RU2663132C1 - Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты - Google Patents
Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663132C1 RU2663132C1 RU2017103244A RU2017103244A RU2663132C1 RU 2663132 C1 RU2663132 C1 RU 2663132C1 RU 2017103244 A RU2017103244 A RU 2017103244A RU 2017103244 A RU2017103244 A RU 2017103244A RU 2663132 C1 RU2663132 C1 RU 2663132C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- molecular weight
- temperature
- homogenate
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims abstract description 3
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 claims abstract 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 32
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 32
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims description 16
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 16
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims description 16
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 claims description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 140
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 16
- 230000000215 hyperchromic effect Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 5
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 3
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108091023046 Deoxyribonucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения. Осуществляют разрушение клеточных мембран и белков чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов. Заморозку осуществляют при температуре от -40 до -50°С, а последующую разморозку при температуре от 20 до 40°С. Циклы заморозки и разморозки повторяют 3-5 раз. Гомогенат подвергают автолизу при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов до образования однородной вязкой массы серого цвета. Осуществляют протеолиз остаточных белков и их фрагментов обработкой автолизата до его растворения комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз с рабочим температурным режимом от 40 до 60°С. После депротеинизации отделяют агрегаты ДНК с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, такого как полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамер с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа в концентрации не выше 30 мас.%, в присутствии хлорида натрия до концентрации, не превышающей 10 мас.%. Однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 мин, позволяющем получить фрагменты ДНК длиной не более 700 п.н.о. Способ обеспечивает выход ДНК из сырья более 80% от исходного, получение фрагментов ДНК длиной 200-700 п.н.о., уменьшение количества примесей в целевом продукте до 0,1% и менее. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 11 пр.
Description
Изобретение относится к биохимии, биотехнологии и может найти применение в медицине, фармацевтической, пищевой и косметической промышленности, микробиологии, сельскохозяйственном производстве.
В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные широко используются как в составе биологически активных добавок к пище (БАД) в качестве источника нуклеотидов для синтеза дезоксирибонуклеиновых кислот в организме, так и в составе лекарственных средств (патент RU 2106149, A61K 31/70, опубл. 10.03.1998; авторское свидетельство СССР 1804852, A61K 35/60, 1987; патент RU 2034028, МПК C12N 9/64, опубл. 30.04.1995).
Молоки рыб, получаемые при переработке рыбы, являются продуктом питания. В то же время благодаря высокому содержанию ДНК молоки уже давно и успешно используются в качестве дешевого и доступного исходного сырья для лекарственных препаратов и продуктов здорового питания (патент GB 808296, МПК С07С, опубл. 04.02.1959; патент DE 1142362, МПК C12N 15/10, опубл. 17.01.1963; патент GB 1233540, МПК C07H 14/47, опубл. 26.05.1971; патент US 3899481, МПК A61K 31/70, опубл. 12.08.1975; патент SU 652187, МПК С07Н 21/04, опубл. 15.03.1979; патент RU 2036652, МПК А61К 35/60, опубл. 09.06.1995; патент RU 2091073, МПК A61K 35/60, опубл. 20.10.1996). При этом несомненными преимуществами молок рыб являются более высокое содержание ДНК по сравнению с другими источниками и относительно низкое содержание примесей, а также дешевизна и доступность молок.
Известные способы крупномасштабной промышленной переработки молок рыб позволяют быстро перерабатывать большие объемы сырья (патент JP S552634, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980; патент JPS 554308, МПК С07Н 01/08, опубл. 12.01.1980; патент CN 103865919, МПК C12N 15/10, опубл. 18.06.2014), иногда даже без предварительного измельчения исходного материала (патент JPS 552635, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.01.1980), и получать при этом препараты высокомолекулярной ДНК, не отличающиеся высокой чистотой, которые, тем не менее, могут быть использованы в виде биологически активных пищевых добавок и в косметических препаратах.
Однако для получения медицинских препаратов необходима тщательная очистка ДНК от белков, жиров и полисахаридов, содержащихся в молоках. Этого можно добиться обработкой молок детергентами (патент RU 2108797, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 20.04.1998) либо ферментами, способными разрушать примесные макромолекулы до легко выводимых из процесса получения ДНК мономеров, при этом могут использоваться как экзоферменты (патент SU 780444, МПК С07Н 21/04, опубл. 23.04.1985; патент RU 2072855, МПК A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 10.02.1997; патент RU 2488634, МПК С12Р 19/34, С07Н 21/04, опубл. 27.07.2013), так и собственные лизосомальные ферменты, содержащиеся в клетках молок (патент RU 2055482, МПК A23J 3/04, A23J 3/00, A23J 3/34, A61K 35/60, опубл. 10.03.1996). Такой подход позволяет добиться большой чистоты выделяемой ДНК, но не обеспечивает ее расщепление на низкомолекулярные фрагменты, потенциально обладающие биологической активностью. Для получения низкомолекулярной ДНК необходимо проводить ее контролируемое фрагментирование, например, при помощи ультразвука (патент RU 2039564, МПК A61K 35/56, С07Н 21/04, опубл. 20.07.1995, патент ЕР 2289903, МПК С07Н 1/08, опубл. 02.03.2011).
Важным моментом при получении низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты является не только очистка полупродуктов от белковых примесей (патент RU 2268730, МПК A61K 31/70, A61K 35/60, С07Н 21/04, опубл. 27.01.2006), но и способы выделения конечного продукта. Обычно для этого используют сорбенты и иные белок-связывающие компоненты, фильтрацию и диафильтрацию на полых волокнах с последующим осаждением и переосаждением полученного продукта органическими растворителями (патент RU 2005724, МПК С07Н 21/04, опубл. 15.01.1994; патент RU 2034554, МПК A61K 35/60, опубл. 10.05.1995; патент RU 2055837, МПК С07Н 21/04, опубл. 10.03.1996; патент RU 2172632, МПК A61K 5/60, опубл. 27.08.2001; заявка JP 2005245394, МПК C12N 15/09, опубл. 15.09.2005).
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб (патент RU 2041885, МПК С07Н 21/04, C12N 15/10, опубл. 20.08.1995), который включает гомогенизацию сырья, обработку реакционной массы детергентом и концентрированным раствором соли при повышенной температуре, охлаждение, отделение белка и детергента фильтрованием и осаждение ДНК спиртом, при этом после обработки реакционной массы детергентом и солевым раствором проводят первую обработку ультразвуком с использованием типового комплекта озвучивающего оборудования в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой 600-1500 кДа, фильтрат после отделения белка и детергента концентрируют с помощью ультрафильтрационного модуля при давлении 0,1-0,8 атм, подвергают диафильтрации и второй обработке ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой 250-600 кДа, а полученный осадок ДНК сушат до постоянной массы. Таким образом, получают порошок с содержанием ДНК 78-95%, гиперхромным эффектом 40-50% и молекулярной массой ДНК 250-600 кДа, с выходом 56-60% от количества ДНК, содержащегося в молоках, и концентрацией примесного белка 0,30-0,60%.
Недостатки данного способа заключаются в следующем:
- в низком выходе ДНК (не более 60% от содержания ДНК в молоках), обусловленном большими потерями ДНК в процессе выделения, главным образом при очистке от белковых примесей на сорбенте;
- в использовании больших объемов легковоспламеняющихся и токсичных растворителей и больших количеств солей, что затрудняет процесс масштабирования при производстве продукта и делает сам процесс небезопасным;
- в достижении нужной длины молекул ДНК только при условии двустадийной ультразвуковой обработки с большой длительностью воздействия ультразвуком;
- в заниженной биологической активности получаемой ДНК, поскольку молекулы ДНК с молекулярной массой выше 450 кДа обладают более низкой проникающей способностью через мембраны клетки и более высокой способностью подвергаться гидролизу крупнощепящими дезоксирибонуклеазами, чем молекулы ДНК меньших молекулярных масс (Шабаева Ю.Д., Филимонова М.Н. Сравнительный анализ субстратов в отношении активности эндонуклеазы бактерий Seratia marcescens.Учебные записки Казанского Государственного университета. Сер. Естественные науки. - 2005. - Т. 147. Кн. 2. - С. 206-212; Черепанова А.В., Тамкович С.Н., Власов В.В. и др. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии. Биомед. химия. - 2007. - Т. 93, №5. - С. 488-496).
Раскрытие сущности изобретения
Сущность заявляемого способа получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения заключается в том, что разрушение клеточных мембран осуществляют чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената сырья в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов; гомогенат подвергают автолизу до образования однородной вязкой массы серого цвета - в условиях активности комплекса эндогенных ферментов и длительности автолиза, достаточной для максимально полного разрушения макромолекул углеводов, жиров, липидов и белков до их моно- и олигомеров; протеолиз остаточных белков и их фрагментов осуществляют обработкой автолизата ферментным препаратом с высокоактивным комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз до растворения автолизата; после депротеинизации отделяют агрегаты ДНК, получаемые с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, после чего однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком в режиме, позволяющем получать фрагменты ДНК длиной не более 700 пар нуклеотидных остатков (п.н.о.).
В качестве сырья для получения низкомолекулярной ДНК используют молоки рыб, а также могут быть использованы гонады кальмаров, тимус теленка, селезенка свиньи, сперма петуха, семенники рогатого скота.
Осуществляют несколько циклов заморозки и последующей разморозки гомогената сырья до максимально полного разрушения мембран клеток. В ходе многократного повторения заморозки и разморозки происходит разрушение стенок клеток гомогената сырья, а также иных мембран клеток, что подтверждается световой микроскопией, показывающей ничтожно малое содержание целых клеток в гомогенате (не более 10 целых на 1000 фрагментированных) (Данилин Н.Ф. Методические рекомендации по молекулярно-генетическим основам микробиологии. - Ленинград, 1982. - 416 с.).
Экспериментально установлено, что для разрушения мембран клеток используемого для выделения ДНК из сырья, достаточно 3-5 циклов заморозки до температуры от (-40) до (-50)°С и разморозки при температуре от 20 до 40°С. Критерием максимально полного разрушения клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов является полнота протекания последующей стадии автолиза. Полнота протекания процесса автолиза контролируется по уменьшению длины молекулы ДНК до 20000 п.н.о., определяемой методом электрофореза в агарозном геле после выделения ДНК фенольным методом (ссылки в примерах).
Индуцированный последовательными процессами заморозки и разморозки автолиз клеток продолжают путем инкубирования гомогената при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов. Автолиз может осуществляться без контроля рН.
Длительность автолиза определяется экспериментально. Гомогенат после автолиза должен стать полностью однородным, без видимого наличия посторонних включений, вязким за счет равномерного распределения внутриклеточной жидкости (цитозоля) по всему объему автолизата и частичного испарения воды. Он теряет красную, кремовую или белую окраску с красными включениями и приобретает серый цвет. Выделенная после автолиза ДНК имеет длину, не превышающую 20000 п.н.о.
Далее процессы ферментативного гидролиза остаточного белка в автолизате продолжают с помощью внеклеточных ферментов (экзоферментов) протеолитического действия. В качестве источника экзоферментов используют ферментный препарат с высокоактивным комплексом нейтральных и щелочных экзопротеаз и рабочим температурным режимом от 40 до 60°С, например, разрешенный для использования в пищевой промышленности ферментный препарат «Алкалаза 2,4 LFG».
Автолизат полностью растворяется при добавлении протеаз не более чем за 6 часов с образованием прозрачной темноокрашенной жидкости красноватых тонов.
Инактивируют экзоферменты термической денатурацией и удаляют образовавшиеся агрегаты денатурированных белков-экзоферментов. Перед фрагментацией ДНК ее осаждают с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, в качестве которого могут быть использованы полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамеры с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа с различным соотношением полиэтиленоксидных и полипропиленоксидных звеньев.
При использовании полиэтиленгликоля для осаждения ДНК в очищенный от белковых примесей раствор ДНК добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас. %, после чего добавляют полиэтиленгликоль до концентрации не выше 30 мас. %; смесь выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов и образовавшуюся взвесь, содержащую ДНК, отделяют центрифугированием.
Полученный осадок ДНК растворяют в воде до кинематической вязкости не выше 65 мм2/с. Полученный раствор подвергают воздействию ультразвука, при этом частота ультразвука для фрагментирования ДНК подобрана таким образом, чтобы за 9 минут воздействия вся ДНК, находящаяся в растворе в объеме ультразвуковой камеры, фрагментировалась до фрагментов, не превышающих 700 п.н.о.
Далее проводят концентрирование и очистку низкомолекулярной ДНК методом диафильтрации, выделяют целевой продукт с длиной цепи ДНК от 200 до 700 п.н.о.
Описание чертежей
На фиг. 1 показана схема получения низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты по заявляемому способу.
Осуществление изобретения
Сырье животного происхождения для получения ДНК, например молоки рыб, тщательно моют и очищают от пленок, жира и иных посторонних включений, после чего подготовленное сырье подвергают тщательному измельчению с гомогенизацией. Для разрушения клеточных мембран гомогенат фасуют в полиэтиленовые пакеты и несколько раз последовательно замораживают при температуре от (-40) до (-50)°С и размораживают при температуре от 20 до 40°С.
Автолиз гомогената молок рыб посредством действия комплекса собственных лизосомальных ферментов проводят инкубированием гомогената в воздушном термостате при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов.
В процессе автолиза часть белков гидролизуется до свободных аминокислот и пептидов под действием лизосомальных протеаз и пептидаз, а дезоксирибонуклеиновая кислота за счет вхождения в дезоксирибонуклеопротеидный комплекс с гистоновыми белками подвергается гидролизу в незначительной степени.
Стадия автолиза может проводиться без контроля рН, поскольку оптимальная рН поддерживается за счет буферных жидкостей цитозоля самих разрушенных клеток гомогената.
Затем осуществляют гидролиз полученной смеси протеолитическими экзоферментами. В качестве источника экзоферментов используют комплексный препарат протеолитического действия, например «Алкалаза 2,4 L FG» (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), разрешенный для использования в пищевой промышленности.
К автолизату добавляют водный раствор гидрокарбоната натрия с концентрацией 0,5-2,0 мас. % в массовом соотношении автолизат:раствор гидрокарбоната натрия 1:(1,8-2,2), доводя рН до значений 6,0-9,0, после чего нагревают полученную смесь до температуры от 40 до 60°С, добавляют препарат «Алкалаза 2,4 L FG» в количестве от 0,5 до 4,0 мас. % от массы автолизата до добавления раствора гидрокарбоната натрия и выдерживают полученную смесь при температуре от 40 до 60°С в течение 1-6 часов при постоянном перемешивании до полного растворения гомогената с образованием прозрачной темноокрашенной жидкости красноватых тонов.
Затем реакционную смесь нагревают до температуры от 70 до 90°С и выдерживают в течение 1-2 часов для инактивации экзоферментов и их агрегации. Далее смесь охлаждают до температуры от 5 до 15°С и отделяют образовавшиеся агрегированные молекулы ферментов любым доступным способом, например фильтрацией или центрифугированием.
После удаления внесенных на стадии протеолиза белков-ферментов из полученного раствора осаждают ДНК, для чего в раствор добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас. %, что приводит к снижению подвижности молекул ДНК за счет увеличения ионной силы раствора. Далее в полученный раствор ДНК добавляют нейтральный инертный органический высокомолекулярный осадитель, например полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа в концентрации не выше 30 мас. %, и выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов для формирования агрегатов, после чего образовавшуюся взвесь отделяют центрифугированием или фильтрацией. В результате получают осадок с содержанием ДНК не ниже 80 мас. % (в пересчете на сухой остаток). Содержание ДНК определяют спектрофотометрическим методом.
Далее проводят ультразвуковое фрагментирование полученной ДНК. Для этого готовят водный раствор ДНК с вязкостью от 40 до 65 мм2/с, который в проточном или в стационарном режиме однократно обрабатывают ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение молекул ДНК размером от 200 до 700 п.н.о., например обрабатывают ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 минут. Длину молекул определяют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.
После этого полученный раствор низмолекулярной ДНК подвергают концентрированию и очистке методом диафильтрации через фильтры с размером пор 100 кДа, при этом получают продукт с содержанием низкомолекулярной ДНК не ниже 95%. Содержание ДНК в продукте определяют спектрофотометрическим методом. В целях дальнейшего хранения полученную низкомолекулярную ДНК подвергают лиофильному высушиванию и хранят при температуре не выше 30°С в плотно закрытой упаковке (предпочтительно при 10°С).
Полученный продукт пригоден для использования без дополнительной обработки как в качестве источника нуклеотидов с высокой биодоступностью для организма в лекарственных средствах и биологически активных добавках к пище, так и в качестве реагента, содержащего фрагменты ДНК определенной длины высокой степени чистоты для различных областей биохимии и биотехнологии. Низкое содержание белка в получаемом продукте (0,069-0,100%) делает также возможным его использование при разработке инъекционных препаратов.
Отличия заявляемого способа от прототипа, технические результаты предлагаемого способа заключаются в следующем:
- на начальном этапе очистки проводится разрушение клеток сырья животного происхождения, в частности молок, посредством чередования процессов заморозки и разморозки гомогената, что приводит к разрушению клеточных мембран и активации процессов лизиса макромолекул клетки лизосомальными ферментами и делает возможным проведение двустадийной ферментной очистки продукта,
- автолиз молок эндогенными, содержащимися в клетках молок лизосомальными ферментами приводит к тому, что возрастает чистота получаемого продукта за счет гидролиза внутриклеточных макромолекул (белков, липидов, жиров и углеводов) до моно- и олигомеров. Кроме того, происходит дополнительное уменьшение длины цепи молекулы ДНК, что облегчает дальнейший процесс ее фрагментирования;
- стадия автолиза может проводиться без контроля рН, поскольку оптимальная рН поддерживается за счет буферных жидкостей цитозоля самих разрушенных клеток гомогената;
- на стадии протеолиза может использоваться высокоактивный протеолитический комплекс "Алкалаза 2,4 LFG", разрешенный для использования в пищевой промышленности, что облегчает использование конечного продукта в медицинских целях. При этом достигается практически полный гидролиз белка до коротких пептидов и аминокислот, а белки самого ферментного комплекса денатурируют с образованием легко удаляемого осадка;
- использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля позволяет не только достичь практически полной агрегации молекул ДНК (не ниже 90% от содержания ДНК в растворе), но и исключить использование в процессе выделения легковоспламеняющихся и токсичных жидкостей, что делает процесс производства более безопасным, увеличивает выход целевого продукта и уменьшает его себестоимость;
- содержание белковых примесей в конечном продукте снижается до 0,1 мас. % и менее (как показано в нижеприведенных примерах - до 0,069-0,100%) против 0,3-0,6% в прототипе, что делает возможным дальнейшую разработку инъекционных препаратов на его основе;
- получаемая по заявляемому способу ДНК имеет диапазон длин фрагментов от 200 до 700 п.н.о., что соответствует молекулярной массе от 130 до 455 кДа (в прототипе 250-600 кДа), и обладает более высокой способностью проникать через клеточные барьеры и в то же время в меньшей степени подвергаться гидролизу ферментами нуклеазного действия, что важно при применении в качестве медицинского средства (Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана. Вопр. онкол. - 2006. - Т. 52., №3. - С. 336-340; Patil S.D., Rhodes D.G. and Burgess D.J. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: a comprehensive review. AAPS. J. - 2005. - V. 7, №1. - P. E61-E77);
- гиперхромный эффект получаемой низкомолекулярной ДНК - не ниже 42% (как показано в нижеприведенных примерах - от 42 до 48%);
- предлагаемый способ является более эффективным: выход готового продукта составляет в предлагаемом способе не менее 80% (как показано в нижеприведенных примерах - от 81,05 до 85,00%) от исходного содержания ДНК в сырье (в прототипе - 56-60%).
Ниже приведены примеры осуществления способа.
Пример 1. 10 кг молок рыб с содержанием ДНК 7% (определялось фенольным методом по руководству В.А. Беликова «Молекулярная биология. Практическое руководство». Саратов: Издательство «Саратовский источник» - 2013. - 84 с.) очищали от пленок, посторонних включений, жира, промывали и измельчали с гомогенизацией на гомогенизаторе шнеково-ножевого типа, фасовали в полиэтиленовые пакеты по 0,5 кг и замораживали в морозильной камере при температуре (-40)°С, затем размораживали в водяном термостате при 37°С в течение 1-2 часов. Операцию заморозки-разморозки повторяли трижды. После третьей разморозки гомогенат молок распределяли в поддоне на марлевой ткани плотным слоем высотой в 25 см и инкубировали в воздушном термостате при 20°С в течение 24 ч.
Протеолиз полученного автолизата проводили следующим образом: автолизат помещали в ферментер, добавляли водный раствор гидрокарбоната натрия с концентрацией соли 2,0 мас. % в массовом соотношении автолизат: раствор гидрокарбоната натрия 1:(1,8-2,2), смесь нагревали до 55°С при постоянном перемешивании и добавляли 200 г ферментного препарата "Алкалаза 2,4 LFG". Реакционную смесь выдерживали при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 1 ч, далее ее нагревали до 90°С и снова выдерживали в течение часа при постоянном перемешивании. Полученный гидролизат представлял собой темноокрашенную прозрачную жидкость красноватых тонов. Его охлаждали до 15°С, после чего подвергали центрифугированию при 6000 об/мин в течение 15 мин для отделения образовавшихся белковых агрегатов.
Масса полученного супернатанта составила 28 кг. К полученному супернатанту добавляли 2,8 кг хлорида натрия (10 мас. % к массе супернатанта) и 6,75 кг полиэтиленгликоля ПЭГ-6000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия) (24 мас. % к массе супернатанта) и перемешивали в течение 30 мин, после чего смесь разливали в полиэтиленовые емкости объемом 6 л и выдерживали при температуре от 5 до 15°С в течение 8 ч.
Образовавшийся осадок ДНК отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин, ДНК растворяли в очищенной воде с контролем вязкости до кинематической вязкости 65 мм2/с и с помощью перистальтического насоса подавали в ультразвуковую камеру проточной ультразвуковой установки «Волна-М». Фрагментирование ДНК проводилось в течение 7 мин при частоте ультразвука 100 кГц. Для итоговой очистки и концентрации полученный раствор ДНК подвергали процессу диафильтрации: раствор с помощью центробежного насоса пропускали через ультрафильтрационную установку УПВ-6 с размером пор картриджа 100 кДа, при этом концентрировали раствор в 10 раз, далее концентрат разбавляли очищенной водой в 10 раз и вновь концентрировали в 10 раз. Процедуру разбавления и концентрирования раствора повторяли дважды. Полученный концентрированный раствор, содержащий конечный продукт, подвергали лиофильной сушке.
Выход ДНК рассчитывали по поглощению при 260 нм, используя коэффициент пересчета 1 о.е.=40 мкг. Содержание ДНК в конечном продукте определяли спектрофотометрически, анализируя соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм (Маниатис Т. Молекулярное клонирование. - М.: "Мир", 1984. - 480 с.). Содержание белка определяли по стандартному методу Бредфорда, используя в качестве стандарта раствор человеческого сывороточного альбумина (Bradford М.М. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 1976, V. 72, p. 248-254). Молекулярную массу ДНК определяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле (Maniatis Т., Jeffrey A. and deSande H.V. Chain length determination of small double-andsingle-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 1975, V. 14, P. 3787-3794). Гиперхромный эффект ДНК определяли, сравнивая оптическую плотность при 260 нм раствора ДНК до и после гидролиза 5% хлорной кислотой при 100°С в течение 20 мин (Лазуркин Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - М.: Наука, 1967. - 342 с.). Обработку результатов анализа продукта проводили путем получения среднего арифметического результата из пяти параллельных определений.
Выход ДНК составил 82,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,12%, содержание белка - 0,100%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.
Пример 2. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом автолиз подвергнутого замораживаниям и размораживаниям гомогената молок проводили при 40°С в течение 8 ч. Выход ДНК составил 81,05% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,17%, содержание белка - 0,050%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 42%, что соответствует заявленному результату.
Пример 3. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом протеолиз автолизата проводили при 40°С в течение 6 ч.
Выход ДНК составил 83,0% от количества исходной. ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 97,30%, содержание белка - 0,076%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.
Пример 4. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 9 кг (30 мас. %) ПЭГ-1000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).
Выход ДНК составил 82,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,10%, содержание белка - 0,091%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.
Пример 5. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение высокомолекулярной ДНК из супернатанта проводили путем добавления к супернатанту 8,85 кг (29,5% к массе супернатанта) ПЭГ-1500 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).
Выход ДНК составил 84,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,13%, содержание белка - 0,094%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 48%, что соответствует заявленному результату.
Пример 6. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осаждение ДНК осуществляли путем добавления в супернатанту 4,5 кг (15 мас %) ПЭГ-15000 ("Завод Синтанолов", Нижний Новгород, Россия).
Выход ДНК составил 83,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,07%, содержание белка - 0,085%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.
Пример 7. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что для получения осадка высокомолекулярной ДНК смесь, содержащую высокомолекулярную ДНК, гидрокарбонат натрия, хлористый натрий и ПЭГ-6000, выдерживали при температуре 5°С в течение 24 часов.
Выход ДНК составил 84,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 96,30%, содержание белка - 0,090%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.
Пример 8. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осадок высокомолекулярной ДНК растворяли в очищенной воде до кинематической вязкости 40 мм2/с, а фрагментирование молекул ДНК проводили в течение 7 мин при частоте ультразвука 70 кГц.
Выход ДНК составил 82,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 97,00%, содержание белка - 0,069%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 46%, что соответствует заявленному результату.
Пример 9. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, за исключением того, что осадок высокомолекулярной ДНК растворяли в очищенной воде до кинематической вязкости 65 мм2/с, а фрагментирование молекул ДНК проводили в течение 9 мин при частоте ультразвука 100 кГц.
Выход ДНК составил 85,0% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,11%, содержание белка - 0,082%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 44%, что соответствует заявленному результату.
Пример 10. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 8,4 кг (28 мас. %) блок-сополимера Pluronic РЕ 3100 с молекулярной массой полипропиленового блока 950 г/моль и с содержанием полиэтиленгликолевого блока 50 мас. % (производства ООО "БАСФ" (Россия, Москва)).
Выход ДНК составил 83,5% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 95,70%, содержание белка - 0,084%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 47%, что соответствует заявленному результату.
Пример 11. Получение низкомолекулярной ДНК высокой степени чистоты осуществляли так же, как в примере 1, при этом осаждение ДНК осуществляли путем добавления к супернатанту 5,85 кг (19,5 мас. %) блок-сополимера Pluronic РЕ 10500 с молекулярной массой полипропиленового блока 3 250 г/моль и с содержанием полиэтиленгликолевого блока 50 мас. % (производства ООО "БАСФ" (Россия, Москва)).
Выход ДНК составил 81,2% от количества исходной ДНК в молоках, содержание ДНК в конечном продукте - 96,40%, содержание белка - 0,061%, длина ДНК - от 200 до 700 п.н.о., гиперхромный эффект - 45%, что соответствует заявленному результату.
Claims (9)
1. Способ получения низкомолекулярной ДНК из сырья животного происхождения, включающий разрушение клеточных мембран и белков, осаждение ДНК, фрагментацию ДНК ультразвуком, отличающийся тем, что разрушение клеточных мембран осуществляют чередованием процессов заморозки и разморозки гомогената в режиме, обеспечивающем максимально полное разрушение клеточных мембран с сохранением активности внутриклеточных ферментов; гомогенат подвергают автолизу до образования однородной вязкой массы серого цвета; протеолиз остаточных белков и их фрагментов осуществляют обработкой автолизата до его растворения ферментным препаратом, представляющим собой комплекс нейтральных и щелочных экзопротеаз с рабочим температурным режимом от 40 до 60°С; после депротеинизации отделяют агрегаты ДНК, получаемые с помощью нейтрального инертного органического высокомолекулярного осадителя, такого как полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1 до 15 кДа или полоксамер с молекулярной массой от 0,9 до 12,5 кДа; после чего однократно фрагментируют ДНК путем ее обработки ультразвуком в режиме, позволяющем получить фрагменты ДНК длиной не более 700 п.н.о.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сырья для получения низкомолекулярной ДНК используют молоки рыб, гонады кальмаров, тимус теленка, селезенку свиньи, сперму петуха, семенники рогатого скота.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заморозку гомогената осуществляют при температуре от –40 до –50°С, а последующую разморозку - при температуре от 20 до 40°С.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что циклы заморозки и разморозки гомогената повторяют 3-5 раз.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения процесса автолиза гомогенат инкубируют при температуре от 20 до 40°С в течение 8-24 часов.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для ферментативного гидролиза автолизата его обрабатывают разрешенной для использования в пищевой промышленности «Алкалазой 2,4 L FG».
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что гидролиз автолизата «Алкалазой 2,4 L FG» осуществляют в солевом буферном растворе при рН 6,0-9,0 и температуре от 40 до 60°С в течение 1-6 часов.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, для осаждения ДНК в очищенный от белковых примесей раствор ДНК добавляют хлорид натрия до концентрации, не превышающей 10 мас.%, после чего добавляют полиэтиленгликоль до концентрации не выше 30 мас.%, смесь выдерживают при температуре от 5 до 15°С в течение 8-24 часов и образовавшуюся взвесь, содержащую высокомолекулярную ДНК, отделяют центрифугированием.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагментируют ДНК ультразвуком с частотой от 70 до 100 кГц в течение не более 9 минут.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103244A RU2663132C1 (ru) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103244A RU2663132C1 (ru) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2663132C1 true RU2663132C1 (ru) | 2018-08-01 |
Family
ID=63142480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103244A RU2663132C1 (ru) | 2017-01-31 | 2017-01-31 | Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2663132C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757686C1 (ru) * | 2020-11-03 | 2021-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ контролируемой фрагментации ДНК |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2041885C1 (ru) * | 1993-05-31 | 1995-08-20 | Научно-производственный центр "Фармзащита" МЗ РФ | Способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб |
| RU2055482C1 (ru) * | 1994-05-13 | 1996-03-10 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН | Способ получения белково-нуклеинового гидролизата |
| RU2072855C1 (ru) * | 1995-09-21 | 1997-02-10 | Ильнур Хамидович Урманов | Способ получения натриевой соли днк из молок рыб |
| RU2108797C1 (ru) * | 1994-11-09 | 1998-04-20 | Закрытое акционерное общество "Фаркавер" | Способ получения антивирусного препарата на основе днк |
| US20020182723A1 (en) * | 1998-12-01 | 2002-12-05 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
| RU2236853C1 (ru) * | 2003-12-30 | 2004-09-27 | Каплина Элли Николаевна | Способ производства иммунотропного стерильного апирогенного толерантного препарата на основе натриевой соли низкомолекулярной нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты |
| EP2289903A2 (en) * | 2009-06-24 | 2011-03-02 | Cesare Merighi | Method and device for the preparation of the sodium salt of deoxyribonucleic acid and related product |
| RU2488634C1 (ru) * | 2012-01-20 | 2013-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН | Способ получения днк из молок лососевых рыб |
-
2017
- 2017-01-31 RU RU2017103244A patent/RU2663132C1/ru active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2041885C1 (ru) * | 1993-05-31 | 1995-08-20 | Научно-производственный центр "Фармзащита" МЗ РФ | Способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб |
| RU2055482C1 (ru) * | 1994-05-13 | 1996-03-10 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН | Способ получения белково-нуклеинового гидролизата |
| RU2108797C1 (ru) * | 1994-11-09 | 1998-04-20 | Закрытое акционерное общество "Фаркавер" | Способ получения антивирусного препарата на основе днк |
| RU2072855C1 (ru) * | 1995-09-21 | 1997-02-10 | Ильнур Хамидович Урманов | Способ получения натриевой соли днк из молок рыб |
| US20020182723A1 (en) * | 1998-12-01 | 2002-12-05 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
| RU2236853C1 (ru) * | 2003-12-30 | 2004-09-27 | Каплина Элли Николаевна | Способ производства иммунотропного стерильного апирогенного толерантного препарата на основе натриевой соли низкомолекулярной нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты |
| EP2289903A2 (en) * | 2009-06-24 | 2011-03-02 | Cesare Merighi | Method and device for the preparation of the sodium salt of deoxyribonucleic acid and related product |
| RU2488634C1 (ru) * | 2012-01-20 | 2013-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН | Способ получения днк из молок лососевых рыб |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757686C1 (ru) * | 2020-11-03 | 2021-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ контролируемой фрагментации ДНК |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vaes | The release of collagenase as an inactive proenzyme by bone explants in culture | |
| Ketnawa et al. | Enhanced recovery of alkaline protease from fish viscera by phase partitioning and its application | |
| EP0112849A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF CHYMOSINE. | |
| JP5946843B2 (ja) | 超音波によりコラーゲンを抽出する方法及びその装置 | |
| Selvakumar et al. | Enzymatic hydrolysis of bovine hide and recovery of collagen hydrolysate in aqueous two-phase systems | |
| US11702447B2 (en) | Methods for producing collagen | |
| WO1989010960A1 (en) | Method for modifying proteins, peptides and/or lipids by enzymes from euphauciaceae | |
| RU2663132C1 (ru) | Способ получения низкомолекулярной днк высокой степени чистоты | |
| KR20040077553A (ko) | 견 단백질로부터 세포 생육 펩티드의 추출과 이용 | |
| EP1036166A1 (en) | Procedure for extraction and use of hatching fluid from atlantic salmon | |
| WO1989001031A1 (en) | Method for the isolation of active enzyme(s) from krill tissue | |
| EA012972B1 (ru) | Трипептиды мар и itp или их соли, белковые гидролизаты и смеси, содержащие указанные трипептиды или их соли, для снижения кровяного давления | |
| RU2055482C1 (ru) | Способ получения белково-нуклеинового гидролизата | |
| RU2610669C1 (ru) | Способ получения протеолитического препарата для медицинского применения | |
| Bhagavan et al. | Properties of a deoxyribonucleoprotein complex derived from Bacillus subtilis | |
| RU2072855C1 (ru) | Способ получения натриевой соли днк из молок рыб | |
| RU2558256C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (дсРНК) ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae | |
| Asmi et al. | The potency of protein Hydrolysate from Epiphytic bacteria associated with brown algae Sargassum sp. as anticancer agents | |
| Piot et al. | Preparation of decolorized peptides from slaughter-house blood | |
| Medina et al. | Biochemical characterization of acid proteases from the stomach of palometa (Pygocentrus nattereri, Kner 1858) with potential industrial application | |
| JPH0461638B2 (ru) | ||
| RU2010855C1 (ru) | Способ получения пептона | |
| RU2679419C1 (ru) | Способ получения биологически активного концентрата из кожи маралов | |
| RU2663285C2 (ru) | Средство, обладающее гемостимулирующей активностью, и способ его получения | |
| Pa’ee et al. | Microalgae protein derived from Chlorella vulgaris using subcritical water treatment |