CN118317777A - 用于制备富含IL-1Ra的血浆的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

公开了用于使用玻璃珠或聚丙烯酰胺微珠制备富含白细胞介素受体1拮抗剂(“IL‑1Ra”)的血浆并且用过滤器回收富含IL‑1Ra的血浆的方法和设备。

Description

用于制备富含IL-1Ra的血浆的方法和设备
发明领域
本发明涉及用于使用玻璃珠或聚丙烯酰胺微珠制备富含白细胞介素受体1拮抗剂(“IL-1Ra”)的血浆的方法和设备。本发明的实施方案涉及富含IL-1Ra的富血小板的血浆(PRP)组合物的制备。
发明背景
本文的发明人的美国专利第9,962,480号和第10,617,812号包括涉及用于获得富含细胞的细胞样品诸如富血小板的血浆(PRP)的系统和方法的实施方案，包括使用密度分离介质在离心管中使用血液样品的离心分离，以及使用多种过滤系统分离细胞组分。这些专利的公开内容通过引用并入。
本文的发明人的美国专利第8,734,373号描述了用于制备PRP的装置和方法，包括使用适于紧密配合到试管中的细长的过滤器装置，以用于从血浆级分中分离细胞组分。本专利的公开内容也通过引用并入，因为它涉及适于插入到收集管中的过滤器。
同样是本文的发明人的美国专利第10,167,310号和第10,519,196号包括涉及用于获得白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)增强的血浆级分的系统和方法的实施方案。在实施方案中，所公开的方法涉及使血液收集管中的血液样品经历离心并孵育血浆级分以使该级分富含IL-1Ra。这些专利的公开内容同样通过引用并入。
在本领域中对于用于获得具有增强的IL-1Ra回收率的富含IL-1Ra的血浆样品的方法和装置，以及用于以较高的效率提供富含IL-1Ra的PRP的方法继续存在需求。
发明概述
本发明的一些方面涉及用于获得富含IL-1Ra的血浆样品的简单且有效的方法，以及涉及用于提供富含IL-1Ra的PRP的方法。
在一个方面中，本发明是一种制备富含IL-1Ra的血浆组合物的方法，该方法包括：将PRP级分收集在含有聚合物微珠的收集容器或收集管中；使聚合物微珠与PRP级分混合以形成微珠和PRP的均匀混合物；允许均匀混合物静置持续预定的时间段；使混合物通过过滤器(和/或使含有混合物的容器或管离心)以分离微珠以及血浆的细胞和/或细胞级分，并获得富含IL-1Ra的血浆组合物。
在实施方案中，IL-1Ra的回收率(定义为处理后最终产物中的IL-1Ra质量除以基线PRP中的IL-1Ra质量)在2.2倍至21倍的范围内，包括中间值，诸如大于5倍和大于10倍。随着浓度(皮克/ml)的增加，本发明的技术可以产生相对于基线2.8倍至25.8倍的浓度的增加。
在另一个方面中，本发明体现在制备富含IL-1Ra的血浆组合物的方法中，该方法包括：将全血样品收集在配备有玻璃珠的离心管中；使全血样品与珠的表面接触持续预定的时间段(例如，i)在30-40℃的温度持续4小时至24小时，或ii)在室温持续5分钟至1小时)；使全血样品离心以获得富含IL-1Ra的血浆；使富含IL-1Ra的血浆通过过滤器，以获得富含IL-1Ra的血浆组合物。
在实施方案中，使用玻璃珠的IL-1Ra的回收率(与基线相比)比在没有玻璃珠的情况下的回收率大1.2倍、1.3倍、1.4倍或更多倍。在实施方案中，玻璃珠可以与聚合物微珠组合使用，并且可以在具有或没有聚合物微珠的情况下与分离介质(诸如凝胶)组合使用。
附图简述
被视为本发明的主题被特别地指出并且在说明书的结论部分中被明确地要求保护。然而，当与附图一起阅读时，可以通过参考以下详细描述最好地理解本发明关于组织和操作方法两者以及其目的、特征和优点，在附图中：
图1描绘了根据本发明的实施方案的工艺顺序，其中通过在聚合物微珠上孵育PRP，随后用套筒式过滤器回收富含IL-1Ra的PRP来使PRP富含IL-1Ra。
图2描绘了根据本发明的实施方案的工艺顺序，其中全血与玻璃珠一起孵育，随后离心并回收富含IL-1Ra的血浆。
将理解，为了图示的简单和清楚，在附图中示出的要素不一定按比例绘制。例如，为了清楚，要素中的某些要素的尺寸可以相对于其他要素被放大。此外，在认为合适的情况下，参考数字可以在附图中被重复以指示对应的或类似的要素。
发明的实施方案详述
用于与本发明一起使用的容器或管可以是真空的或非真空的，由玻璃或塑料制成。在实施方案中，与本发明一起使用的收集管由耐用塑料制成，所述耐用塑料诸如聚丙烯酸酯(PA)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate glycol，PETG)或聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。在其他实施方案中，管或容器可以是玻璃或镀膜玻璃。
在实施方案中，容器或管被提供有密度在1.04g/ml-1.08g/ml的范围内，并且在实施方案中密度在1.073g/ml-1.078g/ml之间的分离介质，诸如凝胶。在实施方案中，抗凝血剂被提供在管或容器中，诸如肝素盐、柠檬酸盐/柠檬酸(例如柠檬酸钠/柠檬酸)、柠檬酸盐/柠檬酸-右旋糖(酸-柠檬酸盐-右旋糖ACD)、柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐、草酸盐以及草酸盐-氟化物盐。在实施方案中，容器或管不被提供有凝胶。在实施方案中，容器或管不被提供有抗凝血剂。
容器或管可以预先插入有具有高吸水率的玻璃珠和/或聚合物微珠，诸如聚丙烯酰胺(PAA)微珠。可选择地，可以使用通常用于孵育细胞样品的类型的玻璃珠。下文提供了两种系统的实例，根据工艺步骤的组合，有时具有令人惊讶地不同的结果。
上文的容器或管可以填充有10ml-100ml的全血，例如10ml-50ml的全血。可选择地，玻璃珠或聚合物微珠可以预先插入第二容器或管中，然后第二容器或管用于收集在单独的容器或管中产生的血浆或PRP级分。
在将抗凝血剂和玻璃珠预先插入到收集管中的情况下，该管可以孵育持续4-24小时或者在环境温度放置持续0至1小时，随后以1000g至3000g离心，例如以1500g离心，其中富含IL-1Ra的血浆级分可以通过套筒式过滤器如前述美国专利第10,519,196号中所描述地分离，或者直接转移至注射器或经由0.22-0.45微米的盘式过滤器转移至注射器，以将细胞和细胞残留物与微珠分离并且使得富含IL-1Ra的血浆能够储存在适当的温度，例如-5℃至-20℃，这允许储存和制备以供使用的IL-1Ra剂型。上文的过滤程序可以在第二次离心，例如以2000g-4000g离心持续5-10分钟之后进行，以沉积细胞、细胞级分和微珠。
在第一容器或收集管不被提供有玻璃珠或聚合物微珠的情况下，血液样品可以离心若干分钟，例如以1000g-3000g，例如以1500g离心5-15分钟，以获得分离的血浆，该分离的血浆具有较高级分的贫血小板的血浆(PPP)和较低级分(仍高于凝胶)的PRP，该PRP富含单核细胞和淋巴细胞，但红细胞和粒细胞大量减少，这是由于凝胶的充当分离器的特定性质。去除PPP，例如去除整个血浆体积的50％-75％，并且将细胞分散在剩余的血浆中以制备富含IL-1Ra的组合物。
PRP级分可以与玻璃珠和/或塑料微珠一起插入到第二收集管中。当第二管仅预先插入有玻璃珠时，孵育可以在例如37℃在具有或不具有5％ CO2的情况下进行持续1-24小时，例如8-16小时，并且富含IL1Ra的血浆经由例如具有0.22-0.45微米的孔径的盘式过滤器收集，以在处理时或在从处理时间起3-12个月之后，当储存在适当的温度，诸如-5℃至-20℃时，消除细胞并提供具有IL-1Ra的浓缩血浆。
当收集管仅预先插入有聚合物微珠或者聚合物微珠和玻璃珠时，富含IL-1Ra的血浆的收集可以立即进行或进行长达1小时，例如产品可以在15-30分钟之后经由具有0.22-40微米的孔径的套筒式过滤器和/或经由具有0.22微米至0.45微米的优选孔径的盘式过滤器抽出或者直接抽出到注射器。
在一种实施方案中，在不存在抗凝血剂的情况下将全血收集在含有密度分离凝胶和玻璃微珠的玻璃收集容器中，随后将PRP级分孵育持续30分钟至24小时。在孵育后，可以将混合物以900g至2500g离心以分离级分。为了收集IL-1Ra浓缩物，富含IL-1Ra的级分可以通过0.2微米至1.0微米的过滤器，该过滤器分离微珠、细胞和细胞级分。可选择地，可以将混合物以3000g-5000g离心以去除这些组分。所得到的富含IL-1Ra的血浆组合物可以用于向患者注射。
如果富含IL-1Ra的血浆储存在适当的温度，诸如在-5℃至-20℃之间，则富含IL-1Ra的血浆的注射可以在上文程序之后立即或者甚至在1-12个月之后进行。
在实施方案中，根据本文描述的方法制备的富含IL-1Ra的血浆产品可以有效地作为治疗，诸如通过注射，用于早期骨科病理状况和晚期骨科病理状况两者和/或减缓慢性骨科疾病的自然进展。富含IL-1Ra的血浆产品可能对具有早期症状的患者和具有家族史的寻求预防性疗法的患者有效。在实施方案中，该产品可以用作骨科外科手术中的预防性疗法或者用作损伤后的症状改善剂选项。注射间隔可以根据症状的严重程度和再现进行。
自体IL-1Ra疗法没有免疫应答，并提供了一种无需药物治疗的非外科手术、微创疗法。所获得的IL-1Ra相当浓缩(concentrate)并且基本上不受到红细胞和促炎白细胞的污染。
参考图1，管10可以提供有聚合物微珠12，并且PRP可以从注射器14提供到管10。PRP 20可以使用连接到注射器18的钝针或使用涡流装置22来混合。在步骤24，使混合物静置持续约15分钟。此后，套筒式过滤器26可以朝向管的底部插入，以收集富含IL-1Ra的血浆，该富含IL-1Ra的血浆可以使用注射器30抽出，以直接用于受试者。
参考图2，在另一种实施方案中，玻璃管或塑料管40可以提供有玻璃微珠或聚合物微珠42和分离凝胶43。可以在步骤44添加全血，并且在步骤46，可以将管孵育持续4-24小时或在环境条件中静置持续长达1小时。孵育后可以进行离心，例如以1000g至3000g离心，以从红细胞56和凝胶52中分离血浆级分50。可以使用注射器60和0.2-1.0微米的盘式过滤器从分离的级分58中抽出期望量的富含IL-1Ra的血浆。可以收集IL-1Ra的等分试样70用于在现场或在以后对一个或更多个受试者74进行给药，前提是提供合适的储存72(-5℃至-20℃)。
实施例1
使用微珠的TropokineTM富含IL-1Ra的血浆(建议的方案)
1.目的:
为了诱导IL-1Ra的产生，该IL-1Ra来源于血液分离平台，例如并在TropokineTMP中与聚丙烯酰胺(PAA)微球融合。
2.设备
2.1.具有凝胶且具有抗凝血剂的22mL管
2.2.排气针
2.3.VACU20S
2.4. 10mL注射器X3
2.5.盘式过滤器40
2.6.注射器式过滤器0.22μm
2.7.尖针16G/90mm
2.8.两根钝针100mm
2.9.具有PAA微珠的TropokineTMP玻璃管
2.10.套筒式过滤器
2.11.能够达到至少1500g的离心机
2.12.涡流机(任选的)
3.程序
3.1.血液收集
3.1.1.将血液抽入22mL管中。
3.1.2.将管倒置2-4次以使血液与抗凝血剂混合。
3.1.3.将管插入到离心机中。始终使用平衡管。
3.2.离心:
3.2.1.以1,500RCF(g)旋转持续20min。
3.2.2.轻轻地从离心机中取出管并将其放置在支架上。
3.3.PRP制备
3.3.1.将排气针插入到管橡胶塞中。
3.3.2.将一根长的尖针插入到管橡胶塞中。
3.3.3.将盘式过滤器附接到10ml注射器，并将其连接到先前插入管中的长尖针(步骤3.3.2)。
3.3.4.抽出PPP，仅留下5ml血浆。
注意：不要用针接触凝胶。针尖端应该在凝胶上方。
3.3.5.保持针插入管中并且仅取出含有PPP的注射器。
3.3.6.将新的10ml注射器附接到与长尖针连接的盘式过滤器。
3.3.7.通过将管倒置十次，将位于凝胶的顶部上的细胞悬浮到剩余的血浆。
3.3.8.收集PRP。
注意：不要用针接触凝胶。针尖端应该在凝胶上方。
3.4.IL-1Ra富集
3.4.1.打开具有PAA微珠的10mL TropokineTM 玻璃管的橡胶塞，并且逐渐转移PRP，同时轻轻地倾斜管，使得所有微珠都将被PRP液体浸泡；使用连接到注射器的钝针将微珠与PRP充分混合。
注意：确保所有微珠与PRP充分混合，并且不存在白色粉末残留物。
3.4.2.用橡胶塞封闭管，并且使管与PAA微珠在室温静置持续15min。
3.4.3.取下橡胶塞，并且将套筒式过滤器插入到管中。
3.4.4.沿着管推动套筒式过滤器。
注意：验证所有剩余的血浆被提取，并且微珠凝胶沉淀物变白。
3.4.5.将钝针连接到具有0.22μm注射器式过滤器的新注射器，并将其插入到套筒式过滤器的底部中，以收集浓缩的富集血浆。
任选的1：使用涡流将PAA微珠与PRP充分混合。
任选的2：将管离心持续5-10分钟以沉积细胞、细胞级分和微珠。
3.4.6.将样品分成等分式样并储存在-20℃长达7个月，直到用ELISA分析。避免重复的冻融循环。
3.5.ELISA评估:
如果需要IL-1Ra浓度值，则进行以下处理:
3.5.1.根据供应商的手册，用Quantikine人类IL-1Ra/IL-1F3免疫测定#DRA00B进行ELISA。
注意：在初步研究中，所使用的ELISA O.D.波长为450nm，没有减去540nm或570nm的O.D.。
如下表1中示出的，对一个样品的ELISA评估示出，根据上文的程序使用PAA珠获得的IL-1Ra浓度的近10倍增加。“倍数”计算是通过将处理之后的最终产物中的IL-1Ra质量除以基线PRP中的IL-1Ra质量获得的。
表1
实施例2
使用玻璃珠的TropokineTM富含IL-1Ra的血浆(建议的方案)
4目的：
为了通过将全血在TropokineTMG管中与玻璃珠一起孵育来诱导IL-1Ra的产生。
5.设备
5.1.具有凝胶的22mL或11mL管
5.2.具有玻璃珠(任选的具有凝胶和玻璃珠的血液)的22mL或11mL TropokineTMG管
5.3.排气针
5.4.VACU20S
5.5. 10mL注射器
5.6.盘式过滤器40μm
5.7.注射器式过滤器0.22μm
5.8.尖针16G/90mm或16G/65mm
5.9.具有凝胶(任选的)的22mL或11mL管
5.10.能够达到至少2000g的离心机
5.11.能够达到37℃的孵育箱
6.程序
6.1.血液收集和IL-1Ra富集
6.1.1.将血液抽入22mL或11mL TropokineTMG管中。
6.1.2.将管倒置2-4次以使血液与玻璃珠混合。
6.1.3.将管在37℃孵育过夜。
6.2.血浆血液分离：
选项1
6.2.1.在孵育后，将管以1500-2000RCF(g)旋转持续10min。
6.2.2.轻轻地从离心机中取出管并将其放置在支架上。
6.2.3.将排气针插入到管橡胶塞中。
6.2.4.将尖针插入到管橡胶塞中。
6.2.5.将0.22μm盘式过滤器附接到10mL注射器，并将其连接到先前插入管中的尖针(3.2.4)
6.2.6.抽取血浆。
6.2.7.将样品分成等分式样并储存在-20℃长达7个月，直到用ELISA分析。避免重复的冻融循环。
选项2-如果用仅具有玻璃珠的管运行，则相关
6.2.8.在孵育后，将血液转移至具有凝胶而不具有抗凝血剂的管。
6.2.9.将管以1,500RCF(g)旋转持续10min。
6.2.10.将排气针插入到管橡胶塞中。
6.2.11.将尖针插入到管橡胶塞中。
6.2.12.将0.22μm盘式过滤器附接到10mL注射器，并将其连接到先前插入管中的尖针(3.2.11)
6.2.13.抽取血浆。
6.2.14.将样品分成等分式样并储存在-20℃长达7个月，直到用ELISA分析。避免重复的冻融循环。
6.3.ELISA评估:
如果需要IL-1Ra浓度值，则进行以下处理:
6.3.1.根据供应商的手册，用Quantikine人类IL-1Ra/IL-1F3免疫测定#DRA00B进行ELISA。
注意：在初步研究中，ELISA O.D.波长为450nm，没有减去540nm或570nm的O.D.。
表2
ELISA评估证实使用玻璃珠。“倍数”通过将用珠处理之后基线的IL-iRa质量除以基线的IL-1Ra质量来计算。具有玻璃珠的全血-具有玻璃珠的玻璃管中的血液；不具有玻璃珠的全血-不具有玻璃珠的玻璃管中的血液。
实施例3-使用玻璃收集容器和塑料收集容器；聚合物微珠；以及玻璃珠的比较效果
从四个供体获得全血样品，并在基线时和在根据上文描述的技术处理之后，使用仅具有微珠的玻璃管、仅具有微珠的塑料注射器、仅玻璃收集管；具有玻璃珠和微珠的玻璃管；以及具有玻璃珠加分离凝胶加微珠的玻璃管测量IL-1Ra，报告为浓度(pg/ml)和总质量(pg)，结果如下：
表3
IL-1Ra浓度(pg/mL) 供体1 供体4 供体3 供体2
基线(t0) 197.8 235.3 131.3 152
仅具有AC的玻璃管 964.4 586.6 467.3 663
仅具有AC的塑料注射器 918.9 655.7 627 未检查
不具有AC的仅玻璃管 5109 1712 795.7 未检查
具有玻璃珠+AC的玻璃管 888.4 666.9 685.4 663
具有玻璃珠+凝胶+AC的玻璃管 1174 668.2 708.1 744.6
表4
样品的体积在表5中报告
表5
样品的体积(ml) 供体1 供体4 供体3 供体2
基线(t0) 6 6.3 6 7
仅具有AC的玻璃管 7 7.5 7 6.4
仅具有AC的塑料注射器 5 5 5 未检查
不具有AC的仅玻璃管 5 6.5 5.5 未检查
具有玻璃珠+AC的玻璃管 6 6 6 6
具有玻璃珠+凝胶+AC的玻璃管 5 6 6 5.3
倍数增加(基于总质量)在表6中报告
表6
IL-1Ra的倍数 供体1 供体4 供体3 供体2
基线(t0) 1 1 1 1
仅具有AC的玻璃管 5.7 3.0 4.2 4.0
仅具有AC的塑料注射器 3.9 2.2 4.0 未检查
不具有AC的仅玻璃管 21.5 7.5 5.6 未检查
具有玻璃珠+AC的玻璃管 4.5 2.7 5.2 3.7
具有玻璃珠+凝胶+AC的玻璃管 4.9 2.7 5.4 3.7
实施例4
在该实施例中，在不存在抗凝血剂的情况下，将全血收集在含有密度分离凝胶和玻璃微珠的玻璃管中。将容器孵育持续30分钟至24小时(以在最终产物中制备不同量的IL-1Ra)，随后将管以1500g离心持续10分钟。富含IL-1Ra的血浆组合物经由注射器直接从血浆级分获得，使混合物通过0.2微米至1.0微米的盘式过滤器。表7示出了在不同孵育期之后在样品中获得的IL-1Ra的以皮克计的平均质量。
表7
虽然已经针对有限数量的实施方案描述了本发明，但这些不应被解释为对本发明的范围的限制，而是作为一些优选实施方案的示例。其他可能的变化、修改和应用也在本发明的范围内。因此，本发明的范围不应受到迄今为止已经描述的内容的限制，而应受到所附权利要求及其法律等同物的限制。

Claims (14)

1.一种制备富含IL-1Ra的血浆组合物的方法，包括：
将PRP级分收集在含有聚合物微珠的收集容器或收集管中；
使所述聚合物微珠与所述PRP级分混合以形成微珠和PRP的均匀混合物；
允许所述均匀混合物静置持续预定的时间段；
使所述混合物通过过滤器，和/或使含有所述混合物的所述容器或管离心，以分离所述微珠、细胞和细胞级分并获得所述富含IL-1Ra的血浆组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物微珠是微米级亲水性聚丙烯酰胺珠。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述聚合物微珠在收集管中与所述PRP级分混合，并且其中使所述混合物通过过滤器包括在允许所述均匀混合物静置持续约15分钟之后将套筒式过滤器压入所述均匀混合物中，以在所述套筒式过滤器中获得珠被去除的富含IL-1Ra的血浆级分。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括在所述套筒式过滤器插入离心管中的同时，用注射器从所述套筒式过滤器中去除所述富含IL-1Ra的血浆级分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中使所述聚合物微珠与所述PRP混合包括用涡流装置混合或者用附接到注射器的针搅拌。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中与基线PRP相比，以皮克/毫升计测量的IL-1Ra浓度在所述富含IL-1Ra的血浆组合物中增加了2.8倍至25.8倍，按照通过ELISA测定所确定的。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中与基线相比，在所述血浆组合物中获得的以皮克计测量的总IL-1Ra增加了2.2倍至21倍。
8.一种制备富含IL-1Ra的血浆组合物的方法，包括：
将全血样品收集在配备有玻璃珠、聚合物微珠或者玻璃珠和聚合物微珠的组合的离心管中；
使所述全血样品与所述珠的表面接触持续预定的时间段；
使所述全血样品离心以获得富含IL-1Ra的血浆；
使富含IL-1Ra的血浆通过过滤器以获得所述富含IL-1Ra的血浆组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述全血样品被收集在提供有抗凝血剂、分离凝胶和所述玻璃珠的离心管中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述全血样品与所述珠的表面i)在30-40℃的温度接触持续4小时至24小时或ii)在室温接触持续5分钟至1小时；随后以1000g至3000g离心。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述富含IL-Ra的血浆经由具有盘式过滤器的注射器从所述离心管中抽出，并且所述富含IL-Ra的血浆通过盘式过滤器以获得富含IL-Ra的血浆的剂量等分试样。
12.一种制备富含IL-1Ra的血浆组合物的方法，包括：
将全血收集在玻璃收集容器或管中，所述容器或管在不存在抗凝血剂的情况下包含密度分离凝胶和玻璃微珠；
将所述容器或管孵育持续30分钟至24小时；
在孵育之后，以900g至2500g离心所述容器或管；
使混合物通过0.2微米至1.0微米的过滤器，或者以3000g-5000g进行第二离心步骤，以分离所述微珠、细胞和细胞级分；以及
收集所述富含IL-1Ra的血浆组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中孵育在含有5％CO2的气氛中进行。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述使混合物通过0.2微米至1.0微米的步骤包括使所述混合物通过盘式过滤器直接进入注射器中。
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