素。表达载体还应包括引起感兴趣蛋白质组成型或诱导型表达的元件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋白质的标签对应的DNA序列可存在于载体中，毗邻感兴趣蛋白质的基因，所述标签能鉴定和纯化蛋白质。例如，N或C末端His标签能用于检测带抗His抗体的蛋白质，且能在镍柱上纯化。制备含感兴趣蛋白质表达基因的表达载体时，细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)能用该表达载体转化。选择标记确保仅转化有载体的细胞在LB肉汤中存活，所述LB肉汤补充有对应选择标记的抗生素。然后，细菌能在补充有抗生素的LB肉汤中生长，以用于表达和纯化。表达载体、克隆感兴趣蛋白质到表达载体中的方法、转化原核细胞的方法、从经转化原核细胞表达蛋白质的方法以及蛋白质纯化方法通常为本领域普通技术人员已知。

为在真核培养物例如哺乳动物细胞中表达感兴趣蛋白质，将cDNA序列(SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15或17)克隆到适合特定哺乳动物细胞的表达载体中。表达载体应包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死哺乳动物细胞的抗生素的非限制性示例包括遗传霉素和庆大霉素。表达载体还应包括引起感兴趣蛋白质组成型或诱导型表达的元件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋白质的标签对应的DNA序列可存在于载体中，毗邻感兴趣蛋白质的基因，所述标签能鉴定和纯化蛋白质。制备含感兴趣蛋白质表达基因的表达载体时，哺乳动物细胞如人细胞能用该表达载体转染。转染细胞能在细胞培养基中生长，所述培养基补充有对应选择标记的抗生素。抗生素的存在能分离稳定细胞系。然后，稳定细胞系能在补充有抗生素的细胞培养基中生长，以用于表达和纯化。表达载体、克隆感兴趣蛋白质到表达载体中的方法、转染真核细胞和开发稳定细胞系的方法、从经转染真核细胞表达蛋白质的方法以及蛋白质纯化方法通常为本领域普通技术人员已知。

或者，可培养未通过DNA转染改变基因的真核细胞。所述真核细胞可以是原代培养物，即细胞直接生长自真核供体如人，或真核细胞可以是确立的细胞系。许多确立细胞系可市售获自美国模式培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Inc.)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。所述细胞能与外源信号如重组蛋白质一起生长。真核细胞通常在有细胞培养基的培养瓶中培养。从瓶中回收细胞培养基，离心以移出非贴壁细胞。

细胞培养可以是单层培养、非贴壁培养或生物反应器。单层培养包括在适当基质上培养的锚依赖性细胞，所述底物允许细胞粘附和伸展，如细胞培养瓶和细胞培养皿。非贴壁培养包括在悬液中维持的细胞。合适的细胞是非锚依赖性，或其是适合悬浮培养的锚依赖性细胞。许多细胞系例如许多昆虫细胞，能单层或悬浮生长。生物反应器是能支持生物活性环境的装置，其中完成化学过程和/或获得生化活性物质。生物反应器可包括悬浮或固定细胞。单层培养、非贴壁培养和生物反应器能通过本领域常用方法维持。

在一些实施方式中，细胞培养物经受电磁场，从而刺激一种或多种蛋白质生成。用电磁场刺激培养物可涉及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或电容耦合电磁场。刺激的方法和条件包括上述那些。

细胞培养物能向培养基自然释放抗炎性细胞因子，或所述培养物可经诱导释放抗炎性细胞因子到培养基中。通过抽吸、离心或过滤可分离培养基，以用于形成非细胞抗炎性细胞因子组合物。

在一些实施方式中，从尿中分离抗炎性细胞因子，用于生成本技术的蛋白质溶液。蛋白质能通过本领域已知方法从尿中分离。一个这种方法用于ProteoSpinTM尿蛋白浓缩Maxi试剂盒，所述试剂盒获自NorgenBiotek公司(NorgenBiotekCorp.)(加拿大安大略省索罗尔德)。此试剂盒采用并入旋转柱的离子交换树脂。简言之，获得尿样品且其pH调至3.5。尿随后转至含离子交换树脂的旋转柱，其置于收集管中。之后柱进行离心，其中蛋白质附于树脂，剩余液体和盐流入收集管并弃去。随后，用提供的柱活化和洗涤缓冲剂清洗蛋白质，接着离心。弃去通过的流体，重复洗涤过程。向柱加入洗脱缓冲剂(10mM磷酸钠，pH12.5)且向洗脱管加入中和剂。含洗脱缓冲剂的旋转柱置于洗脱管中并离心，其中洗脱蛋白质并在含中和剂的洗脱管内捕获。

治疗组合物

本技术还提供含蛋白质溶液和含活性物质、生理学运载体和其组合的第二组分的组合物。在一些实施方式中，组合物包含安全和有效量的蛋白质溶液以及安全和有效量的第二活性剂。“安全和有效”量的组分是用于本技术方法时，足以在人或哺乳动物对象中产生所需治疗效果的量，而没有过度不良副作用(如毒性、刺激或变态反应)，具有合理的利益/风险比。特定安全和有效量的组分显然随着诸如以下因素而变化：所治疗具体病症、患者的身体状况、同期疗法(如果有)性质、所用特定组分、特定给药途径和剂型、所用运载体(如果有)、和所需剂量方案。

本文所用活性物质包括生物和药物活性剂。生物活性剂包括成分血，如PRP、血液制品和浓缩骨髓抽吸物(cBMA)。

因此，在一些实施方式中，本技术提供含安全和有效量蛋白质溶液以及安全和有效量cBMA的组合物。cBMA能包括造血干细胞、基质干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、红细胞、白细胞、成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞或内皮细胞。如上所述，可制备蛋白质溶液，使用骨髓抽吸物作为含细胞因子的组织。然而，治疗组合物可额外包含cBMA与蛋白质溶液。在一个实施方式中，治疗组合物包括蛋白质溶液和cBMA，蛋白质溶液:cBMA之比是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。或者，蛋白质溶液:cBMA之比可以是约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。cBMA和蛋白质溶液还可同时生成。因此，参考图1和上述过程，在步骤140的接触固相提取材料之前或期间，可向步骤115所得全血加入骨髓抽吸物；这种过程涉及操作步骤115和130。例如，在步骤120的富血小板血浆分离之前或期间，可向全血加入骨髓抽吸物。这类方法包括以下所述那些：美国专利公开号2006/0278588,Woodell-May,2006年12月14日公开。

在一些实施方式中，所述cBMA和带白芷溶液可以同时产生。因此，参考图1和上述方法，可以在步骤140中的与固相提取材料接触之前或期间，将骨髓抽吸物添加到步骤115中获得的全血；这种方法涉及步骤115和130的操作。例如，可以在步骤120中的分离富血小板血浆之前或期间将骨髓抽吸物添加全血。这类方法包括以下所述那些：美国专利公开号2006/0278588,Woodell-May,2006年12月14日公开。

本文所用的药物活性剂包括有机分子、蛋白质、肽、模拟肽、核酸、核蛋白、反义分子、多糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物和多糖、植物提取物以及其合成和生物工程类似物、活细胞(白细胞基质细胞以外)如软骨细胞、骨髓细胞、病毒和病毒颗粒、天然提取物、和其组合。生物活性物质的特定非限制性示例包括激素、抗生素和其它抗感染剂、生血剂、促血小板生成素(thrombopoietics)、抗病毒剂、抗肿瘤剂(化疗剂)、退热剂、镇痛药、抗炎剂、抗过敏剂、血管扩张剂、细胞因子、生长因子、基因调节剂、维生素、矿物质和其它营养品、保健营养品和其组合。在一些实施方式中，除所述蛋白质溶液中所存在生长因子以外组合物还可包含如血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白(BMP)的那些。

除了含所述蛋白质溶液的任何液体以外，所述组合物可包含运载体物质。应理解在本技术的各种实施方式中，治疗方法采用如上所含和制备的蛋白质溶液，而没有更多运载体，通过直接注射或另外施用于治疗位点。然而，在一些其它实施方式中，可出于诸如易于施用、用特定递送装置帮助施用、提高活性、增加蛋白质溶液在施用位点维持的时间长度等原因而使用额外运载体物质。本文所用的运载体包括盐水、透明质酸、胶原蛋白、缓冲液(如汉克缓冲液)、细胞培养基、血液制品(如PRP和贫血小板血浆)和其混合物。

蛋白质溶液和含蛋白质溶液的组合物可在施用前通过任何合适方法灭菌。例如，蛋白质溶液可如下灭菌：纳入无菌过滤器以处理由上述过程制备的产品。在一些实施方式中，抗生素可在上述接触步骤中纳入固相提取材料，或可在一个或多个本文所述方法和治疗的不同步骤中加入。或者或另外，所述蛋白质溶液可无菌生成。

蛋白质溶液和含蛋白质溶液的组合物还可在生成后冻干(冷冻干燥或冻干)，用本领域已知方法。因此，如图1所示，所述蛋白质溶液能在从固相提取材料分离后冻干160。冷冻干燥时，抗炎性细胞因子组合物可用盐水水合，在施用前或施用时。冷冻干燥时，抗炎性细胞因子组合物可用合适介质水合，在施用前或施用时。通过混合组合物与溶液可完成水合，所述溶液包括盐水、缓冲液、血液、成分血、骨髓抽吸物、浓缩骨髓抽吸物和其组合。

本技术还提供含血液或其它组织来源的组分的组合物，其适合同种异体施用。特别地，这类组合物可包括分离自哺乳动物对象或多个哺乳动物对象的蛋白质和其它组分，所述对象是在本技术方法中给其施用组合物的对象以外的那些。进一步参考图1，从固相提取材料分离蛋白质溶液后，冷冻干燥使得组合物适宜同种异体施用，所述组合物通过含有白细胞的液体接触固相提取材料来制备，如步骤160所示。在一些实施方式中，所述组合物能处理成移出接触步骤140后蛋白质溶液组合物中存在的白细胞。移出白细胞的方法包括本领域已知的那些，包括过滤、凝结和重量法。在一些实施方式中，分离含血浆的成分血和移出白细胞基本上同时进行。因此，本技术提供制备非免疫原性抗炎性细胞因子组合物的方法，所述方法包括：

(a)从哺乳动物供体获得细胞因子细胞悬液；

(b)所述液体与固相提取材料接触以产生富含白介素-1受体拮抗剂的组合物；

(c)进行以下之一或两者：

(i)从所述组合物移出细胞；和

(ii)冷冻(如冷冻干燥)组合物以生成非免疫原性抗炎性细胞因子组合物。

在一些实施方式中，向所述蛋白质溶液加入冻存储液，以提供后续低温存储的稳定性。合适的储液包括本领域的那些，如甘油和二甲亚砜(DMSO)。所述组合物可低温保存，如约1℃-约6℃。在一些实施方式中，所述组合物在约-80℃液氮下保存。所述冻存储液优选在给哺乳动物对象施用前从蛋白质溶液中移出。移出储液可由本领域已知方法进行，所述方法用于处理含冻存剂的贮存血液。用洗液如盐水进行洗涤。在这些实施方式中，待治疗对象的血型可与获得细胞因子细胞悬液的供体血型匹配。

治疗方法

本技术提供在人或其它哺乳动物对象中治疗疼痛疾病的方法，包括将本技术的蛋白质溶液施用施用到所述对象中的疼痛位置。如本文所述，“治疗”包括防止、减轻和消除疼痛的一或多种。疼痛疾病可以是急性或慢性的，并且可以与引起疼痛的潜在的骨、肌肉、软骨、血管组织或其它组织的伤害、创伤、疾病或其它生理机能不全相关。在各种实施方式中，所述疼痛疾病与炎症性疾病相关，包括IL1-ra介导的炎症。这种炎症性疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质溶解、肌腱炎、滑膜炎、外周血管疾病、和炎症性呼吸道疾病(如慢性阻塞性肺病、纤维化、气肿、急性呼吸窘迫综合征和肺炎)。具体的疼痛疾病包括与创伤性损伤、肌肉拉伤、关节炎(类风湿性关节炎和骨关节炎)、滑膜炎、骶髂关节病变、背疾、术后注射、肌腱注射、运动医学手术(例如ACL修复、MCL修复、BTB修复、髌骨修复或软骨修复)、挫伤、肌肉拉伤、创伤后骨关节炎相关的疼痛。

在各种实施方式中，方法用于治疗人中的疼痛疾病。在其它实施方式中，治疗用于非人哺乳动物，如陪伴、役用和运动类动物。例如，此技术的这些方法可用于治疗马的与关节伤害相关的疼痛。

在各种实施方式中，本技术的方法包括制备蛋白质溶液的照护方法。如本文所示，“照护方法”中本技术的方法在给所治疗对象施用所述蛋白质溶液的时间附近进行。这类方法可在临近位置进行，如同一房间(例如床边)或另外紧邻用所述蛋白质溶液治疗的哺乳动物对象。在各种实施方式中，“相邻时间”可以是例如所述蛋白质溶液施用对象的12小时内、8小时内、2小时内、1小时内或30分钟内。

在一些实施方式中，所述蛋白质溶液与伴随治疗一起施用。例如，这种疗法包括施用上述药物活性剂或生物活性剂。在一些实施方式中，伴随治疗与蛋白质溶液同时施用。例如，方法可包括用安全和有效量的活性剂施用蛋白质溶液，所述活性剂选自镇痛药和糖皮质激素。

在一些实施方式中，方法包括用上述浓缩骨髓抽吸物施用蛋白质溶液。例如，cBMA与蛋白质溶液可同时施用。

本技术的方法一般包括向哺乳动物对象疼痛位置施用蛋白质溶液。施用蛋白质溶液能用任何合适装置进行，包括本领域已知用于局部递送组合物到肌肉、关节、血管、肺或其它组织的装置。例如，用于治疗与关节疾病相关的疼痛的局部递送可包括在关节处或附近注射蛋白质溶液。治疗炎症性呼吸道疾病相关的疼痛可包括通过气管内导管、吸入器和喷雾器递送蛋白质溶液。

本技术的实施方式通过下列非限制性实施例进一步说明。

实施例1：制备和鉴定蛋白质溶液

富含白介素-I受体拮抗剂的蛋白质溶液制备自7个签署知情同意书的人供体。将血液(55mL)吸入带5mL柠檬酸葡萄糖抗凝液A(ACD-A，马萨诸塞州布伦特里的CitraLabs)的60cc注射器。富血小板血浆(PRP)用III血小板浓缩系统(800-1003A，印第安纳州华沙巴奥米特公司)根据使用说明书产生。通过向含1克聚丙烯酰胺珠的改良Plasmax装置(印第安纳州华沙巴奥米特公司)加入6mLPRP，产生所述溶液。从Plasmax装置移出IL-1ra溶液并在-50℃冷冻以用于测定。细胞因子含量在16-plexELISA(Searchlight蛋白质阵列，马萨诸塞州比尔里卡的Aushon生物系统公司(AushonBiosystems))上测定。分析物包括IL-4、IL-10、IL-11、IL-I3、IL-Ira、IFN-γ、sTNF-RI、sTNF-RII、IL-1α、IL-Ιβ、TNF-α、IL-17、IL-18、bFGF、TBF-β1和TBF-β2。

所述溶液含有同化细胞因子(bFGF、TGF-β1、TGF-β2(见表2))和抗炎性细胞因子(IL-1ra、sTNF-RI、sTNF-RII、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、IFN-γ(见表3))，不表达大剂量异化细胞因子(IL-lα、IL-Ιβ、TNF-α、IL-17、IL-18(见表4))。抗炎性细胞因子IL-1ra和sTNF-R均以ng/mL量检测，而所有异化分析物采用pg/mL量。然而，检测到供体间变异性。对比异化细胞因子IL-1和TNF-α与抗炎分析物IL-1ra和sTNF-R之间的相关性，未检测到大相关性(表5)。平均来说，IL-1ra是IL-lα的约13,260倍且是IL-1β的约7,561倍。

表2.溶液中的同化细胞因子

表3.溶液中的抗炎性细胞因子

表4.溶液中的异化细胞因子

表5.相关性分析

实施例2：从富血小板血浆产生IL-1ra

IL-1ra溶液如下产生。从5个健康志愿者中采全血(70mL)，用ACD-A(美国马萨诸塞州布伦特里)抗凝(10％)。保留部分(10mL)用于全血测量。富血小板血浆(PRP)(6mL)用II系统(印第安纳州华沙巴奥米特公司)产生。根据验证程序收集全血和PRP样品的血细胞计数，如Woodell-MayJE,RiddermanDN,SwiftMJ,HigginsJ."生成富血小板血浆的准确血小板计数：血液分析器验证和计数的制备技术(ProducingAccuratePlateletCountsforPlateletRichPlasma:ValidationofaHematologyAnalyzerandPreparationTechniquesforCounting)"J.Craniofac.Surg.(2005)9月16日(5):749-56所述。

PRP生成后，向改良血浆浓缩装置(Plasmax^TM，美国印第安纳州华沙巴奥米特公司)加入5mLPRP，用装置内的聚丙烯酰胺脱水珠室温温育24小时。与聚丙烯酰胺珠电磁场接触后，离心血浆浓缩装置以分离血清部分。

为分析时间零点时的基线IL-1ra水平，全血和PRP样品用50μL凝血酶和10％CaCl2(1,000单位/mL)活化。形成血凝块并室温温育30分钟。温育后，所述凝块以3,000rpm离心5分钟。从凝块中收集血清并保留用于ELISA分析。来自血浆浓缩器的血清部分不需要通过凝血酶活化，可直接测试。分析所有样品的IL-1ra，使用ELISA试剂盒(IL-lraQuantikine^TM试剂盒，美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(R&DSystems))。

PRP样品产生约8倍血小板增加、约5倍总白细胞(WBC)增加、约9倍WBC单核细胞部分增加、和约3倍WBCPMN部分增加。全血和PRP样品的IL-1ra生成与WBC浓度最紧密相关。PRP的5倍增长可能源于WBC增加，全血和PRPIL-1ra值都能视作基线IL-1ra含量。这与血浆浓缩器温育后IL-1ra增长195倍不同。此血浆浓缩装置通常引起血浆蛋白质浓度增加3倍，这归因于干燥过程导致体积减少。此3倍体积减少不引起所见的IL-1ra量水平增加。因此，此水平增加指示在接触固相提取材料(如聚丙烯酰胺珠)和电磁场刺激期间刺激WBC生成IL-1ra。

相关性分析显示IL-1ra生成与WBC增加的关联比血小板含量更密切。IL-1ra水平与PRP中的单核细胞群不紧密相关。这不令人惊讶，因为单核细胞未活化，且通过凝血酶活化血浆来收集血清。然而，可能一旦单核细胞在血浆浓缩装置中活化，其参与所见的显著IL-1ra生成。

实施例3：从PRP生成蛋白质溶液

从5个人供体收集抗凝血(120cc)。富血小板血浆(PRP)用一次性III(印第安纳州华沙巴奥米特公司)制备。将PRP加样到改良血浆浓缩装置(Plasmax^TM，美国印第安纳州华沙巴奥米特公司)并处理。输出分成4组：有和没有凝血酶活化(1MCaC12中1000U/mL)的浓缩血浆中的IL-1ra，有和没有凝血酶活化的无细胞IL-1ra。IL-1ra用ELISA(安迪生物)随着时间测量。

PRP接触Plasmax^TM装置中的聚丙烯酰胺珠，同时用电容耦合电磁场提供电磁场刺激。

未凝结PRP在24小时内平均生成约50ng。无细胞样品在24小时内平均生成约34ng，而没有变化。一旦凝结，IL-1ra洗脱变慢，10小时后仅约30％洗脱。无细胞样品释放也延迟，但10小时后洗脱100％可用IL-1ra。

实施例4：产生蛋白质溶液和鉴定健康对象及骨关节炎对象中的细胞因子水平

来自健康患者的自体蛋白质溶液(APS)如下制备以用于测量生长因子。从6个供体通过静脉穿刺各采72ml抗凝全血。3ml的各供体抗凝全血等分到微量离心管中并于-50℃冷冻。将60ml抗凝全血加样到III一次性装置(美国印第安纳州华沙巴奥米特公司)，根据厂商说明书处理以生成PRP。PRP从III装置中移出并加入Plasmax^TM装置(美国印第安纳州华沙巴奥米特公司)，根据厂商说明书处理以生成APS。从各装置提取APS，等分到微量离心管中，-50℃冷冻。全血和PRP的各样品接受3个冻融循环。就各APS和全血样品而言，用于VEGF、PDGF-BB、PDGF-AB、EGF、TGF-β1、TGF-P2和IGF-1的Quantikine人免疫测定(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物)根据厂商说明书一式两份进行。

来自健康患者的APS如上制备以用于测量抗炎性细胞因子。就各APS和全血样品而言，用于IL-1ra、IL-1β、IL-8、sTNF-RI、TNF-α、IL-6、sTNF-RII、IL-10、IL-13和IL-4的Quantikine人免疫测定(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物)根据厂商说明书一式两份进行。还进行免疫测定以检测肝细胞生长因子(HGF)和可溶性IL-1RII。

来自105名骨关节炎患者的APS如上制备以用于测量生长因子抗炎性细胞因子。APS在-50℃或干冰保存。

对比健康供体与OA患者在基线血液和APS中的细胞因子浓度。IL-Ιβ在OA患者中浓缩水平更高，但倍数增加仍远低于IL-1ra。浓缩到至少健康供体所见水平的其它细胞因子和生长因子包括sTNF-RI、IGF-I、IL-8、VEGF和IL-6。可溶性细胞因子sTNF-RII和sIL-1RII浓缩到与健康浓缩水平极类似的水平，虽然没有那么高。结果示于表6。

表6.从健康患者和骨关节炎患者所得APS的生长因子及抗炎性细胞因子浓度(pg/ml)

实施例5：从脂肪组织产生蛋白质溶液

脂肪基质细胞如下制备。脂肪组织切成小块(约1cm3)，用2mg/mLI型胶原酶(新泽西州莱克伍德的沃辛顿生化公司(WorthingtonBiochemicalCorp.))在间歇式机械搅拌下37℃水浴消化180分钟。通过加入培养基或血源性溶液可中和消化作用。离心细胞悬液(300xg持续7分钟，25℃)，然后从细胞团块中移出上清。随后，团块重悬于相容溶液以提供含脂肪基质细胞的液体体积。

或者，所述团块悬于获自对象的全血，加入GPS^TM血小板浓缩系统，所述系统来自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)。离心后，从该系统提取富血小板血浆层，其还包含脂肪基质细胞。

脂肪基质细胞可选包括富血小板血浆层，随后与聚丙烯酰胺珠组合并通过使用一对亥姆霍兹线圈施加脉冲电磁场以刺激IL-1ra生成。脂肪基质细胞和聚丙烯酰胺珠与液体溶液分离获得富含IL-1ra的溶液。

实施例6：从脂肪组织提取物产生蛋白质溶液

IL-1ra的治疗组合物从分离自脂肪组织的基质细胞产生。分离人基质细胞如下进行：从吸脂/抽脂术获得人皮下脂肪组织，在I型胶原酶溶液(新泽西州莱克伍德的沃辛顿生化公司)中消化，37℃温和搅拌1小时。解离细胞用500μm和250μmNitex滤器过滤。所述部分以300xg离心5分钟。弃上清，细胞团块重悬于相容溶液如血源性溶液。

术语的非限制性讨论

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描述本技术实施方式的说明和特定实施例仅用于阐述目的且不意在限制本技术范围。特定实施方式、材料、组合物和方法的等价改变、修改和变化在本技术范围内作出，结果基本相似。此外，列举有所示特征的各种实施方式不意在排除有另外特征的其它实施方式，或纳入不同组合所示特征的其它实施方式。提供特定实施例以阐明如何制备和应用本技术的组合物及方法，且除非另有明确说明，否则不用于表示本技术的给定实施方式有或没有进行或测试。

本文所用的单词“优选”或“优选的”指本技术的实施方式在某些情况下提供特定益处。然而，其它实施方式也可在相同或其它情况下优选。此外，列举一个或多个优选实施方式不意味着其它实施方式没有用，且不意在从本技术范围中排除其它实施方式。

本文所用的单词“包括”和其变体无限制性，从而在列表上列出条目不排除其它类似条目也可用于本技术的材料、组合物、装置和方法。类似地，术语“能”和“可”及其变体无限制性，从而关于实施方式能或可包括某些元件或特征的叙述不排除未含有这些元件或特征的本技术其它实施方式。

尽管开放式术语“包括”作为非限制性术语如包括、包含或具有的同义词，在本文中用于描述本技术的实施方式并要求权利，但实施方式可用更具限制性术语“由……组成”或“基本由……组成”替代描述。因此，对于列举材料、组分或方法步骤的任何给定实施方式，本技术还特定包括由所述材料、组分或方法组成的实施方式，或基本由其组成，排除额外材料、组分或方法(用于“由……组成”)和排除影响实施方式重要性质的额外材料、组分或方法(用于“基本由……组成”)，尽管这些额外材料、组分或方法在本申请中未明确详述。例如，列举元件A、B和C的组合物或方法详述特定设想了由A、B和C组成的实施方式，或基本由其组成，排除本领域可能列举的元件D，尽管元件D未明确描述为被本文排除。此外，如本文所用，术语“基本由所列举材料或组分组成”设想了“由所列举材料或组分组成”的实施方式。

本文所用的“一个”和“一种”表明存在“至少一个”项目；可能时，可存在多个这类项目。“约”用于数值时，表明计算或测量允许数值略微不精确(用一些方法来达到值精确；近似或相当接近值；几乎)。出于某种原因，如果“约”提供的不精确根据此通常意义在本领域无法理解，则本文所用的“约”表明测量或使用这类参数的普通方法至少可引起变化。

如本文所示，除非另有特定说明，范围涵盖终点且包括披露所有不同值和完整范围内的更多划分范围。因此，例如，“从A到B”或“从约A到约B”的范围涵盖A和B。披露特定参数(如温度、分子量、重量比分比等)的值和值范围不排除本文所用的其它值和值范围。设想给定参数的2个或更多特定示例值可定义所述参数要求的值范围终点。例如，若参数X在本文中例示具有值A且还例示具有值Z，设想参数X可具有从约A到约Z的值范围。类似地，设想披露参数的2个或更多值范围(无论所述范围是嵌套、重叠或是不同的)会归入该值所有可能的范围组合，其可以用所公开范围的终点要求。例如，若参数X在本文中例示具有1-10、或2-9、或3-8的值范围，还设想参数X可具有包括1-9、1-8、1-3、1-2、2-10、2-8、2-3、3-10和3-9在内的其它值范围。

Claims

1.用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括将来源于血液的组合物局部施用到疼痛位置，所述组合物包含选自IL-1ra、sTNF-R1、sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1和sIL-1RII的至少两种蛋白质，其中各蛋白质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。

2.权利要求1的方法，其中所述来源于血液的组合物是所述对象自体的。

3.权利要求1的方法，其中所述来源于血液的组合物包含

(a)至少约10,000pg/ml的IL1-ra；

(b)至少约1,200pg/ml的sTNF-RI；和

4.用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括将来源于血液的组合物局部施用到疼痛位置，所述组合物包含

(a)白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，浓度是正常血液中的IL-1ra浓度的至少3倍；

(b)可溶性组织坏死因子-r1(sTNF-r1)，浓度是正常血液中的IL-1ra浓度的至少2倍；

(c)白细胞，浓度是正常血液中的白细胞浓度的至少2倍；和

(d)血小板，浓度是正常血液中的血小板浓度的至少2倍。

5.权利要求4的方法，其中所述组合物进一步包含选自sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β1、sIL-1RII及其混合物的蛋白质，其中所述蛋白质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。

6.权利要求4的方法，其中所述组合物进一步包含浓缩的骨髓抽吸物。

7.用于治疗哺乳动物对象中疼痛疾病的方法，包括：

(a)从所述对象获得细胞因子细胞悬液；

(b)分级分离所述悬液以产生包含白介素-1受体拮抗剂的自体的蛋白质溶液；

(c)将所述自体的蛋白质溶液施用到所述对象中的疼痛位置。

8.权利要求9的方法，其中所述细胞因子细胞悬液包含全血、骨髓抽吸物、脂肪组织、尿液、其部分和其混合物。

9.权利要求8的方法，其中所述液体是富血小板血浆或骨髓浓缩物。

10.权利要求7的方法，其中所述分级分离包括将血液置于容器，可操作以将所述血液分离为两或多个部分的分离器；以及离心所述分离器以产生富血小板血浆部分。

11.权利要求10的方法，其中所述分级分离进一步包括将所述富血小板血浆与聚丙烯酰胺珠接触，并将所述富血小板血浆与所述聚丙烯酰胺珠分离以形成所述自体的蛋白质溶液。

12.权利要求7的方法，其中所述分级分离包括：

(1)将包含全血、骨髓抽吸物或两者的组织和抗凝剂加样到置有浮标的管内，其中所述浮标的密度使得浮标能在管内组织离心后达到平衡位置，所述平衡位置在包含细胞因子生成细胞的第一部分和第二部分之间，第二部分的细胞浓度大于第一部分的白细胞浓度；

(2)对管进行离心，从而所述浮标界定第一部分与第二部分之间的界面；和

(3)收集第二部分；

(4)将所述第二部分加样到包含固相提取材料的浓缩器组件，温育与固相提取材料接触的第二部分；和

(5)旋转浓缩器组件，采用的离心速度能分离固相提取材料和富含白介素-1受体拮抗剂的溶液，所述溶液的白介素-1受体拮抗剂浓度大于全血。

13.权利要求12的方法，其中所述固相提取材料选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和其组合。

14.权利要求13的方法，其中所述固相提取材料包含聚丙烯酰胺。

15.权利要求13的方法，其中所述固相提取材料的形式选自珠、纤维、粉末、多孔材料和其组合。

16.权利要求7的方法，进一步包括：

(d)从所述对象获得骨髓抽吸物；

(e)浓缩所述骨髓抽吸物以产生浓缩的骨髓抽吸物(cBMA)；

(f)给所述对象施用cBMA。

17.权利要求16的方法，其中在分级分离所述血液期间或之前将所述骨髓抽吸物与所述血液混合。

18.权利要求7的方法，进一步包括给所述对象施用伴随的疼痛管理治疗。

19.权利要求18的方法，其中所述疼痛管理治疗包括将包含透明质酸、胶原蛋白、类固醇、微球体、镇痛药和其组合的组合物施用到疼痛位置。

20.权利要求18的方法，其中所述疼痛管理治疗包括使用减负型支具(offloaderbrace)、电刺激和其组合。

21.权利要求18的方法，其中所述治疗包括施用选自镇痛药、类固醇和其组合的的系统性药物。

22.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物对象是人。

23.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物对象是陪伴、役用或运动类动物。

24.权利要求7的方法，其中所述细胞因子细胞悬液是所述哺乳动物对象自体的。

25.权利要求7的方法，其中所述疾病是与骨关节炎相关的疼痛、与滑膜炎相关的疼痛、骶髂关节疼痛、背部疼痛、与手术后注射相关的疼痛、与肌腱注射相关的疼痛、与运动医学过程相关的疼痛、与挫伤相关的疼痛、与肌肉拉伤相关的疼痛、与肺气肿相关的疼痛或与创伤性损伤后骨关节炎相关的疼痛。

26.权利要求25的方法，其中所述疾病是与选自ACL修复、MCL修复、BTB修复、髌骨修复和软骨修复的运动医学过程相关的疼痛。