CN102690783A - 体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能体外诱导树突状细胞（DC）成熟和增殖的红桂木凝集素及其诱导DC成熟和增殖的专用培养基和制备方法。所述红桂木凝集素以红桂木种子为原料，采用常规分离方法分离纯化。所述专用培养基是：是在DC培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素。所述的制备方法是：在DC培养基中加入DC的前体细胞和诱导因子，培养到第6天时，加入红桂木凝集素，继续培养2天，制备获得成熟DC。所述前体细胞为外周血单个核细胞。所述诱导因子为GM-CSF和IL-4。本发明建立了稳定的诱导DC成熟和增殖的培养技术体系，操作简单，方便实用，所需的细胞因子少，费用低，且DC成熟度高，功能强。本发明提供的红桂木凝集素为进一步开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径。

Description

体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素

技术领域

本发明涉及用植物凝集素诱导树突状细胞（DC）成熟和增殖的方法,特别涉及红桂木凝素诱导树突状细胞成熟和增殖的培养基。

背景技术

植物凝集素是一类具高度特异的糖结合活性的蛋白，其最大的特点在于识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂结构的糖链：即细胞膜表面决定簇。植物凝集素能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用，引起或增强细胞内吞作用或细胞间转运，诱发一定的生理效应。它可以储存物质；抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵；还作为促有丝分裂因子，调节细胞的分裂和生长。由于凝集素能选择性地识别细胞膜糖脂或糖蛋白糖链的不同糖基，在生化、医学上，植物凝集素常用于细胞的分型、分离、糖蛋白和有丝分裂原的纯化、癌化学的研究等。随着基因工程的发展，植物凝集素已成为一种很有潜力对抗疾病的工具，在免疫学、肿瘤、生物学等方面得到诸多应用。红桂木凝集素（Artocarpus Lingnanensis Lectin，ALL）是我们的相关研究人员对30多种生长在广西东南部地区的植物种子经过精心筛选出来的植物凝集素，前期研究表明它具有很强的促进T淋巴细胞增殖活性。

在抗肿瘤免疫治疗中，DC是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞，外周的DC摄取外来抗原后，保留并提呈此抗原，同时发生迁移，进入淋巴结内初始T细胞循环池，能显著地刺激初始型T细胞增殖，启动、调控、维持免疫应答；能递呈抗原给MHCI类限制性CD8+和MHC Ⅱ类限制性CD4+T淋巴细胞，把加工处理的抗原肽提呈在细胞膜表面上，并表达高水平的协同刺激分子和粘附分子，以保证与T细胞结合并促进T细胞的有效激活，诱导特异性免疫反应。DC在体内分布广泛，但数量少(仅占外周血单个核细胞的1％左右)且分散，但可由CD34+细胞或单核细胞诱导、衍生、增殖培养。目前培养DC的细胞因子组合方案有多种，在培养基中仅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培养出不成熟的DC。目前通常采用TNF-α、IFN-γ等在体外诱导DC的成熟，而TNF-α价格昂贵。为解决这一问题，我们从正常人外周血分离单核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)和红桂木凝集素联合诱导培养8d，获得成熟DC，为DC的进一步研究及应用免疫治疗奠定实验基础。

经检索，红桂木凝集素诱导人外周血树突状细胞的成熟和增殖未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素。

本发明的又一目的在于利用红桂木凝集素制备成熟的树突状细胞。

本发明是这样实现的：

一种体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素，其特征在于：添加红桂木凝集素作为诱导树突状细胞成熟和增殖的专用培养基，是在树突状细胞培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素；所述树突状细胞培养基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基；所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是22-220μg/mL。

以上所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是44μg/mL。

红桂木凝集素的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法，是在树突状细胞培养基中加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，培养到第6天时，加入红桂木凝集素，继续培养2天，制备成熟的树突状细胞；所述的前体细胞来自人外周血单个核细胞。

以上所述的诱导因子为GM-CSF和IL-4，诱导因子在加入树突状细胞的前体细胞的第一天加入，所述的GM-CSF的浓度为15ng/mL，所述的IL-4的浓度为15ng/mL。

以上所述的培养温度为37℃，CO₂浓度为5%，湿度为饱和湿度，每2天换一次新鲜的培养基。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明利用本教研室自行发现的红桂木凝集素诱导树突状细胞成熟和增殖，所获得的树突状细胞高表达CD83、CD86、CD40、HLA-DR等，抗原递呈能力增强，因此本发明为进一步开展对DC的深入研究及临床免疫治疗打下了基础，为临床实体肿瘤的生物治疗提供一条新的路径，也为进一步开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径。

2.本发明红桂木凝集素在体外能诱导树突状细胞分泌IL-12和TNF-α，从而诱导Th0细胞向Th1方向分化。Th1细胞主要介导细胞免疫反应，在诱发器官特异性自身免疫病，器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用。

3.本发明的诱导树突状细胞成熟和增殖的专用培养基，克服了目前在培养基中仅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培养出不成熟的DC和采用TNF α、IFN-γ等在体外诱导DC的成熟而TNF-α和IFN-γ价格昂贵的问题。

4.本发明操作简单，方便实用，与现有的方法相比利用的细胞因子少，费用低，且细胞成熟度高，功能强，在树突状细胞的基础研究及临床应用具有广泛的前景。

附图说明

图1：细胞生长的形态学图片；

图1的说明：a-ALL浓度为0；b-ALL浓度为44μg/mL；c-ALL浓度为220μg/mL；d-TNF α浓度为50ng/mL。

图2：ELISA法检测TNFα的含量。

图3：ELISA法检测IL-12的含量。

图4：流式细胞术鉴定DC表面标志；

图4的说明：a-CD1a的表达；b-CD83的表达；c-CD86的表达；d-CD40的表达；e-HLA-DR的表达。

图5：ALL诱导的DC促进异体T细胞增殖。

图6：ALL促进DC增殖。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案进一步具体的说明。

实施例1 红桂木凝集素的获得

红桂木凝集素的分离纯化的所有操作，均在4℃下进行。先取红桂木种子30g，粉碎研磨，按1:5的比例加入0.01mol/L含0.1mol/L NaCl，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液150mL，磁力搅拌器搅拌2h，浸泡抽提24h。抽提液凝血活力在2⁹-2¹¹之间。将抽提液过滤，滤液以3000rpm离心15min，于上清液中加入硫酸铵至30%饱和度。3000rpm离心20min，弃沉淀物。上清液同上法加入硫酸铵至60%饱和度，放置12h。3000rpm离心20min。弃上清液，用少量0.01mol/L含0.1mol/L NaCl，pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀。将粗提液依次对流水、蒸馏水透析，最后对0.01mol/L含0.1mol/L NaCl，pH7.2的磷酸盐缓冲溶液透析至无NH4+。3000rpm离心20min，将上清液上Gal-Sepharose 6B亲和层析柱，以0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱,当A 280降至0.05后,换0.2mol/moL半乳糖溶液继续洗脱。收集洗脱峰，透析及超滤除去半乳糖。超滤液经冷冻干燥备用。所得红桂木凝集素冻干粉经0.01mol/L磷酸盐缓冲液溶解，0.22μm过滤器除菌，用BCATM试剂盒检测蛋白浓度，并配制不同浓度的ALL溶液：22μg/mL、44μg/mL、220μg/mL。

实施例2 成熟树突状细胞的诱导

1.分离外周血单个核细胞（PBMC)：抽取健康人静脉血50ml，注入到含有肝素钠溶液的无菌采血管中缓慢摇匀，再加入等量的无菌PBS缓冲液混匀。取5ml淋巴细胞分离液加入到15ml离心管中，将血液稀释液沿管壁缓缓叠加于分离液上，形成清晰的界面。血液稀释液与分离液的容积比例以2:1-3:1为宜,静置10min后，2000rpm常温离心20min。用滴管吸取单个核细胞层并置于另一离心管中，加入2-3倍体积的红细胞裂解液，混匀，冰上静置3min，加入10倍体积的PBS缓冲液，充分混匀后，1500rpm，4℃离心5min。离心后倾弃上清液，再用PBS缓冲液洗2次。用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的的RPMI-1640培养基配制成细胞悬液，并调整细胞浓度为106/mL，于37℃，5%CO₂培养箱中培养2h。去除非贴壁细胞，剩下的贴壁细胞即为单核细胞。

2.用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640继续培养PBMC,同时加入GM-CSF 15ng/mL和IL-415ng/mL，每2天进行一次半量换液，第六天加入红桂木凝集素22-220μg/ml,作用48小时。所得上层细胞即为成熟的树突状细胞。

空白对照组的培养基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，同时加入GM-CSF 15ng/mL和IL-415ng/mL，每2天进行一次半量换液，培养8天。

TNF-α对照组的培养基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，同时加入GM-CSF 15ng/mL和IL-415ng/mL，每2天进行一次半量换液，第六天加入TNF-α50ng/mL，作用48小时。

实施例3 树突状细胞的鉴定

1.细胞形态学观察

如图1所示，加入不同浓度ALL培养2天后，各组细胞均生长良好，呈不规则状态，大部分呈悬浮或半贴壁状态，细胞表面都有长短不等的突起，单独生长或聚集成较大的细胞集落，为典型的树突状细胞形态。

2.流式细胞术检测DC表面标志

计数细胞，调整DC浓度至1×10⁶/mL，加入Ep管，PBS洗一次，1500rpm离心5min；弃上清，残留100μL，混匀细胞，分别加入单克隆抗体CD1a、CD83、CD86、CD40和HLA-DR；4℃避光反应30min，PBS洗一次，加入500μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞的表面标志。

空白对照组和TNF α对照组的DC经同样步骤分别上流式细胞仪检测细胞的表面标志。

检测结果见图4，可以看出ALL能增强DC表面分子CD1a的表达，表明ALL在一定程度上促进单核细胞向树突状细胞的分化，同时ALL明显增强DC表面分子CD83、CD86、CD40、HLA-DR的表达，表明ALL可促进DC成熟。

3.ELISA法检测细胞因子的分泌

收集实施例2的DC培养上清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，分析细胞因子TNF-α和IL-12含量。

检测结果见图2和图3：ALL明显促进DC分泌TNF-α和IL-12。

4.混合淋巴细胞实验检测DC的功能

（1）计数实施例2中收集的DC，调浓度至1×10⁶/ml，加入丝裂霉素C 25μg/mL，37℃ 5%CO2培养箱中培养30min。用无血清RPMI-1640培养基洗细胞3次，再用RPMI-1640完全培养基调细胞浓度为2×10⁶/mL。

(2)按常规法分离人外周血T淋巴细胞，并用RPMI-1640完全培养基调细胞浓度至5×105/ml。

(3)按DC∶T比例梯度1:5，1:10，1:20，1:50接种细胞至96孔圆底培养板，200μL/孔，每组设3个复孔。于37℃，5%CO2培养箱中培养96h。1300rpm，5min，弃去100μL上清液，每孔加入MTT 10μL（5g/L），继续培养4h，1300rpm,min弃上清液，每孔加入DMSO 100μl充分溶解结晶，用Bio-Rad酶标仪检测OD570nm。

检测结果见图5：DC与T淋巴细胞比例为1:5时，其促进T细胞增殖的能力最强，而且ALL浓度为44μg/mL和220μg/mL时的作用明显强于空白组，结果表明ALL能增强DC的抗原递呈能力。

实施例4 树突状细胞的增殖检测

将PBMC调整浓度为1×10⁶/mL，接种于96孔板。按实施例2的处理方法，培养8天后，每孔中加入CCK-8溶液10μL，继续培养2h，用Bio-Rad酶标仪检测OD450nm，计算细胞增殖率。

增殖率（%）=（实验组OD值-空白组的OD值）/空白组的OD值×100%

检测结果见图6：红桂木凝集素显著促进DC的增殖，增殖率随着红桂木凝集素浓度的增加而升高。

Claims (5)

1.一种体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素，其特征在于：添加红桂木凝集素作为诱导树突状细胞成熟和增殖的专用培养基，是在树突状细胞培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素；所述树突状细胞培养基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基；所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是22-220μg/mL。

2.根据权利要求1所述的体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素，其特征在于：所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是44μg/mL。

3.根据权利要求1所述的红桂木凝集素的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法，其特征在于：在树突状细胞培养基中加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，培养到第6天时，加入红桂木凝集素，继续培养2天，制备成熟的树突状细胞；所述的前体细胞来自人外周血单个核细胞。

4.根据权利要求4所述的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法，其特征在于：所述的诱导因子为GM-CSF和IL-4，诱导因子在加入树突状细胞的前体细胞的第一天加入，所述的GM-CSF的浓度为15ng/mL，所述的IL-4的浓度为15ng/mL。

5.根据权利要求4所述的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法，其特征在于：所述的培养温度为37℃，CO₂浓度为5%，湿度为饱和湿度，每2天换一次新鲜的培养基。

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