NL9000090A - Werkwijze voor het bereiden van een fibrinogeenconcentraat uit bloedplasma, inrichting voor het uitvoeren van deze werkwijze en werkwijze voor het bereiden van fibrinogeen uit het concentraat. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van een fibrinogeenconcen-traat uit bloedplasma, inrichting voor het uitvoeren van deze werkwijze enwerkwijze voor het bereiden van fibrinogeen uit het concentraat.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het^bereiden van fibrinogeenconcentraat uit bloedplasma door het bloedplasmaaf te koelen van een temperatuur boven 0 °C tot een eerste temperatuurliggend tussen -10 °C en -40 °C, het aldus verkregen vaste materiaal teontdooien tot nabij het vriespunt van water en het daarna fysisch scheidenvan de vaste stof van de vloeibare hoofdfractie van het plasma te wetenwater. De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor hetbereiden van fibrinogeen uit het aldus verkregen fibrinogeenconcentraat enop een inrichting voor het bereiden van het fibrinogeenconcentraat.

Fibrinogeen is een in het bloedplasma oplosbaar eiwit, datonder invloed van trombine in fibrine wordt omgezet waardoor bloedstollingontstaat. In het Amerikaanse octrooi schrift 4.741.906 is een werkwijzebeschreven waarbij snippers vlees met behulp van een oplossing vanfibrinogeen met elkaar worden verbonden zodat grotere vleesbrokkenontstaan. Deze werkwijze kan met name worden toegepast in de vleesverwer¬kende industrie. Door deze industriële toepassing en de nog te verwachtenverdere toepassingen is het noodzakelijk fibrinogeen op grote schaal, endaarom industrieel, te bereiden.

Thans wordt op kleine schaal fibrinogeen bereid door eenafscheiding uit bloedplasma met behulp van chemische middelen die aan hetbloedplasma worden toegevoegd zodat de daarin aanwezige eiwitten neerslaanen vervolgens worden gewonnen. In de voedingsmiddelenindustrie is hetechter ongewenst te werken met uitgangsstoffen waaraan chemicaliën zoalsextractie- of oplosmiddelen zijn toegevoegd of die een behandeling hebbenondergaan bij verhoogde temperaturen boven 50 °C, waardoor de werking vanfibrinogeen achteruitgaat. Daarom is gezocht naar een werkwijze voor hetbereiden van fibrinogeen zonder dat additieven of hulpstoffen wordentoegevoegd of dat een verhoogde temperatuur wordt toegepast.

Uit een artikel van A.M. Cucuianu e.a. gepubliceerd in Rev.Chir. Oncol. Radiol 0 R L Oftamol Stomatol SER OT-Rino-Laringol, 33 (2).

1988 blz. 81-88, getiteld: "Preliminary data on the preparation of afibrin glue from the patiënt's plasma and its utilization in ORL Surgery"is een werkwijze bekend voor de bereiding van fibrinogeen door citraatbe-vattend plasma af te koelen tot -20 °C daarna langzaam ontdooien tot eentemperatuur tussen 0 °C en +4 °C en koud centrifugeren. Het rendement bijdeze werkwijze is echter laag en kan aanzienlijk worden verhoogd met hettoepassen van een werkwijze volgens de uitvinding. Uit een artikel vanW.D. Spotnitz e.a. gepubliceerd in AM Surg. 53 (8), 1987 460-462 getiteld"Fibrin glue from stored human plasma an inexpensive and efficiënt methodfor local blood bank preparation." is een werkwijze bekend voor hetafscheiden van fibrinogeen uit bloedplasma, waarbij met name de nadrukligt op het voorkomen van therapeutisch ongewenste faktoren in hetverkregen eindprodukt zoals hepatitis. Deze werkwijze wordt slechts opkleine schaal toegepast en vermeldt enkel dat wordt uitgegaan vaningevroren vers plasma.

Thans is het mogelijk gebleken op industriële schaal fibri-nogeenconcentraat met een hoog rendement af te scheiden uit bloedplasmadoor fysische scheidingen. Bij het verrichte onderzoek is gebleken dat metname de bewerking tussen het invriezen bij een eerste temperatuur vanongeveer -20 °C en het afscheiden van fibrinogeen door bijvoorbeeldcentrifugeren bij een temperatuur van ongeveer 0 °C van belang is. Dezevan belang zijnde stap is verder in de tekst aangegeven als conditioneren.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt hierdoor gekenmerktdat het ontdooien stapsgewijs plaatsheeft van de eerste temperatuur toteen conditioneertemperatuur tussen -5 °C en -1 °C, waarna het vastemateriaal wordt verkleind en het verkleinde materiaal op een temperatuurwordt gebracht waarbij de hoofdfractie van het plasma, te weten water,vloeibaar wordt en de oplosbaarheid van fibrinogeen in de vloeistof zolaag mogelijk is, waarna vloeistof wordt afgescheiden van hetfibrinogeenconcentraat. De temperatuur waarop het verkleinde materiaalwordt gebracht zodat het grootste deel van het materiaal vloeibaar is,ligt bij voorkeur tussen -2 °C en 0 °C. Deze temperatuur moet wordenbereikt door een geleidelijke temperatuursverhoging, waarbij het strevenis te voorkomen dat plaatselijk het materiaal wordt oververwarmd totaanzienlijk boven 0 °C en deze geleidelijke temperatuursverhoging wordtbij voorkeur bereikt in een reciroulatiesysteem waarin een warmtewisselaar is opgenomen waarbij de gewichtsverhouding vers materiaal totgerecirculeerd materiaal 1:1,5-5 bedraagt, zodat in hetreciroulatiesysteem het materiaal wordt verwarmd tot de temperatuurwaarbij het fibrinogeenconcentraat door bij voorkeur centrifugeren, kanworden afgescheiden van de vloeistof, te weten tot een temperatuur tussen-2 °C en 0 °C.

Het is aannemelijk, hoewel de uitvinding niet is beperktdoor deze verklaring, dat door het conditioneren het te winnen eiwit,fibrinogeen, minder oplosbaar is in de vloeibare fase van het bloedplasma,dan normaal zal worden verwacht bij de temperatuur waarbij de scheiding,zoals centrifugeren van het fibrinogeenconcentraat uiteindelijk wordtuitgevoerd.

De uitvinding heeft verder betrekking op een inrichting diewordt toegepast voor het uitvoeren van deze werkwijze.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van devolgende beschrijving, waarbij is verwezen naar de bijgevoegde tekeningwaarin: fig. 1 schematisch de inrichting weergeeft voor hetuitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding.

In fig. 1 is in een eerste stap, aangegeven met deverwijzingscijfers 1-9, de scheiding van bloedplasma uit bloed weergegeven, welke stap geen deel uitmaakt van de uitvinding en slechtsals toelichting is bedoeld om een zo volledig mogelijk procédé tebeschrijven.

Via leiding 3 wordt bloed, bij voorkeur afkomstig vanslachtvee, met een temperatuur van ongeveer 4 °C toegevoerd aan centrifuge1. Na centrifugeren wordt ingedikt bloed afgevoerd via leiding 4 en plasmamet een pH van 7,7 bij een temperatuur van ongeveer 4 °C via leiding 5,toegevoerd aan een opslagvat 2 voor plasma, voorzien van een roerder 7, inwelk opslagvat 2 de pH van het plasma wordt ingesteld op een waarde vanongeveer 8,5 door aan het opslagvat 2 NaOH via leiding 6 toe te voeren inde vorm van een 30%-ige oplossing in water. Uit vat 2 wordt, regelbaar metklep 9 via leiding 8, plasma afgevoerd met een pH van ongeveer 8,5 en meteen temperatuur van ongeveer 4 °C.

In een tweede stap wordt het fibrinogeen bevattend plasmaverkregen in de eerste stap, verder verwerkt door het in te vriezen en te conditioneren. Hiertoe wordt het plasma, verkregen uit de eerste stap, vialeiding 11 toegevoerd aan een vriesinstallatie (platenvriezer) 12. In dezevriesinstallatie 12 wordt het plasma ingevroren tot een temperatuur tussen-10 °C en -40 °C, bij voorkeur bij een temperatuur van ongeveer -20 °C.Van de aldus verkregen blokken plasma kunnen schijven worden gezaagd dieafmetingen kunnen hebben van 9 x 20 cm en een dikte van ongeveer 7-9 mm.Het vormen van de schijven heeft plaats met behulp van bijvoorbeeld eenzaag 13. De schijven kunnen vervolgens worden geconditioneerd. Het isechter ook mogelijk een buffervoorraad van schijven op te slaan in koelcel 14 bij een temperatuur van ongeveer -20 °C, waarbij het bewaren in devriescel bij voorkeur plaatsheeft in een verpakking van polyetheen. Het isverder mogelijk meerdere schijven in een verpakking te bewaren,bijvoorbeeld drie schijven, zodat uiteindelijk grote schijven wordenbewaard in vriescel 14 met afmetingen van 27 x 20 cm en een dikte van 7-9mm. Ook kan men de blokken plasma, verkregen in vriesinstallatie 12,direkt overbrengen naar conditioneercel 15. Het zal duidelijk zijn dat bijschijven de warmte-overdracht in de cel 15 makkelijker kan worden geregelddan bij het gebruik van blokken die aanzienlijk grotere afmetingen hebbendan de schijven.

De blokken of schijven worden na eventueel bewaren inkoelcel 14 bij ongeveer -20 °C indien nodig, ontdaan van het verpak¬kingsmateriaal en toegevoerd aan conditioneercel 15. In de conditioneercel 15 wordt het materiaal verwarmd van een temperatuur zoals heerst inkoelcel 14 of in vriesinstallatie 12, hetgeen bij voorkeur een temperatuuris van ongeveer -20 °C, tot een temperatuur na het conditioneren, te weteneen temperatuur tussen -5 °C en -1 °C. Belangrijk bij dit conditioneren isde eindtemperatuur en de tijd gedurende welke het conditioneren wordtuitgevoerd. De schijven moeten worden verhoogd van een temperatuur van on¬geveer -20 °C tot een temperatuur dicht onder het vriespunt van water omde schijven in de daarna volgende bewerking te verkleinen. Schijven meteen temperatuur van ongeveer -20 °C zijn slechts moeilijk klein te maken,welke verkleining noodzakelijk is voor de verdere fysische scheidingtussen fibrinogeenconcentraat en plasmavloei stof. Bij de uitgevoerde expe¬rimenten is gebleken dat de manier van conditioneren van grote invloed isop het rendement waarmee fibrinogeen wordt verkregen. Dit blijkt ook uitde hierna vermelde experimenten. Ten aanzien van de conditioneert!jd geldt dat een tijdsduur langer dan 24 uren het rendement nauwelijks verbetert endat bij een tijdsduur vanaf 0,5 uur een aanzienlijke verhoging van hetrendement wordt waargenomen. Daarom wort het conditioneren bij voorkeuruitgevoerd gedurende een tijdsduur van 0,5 tot 48 uren, bij voorkeurtussen 2 en 24 uren.

Na het conditioneren van de schijven of blokken in deconditioneercel 15 worden de schijven bij een temperatuur tussen -5 °C en-1 °C, bij voorkeur met een temperatuur van ongeveer -2 °C in een derdestap toegevoerd aan wolf 21, hetgeen een voorbeeld is van een apparaatvoor het verkleinen van de schijven. Het kleingemaakte materiaal wordt danvolgens een bij voorkeur uit te voeren werkwijze via leiding 25 toegevoerdaan recirculatievat 22 voorzien van roerder 27. Het reciroulatiesysteembestaat uit recirculatievat 22, pomp 23, warmtewisselaar 24 en debetreffende leidingen zoals aangegeven in de tekening. De warmtewisselaar24 wordt enerzijds via leiding 28 gevoed met verpompbaar fibrinogeenbevattend plasma met een temperatuur van ongeveer -2 °C en anderzijdswordt de warmtewisselaar 24 gevoed met water, waarbij toevoer 24a deomgevingstemperatuur heeft of iets hoger, te weten ongeveer 30 °C en bijafvoer 24b wordt water afgevoerd met een temperatuur die ongeveer 10 °Clager is, te weten ongeveer 20 °C. Gemiddeld gesproken zal het fibrinogeenbevattend plasma 3-4 keer de cyclus doorlopen en dan via leiding 31 wordenafgevoerd.

De vierde stap van de werkwijze heeft in principe plaats inde centrifuge 34. Hiertoe wordt het uit de derde stap verkregenfibrinogeen bevattend plasma met een temperatuur van ongeveer 0 °C, bijvoorkeur enigszins beneden 0 °C als vloeistof met hierin aanwezig vastfibrinogeen toegevoerd via leiding 31 aan opvangvat 32 voorzien vanroerder 37, zodat een via klep 38 regelbare hoeveelheid via leiding 41 enpomp 33 via leiding 42 wordt toegevoerd aan centrifuge 34. Uit decentrifuge wordt enerzijds resterend plasma afgevoerd en anderzijds wordtaan opslagvat 35, voorzien van roerder 47 het fibrinogeenconcentraattoegevoerd dat in opvangvat 35 wordt gehomogeniseerd en via leiding 45,regelklep 36 en leiding 46 wordt afgevoerd en verpakt en ingevroren om teworden bewaard tot gebruik. Desgewenst kan uit het concentraatpoedervormig fibrinogeen worden gewonnen.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I.

Onder toepassing van de apparatuur zoals weergegeven infig. 1 werd bloed, verkregen uit runderen, gescheiden in ingedikt bloed enplasma, waarbij het bloed eerst werd afgekoeld tot een temperatuur van4 °C en daarna had de scheiding plaats met behulp van een centrifuge,zodat plasma werd verkregen met een pH van 7,7 en ingedikt bloed dat werdafgevoerd. Met behulp van 30%-ige NaOH werd het plasma gebracht op een pHvan 8,5 en bij een temperatuur van 4 °C toegevoerd aan platenvriezer 12waarin het plasma werd afgekoeld tot -20 °C. De aldus verkregen ingevrorenblokken plasma werden in schijven gesneden met afmetingen van 9 x 20 cm enmet een dikte van 8 mm.

Deze schijven werden geconditioneerd in een conditioneercel15 gedurende 24 uren bij -2 °C. Vervolgens werden de geconditioneerdeschijven bij een temperatuur van -2 °C toegevoerd aan een installatie voorhet verkleinen van de schijven waartoe een "Wolf" werd gebruikt. De afvoeruit de "Wolf" 21 bedroeg 800 kg/uur fijngemaakt fibrinogeen bevattendplasma met een temperatuur van -2 °C. Dit fijngemaakte materiaal werdtoegevoerd aan een circulatievat 22, waarin het werd gemengd met 2200kg/uur uit warmtewisselaar 24 verkregen gerecirculeerd materiaal met eentemperatuur van 0 °C. Zodoende werd uit het circulatievat 22, 3000 kg/uurfibrinogeen bevattend plasma afgevoerd met een temperatuur van -1 °C. Dewarmtewisselaar 24 werd als verwarmend medium gevoed met 6500 kg/uur watermet een temperatuur van 30 °C, terwijl eenzelfde hoeveelheid water werdafgevoerd via leiding 24b met een temperatuur van 20 °C.

Via leiding 31 werd 800 kg/uur fibrinogeen bevattend plasmamet een temperatuur van 0 °C toegevoerd aan opvangvat 32 en met behulp vanpomp 33 toegevoerd aan centrifuge 34 waaruit 70 kg/uur fibrinogeenc-oncentraat werd verkregen dat werd toegevoerd aan opslagvat 35 en ander¬zijds werd 730 kg/uur resterend plasma uit de centrifuge verwijderd vialeiding 44. Uit opslagvat 35 werd het gewenste eindprodukt, te wetenfibrinogeenconcentraat afgevoerd via leiding 46 en tot slot ingevroren enverpakt.

Het rendement voor het winnen van fibrinogeen was bij dezeuitvoeringsvorm 73,6%.

Voorbeelden II-V.

De werkwijze volgens de voorbeelden II-V werden op dezelfdewijze uitgevoerd als aangegeven in voorbeeld I, waarbij echter in devoorbeelden II en III het conditioneren werd uitgevoerd bij -2 °Cgedurende een tijdsduur van respectievelijk 2 uur en 30 minuten. Hetrendement was dan respectievelijk 50,2% en 16,6%.

In voorbeeld IV werd de conditioneert!jd geminimaliseerd,hetgeen inhoudt dat de temperatuur van het fibrinogeen bevattend plasmawerd verhoogd van -20 °C tot -2 °C en zodra deze temperatuur was bereiktwerd het materiaal verkleind. Bij een conditioneert!jd van 0 uur was hetrendement 10,8%.

In vergelijkend voorbeeld V werd het conditionerenuitgevoerd bij -10 °C gedurende 18 uren en daarbij was het rendement 5,1%.

Uit deze gegevens blijkt dat het conditioneren gedurende 24uren bij -2 °C een aanzienlijke verhoging van het rendement geeft tenopzichte van het achterwege laten van het conditioneren omdat hetrendement wordt verhoogd van 10,8% tot 73,6%.

Conditioneren bij -10 °C leidt niet tot enig resultaat,zelfs niet indien dit gedurende 18 uren plaatsheeft. Uit verdere proevenis gebleken dat conditioneren bij een temperatuur tussen -2 °C en -5 °Cvergelijkbare resultaten geeft.

Claims (11)

1. Werkwijze voor het bereiden van fibrinogeenconcentraat uitbloedplasma door het bloedplasma af te koelen van een temperatuur boven0 °C tot een eerste temperatuur liggend tussen -10 °C en -40 °C, het aldusverkregen vaste materiaal vervolgens te ontdooien tot nabij het vriespuntvan water en het daarna fysisch scheiden van de vaste stof van devloeibare hoofdfraktie van het plasma, te weten water, met het kenmerk,dat het ontdooien stapsgewijs plaatsheeft van de eerste temperatuur toteen conditioneertemperatuur tussen -5 °C en -1 °C waarna het vastemateriaal wordt verkleind en het verkleinde materiaal op een temperatuurwordt gebracht waarbij de hoofdfraktie van het plasma, te weten water,vloeibaar wordt en de oplosbaarheid van fibrinogeen in de vloeistof zolaag mogelijk is, waarna vloeistof wordt afgescheiden van het fibrinogeen¬concentraat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat na hetconditioneren de temperatuur wordt verhoogd tot een waarde tussen -2 °C en0 °C door het verkleinde materiaal te roeren en te mengen in eenreciroulatiesysteem, waarbij de gewichtsverhouding vers materiaal totgerecirculeerd materiaal 1:1,5-5 bedraagt, waarbij in het recirculatie-systeem een warmtewisselaar is opgenomen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het conditioneren plaatsheeft bij een temperatuur tussen -5 °C en -2 °Cgedurende 0,5-48 uren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het conditioneren plaatsheeft gedurende 2-24 uren.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-4, met het kenmerk, dat hetconditioneren plaatsheeft bij een temperatuur tussen -3 °C en -1,5 °C.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat na hetconditioneren en verkleinen van het vaste fibrinogeenbevattende materiaalde recirculatie onder verwarmen plaatsheeft in een warmtewisselaar tot eenafvoertemperatuur tussen -0,5 °C en 0 °C.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de recirculatieverhouding 1 deel geconditioneerd (vers) materiaal is op 2-4delen gerecirculeerd materiaal.

8. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het verwarmen plaatsheeft in een warmtewisselaar tegen water met omgevings¬temperatuur.

9. Werkwijze volgens conclusies 1-8, met het kenmerk, datfibrinogeenconcentraat wordt afgescheiden uit het geconditioneerdefibrinogeen bevattende materiaal bij een temperatuur van 0 °C door centri¬fugeren.

10. Werkwijze voor het bereiden van fibrinogeen uit een waterbevattend fibrinogeenconcentraat door water uit het concentraat teverwijderen en vast fibrinogeen te winnen, met het kenmerk, dat eenfibrinogeenconcentraat wordt gebruikt zoals bereid volgens de werkwijzevan conclusies 1-9. Π. Inrichting voor het uitvoeren van een werkwijze volgensconclusie 1, bestaande uit een toevoer aan een verkleiner van vastmateriaal, een afscheider voor fibrinogeenconcentraat, met het kenmerk,dat voor de verkleiner conditioneerapparatuur is opgesteld.

12. Inrichting volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat deinrichting overeenkomt met de achtereenvolgende onderdelen zoalsweergegeven in de tekening.