CN104480070A - 一种人外周血单个核细胞的分离方法 - Google Patents
一种人外周血单个核细胞的分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人外周血单个核细胞的分离方法,结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点,针对大容量血液样本的分离特点,先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞,然后在空气中自然沉降,再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化,从而得到纯度超过95%,活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法,获得的细胞活力和纯度更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分离方法,具体地涉及一种人外周血单个核细胞的分离方法。
背景技术
细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术,是指利用某些具有特定功能的细胞的特性,采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后,使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效,从而达到治疗疾病的目的。
细胞治疗以其良好的疗效,副作用小,更个体化、个性化等独特的优势,为一些难治性疾病的治疗,提供了一种选择,有时甚至是最后的选择。在当前和今后很长的历史阶段,细胞治疗都将在临床治疗中担当重要的角色,二十一世纪将是细胞治疗发挥重要作用的时代。
在免疫细胞治疗中,一般采用羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)离心沉淀法或Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便,但是细胞分离的效果不佳,得到的细胞纯度难以满足要求,有较多的血小板、红细胞及粒细胞等。而采用Ficoll密度梯度离心法,红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的白膜层细胞,就可从外周血中分离得到单个核细胞。这个方法所得到的细胞纯度较好,但是对操作上的要求比较高,如果操作不够谨慎,分离得到的细胞在数量和纯度上都会有较大影响。
发明内容
现有技术中采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便,但是细胞分离的效果不佳,得到的细胞纯度难以满足要求,有较多的血小板、粒细胞及红细胞等。而Ficoll密度梯度离心法所得到的细胞纯度较好,但是对样本体积上的要求有一定的限制,如果样本体积超过50ml,分离的效果会大大降低。此外,不同的离心力与离心时间对细胞分离的效果也有较大影响,采用不同的离心参数分离出来的细胞,纯度和活力都有很大的差异。
本发明的目的是结合羟乙基淀粉沉淀以及Ficoll密度梯度离心法,对PBMC的分离方法进行改进,尤其对于大体积(>50ml)的血液样本分离更具优势。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
本发明的发明人通过研究发现:提高PBMC分离效果的关键之一是在保证分离得到的PBMC细胞的活力及数量的前提下,减少血小板、红细胞及粒细胞等杂细胞的比例,提高PBMC细胞的纯度。本发明通过不断地摸索及验证,首先使用羟乙基淀粉沉淀,在空气中自然沉降后,再采用Ficoll密度梯度离心的分离方法,得到纯度和活力都较高的PBMC。
现有技术中一般采用羟乙基淀粉沉淀法或者Ficoll密度梯度离心法。本发明结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点,针对大容量血液样本的分离特点,先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞,然后在空气中自然沉降,再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化,从而得到纯度超过95%,活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法,获得的细胞活力和纯度更高。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
一种人外周血单个核细胞的分离方法,包括以下步骤:
(1)将外周血离心后,上层为血浆,下层为血细胞沉淀;
(2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液,羟乙基淀粉溶液的浓度为4%-10%g/mL,混合均匀后在空气中自然沉降15~35min;
(3)将上清液缓慢转移至Ficoll淋巴细胞分离液表面,离心力为600g~800g,离心20~30min;
(4)离心后从下到上分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血浆层;吸取白膜层,重悬,离心;
(5)离心后弃上清液,用1640培养基重悬细胞,调整细胞密度为5×105~10×105cells/mL,得到人外周血单个核细胞。
优选,所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6%g/mL。
步骤(4)所述重悬是加入生理盐水。
步骤(4)和(5)所述离心的转速为1000~2000rpm/min,离心5~10min。
步骤(1)所述离心的转速为1500~3000rpm,离心时间为8~12min。
与现有技术相比,本发明具有的优点及有益效果:
(1)本发明技术结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点,克服了目前技术在大容量血液样本中的缺点,得到高纯度的PBMC;
(2)分离得到的PBMC细胞的分化能力好,体外扩增倍数高,能更快的达到临床应用所需的细胞数量。
(3)先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞,然后在空气中自然沉降,再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化,从而得到纯度超过95%,活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法,获得的细胞活力和纯度更高。
附图说明
图1为PBMC的分离纯度对比;
图2为PBMC的分离活力对比;
图3为NK细胞的生长曲线;
图4为NK细胞的流式鉴定结果;
图5为NKT细胞的生长曲线;
图6为NKT细胞的流式鉴定结果;
图7为CIK细胞的生长曲线;
图8为CIK细胞的流式鉴定。
具体实施方式
实施例1
1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒,将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中,2000rpm离心10min,离心结束后共分为两层,上层为血浆,下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中,标记后置于4℃冰箱,备用。
3、将下层血细胞转移到50mL离心管中,加入等体积的6%g/mL羟乙基淀粉溶液,混合均匀后使其自然沉降20min。
4、另取一支新的50mL离心管,每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司;货号:AS1114546),将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面,使二者之间形成清晰的界面。
5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机,700g离心30min,离心升降速率改为0;
6、离心后从管底到液面分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来,转移至另一支50mL离心管中。
7、加生理盐水至40mL,重悬PBMC,1500rpm/min离心5min。
8、离心结束后弃上清,加入40mL生理盐水充分重悬细胞后,取20μL细胞悬液于EP管中,用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测,其余细胞悬液1500rpm/min离心5min。
9、离心结束后弃上清,用1640培养基(含10%FBS)重悬细胞,调整细胞密度为5×105cells/mL后置于37℃、5%CO2培养箱中扩增培养。定期进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。生长曲线图见实例中NK,NKT,CIK诱导分化结果。
实施例2
1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒,将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中,1500rpm离心8min,离心结束后共分为两层,上层为血浆,下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中,标记后置于4℃冰箱,备用。
3、将下层血细胞转移到50mL离心管中,加入等体积的4%g/mL羟乙基淀粉溶液,混合均匀后使其自然沉降15min。
4、另取一支新的50mL离心管,每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司;货号:AS1114546),将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面,使二者之间形成清晰的界面。
5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机,600g离心20min,离心升降速率改为0;
6、离心后从管底到液面分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来,转移至另一支50mL离心管中。
7、加生理盐水至40mL,重悬PBMC,1000rpm/min离心5min。
8、离心结束后弃上清,加入40mL生理盐水充分重悬细胞后,取20μL细胞悬液于EP管中,用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测,其余细胞悬液1000rpm/min离心5min。
9、离心结束后弃上清,用1640培养基(含10%FBS)重悬细胞,调整细胞密度为10×105后置于37℃、5%CO2培养箱中扩增培养。
实施例3
1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒,将装有外周血的抗凝管放入超净台中。
2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中,3000rpm离心12min,离心结束后共分为两层,上层为血浆,下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中,标记后置于4℃冰箱,备用。
3、将下层血细胞转移到50mL离心管中,加入等体积的10%g/mL羟乙基淀粉溶液,混合均匀后使其自然沉降35min。
4、另取一支新的50mL离心管,每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司;货号:AS1114546),将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面,使二者之间形成清晰的界面。
5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机,800g离心30min,离心升降速率改为0;
6、离心后从管底到液面分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来,转移至另一支50mL离心管中。
7、加生理盐水至40mL,重悬PBMC,2000rpm/min离心10min。
8、离心结束后弃上清,加入40mL生理盐水充分重悬细胞后,取20μL细胞悬液于EP管中,用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测,其余细胞悬液2000rpm/min离心10min。
9、离心结束后弃上清,用1640培养基(含10%FBS)重悬细胞,调整细胞密度为8×105后置于37℃、5%CO2培养箱中扩增培养。
分离大容量血液样本PBMC的纯度对比试验:
根据现有技术中的Ficoll密度梯度离心法跟本发明技术的方法进行PBMC分离后的纯度对比实验。如图1所示,采用单一的羟乙基淀粉沉淀法得到的PBMC存在大量的红细胞,纯度仅为43%;采用单一的Ficoll密度梯度离心法有少量的红细胞及血小板,纯度为87%;而采用本发明方法得到的PBMC的纯度高达96%。结果显示,采用本发明实施例1方法,即结合羟乙基淀粉沉淀法跟Ficoll密度梯度离心法两种方法分离所得到的PBMC,在纯度上明显优于其他两种单一的处理方法。
对比例2:PBMC的活力鉴定
将采用三种方法分离所得到的PBMC进行台盼蓝染色,并用细胞计数仪进行细胞的计数及活力鉴定。鉴定结果如图2所示,1为羟乙基淀粉沉淀法;2为Ficoll密度梯度离心法;3为本发明实施例1的方法,本发明技术分离的PBMC的活力为95%。而采用羟乙基淀粉沉淀法PBMC活力为85%,Ficoll密度梯度离心法则为83%。可见,本发明得到的PBMC活力均高于其他两种方法。
对比例3:PBMC的NK分化扩增试验
利用本发明实施例1分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后,利用NK细胞分选试剂盒将其进行NK细胞的分选及诱导培养,培养两周后绘制NK细胞的生长曲线,并取一部分细胞进行流式检测(主要检测CD3-CD56+亚群,即NK细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图3和图4。
由图3可见,利用本技术分离得到的PBMC进一步分选NK细胞,细胞的增殖能力很强,在第6天之后进入对数生长期,第13天增殖速度开始变慢,到第15天收集细胞时,细胞增殖倍数高达825倍。
由图4可见,CD3-CD56+亚群细胞,即右图第四象限中的细胞,流式检测结果显示NK细胞的比例为95.4%,细胞纯度较高。
对比例4:PBMC的NKT分化扩增试验
利用本发明实施例2分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后,将其进行NKT细胞的诱导培养,培养两周后绘制NKT细胞的生长曲线,并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+及CD161+两个亚群的细胞,即NKT细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图5和图6。
由图5可见,利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养NKT细胞,细胞的增殖能力较好,在第5天之后细胞开始出现明显增殖,第14天增殖速度开始变慢,收集细胞时,细胞增殖倍数高达200倍以上。
由图6可见,CD3+CD56+及CD161+两个亚群的细胞,即NKT细胞,流式检测结果显示NKT细胞两个亚群的比例合计为61.9%,细胞诱导分化培养效果很好。
对比例5:PBMC的CIK分化扩增试验
利用本发明实施例3方法分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后,将其进行CIK细胞的诱导培养,培养两周后绘制CIK细胞的生长曲线,并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+效应细胞,即CIK细胞)。其生长曲线及流式检测结果分别见下图7和图8。
由图7可见,利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养CIK细胞,细胞的增殖能力较好,在第5天之后细胞开始出现明显增殖,第12天增殖速度开始变慢,第14天收集细胞时,细胞增殖倍数高达200倍以上。
由图8可见,CD3+CD56+亚群的细胞,即CIK细胞,流式检测结果显示CIK细胞比例为24.9%,细胞诱导分化培养效果较好。
Claims (5)
1.一种人外周血单个核细胞的分离方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将外周血离心后,上层为血浆,下层为血细胞沉淀;
(2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液,羟乙基淀粉溶液的浓度为4%-10%g/mL,混合均匀后在空气中自然沉降15~35min;
(3)将上清液缓慢转移至Ficoll淋巴细胞分离液表面,离心力为600g~800g,离心20~30min;
(4)离心后从下到上分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血浆层;吸取白膜层,重悬,离心;
(5)离心后弃上清液,用1640培养基重悬细胞,调整细胞密度为5×105~10×105cells/mL,得到人外周血单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的分离方法,其特征在于,所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6%g/mL。
3.根据权利要求1所述的分离方法,其特征在于,步骤(4)所述重悬是加入生理盐水。
4.根据权利要求1所述的分离方法,其特征在于,步骤(4)和(5)所述离心的转速为1000~2000rpm/min,离心5~10min。
5.根据权利要求1所述的分离方法,其特征在于,步骤(1)所述离心的转速为1500~3000rpm,离心时间为8~12min。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150401 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |