CN107462724A - 血液中循环肿瘤细胞的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤细胞领域，具体为一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：a. 全血处理；b. 细胞全富集；c. 细胞固定；d. 封闭及抗体孵育；e. 扫描。本发明无分离，全富集，精度高。

Description

血液中循环肿瘤细胞的检测方法

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞领域，具体为一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。

背景技术

原发肿瘤生长到一定阶段会侵扰周围血管，首先通过整联蛋白附着于血管基底膜处生长，随着肿瘤细胞逐渐增多，其分泌的基底金属蛋白酶也逐渐增加，通过逐步消化掉IV型胶原蛋白，突破基底膜屏障进入血液，即被称为循环肿瘤细胞（即CTC），CTC进入血液后会随着血液循环游走全身，形成复发转移。CTC是一种新型肿瘤标志物，通过检测CTC数量可对肿瘤进行确诊、判断预后和监控疗效，通过对比手术和放化疗前后血液中的CTC数量，可以判断治疗是否有效。

目前CTC富集的方法主要有两类。第一类是基于抗体分离CTCs（CTCs是CTC的复数形式）。最常见的是正性分离，即用抗体与CTCs表面受体结合来分离。这类技术通常以EpCAM抗体标记的磁珠与表达EpCAM的CTCs结合来分离CTCs。正性分离的缺陷在于：很多肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM。如：超过一半的ALK基因融合阳性的肺癌CTCs弱表达甚至完全不表达EpCAM，从而导致检测结果假阴性。另一种是负性分离，利用CD45抗体标记的磁珠去除白细胞后，收集剩余细胞做CTCs检测。负性分离的效率在50~80%间大幅波动。主要原因在于CTCs会吞噬磁珠，亦或因CTCs与白细胞粘连而被去除，导致分离效率不稳定，甚至在同一病人一个时间点收集的两份血样中，检测到的CTCs数目能出现数量级差异。而最近俄亥俄州立大学肿瘤中心确认了在患者体内，有些癌细胞同时表达CD45和CK。因此利用负性分离也有严重假阴性结果。

总之，利用抗体分离CTCs亟需解决假阴性率高的问题。第二类是基于CTCs物理特性，如大小、密度、表面电荷等，去分离检测CTCs。其中最具代表性的是利用细胞大小来分离。在过滤器件上设计8微米孔阵列，设想CTCs直径普遍都在12 微米以上，且细胞变形性差，故可把CTCs分离出来。但实际分离效果不尽如人意。在临床样本中，直径12μm，甚至8μm的肿瘤细胞经常出现。白细胞尚可通过主动耗能，以阿米巴运动方式，跨越仅几微米宽的血管内皮缝隙，进入到血管周围组织间隙，耗时仅2min～12min。且在过滤过程中，细胞物理性地卡在微孔中，细胞前后两段存在巨大压力差，细胞多有破损。而恶性肿瘤细胞变形性更好，完全可以在几分钟内被动挤过8微米直径的孔隙。因此，传统的利用大小来分离CTCs的技术也有严重的假阴性问题。综上，目前CTCs的检测技术方法都存在缺陷。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，提供一种全富集、高精度的肿瘤细胞富集方法，本发明公开了一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法。

本发明通过如下技术方案达到发明目的：

一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：

a. 全血处理：

向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；

200RCF（即relative centrifugal force，意为相对离心力，数值表明离心加速度除以重力加速度后所得的倍数）下离心5min，吸除上清液（上清液指在做血液分层试验中位于沉积固体上层的透明液体，成分为血浆，又称清液层），保留细胞；

向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；

b. 细胞全富集：

加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H₂NCH₂CH₂CH₂Si(OC₂H₅)₃，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；

培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；

c. 细胞固定：

吸除FPBS，向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；

吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃环境中静置10min；

吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；每次加入PBS时沿培养皿的侧壁加入，避免将细胞冲起；

d. 封闭及抗体孵育：

向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液，在4℃环境下避光孵育1hour；

封闭液的配制方法是：首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉，然后向脱脂奶粉中加入Tween-20使Tween-20的浓度为0.02%(V/V)，即为封闭液，m/V指溶质质量/溶液体积，V/V指溶质体积/溶液体积；

吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST（即含0.02%Tween-20的PBS）清洗4次，每次5min；

向500μL封闭液中加入2μL的anti pan cytokeratin和3μL的CD45，anti pancytokeratin即抗广谱细胞角蛋白，CD45即白细胞共同抗原，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；

CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原，由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物P56lck和P59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，CD45的分布可作为某些T细胞亚群的分类标志。

吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI，DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测，常温避光孵育30min；

e. 扫描：

吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描。

所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：还包括f步骤鉴定循环肿瘤细胞：

在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态特征的为循环肿瘤细胞，一定形态特征包括：比较圆润，最长径不低于12μm，有明显细胞核且核质比较大，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。

所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：步骤b细胞全富集时，APTES处理培养皿的步骤如下：

i. 将培养皿置于等离子清洗仪中清洗12min，使培养皿表面粘性增加，以便与APTES结合；

ii. 用质量百分比浓度为2%的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，使APTES与培养皿中的硅原子充分结合；

iii. 吸除多余的APTES，用纯水清洗培养皿5～6次；

iv. 将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时，使APTES充分固定于培养皿表面，处理完毕。

本发明的主要特点是无分离，全富集。首先对血液进行红细胞裂解，利用纳米技术使剩余有核细胞（主要是CTC和淋巴细胞）全部平铺富集在纳米基底上固定，然后用细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞，之后通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-CK进行阳性筛选和白细胞共同抗原抗体anti-CD45进行阴性筛选，这样既不依赖于肿瘤类型，也可以保证检测的准确性。，再经过高通量技术扫描，机器判读识别CTC。这样一来，避免了分离导致的CTC流失，也避免了人为显微镜判读误差。

附图说明

无。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。

实施例1

一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，按如下步骤依次实施：

a. 全血处理：

将市售的10×红细胞裂解液稀释至1×，向2mL全血中加入200μL的1×红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；

200RCF（即relative centrifugal force，意为相对离心力，数值表明离心加速度除以重力加速度后所得的倍数）下离心5min，吸除上清液（上清液指在做血液分层试验中位于沉积固体上层的透明液体，成分为血浆，又称清液层），保留细胞；

向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；

b. 细胞全富集：

加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H₂NCH₂CH₂CH₂Si(OC₂H₅)₃，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；

APTES处理培养皿的步骤如下：

i. 将培养皿置于等离子清洗仪中清洗12min，使培养皿表面粘性增加，以便与APTES结合；

ii. 用质量百分比浓度为2%的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，使APTES与培养皿中的硅原子充分结合；

iii. 吸除多余的APTES，用纯水清洗培养皿5～6次；

iv. 将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时，使APTES充分固定于培养皿表面，处理完毕；

培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；

c. 细胞固定：

吸除FPBS，向培养皿中加入4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；

吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃环境中静置10min；

吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；每次加入PBS时沿培养皿的侧壁加入，避免将细胞冲起；

d. 封闭及抗体孵育：

向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液，在4℃环境下避光孵育1hour；

封闭液的配制方法是：首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉，然后向脱脂奶粉中加入Tween-20使Tween-20的浓度为0.02%(V/V)，即为封闭液，m/V指溶质质量/溶液体积，V/V指溶质体积/溶液体积；

吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST（即含0.02%Tween-20的PBS）清洗4次，每次5min；

向500μL封闭液中加入2μL的anti pan cytokeratin和3μL的CD45，anti pancytokeratin即抗广谱细胞角蛋白，CD45即白细胞共同抗原，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；

CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原，由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物P56lck和P59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，CD45的分布可作为某些T细胞亚群的分类标志。

吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI，DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测，常温避光孵育30min；

e. 扫描：

吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描；

f. 鉴定循环肿瘤细胞：

在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足一定形态特征的为循环肿瘤细胞，一定形态特征包括：比较圆润，最长径不低于12μm，有明显细胞核且核质比较大，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。

Claims (3)

1.一种血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：按如下步骤依次实施：

a. 全血处理：

向2mL全血中加入200μL的红细胞裂解液，室温放置15min，放置期间均匀摇晃；

200RCF下离心5min，吸除上清液，保留细胞；

向离心管中加入2mL、质量百分比浓度为1%的FPBS溶液，FPBS即血纤蛋白原结合蛋白，混匀后于200RCF下离心5min，去除上清液；FPBS溶液的体积配比为：FBS:PBS=1:99，FBS全称fetal bovine serum，即胎牛血清，PBS全称Phosphate Buffered Saline，即磷酸盐缓冲液；

b. 细胞全富集：

加入1mL的FPBS溶液，混合均匀后转入用APTES处理的培养皿中，APTES即3-氨丙基三乙氧基硅烷，分子式H₂NCH₂CH₂CH₂Si(OC₂H₅)₃，将培养皿置于37℃摇床中培养45min；

培养后将培养皿置于4℃环境中静置10min；

c. 细胞固定：

吸除FPBS，向培养皿中加入质量百分比浓度为4%甲醛溶液后置于4℃环境中静置10min；

吸除甲醛，加入1mL甲醇，置于-20℃环境中静置10min；

吸除甲醇，用2mL的PBS清洗三次；

d. 封闭及抗体孵育：

向培养皿中加入1mL用PBS配制的封闭液，在4℃环境下避光孵育1hour；

封闭液的配制方法是：首先用PBS配置浓度为5%(m/V)的脱脂奶粉，然后向脱脂奶粉中加入Tween-20使Tween-20的浓度为0.02%(V/V)，即为封闭液，m/V指溶质质量/溶液体积，V/V指溶质体积/溶液体积；

吸除脱脂奶粉后，沿培养皿的侧壁加入2mL的PBST（即含0.02%Tween-20的PBS）清洗4次，每次5min；

向500μL封闭液中加入2μL的anti pan cytokeratin和3μL的CD45，anti pancytokeratin即抗广谱细胞角蛋白，CD45即白细胞共同抗原，混合均匀后沿壁加入培养皿中，4℃避光孵育过夜；

吸除抗体，用PBST清洗三次，加入1mL的DAPI，DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，常温避光孵育30min；

e. 扫描：

吸除抗体，用2mL的PBST清洗三次，加入1mL的PBS扫描。

2.如权利要求1所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：还包括f步骤鉴定循环肿瘤细胞：

在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI-，显绿色则CK+，不显绿色则CK-，显红色则CD45+，不显红色则CD45-，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45-且满足最长径不低于12μm的圆润形态特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。

3.如权利要求1或2所述的血液中循环肿瘤细胞的检测方法，其特征是：步骤b细胞全富集时，APTES处理培养皿的步骤如下：

i. 将培养皿置于等离子清洗仪中清洗12min，使培养皿表面粘性增加，以便与APTES结合；

ii. 用质量百分比浓度为2%的APTES润洗培养皿表面，避光1小时，使APTES与培养皿中的硅原子充分结合；

iii. 吸除多余的APTES，用纯水清洗培养皿5～6次；

iv. 将培养皿置于80℃烘箱烘干1小时，使APTES充分固定于培养皿表面，处理完毕。