CN108489795A - 一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法。具体步骤如下：(1)制备FPBS重悬的尿液细胞；(2)将APTES加入到培养皿，避光放置、洗涤烘干；(3)将重悬的尿液细胞加入APTES培养皿中培养，再依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；(4)吸除培养皿中的脱脂牛奶(5)向脱脂牛奶中加入anti‑CK抗体和CD45抗体，混合均匀后加入培养皿中，避光孵育；加入DAPI，常温避光孵育；吸除抗体，再加入PBS扫描；(6)吸除脱脂奶粉后，显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色。本发明方法用于无创检测膀胱癌，具有高敏感性和高特异性。

Description

一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法
技术领域
本发明涉及一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
膀胱癌以尿路上皮癌(urothelium carcinoma，UC)最为常见，占90％以上，其中非浸润性乳头状UC、原位癌及浸润深度不超过固有层的UC统称为浅表性UC。目前膀胱癌诊断及术后随访最常用的方法包括膀胱镜、影像学检查、尿脱落细胞学检查、荧光原位杂交和一些尿液肿瘤标志物等。膀胱镜是创伤性检查，可增加患者痛苦，且禁忌症较多；影像学检查对病灶较小的肿瘤敏感性低，且存在一定的假阳性率；尿脱落细胞学特异性高，但对低级别UC敏感性低。除此之外，尿液肿瘤标记物也是目前研究和使用的热点，包括端粒酶检测、膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen，BTA)、核基质蛋白、透明质酸和透明质酸酶等。膀胱癌尿脱落细胞端粒酶活性的表达与非肿瘤比较差异有统计学意义，即使在低级别的膀胱癌，端粒酶的敏感性也达到90％以上，明显高于膀胱镜，但端粒酶活性检测假阳性率较高，需要进一步研究。核基质蛋白22(nuclear matrix protein 22，NMP22)是核基质蛋白家族的一员，当细胞恶变时，核内遗传物质在分裂末期分配季度异常，NMP22合成激增，膀胱癌患者敏感性为67.6％，尿路上皮癌症患者尿液中NMP22阳性率为61.9％，非尿路上皮癌患者尿液中阳性率为50％。但在膀胱癌术后患者的监测中，NMP22的水平易受到泌尿系统一些良性病变(如泌尿系感染、尿路结石、血尿等)的影响而增高，导致NMP22检测结果假阳性。利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术，能够分析检测标本中染色体异常改变的部分。据报道，FISH检测膀胱癌的敏感性为29.1％，特异性为96.9％，其敏感性虽优于传统尿细胞学，但其假阳性率较高，诊断时缺乏统一的阳性判断标准，检测费用亦较高，因而制约了其在临床诊断中的使用。综上所述，寻找一种无创、高敏感性及高特异性的检查方法用于膀胱癌的诊断和术后随访是非常必要的。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法。本发明方法对于膀胱癌检测具有无创、高敏感性和高特异性的优点。
本发明中，为尽可能多的收集尿液细胞，并且避免在荧光扫描时有细胞团或细胞簇而影响扫描计数，本发明对培养皿进行特殊处理。本发明通过用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)润洗培养皿表面，其结构一端含有与玻璃中硅相连的烷氧基，另一端含有与细胞膜上磷脂双分子层结合的活性基团氨基，这样可以让单个细胞紧密的贴合在培养皿底部。进而利用免疫荧光的方法对肿瘤细胞进行特异性标记，通过全自动荧光扫描和软件计数，对尿液中的肿瘤细胞统计分析。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法，具体步骤如下：
(1)取100mL尿液离心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿液细胞；
(2)将培养皿清洗后，将2wt％APTES溶液加入到培养皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，纯水清洗若干次后，培养皿置于75～85℃的烘箱中烘干；
(3)将步骤(1)的FPBS重悬的尿液细胞加入到步骤(2)中的APTES培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；
(4)吸除步骤(3)的培养皿中的脱脂牛奶后，向培养皿中加入PBST清洗；
(5)向1ml 5wt％脱脂牛奶中加入2μL的anti-CK抗体和3μL的CD45抗体，混合均匀后加入到培养皿中，4℃避光孵育过夜；吸除抗体，用PBST清洗，加入1mL的DAPI，常温避光孵育1小时；吸除抗体，用PBST清洗，再加入1mL的PBS扫描；使用GE Cytell细胞成像系统进行扫描；
(6)吸除脱脂奶粉后，在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色；观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。
本发明中，步骤1)中，尿液为晨尿。
本发明中，步骤2)中，烘干时间为1～2h。
本发明中，步骤3)中，吸出多余液体，加入4wt％多聚甲醛1ml，4℃放置10min；吸出多余液体，加入预冷甲醇1ml，-20℃放置10min；吸出多余液体，加入2mlPBS进行洗涤；吸出多余液体，加入1mlPBS进行洗涤；吸出多余液体，加入1ml 5wt％脱脂牛奶室温封闭30min。
本发明中，步骤3)中，PBS清洗3～5次；步骤4)和步骤5)中，PBST清洗3～5次。
和现有技术相比，本发明方法用于膀胱癌的检测，检测结果准确，具有高敏感性和高特异性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。
实施例1
一、样品准备
1.晨尿：早晨5点至6点留尿(由于时间因素，一般建议7点左右)；
2.体位选择：采集尿标本时采取蹲位或者是坐位前方接取尿液(避免女性阴道分泌物对标本的影响)；
3.保存：尿液标本留取后应在2h内及时处理，或置于2～8℃冰箱内保存，但不宜超过6h；
4.尿液离心：取尿液100ml，200g离心5min后，以1ml含有1％FBS的PBS将沉淀重悬。二、处理培养皿
1.将培养皿置于等离子清洗仪中清洗15min，使其表面粘性增加，以便与APTES结合，APTES的结构式如下所示：
2.配制2％APTES；
3.将1ml 2％APTES加入到培养皿表面，避光放置1小时，使APTES与培养皿中硅原子充分结合；
4.吸除多余的APTES，用纯水清洗培养皿5-6次；
5.将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时，使APTES充分固定于培养皿表面。
三、尿液样品处理
1.将1ml 1％FPBS重悬的尿液细胞加入APTES培养皿中，37℃培养1h；
2.将培养皿放置4℃10min；
3.缓慢吸出多余液体，加入4％多聚甲醛1ml，4℃放置10min；
4.缓慢吸出多余液体，加入预冷甲醇1ml，-20℃放置10min；
5.缓慢吸出多余液体，加入2mlPBS进行洗涤；
6.缓慢吸出多余液体，加入1mlPBS进行洗涤；
7.缓慢吸出多余液体，加入1ml 5％脱脂牛奶室温封闭30min。
四、荧光标记鉴别肿瘤细胞
1.吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST(即含0.02％Tween-20的PBS)清洗4次，每次5min；
2.向1ml 5％脱脂牛奶中加入2μL的anti-CK(即抗体)和3μL的CD45抗体，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；
3.吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI(即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测)，常温避光孵育30min；
4.吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描；
5.在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。
五、数据分析
我们共收集200例尿路上皮癌和50例对照组，和病理结果以及脱落细胞检测结果对比，使用Kappa检验对脱落细胞学检测与病理检测结果的一致性进行分析，其p值为0.173＞0.05，不具有统计学意义，说明脱落细胞学检测结果与病理检测结果不具有一致性。使用Kappa检验对本方法检测与病理检测结果的一致性进行分析，其p值小于0.0001，具有统计学意义，说明UTC检测结果与病理检测结果具有一致性。本检测方法的敏感性为79.6％，特异性为85.7％，传统的脱落细胞学检测敏感性为32.6％，特异性为91.7％。本方法在敏感性上远高于脱落细胞学检测。

Claims (5)

1.一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取100mL尿液离心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿液细胞；
(2)将培养皿清洗后，将2wt％APTES溶液加入到培养皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，纯水清洗若干次后，培养皿置于75～85℃的烘箱中烘干；
(3)将步骤(1)的FPBS重悬的尿液细胞加入到步骤(2)中的APTES培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；
(4)吸除步骤(3)的培养皿中的脱脂牛奶后，向培养皿中加入PBST清洗；
(5)向1ml 5wt％脱脂牛奶中加入2μL的anti-CK抗体和3μL的CD45抗体，混合均匀后加入到培养皿中，4℃避光孵育过夜；吸除抗体，用PBST清洗，加入1mL的DAPI，常温避光孵育1小时；吸除抗体，用PBST清洗，再加入1mL的PBS扫描；使用GE Cytell细胞成像系统进行扫描；
(6)吸除脱脂奶粉后，在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色；观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，尿液为晨尿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，烘干时间为1～2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，吸出多余液体，加入4wt％多聚甲醛1ml，4℃放置10min；吸出多余液体，加入预冷甲醇1ml，-20℃放置10min；吸出多余液体，加入2mlPBS进行洗涤；吸出多余液体，加入1mlPBS进行洗涤；吸出多余液体，加入1ml5wt％脱脂牛奶室温封闭30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PBS清洗3～5次；步骤4)和步骤5)中，PBST清洗3～5次。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111077148A (zh) * 2019-12-19 2020-04-28 苏州浚惠生物科技有限公司 一种尿液异常代谢细胞捕获和检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105067808A (zh) * 2015-07-30 2015-11-18 南京医科大学 一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒
CN105115878A (zh) * 2015-09-11 2015-12-02 上海交通大学 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用
CN104062428B (zh) * 2014-07-09 2016-08-17 郑勤 一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒
CN107462724A (zh) * 2016-08-30 2017-12-12 上海浦美生物医药科技有限公司 血液中循环肿瘤细胞的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104062428B (zh) * 2014-07-09 2016-08-17 郑勤 一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒
CN105067808A (zh) * 2015-07-30 2015-11-18 南京医科大学 一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒
CN105115878A (zh) * 2015-09-11 2015-12-02 上海交通大学 一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用
CN107462724A (zh) * 2016-08-30 2017-12-12 上海浦美生物医药科技有限公司 血液中循环肿瘤细胞的检测方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111077148A (zh) * 2019-12-19 2020-04-28 苏州浚惠生物科技有限公司 一种尿液异常代谢细胞捕获和检测方法

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