CN105255829A - 一种分离pbmc的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离PBMC的方法，包括以下步骤：全血离心后取血细胞制成血细胞稀释液，使用Ficoll分离液在15～18℃、500～1000g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min分离血细胞稀释液中的PBMC。本发明中分离PBMC时离心力升降速为0，能够使PBMC层分层更为明显，有利于提高PBMC的得率和纯度。本发明能够回收血浆，血浆中含有大量蛋白因子，为后续培养提供丰富的营养。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分离PBMC的方法。
背景技术
细胞免疫治疗是肿瘤康复医学一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、副作用、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段，也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。
细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。常用的细胞免疫治疗疗法有细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法和DC-T细胞疗法等。
上述免疫细胞疗法中的CIK细胞、DC细胞、NK细胞、DC-T细胞等细胞，均由PBMC诱导分化而来。PBMC(peripheralbloodmononuclearcell)即外周血单个核细胞，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。若要获得上述免疫细胞，需要先自外周血中分离PBMC。外周血含有血小板、PBMC、红细胞和多核白细胞等多种细胞。PBMC的密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090kg/m3左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090kg/m3，血小板为1.030～1.035kg/m3。为此利用一种密度介于1.075～1.092kg/m3之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，便可将各种血细胞加以分离。常用的PBMC分离方法有Ficoll分离法和Percoll分离法两种。Percoll分离法操作流程较长，手续较为繁琐；相比之下Ficoll分离法较为常用。Ficoll分离法一般是按抗凝外周血：稀释液＝1：1稀释后，将其按与Ficoll分离液体积比2:1的比例与注入到Ficoll分离液上层，常温400g条件下离心30分钟，离心后管内分为三层，上层为血浆层，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一白膜层即为PBMC，吸取白膜层，洗涤两次后重悬即可。但是，Ficoll分离法存在不能回收血浆，Ficoll分离液用量大，分层不明显等缺点，有待进一步改进。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种分离PBMC的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种分离PBMC的方法，包括以下步骤：全血离心后取血细胞制成血细胞稀释液，使用Ficoll分离液在15～18℃、500～1000g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min分离血细胞稀释液中的PBMC。
优选地，所述分离PBMC的方法，包括以下步骤：
S1、分离血细胞：将外周血在15～18℃、500～1000g的条件下离心5～15min，离心结束后外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层；
S2、制备血细胞稀释液：取血细胞层，将其和生理盐水按体积比1:1.5～2.5进行稀释，充分混匀得到血细胞稀释液；
S3、分离PBMC：将血细胞稀释液添加到Ficoll分离液上，血细胞稀释液与Ficoll分离液的体积比2:1，在15～18℃、500～1000g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min；取PBMC层，清洗两次，弃上清，加入培养基或生理盐水重悬细胞即可获得PBMC悬液。
优选地，步骤S3中分离离心结束后，PBMC层位于上方第二层分层，离心管中从下到上分为4层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
优选地，用RPMI1640培养基清洗PBMC层两次，清洗方法为将PBMC与RPMI1640培养基混匀后在15～18℃、300g离心5min，弃上清，向细胞沉淀中再次加入RPMI1640培养基混匀，在15～18℃、300g离心5min，弃上清。
优选地，分离PBMC的离心条件为18℃、600～800g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min。
更优选地，分离PBMC的离心条件为18℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。
优选地，步骤S1获得的第一血浆层在15～18℃、2000～3000g条件下离心5～15min，上清用0.22μm滤网过滤，得到血浆。
更优选地，步骤S1获得的第一血浆层在18℃、3000g条件下离心10min，上清用0.22μm滤网过滤，得到血浆。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明仅对血细胞进行Ficoll分离，不仅节省了大量的Ficoll分离液，还可以回收血浆，富含大量蛋白因子的血浆可以为后续培养提供丰富的营养；仅对血细胞层进行PBMC分离，可以提高PBMC的得率和纯度，也能够缩短Ficoll分离时间，节省时间成本。
2、本发明中在分离PBMC时离心力升降速为0。与现有技术中离心力升降速不为0相比，离心力升降速为0能够使PBMC层分层更为明显，避免PBMC残留在分离液层上，有利于提高PBMC的得率和纯度。
3、本发明全过程中离心温度都为15～18℃，优选18℃。温度影响Ficoll分离液的密度，Ficoll分离液在18℃时的密度恰好为1.077kg/m3附近，能得到明显的梯度，有利于提高PBMC得率。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，1000g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、2500g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:1.5进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液体积比为1:2，在18℃、600g、离心力升降速为0的条件下离心30min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
实施例2
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，800g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、3000g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:2倍进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液的体积比为1:2，在18℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
实施例3
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，600g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、3000g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:2.5进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液体积比为1:2，在18℃、1000g、离心力升降速为0的条件下离心20min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加生理盐水至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mL生理盐水重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例1
把抗凝外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液体积比为1:2，室温(25℃)、400g、离心力升降速为5的条件下离心30min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后，室温、300g条件下离心5min。清洗两次，弃上清，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例2
把抗凝外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液体积比为1:2，室温(25℃)、400g、离心力升降速为0的条件下离心30min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后，室温、300g条件下离心5min。清洗两次，弃上清，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例3
将20mL外周血在4℃、2000rpm条件下离心10min，离心后外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。血细胞层用生理盐水按体积比1:1进行稀释，得到血细胞稀释液。
将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液的体积比为1:2，在4℃、700g、离心力升降速为5的条件下离心40min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加生理盐水至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mL生理盐水重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例4
将20mL抗凝外周血在室温、2000rpm条件下离心10min，离心结束后外周血分为两层，上层为血浆层，下层为血细胞层。
将血细胞层转移到50mL离心管中，加入等体积的质量体积浓度6％的羟乙基淀粉溶液，混合均匀后使其自然沉降20min。另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll分离液，将自然沉降后的上清液缓慢转移至Ficoll分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
用封口膜将离心管封口后转移至离心机，在室温、离心力升降速为0.700g的条件下离心30min；离心后自下而上分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、PBMC层、血浆层。吸取PBMC层转移至另一支50mL离心管中，洗涤两次，加20mL生理盐水得到PBMC悬液。
对比例5
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，800g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、3000g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:1倍进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液的体积比为1:2，在18℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例6(仅稀释倍数与本发明不同)
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，800g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、3000g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:3倍进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液的体积比为1:2，在18℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
对比例7
将20mL健康人抗凝外周血转移至50mL离心管中，18℃，800g离心10min；离心管内的外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层。第一血浆层在18℃、3000g的条件下离心10min，取上清经0.22μm滤网过滤，去除红细胞，滤液即为血浆。血浆富含大量的蛋白因子，可以用于后续的细胞培养实验。
将血细胞层和生理盐水按体积比1:2倍进行稀释，充分混匀形成血细胞稀释液。将血细胞稀释液添加到离心管中Ficoll分离液的上方，其中Ficoll分离液与血细胞稀释液的体积比为1:2，在4℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。离心后离心管中自下而上分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
吸取PBMC层至另一新的离心管中，添加RPMI1640培养基至40mL，充分混匀后在18℃、300g条件下离心5min进行清洗，弃上清，重复上述步骤再清洗一次，加入20mLRPMI1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
效果实施例1
取上述各实施例和对比例中获得的PBMC悬液进行台盼蓝染色，通过countstar细胞计数仪计算细胞数目、活力以及纯度，结果如表1所示。
表1、各组分离得到PBMC的数目、活力以及纯度对比表
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 |
| PBMC数量 | 2.8×107 | 3.6×107 | 3.2×107 | 2.1×107 | 2.7×107 |
| 活力 | 97.5％ | 98.7％ | 97.2％ | 94.2％ | 95.1％ |
| 纯度 | 95％ | 96％ | 95％ | 90％ | 94.4％ |
| 项目 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| PBMC数量 | 2.4×107 | 2.5×107 | 2.5×107 | 2.0×107 | 2.7×107 |
| 活力 | 96.4％ | 95.5％ | 97.4％ | 96.6％ | 96.4％ |
| 纯度 | 92.1％ | 93.7％ | 94.8％ | 90.4％ | 93.6％ |
由表1可知，本发明所述的分离PBMC的方法能够明显提高PBMC的得率，且能使PBMC保持相当高的细胞活力和纯度。
效果实施例2
取以上各实施例和对比例的分离PBMC各2×107个细胞诱导培养为CIK细胞。具体方法为按1×106cell/mL用X-VIVO15培养基接种于T75培养瓶中，添加1％培养基体积的IFN-γ溶液，次日添加1％培养基体积的IL-1α溶液、IL-2溶液以及OKT-3溶液。其中IFN-γ溶液的浓度为1000IU/mL，IL-1α溶液的浓度为500IU/mL，IL-2溶液的浓度为500IU/mL，OKT-3溶液的浓度为100ng/mL。每天观察记录细胞生长状态，每隔2～3天对细胞进行取样计数、补充X-VIVO15培养基及细胞因子。培养两周，取样检测细胞表面抗原表达量(CD3+CD56+)、扩增倍数，以及对K562细胞的杀伤效果。
表2、CIK扩增的倍数、表面抗原表达量以及对K562杀伤效果对比表
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 |
| 扩增倍数 | 104 | 186 | 153 | 82 | 93 |
| (CD3+CD56+)表达量 | 39.8％ | 43.2％ | 41.5％ | 30.5％ | 37.3％ |
| 对K562杀伤效果 | 50.6％ | 56.4％ | 54.3％ | 40.8％ | 48.2％ |
| 项目 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| 扩增倍数 | 85 | 88 | 89 | 80 | 92 |
| (CD3+CD56+)表达量 | 32.2％ | 32.7％ | 34.2％ | 28.6％ | 36.8％ |
| 对K562杀伤效果 | 42.1％ | 43.9％ | 45.4％ | 39.3％ | 47.5％ |
由表2可知，经过本发明所述的分离PBMC的方法分离得到的PBMC能够在体外扩增较高的倍数，且表面抗原表达量较高，对K562的杀伤效果较强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种分离PBMC的方法，其特征在于，包括以下步骤：全血离心后取血细胞制成血细胞稀释液，使用Ficoll分离液在15～18℃、500～1000g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min分离血细胞稀释液中的PBMC。
2.根据权利要求1所述的分离PBMC的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分离血细胞：将外周血在15～18℃、500～1000g的条件下离心5～15min，离心结束后外周血分为两层，上层为第一血浆层，下层为血细胞层；
S2、制备血细胞稀释液：取血细胞层，将其和生理盐水按体积比1:1.5～2.5进行稀释，充分混匀得到血细胞稀释液；
S3、分离PBMC：将血细胞稀释液添加到Ficoll分离液上，血细胞稀释液与Ficoll分离液的体积比2:1，在15～18℃、500～1000g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min；取PBMC层，清洗两次，弃上清，加入培养基或生理盐水重悬细胞即可获得PBMC悬液。
3.根据权利要求2所述的分离PBMC的方法，其特征在于，分离PBMC的离心条件为18℃、600～800g、离心力升降速为0的条件下离心20～30min。
4.根据权利要求3所述的分离PBMC的方法，其特征在于，分离PBMC的离心条件为18℃、800g、离心力升降速为0的条件下离心25min。
5.根据权利要求2所述的分离PBMC的方法，其特征在于，步骤S1获得的第一血浆层在15～18℃、2000～3000g条件下离心5～15min，上清用0.22μm滤网过滤，得到血浆。
6.根据权利要求5所述的分离PBMC的方法，其特征在于，步骤S1获得的第一血浆层在18℃、3000g条件下离心10min，上清用0.22μm滤网过滤，得到血浆。
7.根据权利要求2所述的分离PBMC的方法，其特征在于，步骤S3中分离离心结束后，PBMC层位于上方第二层分层，离心管中从下到上分为4层，分别为红细胞和粒细胞层、分离液层、PBMC层以及第二血浆层。
8.根据权利要求2所述的分离PBMC的方法，其特征在于，用RPMI1640培养基清洗PBMC层两次，清洗方法为将PBMC与RPMI1640培养基混匀后在15～18℃、300g离心5min，弃上清，向细胞沉淀中再次加入RPMI1640培养基混匀，在15～18℃、300g离心5min，弃上清。
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| CN104480070A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的分离方法 |
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2015
- 2015-11-10 CN CN201510768205.9A patent/CN105255829A/zh active Pending
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