CN115261314B - 单个核细胞和血小板的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种单个核细胞和血小板的制备方法，包括以下步骤：采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层；用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层；将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板；清洗所述白膜层，得到单个核细胞。本发明的技术方案操作简单、可同时得到高纯度、高数量的血小板和高纯度、高数量的单个核细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单个核细胞和血小板的制备方法。
背景技术
外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，PBMC常用于细胞培养及药物敏感试验等临床科研项目，对于实验室研究具有重要价值。分离PBMC的方法很多，各有利弊,如分离的过程较繁琐、耗材较多、细胞分层效果及分离率欠理想等，但主要的分离方法是葡聚糖－泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法，相对于分离效果更好的Percoll非连续密度梯度离心法。不同的方法及离心力都影响着PBMC的质量，主要体现在PBMC回收率、回收纯度、活率等。血小板作为血液的提取产物在临床上得到了越来越广泛的使用。可以增强组织的愈合能力，促进康复，促进组织细胞增殖分化。可以加速组织损伤的愈合过程，包括肌肉，韧带，软骨，以及肌腱。而血小板裂解物是血小板裂解后进一步提纯的产物，不仅去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且还保留了多种生长因子，可为异体或异种移植创造条件。
但是，在提取PBMC及PTL时往往因纯度不够或回收率不高导致科研效果不佳，甚至失败。如在免疫细胞培养过程中往往因过多的血小板残留导致细胞生长缓慢或血小板聚集成絮状物导致培养失败。在PLT裂解物中残留大量免疫细胞导致免疫原性增强，发生炎症反应。
综上所述，如何提取高纯度、高回收率的单个核细胞和血小板，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种单个核细胞和血小板的制备方法，旨在提供一种高提取率、高纯度的单个核细胞和血小板的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种单个核细胞和血小板的制备方法，包括以下步骤：
采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层；
用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层；
将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板；
清洗所述白膜层，得到单个核细胞。
在本发明一实施例中，所述采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层的步骤包括：
采用等体积比的羟乙基淀粉注射液稀释血液；
将稀释后的血液置于离心机中，离心机的转速为160-200g，离心10分钟，得到富含血小板的血浆层和细胞沉淀层。
在本发明一实施例中，所述用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层的步骤包括：
用2倍体积量的羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理；
得到上清层、白膜层、分离液层及红细胞层，取上清层和白膜层于两个新的离心管中。
在本发明一实施例中，所述将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理的步骤中，所述细胞悬液与所述淋巴细胞分离液的体积比为3:1-2:1；且将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管时，保证所述细胞悬液和所述淋巴细胞分离液的界限清晰。
在本发明一实施例中，所述将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理的步骤中，离心机的转速为1000g，升7降7，离心时间为20min。
在本发明一实施例中，所述将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板的步骤包括：
将得到的所述血浆层和所述上清层置于一个新的离心管中，并放入转速为2000g的离心机中，离心10min；
得到高纯度的血小板。
在本发明一实施例中，所述清洗所述白膜层，得到单个核细胞的步骤包括：
将PBS缓冲液加入所述白膜层中，
置于离心机中清洗，离心机的转速为400g，离心时间为10min；
得到高纯度的单个核细胞。
本发明的技术方案，通过羟乙基淀粉注射液对血液进行稀释，羟乙基淀粉注射液具有提高血浆渗透压，稀释血液，并增加细胞膜负电荷，使已聚集的红细胞解聚，降低血粘度等作用，采用羟乙基淀粉注射液稀释血液后，通过低速离心可以获得大量中小形血小板，提高回收率的情况下，而不影响其他细胞的质量及数量，后经淋巴细胞分离液高速分离稀释的细胞悬液，可以充分分离大形血小板、单个核细胞、红细胞等，将富含血小板的悬液收集到一个离心管内，并经高速离心后即得高纯度的、高数量的血细胞板，将分离后的白膜层经低速清洗后即得高纯度、高数量的单个核细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述单个核细胞和血小板的制备方法的步骤流程图；
图2为本发明步骤S10的步骤流程图；
图3为本发明步骤S20的步骤流程图；
图4为本发明步骤S30的步骤流程图；
图5为本发明步骤S40的步骤流程图；
图6为本发明所述细胞悬液和分离液的离心示意图；
图7为本发明实施例2的其中一数据对比图；
图8为本发明实施例2的其中一数据对比图；
图9为本发明实施例2的其中一数据对比图；
图10为本发明实施例3的其中一数据对比图；
图11为本发明实施例3的其中一数据对比图；
图12为本发明实施例3的其中一数据对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种单个核细胞和血小板的制备方法，旨在。
下面将在具体实施例中对本发明提出的单个核细胞和血小板的制备方法的具体结构进行说明：
在本实施例的技术方案中，如图1所示，一种单个核细胞和血小板的制备方法，包括以下步骤：
S10：采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层；
S20：用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层；
S30：将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板；
S40：清洗所述白膜层，得到单个核细胞。
可以理解地，羟乙基淀粉注射液具有提高血浆渗透压，稀释血液，并增加细胞膜负电荷，使已聚集的红细胞解聚，降低血粘度等作用，采用羟乙基淀粉注射液稀释血液后，通过低速离心可以获得大量中小形血小板，提高回收率的情况下，而不影响其他细胞的质量及数量，后经淋巴细胞分离液高速分离稀释的细胞悬液，可以充分分离大形血小板、单个核细胞、红细胞等，将富含血小板的悬液收集到一个离心管内，并经高速离心后即得高纯度的、高数量的血小板，将分离后的白膜层经低速清洗后即得高纯度、高数量的单个核细胞。
在本实施例的技术方案中，如图2所示，所述S10：采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层的步骤包括：
S11：采用等体积比的羟乙基淀粉注射液稀释血液；
S12：将稀释后的血液置于离心机中，离心机的转速为160-200g，离心10 分钟，得到富含血小板的血浆层和细胞沉淀层。
在本实施例的技术方案中，如图3所示，所述S20：用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层的步骤包括：
S21：用2倍体积量的羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，得到细胞悬液；
S22：将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理；
可以理解地，所述细胞悬液与所述淋巴细胞分离液的体积比为3:1-2:1；且将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管时，保证所述细胞悬液和所述淋巴细胞分离液的界限清晰；离心机的转速为1000g，升7降7，离心时间为20min。
S23：得到上清层、白膜层、分离液层及红细胞层，取上清层和白膜层于两个新的离心管中。
可以理解地，如图6所示，离心后离心管中出现上清层、白膜层、分离液层及红细胞层，其中上清层为稀释液层，富含血小板；白膜层为淋巴细胞层，包含单个核细胞。
在本实施例的技术方案中，如图4所示，所述S30：将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板的步骤包括：
S31：将得到的所述血浆层和所述上清层置于一个新的离心管中，并放入转速为2000g的离心机中，离心10min；
S32：得到高纯度的血小板。
可以理解地，离心后的沉淀层即为高纯度的血小板层，收集沉淀层，得到高纯度的血小板。
在本实施例的技术方案中，如图5所示，所述S40：清洗所述白膜层，得到单个核细胞的步骤包括：
S41：将PBS缓冲液加入所述白膜层中；
可以理解地，PBS缓冲液的主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和 KCl。
S42：置于离心机中清洗，离心机的转速为400g，离心时间为10min；
S43：得到高纯度的单个核细胞。
可以理解地，离心后的沉淀层即为高纯度的单个核细胞，收集沉淀，即得到高纯度的血小板。
实施例1
(1)肝素抗凝的外周血与羟乙基淀粉40氯化钠注射液1:1进行混匀(在离心管内混合)，将离心管置于离心机内，离心机的转速为180g，离心10分钟后，收集富含血小板的血浆层于新的离心管内和细胞沉淀层于另一新的离心管中；
(2)加入羟乙基淀粉注射液稀释细胞沉淀层，加入羟乙基淀粉注射液的体积量是细胞沉淀层的2倍，得到新的细胞悬液；
(3)将细胞悬液加入到盛有淋巴细胞分离液的离心管中，加入时，保证细胞悬液和淋巴细胞分离液的液界清晰，其细胞悬液和淋巴细胞分离液的体积比为2:1；将离心管放入离心机中，离心机的转速为1000g，升7降7，离心20min；
(4)离心后，得到上清层、白膜层、分离液层及红细胞层；收集富含血小板和血浆的于新的离心管中，收集白膜层于另一新的离心管中；
(5)将步骤(1)收集富含血小板的血浆层的离心管和步骤(4)收集上清层的离心管置于离心机中，离心机的转速为2000g，离心10min，得到沉淀即为高纯度的血小板。
(6)将步骤(4)收集的白膜层置于离心机中，加入PBS缓冲液进行清洗两次，每次离心机的离心转速为400g，每次离心时间为10min，最终离心得到的沉淀即为高纯度的单个核细胞。
实施例2，进行羟乙基淀粉注射液浓度对比实验
采用肝素抗凝血4份，40ml/份，分四组进行优化试验，10ml/组，羟乙基淀粉注射液稀释血液样本，用量分别为0ml、5ml、10ml、20ml，分别为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4(对照组为肝素抗凝血)。混匀后，进行离心处理，离心机的转速为180g，离心时间为10分钟，收集血浆层至新的离心管，羟乙基淀粉注射液补充血样至10ml,混匀、留样进行血常规检测，结果如表1和图7至图9所示，低速离心能够收集到血液中的血小板，血液中剩余血小板量实验组1>实验组2>实验组3>实验组4,不同实验组间具有显著性差异，P<0.05,实验组3与实验组4无显著性差异,P>0.05；血液中其他细胞如红细胞、白细胞没有丢失，与对照组无显著性差异，P>0.05.表明全血经羟乙基淀粉注射液稀释后低速离心可以有效分离出80％的中小形血细胞板，而不影响其他血细胞成分，最佳稀释比例为1:1。
表1
| 实验分组 | 血小板(109/L) | 白细胞(109/L) | 红细胞(1012/L) |
| 对照组(全血) | 246.75±10.71a | 7.22±0.28a | 4.96±0.30a |
| 实验组1(0ml) | 153.25±6.39b | 7.19±0.31a | 4.93±0.28a |
| 实验组2(5ml) | 105.75±6.55c | 7.11±0.25a | 4.64±0.44a |
| 实验组3(10ml) | 48.50±4.12d | 7.20±0.24a | 4.94±0.25a |
| 实验组4(20ml) | 45.50±2.65d | 7.20±0.21a | 4.97±0.23a |
备注：a>b>c>d,不同字母之间具有显著性差异，P<0.05。
实施例3，以实施例2为基础，进行PBMC(单个核细胞)分离效果对比实验
羟乙基淀粉注射液稀释实施例2中的细胞沉淀层，定容至20ml,混匀。按照细胞沉淀层与淋巴细胞分离液的体积比为2:1进行PBMC提取，分别收集上清层及白膜层，含血小板的上清层收集于实施例1中盛放血浆层的离心管中，并离心处理，离心机的转速为2000g，离心10min后，得到沉淀血小板，羟乙基淀粉注射液定容至10ml,留样进行血常规检测(PCL血常规检测)；白膜层收集于新的离心管内，采用PBS清洗(离心机的转速为400g，离心时间为10min，清洗两次),得到沉淀单个核细胞，用羟乙基淀粉注射液定容至10ml, 留样进行血常规检测(PBMC血常规检测)；结果如表2和图10至图12所示， PBMC中含有大量的淋巴细胞和少量的单个核细胞及血小板板，但PBMC中血小板含量存在显著性差异，实验组3、实验组4显著性低于其他实验组，P<0.05；各组间PBMC数量存在显著性差异，实验组3与实验组4含量最高，回收率高于75％，远高于其他各组，P<0.05；血小板沉淀中无其他细胞成分(红细胞及白细胞)，各组血小板(PLT)含量存在显著性差异，实验组3、实验组4含量最高，回收率高于90％。表明羟乙基淀粉注射液在分离PBMC时，能够提高 PBMC及PLT的回收率和纯度，分离效果更加显著，使PLT回收率可高达90％以上，PBMC中PLT含量更接近于0，更有益PBMC和PLT的后期研究与培养。
表2
备注：a>b>c>d,不同字母之间具有显著性差异，P<0.05。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层；
用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层；
将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板；
清洗所述白膜层，得到单个核细胞；
其中，所述采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层的步骤中，离心机的转速为160-200g。
2.根据权利要求1所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述采用羟乙基淀粉注射液稀释血液，通过离心的方式得到上层血浆层和下层细胞沉淀层的步骤包括：
采用等体积比的羟乙基淀粉注射液稀释血液；
将稀释后的血液置于离心机中，离心机的转速为160-200g，离心10分钟，得到富含血小板的血浆层和细胞沉淀层。
3.根据权利要求1所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述用羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，将稀释后的所述细胞沉淀层置于装有淋巴细胞分离液的离心管中进行离心，得到上清层和白膜层的步骤包括：
用2倍体积量的羟乙基淀粉注射液稀释所述细胞沉淀层，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理；
得到上清层、白膜层、分离液层及红细胞层，取上清层和白膜层于两个新的离心管中。
4.根据权利要求3所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理的步骤中，所述细胞悬液与所述淋巴细胞分离液的体积比为3:1-2:1；且将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管时，保证所述细胞悬液和所述淋巴细胞分离液的界限清晰。
5.根据权利要求3所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述将所述细胞悬液加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，并离心处理的步骤中，离心机的转速为1000g，升7降7，离心时间为20min。
6.根据权利要求1所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述将所述血浆层和所述上清层离心，得到血小板的步骤包括：
将得到的所述血浆层和所述上清层置于一个新的离心管中，并放入转速为2000g的离心机中，离心10min；
得到高纯度的血小板。
7.根据权利要求1所述的单个核细胞和血小板的制备方法，其特征在于，所述清洗所述白膜层，得到单个核细胞的步骤包括：
将PBS缓冲液加入所述白膜层中，
置于离心机中清洗，离心机的转速为400g，离心时间为10min；
得到高纯度的单个核细胞。
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