CN105067808A - 一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术工程及肿瘤医学领域，公开了一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒。该方法采用2次磁分离技术，一次对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除，一次对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除，该方法可获得高纯度、高回收率的循环肿瘤细胞CTCs，具有较好的临床应用前景。

Description

一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒
发明领域
本发明属于生物技术工程及肿瘤医学领域，涉及一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒。
背景技术
肿瘤细胞发生转移是造成患者死亡的主要原因。在肿瘤转移的过程中，原发灶肿瘤细胞侵袭到邻近组织后穿透基底膜并进入血循环，从而成为循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)。CTCs被认为是肿瘤发生远端转移的关键“参与者”，其临床应用价值在近年来越来越受到关注，并已成为肿瘤研究领域的热点之一。
CTCs在血液中的存在数量非常少，每106个白细胞中大约才有一个CTCs。因此，检测CTCs需要首先分离和富集CTCs。由于CTCs缺乏特异性的标志物，目前普遍采用EpCAM(上皮细胞粘附分子)进行磁性标记来分离CTCs，称为阳性-磁性分离。基于这一原理发展起来的CellSearch、Cellrich等仪器已经投入市场运作。然而，该方法排除了低表达和不表达EpCAM的CTCs。已有研究指出，基于这一原理分离CTCs将低估其数量并丢失具有高转移及增殖潜力的CTCs亚群。一个典型的例子就是，发生上皮-间质转化的CTCs低表达或不表达EpCAM，这类EpCAM亚群因为具有高的迁移力和肿瘤干性而被认为是转移的根源。因此，PantelK等2014年发表在NatureReviewsCancer期刊上的文章已经指出，更可取的CTCs分离技术应当能够分离出全部类型的CTCs。
在这方面，CTCs阴性-磁分离方法更为可取。该技术通过白细胞表面的CD45抗原(白细胞共同抗原)与CD45单克隆抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，并在磁场中去除白细胞，从而“无偏见”地富集出高表达、低表达以及不表达EpCAM抗原的CTCs。该技术弥补了基于上皮标志物EpCAM磁分离CTCs技术在方法上的不足，因而更加具有优越性。尽管这一技术已经有了商业化试剂盒，然而基于这一技术原理获得的CTCs纯度仅在0.1％～1％之间，甚至更低，难以满足CTCs进一步分子分型的要求，因而限制了CTCs的临床应用。近来的研究已经显示，对CTCs做进一步的分子分型鉴定，将可能取代传统的癌组织检测而能用于指导肿瘤的临床治疗当中。一个典型的例子就是，CTCs的EGFR基因突变检测可以取代肺癌组织的检测而能筛选患者用于肺癌的分子靶向治疗。然而，CTCs的分子分型需要足够纯度的靶细胞才能被准确检测出。PantelK等的文章已经指出，难以获得足够纯度的CTCs已经限制了其进一步的临床应用。因此，最佳的CTCs分离技术应当不仅能够分离出全部类型的CTCs，而且能获得足够纯度的CTCs。遗憾的是，目前还没有任何技术能够同时具备这两个优势。
在这方面，CTCs阴性-磁分离技术在分离出全部类型的CTCs上具有技术优势。通过这一技术能够去除99.99％的白细胞，即富集效率高达10000倍。然而，CTCs在血中的数量是白细胞数量的百万分之一或千万分之一。由于数量极其稀少，按照每毫升血液中白细胞的标准数量为5×106个计算，目前的技术(包括阴性-磁分离法)分离CTCs后，依旧会有大约2000～20000个白细胞无法被去除，从而仅能获得0.1％～1％纯度的CTCs。因此，进一步的技术改进以去除剩余的白细胞是提高CTCs纯度的关键。
目前普遍使用的CTCs阴性-磁分离法的原理是：磁性标记白细胞表面的特异性抗原CD45并在磁场中去除白细胞，从而富集出CTCs。运用同样的原理，对剩余的白细胞做进一步的特异性抗原磁性标记并在磁场中予以去除是一个显而易见的方法能进一步提高CTCs纯度。然而，该技术改进的原理并不是一个简单的方法叠加。因为：(1)能够进一步用于磁性标记白细胞的抗原种类十分有限：目前基于CD45的阴性-磁性法去除白细胞后，剩余的白细胞只能选择其它的白细胞抗原进行磁性标记才能在磁场中被去除。并且这些抗原需要满足以下两个方面的要求：首先，仅在白细胞表面表达，并在血液其它组成部分(例如红细胞以及血小板等)中不表达，以降低对分离的干扰；其次，肿瘤细胞不表达或与肿瘤细胞不能间接连接，以保证分离方法的特异性。尽管目前已经发现超过150种白细胞的分化抗原，但符合上述条件的白细胞抗原种类非常有限。(2)基于CD45磁性去除白细胞后，进一步磁性标记白细胞的次数并不是越多越好：理论上，磁性标记白细胞并在磁场中去除的次数越多，CTCs的纯度将越高。然而，CTCs的回收率也将越低。我们与其他学者以前的研究已经显示，每一次的磁分离将损失10～20％的CTCs。因此，多次的磁分离将损失大部分CTCs而使检测结果失去代表性，并且多次的磁分离将延长分离时间并增加检测成本，难以在临床上推广应用。
目前尚没有适于临床应用的高纯度CTCs的富集方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种高纯度CTCs的富集方法。
本发明的第二个目的是提供运用上述方法富集CTCs的试剂盒。
鉴于每一次的磁分离将损失10～20％的CTCs，过多的磁分离将损失大部分CTCs而使检测结果失去代表性，并且多次的磁分离将延长分离时间并增加检测成本，难以在临床上推广应用。阴性-磁分离法富集CTCs的效率能达到10000倍，两次的阴性-磁分离连用技术的富集效率理论上将能达到108，足以获得满足分子分型要求的CTCs纯度，并且能够保证足够的回收率。因此，发明人通过外周血中白细胞表面的两个特异性表达的抗原CD45和CD53通过抗体复合物与纳米磁性粒子结合，以磁性标记白细胞，并先后在磁场中去除白细胞，建立了一种基于阴性-磁分离方法的高纯度CTCs富集技术和流程，并研制出可便于临床应用的CTCs富集试剂盒。该方法不仅能够实现循环肿瘤细胞的“无偏见”富集，而且能同时获得高纯度和高回收率的CTCs，为进一步的基因分型鉴定及相关科学研究提供了技术平台。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法，该方法采用2次磁分离技术，一次对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除，一次对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除，得到高纯度循环肿瘤细胞CTCs。
上述方法中磁分离技术为CTCs阴性-磁分享技术。
上述方法中：
对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的CD45抗原与CD45抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞；
对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的CD53抗原与CD53抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞。
所述的方法，该方法包括将血样品中红细胞去除，然后先对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除，再对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除。
所述的方法，其中CD45抗体为单克隆抗体，CD53抗原为单克隆抗体。
一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，该试剂盒含有CD45单克隆抗体、PE标记的CD53单克隆抗体、纳米磁珠、用于连接CD45单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物、以及用于连接PE标记的CD53单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物。
所述的试剂盒还含有白细胞磁性标记的溶液体系，和/或白细胞在磁场中去除的溶液体系。
所述的试剂盒，其中白细胞磁性标记的溶液体系为：pH7.4PBS，10％胎牛血清，2mMEDTA；白细胞在磁场中去除的溶液体系为：pH7.4PBS，0.1％胎牛血清，2mMEDTA。
更进一步，本发明的目的是基于下列几步技术方案实现的：
第一步：筛选适合与CD45连用进一步磁性标记白细胞的抗原。发明人通过以下步骤筛选出候选靶抗原：
①筛选仅在白细胞特异性表达的抗原：发明人根据目前公布的CD抗原种类，从CD1a～CD363(除CD45外)中筛选出了8种仅在白细胞表达而在其它血液组成部分(例如红细胞和血小板等)中不表达的白细胞抗原，分别是：CD11a；CD18；CD44；CD48；CD50；CD52；CD53；CD99。
②进一步筛选肿瘤细胞不表达的白细胞特异性抗原：发明人根据已经发表的文献，通过Pubmed网站检索了上述8种抗原与肿瘤细胞的关系。结果显示，CD11a、CD18和CD50能与肿瘤细胞发生间接连接，CD44已经被人为是肿瘤干细胞的标志物，CD99和CD48在乳腺癌细胞中表达。迄今为止，未见任何报道显示CD52和CD53在肿瘤细胞中表达或能与肿瘤细胞能发生间接连接，因此CD52和CD53被作为候选靶抗原。
第二步：候选靶抗原标记白细胞的效率检验：发明人分别使用CD53和CD52单克隆抗体(PE标记)，检测了这两种抗原在白细胞上的表达。以明确白细胞表达候选靶抗原的阳性率。
第三步：候选靶抗原去除白细胞的效率检验：发明人分别使用CD53和CD52单克隆抗体磁性标记白细胞，检验了这两种抗体在磁场中去除白细胞的效率。
第四步：最终确定的靶抗原与CD45连用去除白细胞的效率检验：发明使用最终确定的靶抗体，与CD45连用，检验了不同方法去除白细胞的效率差别。
具体的技术流程主要包括以下几个部分：
1.血样品去除红细胞：采用红细胞裂解液(含154mMNH4Cl、10mMKHCO3以及0.1mMEDTA的超纯水溶液)去除其中的红细胞。
2.CD45抗体磁性标记白细胞，并在磁场中去除白细胞：
(1)白细胞按照1x108/mL重悬于含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀；
(2)按照每毫升细胞溶液加入100μL一端连接CD45抗体、另一端连接抗葡聚糖抗体的Tetramer四聚体复合物溶液，混匀后冰浴15min；
(3)按照每毫升细胞溶液加入50μL包被葡聚糖抗体的纳米磁珠溶液，混匀后冰浴8min；
(4)加入含0.1％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)至2.5mL，放入磁场静置5min；倒出的细胞溶液即为第一次富集后的CTCs溶液。
3.CD53抗体磁性标记白细胞，并在磁场中去除白细胞：
(1)上述富集后的细胞经300g,5min，4℃离心弃去上清液后，重悬于100μL含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀；
(2)用PE标记的CD53单克隆抗体免疫荧光染色10分钟后，用PBS洗1次，300g,5min，4℃离心弃去上清液；
(3)按照每毫升细胞溶液加入100μL一端连接PE染料抗体，另一端连接抗葡聚糖抗体的四聚体抗体复合物溶液，混匀后冰浴15min；
(4)按照每毫升细胞溶液加入50μL包被葡聚糖抗体的纳米磁珠溶液，混匀后冰浴8min；
(5)加入含0.1％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)至2.5mL，放入磁场静置5min；倒出的细胞溶液即为第二次富集的CTCs溶液。
4.试剂盒的制备方法
CD45抗体与纳米磁珠形成磁性复合物，在磁场中对白细胞做第一次去除。富集后的细胞经CD53抗体与纳米磁珠再次形成复合物，在磁场中对白细胞做第二次去除。试剂盒中还可以包括商业化或者自配的红细胞裂解液以及CD53单克隆抗体。
以下是本发明进一步的说明：
发明人使用干细胞公司(StemCellsTechnologies,Inc,Vancouver,BC,Canada)提供的抗体复合物和纳米磁珠(HumanCD45DepletionKit，Catalog#18289,PEselectionkit,Catalog18551,EasySep,StemCellsTechnologies,Inc,Vancouver,BC,Canada),以及BD公司生产的PEAnti-HumanCD53单克隆抗体(产品编号为555508)建立了CTCs的富集方法。通过抗体复合物、纳米磁珠以及CD53单克隆抗体的组合构成了相关富集试剂盒。
本发明有益效果：
本发明提供的高纯度CTCs富集方法的优越性在于：本方法能够“无偏见”地富集得到高表达、低表达以及不表达EpCAM抗原的CTCs，比现有的Cellsearch等仪器在原理上更加优越，尤其在提高CTCs纯度上比目前普遍使用的磁分离方法(例如Cellsearch仪器)提高100倍左右，弥补了现有磁分离方法在富集CTCs上获得的纯度低这一缺陷。迄今为止，未见报道显示有任何技术能够在“无偏见”富集CTCs的同时还能够同时获得高的CTCs纯度。因此，发明人建立的方法突破了CTCs用于临床应用的技术瓶颈，为临床医生通过CTCs指导肿瘤患者的“个体化”治疗提供了技术支持。
附图说明
图1：白细胞表达CD53和CD52的流式细胞检测结果。(灰阶图上红色无法显示，附图1中红色为偏右侧颜色略浅部分)
图2：细胞梯度加入法验证该方法在富集高表达EpCAM的CTCs上的效率：(i)每2mL外周血中分别加入(A)0、(B)10、(C)50、(D)100、(E)500个高表达EpCAM的PC9肺癌细胞，使用建立的富集方法富集血中高表达EpCAM的PC9细胞，经EpCAM免疫荧光染色后，流式细胞仪检测出的高表达EpCAM的PC9细胞数量和纯度。(ii)上述梯度加入法得到的高表达EpCAM的PC9细胞数量的线性拟合直线。
图3.细胞梯度加入法验证该方法在富集不表达或低表达EpCAMCTCs上的效率。(i)流式细胞仪检测PC9细胞经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后的EpCAM表达水平(A)PC9细胞的EpCAM表达水平；(B)经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后PC9细胞的EpCAM表达水平。(ii)每2mL外周血中分别加入(A)0、(B)5、(C)25、(D)50、(E)250个经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后的PC9细胞，使用建立的富集方法富集血中的靶细胞后，流式细胞仪检测出的靶细胞数量和纯度，图中的右下象限为靶细胞。(iii)上述梯度加入法得到的靶细胞数量的线性拟合直线。
图4：25例晚期肺癌患者外周血中CTCs富集后的流式细胞仪检测结果。图中右上象限是高表达EpCAM的CTCs，右下象限是不表达EpCAM的CTCs。阳性信号的划分均以各自样品的同型对照作为阴性对照(未列出)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：靶抗原的确定及不同阴性-磁性富集方法的效率对比
发明人通过以下三个方面的实验，确定了用于阴性-磁性去除白细胞的靶抗原以及与CD45连用磁性去除白细胞的流程。
1、流式细胞检测CD52和CD53在白细胞表面的表达。具体步骤为：
①使用真空抗凝(EDTA)采血管收集健康者外周血3mL，
②去除红细胞：采用红细胞裂解液(含154mMNH4Cl、10mMKHCO3以及0.1mMEDTA的超纯水溶液)去除其中的红细胞。
③白细胞按照1x107/mL重悬于含2％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀；
④上述白细胞溶液各取100μL，分别加入4个5mL流式管中，然后分别加入PE标记的CD53和CD52单克隆抗体以及相应的同型对照MsIgG1,κ和MsIgG3,κ(BD公司，终浓度均为1μg/mL，下同)，免疫荧光染色10分钟后，PBS洗1次，300g,5min，4℃离心，弃去上清液；
⑤流式细胞仪检测CD52和CD53在白细胞表面的表达。
结果显示，白细胞表达CD53的总体阳性率均明显高于CD52。CD52仅在淋巴细胞中的表达很高。这表明，CD53标记白细胞的效率要大大高于CD52。
图1白细胞表达CD53和CD52的流式细胞检测结果。
表1白细胞中CD52和CD53表达的流式细胞分类检测结果
2、CD52和CD53分别通过阴性-磁性法去除白细胞的效率检验。发明人通过肺癌PC9细胞系加入健康人外周血来模拟肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞，检验了基于CD52和CD53阴性-磁性法去除白细胞的效率，并与普遍使用的CD45阴性-磁性去除白细胞的结果进行了对比。具体步骤为：
①使用真空抗凝(EDTA)采血管收集健康者外周血6mL，3等分后分别转入3个离心管(标记为A、B、C管)。
②收获PC9细胞：使用含5mMEDTA的PBS溶液(pH7.4)收获对数生长期的PC9细胞，悬浮于含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH7.4)，细胞计数并经胎盘兰排除死细胞。
③PC9细胞的梯度稀释：根据上述计数结果得到的细胞浓度，用含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH7.4)进行梯度稀释，配制成1×103/mL的细胞溶液。
④上述PC9细胞溶液各取100μL，分别加入A、B、C管后，采用红细胞裂解液(含154mMNH4Cl、10mMKHCO3以及0.1mMEDTA的超纯水溶液)去除其中的红细胞，并按照1x107/mL重悬于含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀。
⑤分别用PE标记的CD53(A)和CD52(B管)单克隆抗体进行免疫荧光染色10分钟，PBS洗1次，4℃下300g离心5min后弃去上清液，并按照1x108/mL浓度重悬于含10％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)，混合均匀。
⑥按照每毫升细胞溶液A和B管中分别加入100μL抗-PE抗体复合物，C管加入100μLCD45抗体复合物，冰浴15min。
⑦各管按照每毫升细胞溶液加入50μL包被葡聚糖抗体的纳米磁珠溶液，混匀后冰浴8min。
⑧各管分别加入含0.1％胎牛血清和2mMEDTA的PBS溶液(pH,7.4)至2.5mL，放入磁场静置5min；倒出的细胞溶液即为富集后的细胞溶液。
⑨富集后的细胞经APC标记的EpCAM单克隆抗体(BD公司，产品编号为347200)的免疫荧光染色后使用流式细胞仪定量检测靶细胞的数量和纯度。
结果显示，CD53、CD52以及CD45阴性-磁性去除白细胞后，PC9细胞的回收率均接近。然而，仅有CD53阴性-磁性法与CD45阴性-磁性法富集PC9细胞的纯度接近，CD52阴性-磁性法富集PC9细胞上几乎没有任何效果。这与流式细胞检测的结果一致。这表明，CD53是除了CD45外能用于白细胞去除的最佳靶抗原。
表2.CD52和CD53分别用于富集血液中肿瘤细胞的效率
3、不同阴性-磁性富集方法在分离CTCs上的效率。
发明人通过肺癌PC9细胞系加入健康人外周血来模拟肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞，使用如下步骤对比了不同阴性-磁性富集方法在分离CTCs上的效率。具体步骤为：
①使用与上述方法2中相同的步骤①～④获得3等份的含有PC9肿瘤细胞的白细胞溶液(分别标记为A、B、C管)；
②A管细胞使用PE标记的CD53单克隆抗体通过与上述2中相同的步骤⑤～⑨富集其中的PC9细胞，该方法用于检验单独使用CD53阴性-磁性法富集CTCs的效率。
③B管细胞加入CD45抗体复合物，通过与上述2中相同的步骤⑥～⑨富集其中的PC9细胞，该方法用于检验单独使用CD45阴性-磁性法富集CTCs的效率。
④C管细胞首先采用步骤③富集其中的PC9细胞后，接着采用步骤②富集其中的PC9细胞，该方法用于检验CD45和CD53连用的阴性-磁性法富集CTCs的效率。
⑤富集后的细胞经EpCAM单克隆抗体的免疫荧光染色后使用流式细胞仪定量检测靶细胞的数量和纯度。
结果显示，三种方法富集PC9细胞的回收率可比，然而，CD45与CD53连用的阴性-磁性法获得的靶细胞纯度要比单独使用CD45或者CD53提高100倍以上。这表明，CD45与CD53连用的阴性-磁性法在提高CTCs的纯度上要比现有的同类技术更加优越。
表3.不同方法的富集效率对比
实施例2：发明的方法在富集高表达EpCAM的CTCs上的效率检验
发明人使用肺癌细胞系PC9(该细胞高表达上皮标志物EpCAM)来模拟外周血中的CTCs，通过健康者外周血中加入不同数量的PC9细胞，并经同样的流程富集其中的PC9细胞，以检验发明的方法在富集高表达EpCAMCTCs上的效率。具体步骤为：
1、使用真空抗凝(EDTA)采血管收集健康者外周血10mL，并将外周血5等分分别转入5个离心管。
2、使用与实施例1-2中相同的步骤②收获PC9细胞。
3、使用与实施例1-2中相同的步骤③，分别配制成1×102/mL、5×102/mL、1×103/mL、5×103/mL的PC9细胞溶液。
4、使用与实施例1-2中相同的步骤④，获得含不同PC9细胞数量的白细胞溶液。
5、使用与实施例1-3中相同的步骤④，富集其中的PC9细胞。
6、使用与实施例1-3中相同的步骤⑤，鉴定富集的PC9细胞的回收率和纯度。
结果显示，使用该方法富集后，高表达EpCAM的PC9细胞的回收率在68.8～74％之间，这与报道的CellSearch仪器的结果以及国外学者目前使用的阴性-磁分离的结果处于同一水平。然而，该方法富集PC9细胞后获得的肿瘤细胞纯度在3.4～17.0％之间，CellSearch仪器和目前使用的阴性-磁分离法获得的纯度仅在0.1～1％左右。这表明，发明人建立的方法在富集高表达EpCAM的CTCs上获得的纯度要比现有的同类技术更加优越。
图2：细胞梯度加入法验证该方法在富集高表达EpCAM的CTCs上的效率：(i)每2mL外周血中分别加入(A)0、(B)10、(C)50、(D)100、(E)500个高表达EpCAM的PC9肺癌细胞，使用建立的富集方法富集血中高表达EpCAM的PC9细胞，经EpCAM免疫荧光染色后，流式细胞仪检测出的高表达EpCAM的PC9细胞数量和纯度。(ii)上述梯度加入法得到的高表达EpCAM的PC9细胞数量的线性拟合直线。
表4.PC9细胞富集后的回收率与纯度。
实施例3：发明的方法在富集低表达和不表达EpCAMCTCs上的效率验证。
发明人使用转化生长因子-β(5ng/mL)刺激PC9细胞6天，使之发生上皮-间质转化，从而获得低表达和不表达EpCAM的PC9细胞，以此来模拟外周血中低表达和不表达EpCAM的CTCs，并经同样的流程富集其中的PC9细胞，以检验发明的方法在富集低表达或不表达EpCAM的CTCs上的效率。具体步骤为：
1、转化生长因子-β刺激PC9细胞使之发生上皮-间质转化：对数生长期的PC9细胞在DMEM无血清培养基(含0.1％BSA)中饥饿24小时后，在该无血清培养基中加入转化生长因子-β(终浓度为5ng/mL)，刺激6天(每3天更换一次含5ng/mL转化生长因子-β的无血清培养基)。使之发生上皮-间质转化，从而EpCAM下调。
2、使用EpCAM下调的PC9细胞，采用与实施例2相同的步骤1～4，富集其中EpCAM下调的PC9细胞。
3、富集后的细胞使用FITC标记的Cytokeratin单克隆抗体(BD公司，产品编号为347653)进行免疫荧光染色，并通过流式细胞仪检测靶细胞的数量和纯度。
结果显示，经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后，PC9细胞的EpCAM表达水平从92.7％下调至10.2％，存在低表达和不表达EpCAM的PC9细胞。使用发明的方法从外周血中对这些细胞进行富集，低表达和不表达EpCAM的PC9细胞回收率在64～80％之间，纯度在2.3～25.3％之间。回收率与CellSearch仪器的结果和国外学者目前使用的阴性-磁分离的结果处于同一水平。然而CTCs的纯度远高于使用后两者方法得到的纯度。这表明，发明人建立的方法在富集低表达或不表达EpCAM的CTCs上获得的纯度要比现有的同类技术更加优越。
图3.细胞梯度加入法验证该方法在富集不表达或低表达EpCAMCTCs上的效率。(i)流式细胞仪检测PC9细胞经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后的EpCAM表达水平(A)PC9细胞的EpCAM表达水平；(B)经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后PC9细胞的EpCAM表达水平。(ii)每2mL外周血中分别加入(A)0、(B)5、(C)25、(D)50、(E)250个经转化生长因子-β(5ng/mL)刺激6天后的PC9细胞，使用建立的富集方法富集血中的靶细胞后，流式细胞仪检测出的靶细胞数量和纯度，图中的右下象限为靶细胞。(iii)上述梯度加入法得到的靶细胞数量的线性拟合直线。
表5.梯度加入法得到的回收率与纯度。
注：本实施例中的PC9细胞使用Cytokeratin进行鉴定。原因是由于转化生长因子-β诱导后，PC9细胞的EpCAM大幅度下调，然而已被普遍用于CTCs鉴定的Cytokeratin在此过程中依然表达阳性。
实施例4肺癌患者外周血中CTCs的富集
发明人使用建立的方法富集了25例晚期非小细胞肺癌患者外周血中的CTCs，以检验发明的方法在临床试剂样品中的效果。具体步骤为：
1、使用真空抗凝(EDTA)采血管收集晚期非小细胞肺癌患者的外周血各7.5mL。
2、使用同样的红细胞裂解液去除红细胞后，与实施例2相同的步骤1～4，富集其中的循环肿瘤细胞。
3、富集后的循环肿瘤细胞分别进行EpCAM、Cytokeratin以及相应同型对照的免疫荧光染色后，经流式细胞仪定量检测其中高表达和不表达EpCAM的CTCs数量及纯度。
发明人根据国内外学者通常的做法定义CD45-CD53-Cytokeratin+细胞为CTCs。结果显示，富集出的CTCs平均纯度为15.8％，最高可达84％左右。此外，富集出高表达EpCAM的CTCs平均数量为18.0个/mL血(0～119个/mL血)，富集出不表达EpCAM的CTCs平均数量为259.8个/mL血(5～5770个/mL血)。MatthewG等2011年发表在JournalofClinicalOncology上的结果显示，使用Cellsearch仪器(基于EpCAM富集CTCs的原理)富集CTCs时，仅有15％的IV期非小细胞肺癌患者的CTCs数量大于5个/7.5mL血。而使用该方法时，IV期非小细胞肺癌患者的CTCs检出率为78.7％(11/14)并且数量均显著高于5个/7.5mL血。更为重要的是，使用该方法获得的结果显示，非小细胞肺癌患者的外周血中存在大量EpCAM阴性的CTCs，这是Cellsearch仪器富集效果所不能比拟的。这表明，使用发明人建立的方法在富集EpCAM阴性CTC上具有优越性。此外，CellSearch仪器和其它阴性-磁性分离法获得的CTCs纯度仅在0.1～1％之间，难以满足进一步的分子分型要求，而该方法富集出的CTCs平均纯度为15.77％，远高于Cellsearch以及其它同类技术。这表明，发明人建立的方法在富集临床血样品中的CTCs时获得的纯度要比现有的同类技术优越。
图4：25例晚期肺癌患者外周血中CTCs富集后的流式细胞仪检测结果。图中右上象限是高表达EpCAM的CTCs，右下象限是不表达EpCAM的CTCs。阳性信号的划分均以各自样品的同型对照作为阴性对照(未列出)。
表6：25例晚期肺癌患者外周血使用该方法富集后获得的CTCs数量和纯度。
实施例5用于CTCs富集试剂盒的制作
CTCs富集试剂盒的制作和操作流程基于前面提及的具体技术流程。该试剂盒含有CD45单克隆抗体、PE标记的CD53单克隆抗体、纳米磁珠、用于连接CD45单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物、以及用于连接PE标记的CD53单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物。其中白细胞磁性标记的溶液体系组成为：PBS(pH7.4)；10％胎牛血清；2mMEDTA。其中白细胞在磁场中去除的溶液体系为：PBS(pH7.4)；0.1％胎牛血清；2mMEDTA。此外，还可以有红细胞去除和分选细胞缓冲液等常用试剂，如：红细胞裂解液、EDTA缓冲液(pH7.4)等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的。此试剂盒的价值在于只需要额外配置磁铁即可实现外周血中CTCs的高效富集，操作简单，因此将此试剂盒投入实践，可在临床上用于肿瘤患者的预后判断并指导“个体化”治疗，尤其是肺癌的分子靶向治疗。

Claims (8)

1.一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于该方法采用2次磁分离技术，一次对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除，一次对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除，得到高纯度循环肿瘤细胞CTCs。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于磁分离技术为CTCs阴性-磁分享技术。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的CD45抗原与CD45抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞；
对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的CD53抗原与CD53抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括将血样品中红细胞去除，然后先对白细胞进行CD45抗原磁性标记与磁场去除，再对白细胞进行CD53抗原磁性标记与磁场去除。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于CD45抗体为单克隆抗体，CD53抗原为单克隆抗体。
6.一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有CD45单克隆抗体、PE标记的CD53单克隆抗体、纳米磁珠、用于连接CD45单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物、以及用于连接PE标记的CD53单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有白细胞磁性标记的溶液体系，和/或白细胞在磁场中去除的溶液体系。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于白细胞磁性标记的溶液体系为：pH7.4PBS，10％胎牛血清，2mMEDTA；白细胞在磁场中去除的溶液体系为：pH7.4PBS，0.1％胎牛血清，2mMEDTA。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198963A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法
CN106366198A (zh) * 2016-08-31 2017-02-01 上海美吉生物医药科技有限公司 一种免疫磁珠及其制备方法
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CN107287107A (zh) * 2016-03-30 2017-10-24 无锡纳奥生物医药有限公司 一种循环肿瘤细胞分离设备、系统及方法
CN107462724A (zh) * 2016-08-30 2017-12-12 上海浦美生物医药科技有限公司 血液中循环肿瘤细胞的检测方法
CN108489795A (zh) * 2018-03-21 2018-09-04 上海浦美生物医药科技有限公司 一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法
CN109507427A (zh) * 2017-09-14 2019-03-22 上海白泽医学检验所有限公司 一种基于高亲和力cd45兔单抗的循环肿瘤细胞高效富集方法及其应用
CN109991410A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 上海白泽医学检验所有限公司 一种含抗cd45单抗的组合物及其使用方法
CN110133294A (zh) * 2019-06-18 2019-08-16 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 一种外周血ctc的捕获方法和检测方法
CN112111456A (zh) * 2020-08-28 2020-12-22 益善生物技术股份有限公司 一种循环肿瘤细胞分离富集试剂盒
CN114964996A (zh) * 2022-06-10 2022-08-30 江苏格诺生物科技有限公司 一种免疫磁珠负向富集循环肿瘤细胞的方法

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106645724A (zh) * 2016-12-21 2017-05-10 上海浦美生物医药科技有限公司 循环肿瘤细胞表面标志分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3的检测方法
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