KR20150045816A - 미세유동장치 및 이를 이용한 표적 세포 검출 방법 - Google Patents

미세유동장치 및 이를 이용한 표적 세포 검출 방법 Download PDF

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문희성
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삼성전자주식회사
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Abstract

원심력에 의하여 유체의 흐름을 유발하는 미세유동 장치가 개시된다. 미세유동장치는, 표적 세포가 포함된 시료가 수용되는 시료 챔버와, 시료 챔버와 연결되는 유입부와 이 유입부로부터 외측으로 연장되며 표적 세포가 포집되는 검출부와 이 검출부로부터 내측으로 연장된 배출부를 구비하는 U자 형태의 검출 챔버와, 배출부와 연결된 드레임 챔버와, 검출 챔버로 표적 세포의 처리를 위한 하나 이상의 시약을 공급하는 시약 수용부를 포함한다.

Description

미세유동장치 및 이를 이용한 표적 세포 검출 방법{Microfluidic apparatus and target cell detecting method using the same}
액상 세포 검사(liquid based cytology)가 가능한 디스크 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 표적 세포 검출 방법이 개시된다.
임상 세포 검사 방식으로서 스미어(smear) 방식이 있다. 스미어 방식은, 표적 세포(target sell)이 포함된 샘플을 환자로부터 채취하여 슬라이드(slide)에 묻힌 후에 슬라이드에 고정시약(fixative)를 분사하여 샘플을 슬라이드에 고정시키고, 이 슬라이드를 검사실로 옮겨서 전자 현미경 등을 이용하여 표적 세포를 확인하는 방식으로 수행된다. 그러나, 샘플을 슬라이드에 묻히는 과정에서 슬라이드로 옮겨지는 샘플의 양은 채취된 샘플의 양의 약 20% 미만이며, 채취된 샘플의 약 80% 이상이 버려지게 된다. 그러므로, 채취된 표적 세포의 대부분이 버려질 가능성이 있으며, 슬라이드로 옮겨진 샘플의 대표성이 약화되어 환자의 상태에 대한 정확한 진단이 어렵다.
샘플의 대표성을 강화하여 진단의 정확성을 향상시키기 위하여 액상 세포 검사가 제안되었다. 액상 세포 검사에서는 표적 세포(target sell)가 포함된 샘플을 환자로부터 채취하여 액상에서 시약 처리한 후에 검사실로 옮긴다. 검사실에서는 액상의 샘플을 슬라이드에 고정하고, 전자 현미경 등을 이용하여 표적 세포를 확인한다. 이와 같은 방식에 의하면, 버려지는 샘플이 거의 없기 때문에 샘플의 대표성을 확보할 수 있으며 진단에서의 왜곡요인(obscuring fators)를 줄일 수 있어 진단의 정확도를 향상시킬 수 있다.
이와 같은 액상 세포 검사는 채취된 샘플을 액상에서 시약 처리하는 단계와 액상의 샘플을 슬라이드에 고정하는 단계 등이 분리되어 작업자에 의하여 개별적으로 수행된다. 그러므로, 작업자의 숙련도가 샘플의 대표성 및 그에 따른 진단 결과에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 전술한 단계들이 별개의 장비에서 수행되기 때문에 진단 비용이 증가될 수 있다.
액상 세포 검사를 일관된 과정을 통하여 수행할 수 있는 랩-온-어-디스트(lab-on-a-disc)기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 표적 세포 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에 따른 미세유동장치는, 원심력에 의하여 유체의 흐름을 유발하는 미세유동 장치로서, 표적 세포가 포함된 시료가 수용되는 시료 챔버; 상기 시료 챔버와 연결되는 유입부와, 상기 유입부로부터 외측으로 연장되며 상기 표적 세포가 포집되는 검출부와, 상기 검출부로부터 내측으로 연장된 배출부를 구비하는 U자 형태의 검출 챔버; 상기 배출부와 연결된 드레임 챔버; 상기 검출 챔버로 상기 표적 세포의 처리를 위한 하나 이상의 시약을 공급하는 시약 수용부;를 포함한다.
상기 검출부에는 상기 표적 세포가 포집되는 필터가 마련될 수 있다.
상기 미세유동장치는, 상기 검출 챔버의 하부벽과 상부벽을 각각 형성하는 하판과 상판을 구비하며, 상기 필터는, 상기 하판으로부터 상기 상판을 향하여 돌출되어 그 상면과 상기 상판과의 사이에 미소 간격을 형성하는 돌출부를 포함할 수 있다.
상기 돌출부의 상면에 상기 표적 세포가 고정될 수 있다.
상기 돌출부의 상기 유입부 측의 면은 상기 상면을 향하여 상향 경사진 경사면일 수 있다.
상기 돌출부의 상면은 상기 미세유동장치의 회전중심으로부터 연장된 반경 방향의 선 상에 위치될 수 있다.
상기 필터는 상기 표적 세포를 걸러내는 멤브레인 필터를 포함할 수 있다.
상기 유입부와 상기 배출부는 각각 상기 미세유동장치의 두께 방향으로 단차지게 형성되며, 상기 유체는 상기 유입부를 따라 상기 멤브레인 필터의 상면으로 공급되며, 상기 멤브레인 필터를 통과하여 상기 멤브레인 필터의 하면을 따라 상기 배출부로 흐를 수 있다.
상기 검출 챔버의 상부벽과 하부벽을 각각 형성하는 상판과 하판을 더 구비하며, 상기 유입부는 상기 상판의 하면으로부터 몰입되어 형성되며, 상기 배출부는 상기 하판의 상면으로부터 몰입되어 형성될 수 있다.
상기 멤브레인 필터의 반경방향의 양쪽 가장자리는 상기 상판의 하면과 하판의 상면에 의하여 지지되며, 상기 멤브레인 필터의 상기 유입부 쪽의 가장자리는 상기 유입부의 상부벽으로부터 돌출된 제1지지부와 상기 하판의 상면에 의하여 지지되며, 상기 멤브레인 필터의 상기 배출부 쪽의 가장자리는 상기 상판의 하면과 상기 배출부의 하부벽으로부터 돌출된 제2지지부에 의하여 지지되며, 상기 제1지지부의 폭은 상기 유입부의 상기 검출부 쪽의 폭보다 작으며, 상기 제2지지부의 폭은 상기 배출부의 상기 검출부 쪽의 폭보다 작을 수 있다.
상기 검출 챔버의 깊이는 1mm 이하일 수 있다.
상기 하나 이상의 시약은 상기 표적 세포를 상기 검출부에 고정시키는 고정시약, 상기 표적 세포를 투과화 시키는 투과화시약, 상기 표적 세포의 특정 인자와 결합되는 염색시약 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일 측면에 따른 표적 세포 검출 방법은, 상술한 미세유동장치를 준비하고, 상기 시료 챔버와 상기 시약 수용부에 표적 세포를 포함하는 유체와 시약을 각각 주입하는 단계; 상기 미세유동장치를 회전시켜, 원심력을 이용하여 상기 검출 챔버로 상기 유체를 공급하는 단계; 상기 검출부에 마련된 필터를 이용하여 상기 표적 세포를 포집하고, 사이폰의 원리에 의하여 상기 검출 챔버의 수용 용량을 초과한 유체를 상기 드레인 챔버로 배출하는 단계; 상기 검출 챔버로 상기 시약을 공급하여 상기 표적 세포를 염색하는 단계;를 포함한다.
상기 염색하는 단계는, 상기 검출 챔버로 고정시약을 공급하여 상기 표적 세포를 상기 검출부에 고정시키는 단계; 상기 검출 챔버로 투과화시약을 공급하여 상기 표적 세포를 투과화시키는 단계; 상기 검출 챔버로 염색 시약을 공급하여 상기 표적 세포를 염색시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 검출 챔버의 깊이는 1mm 이하일 수 있다.
상술한 미세유동장치 및 표적 세포 검출 방법에 따르면, 액상 세포 검사가 분석 장치 내에서 순차적인 과정을 통하여 자동으로 수행될 수 있다. 그러므로, 표적 세포의 검출결과가 작업자의 숙련도에 영향을 받지 않으므로 검출의 재현성 및 신뢰성을 향상시킬 수 있다. 또한, 일관된 액상 세포 검사 과정이 하나의 통합된 분석 장비에 의하여 수행될 수 있으므로 진단 비용을 절감할 수 있다. 표적 세포 검출 시간을 줄여 신속한 진단이 가능하다. 또한, 스미어 방식과 대비하여 슬라이드의 이동 과정없이 표적 세포를 액상에서 관찰할 수 있어, 시료의 대표성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 미세유동장치의 일 실시예의 구성도로서, 상판이 제거된 상태의 사시도이다.
도 2는 도 1의 검출부를 상세히 도시한 사시도이다.
도 3은 도 2의 A-A' 단면도이다.
도 4는 검출부의 다른 실시예의 평면도이다.
도 5는 도 4의 B-B' 단면도이다
도 6a와 도 6b는 폐쇄된 밸브의 일 예를 보여주는 단면도들이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 이들 실시예는 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 미세유동장치(1)의 일 실시예의 구성도로서, 상판이 제거된 상태의 사시도이다. 미세유동장치(1)에는 유체를 수용할 수 있는 챔버와 유체의 통로를 제공하는 채널을 포함하는 미세유동구조물이 마련된다. 미세유동장치(1)는 예를 들어 회전 가능한 디스크 형상일 수 있다. 미세유동장치(1)는 유체의 수용공간을 형성하는 챔버들과 챔버들 사이에 유체의 통로를 제공하는 채널 등의 음각 형태의 미세유동 구조물이 형성된 하부 구조물과, 하부 구조물에 결합되어 미세유동 구조물의 상부벽을 형성하는 상부 구조물(상판)을 포함할 수 있다. 미세유동장치(1)는 상판과, 미세유동 구조물이 형성된 하판이 결합된 2판 구조일 수 있다. 또한, 미세유동장치(1)는 상판과 하판 사이에 미세유동 구조물을 정의하는 구획판이 개재된 3판 구조일 수도 있다. 판과 판의 접합은 접착제나 양면 접착테이프를 이용한 접착이나 초음파 융착, 레이저 융착 등 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
미세유동장치(1)는 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴, PDMS 등의 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다.
원심력을 제공하기 위하여 미세유동장치(1)는 분석 장치(미도시)의 회전구동부(미도시)에 장착된다. 이를 위하여, 미세유동장치(1)의 회전중심(RC)에는 회전구동부와 결합되는 장착부(500)가 마련된다. 미세유동장치(1) 내의 유체는 회전중심(RC)으로부터 가까운 위치로부터 먼 위치로 순차로 이송되면서 소망하는 처리과정(processing steps)을 거치게 된다. 이하에서 '내측'은 반경 방향으로 회전중심(RC)에 가깝다는 것을 의미하며, '외측'은 반경 방향으로 회전중심(RC)에서 멀다는 것을 의미한다.
본 실시예의 미세유동장치(1)는 시료 중의 표적 세포를 검출한다. 표적 세포는 혈중 종양 세포(CTC: circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)일 수 있다. 표적 세포는 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 또는 종양 세포일 수 있다.
시료는 표적 세포가 존재할 수 있는 한 어떠한 생물학적 시료라도 무방하다. 예를 들면, 생물학적 시료는 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 시료는 혈액, 골수액, 타액, 누액, 뇨, 정액, 점막액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 혈중 종양 세포를 분리하기 위해, 혈액을 시료로써 사용할 수 있다.
도 1을 참조하면, 미세유동장치(1)는 시료 챔버(100)와, 시약 수용부(200), 검출 챔버(300), 및 드레인 챔버(400)를 구비한다. 시료 챔버(100)에는 표적 세포를 포함하는 시료가 수용된다. 시약 수용부(200)는 세포 처리, 예를 들어 표적 세포의 특정 마커를 식별하기 위한 시약이 수용되는 하나 이상의 시약 챔버(210)(220)(230)(240)를 포함한다. 마커는 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 커는 암 또는 종양 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질, 즉 항원일 수 있다. 본 실시예에서는 4개의 시약 챔버가 도시되어 있으나 시약 챔버의 갯수는 표적 세포의 종류 및 표적 세포 검출을 위한 시약의 종류 및 처리 횟수에 따라 달라질 수 있다. 시약은 예를 들어 표적 세포를 검출부(320)에 고정하기 위한 고정시약, 표적 세포를 투과화하기 위한 투과화시약, 표적 세포 내의 특정 마커에 부착되어 형광 발현하는 하나 이상의 염색시약, 세척을 위한 세척제 등을 포함할 수 수 있다. 시료 챔버(100)와 시약 수용부(200)는 검출 챔버(300) 및 드레인 챔버(400)보다 내측에 위치된다.
시료 챔버(100)는 주채널(11)에 의하여 검출 챔버(300)에 연결된다. 시료 챔버(100)의 출구에는 주 채널(10)을 통한 시료의 공급을 제어하는 시료 밸브(11)가 마련된다. 시료 밸브(11)는 예를 들어 폐쇄된 상태에서 개방된 상태로 전환되는 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다. 각각의 시약 챔버(210)(220)(230)(240)들은 시약 채널(211)(221)(231)(241)에 의하여 주채널(10)과 연결된다. 시약 채널(211)(221)(231)(241)에는 유체의 흐름을 제어하는 시약 밸브(212)(222)(232)(242)가 마련된다. 시약 밸브(212)(222)(232)(242)는 예를 들어 폐쇄된 상태에서 개방된 상태로 전환되는 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다.
드레인 챔버(400)는 배출 채널(30)에 의하여 검출 챔버(300)와 연결된다. 검출챔버(300)는 주채널(10)과 연결되는 유입부(310)와, 배출 채널(20)과 연결되는 배출부(330), 및 유입부(310)와 배출부(330) 사이에 위치되고 표적 세포가 포집(trap)되는 검출부(320)를 포함한다. 검출부(320)는 유입부(310) 및 배출부(330)보다 반경 방향으로 더 외측에 위치된다. 즉, 검출부(320)의 최내측 부분(321)은 유입부(310) 및 배출부(330)의 최내측 부분(311)(331)보다 더 반경 방향으로 더 외측에 위치된다. 유입부(310)의 최내측 부분(311)은 반경방향으로 배출부(330)의 최내측 부분(331)보다 내측 또는 동등한 위치에 위치될 수 있다. 따라서, 검출챔버(320)는 전체적으로 "U"자 형태 또는 "V"자 형태가 된다. 이하에서는 "U"자 형태 또는 "V"자 형태를 통칭하여 "U"자 형태로 지칭한다.
미세유동장치(1)에서 위치 에너지는 회전중심(RC)에서 가까울수록 크며, 회전중심(RC)으로부터 멀어질수록 작아진다. 미세유동장치(1) 내에서 유체는 원심력에 의하여 위치 에너지가 높은 영역으로부터 낮은 영역으로 이송되면서 소정의 처리 과정을 거치게 된다. 검출 챔버(320)의 경우에, 유입부(310)를 통하여 유입된 유체는 위치 에너지가 낮은 검출부(320)까지는 원심력의 방향으로 이송된다. 검출부(320)로부터 배출부(330)까지의 유체의 이송은 사이폰의 원리에 의하여 원심력의 반대 방향으로 일어난다. 유체는 배출부(330)로부터 드레인 챔버(400)로 배출된다. 즉, 검출 챔버(300)로 공급된 유체는 검출 챔버(300)를 채우며, 검출 챔버(300)의 수용 용량을 넘어서는 유체는 드레인 챔버(400)로 배출된다. "U"자 형태의 검출챔버(300) 내의 유체는 유입부(310) 및 배출부(330)의 수위가 동일해지면 평형 상태에 도달된다. 그러므로, 검출 챔버(300) 내에는 항상 일정한 양의 유체가 존재하며, 검출부(320)에 포집된 표적 세포는 항상 액체에 잠긴(wetting) 상태가 된다. 따라서, 액상 기반의 세포 검사가 가능하다.
도 2는 도 1의 검출부(320)를 상세히 도시한 사시도이며, 도 3은 도 2의 A-A' 단면도이다. 도 2와 도 3을 참조하면, 검출부(320)에는 표적 세포를 포집하기 위한 필터(322)가 마련된다. 필터(322)는 예를 들어 미소 간격(G)에 의하여 구현될 수 있다. 하판(1001)과 상판(1002)은 각각 검출 챔버(300)의 상부벽과 하부벽을 형성한다. 미소 간격(G)은 상부벽에 인접하게 형성될 수 있다. 하판(1001)에는 상판(1002)을 향하여 돌출된 돌출부(324)가 마련되며, 돌출부(324)의 상면(325)과 상판(1002)과의 사이에 미소 간격(G)이 형성된다. 돌출부(324)의 상면(325)은 폭(W)을 가진다. 상면(325)에 표적 세포가 고정된다. 미소 간격(G)은 표적 세포의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 수 내지 수십 마이크로미터 정도일 수 있다. 미소 간격(G)으로의 표적 세포의 유입을 용이하게 하기 위하여, 돌출부(324)의 유입부(310)측의 면(326)은 유입부(310)의 바닥(312)으로부터 상향 경사진 경사면일 수 있다.
예를 들어, 검출 챔버(300)로 시약1과 시약2가 순차로 유입될 때에, 먼저 유입된 시약1은 뒤이어 유입되는 시약2에 밀려서 드레인 챔버(400)로 자연스럽게 배출된다. 이때, 시약1과 시약2가 검출 챔버(300) 내에서 서로 혼합되지 않도록 할 필요가 있다. 이를 위하여, 검출 챔버(300)의 깊이(H)는 2mm 이내일 수 있다. 검출 챔버(300)의 깊이(H)가 2mm를 넘어서면 검출 챔버(300) 내에서 와류가 발생하여 시약1과 시약2가 서로 혼합되어 표적 세포 내의 특정 마커의 발현율을 저하시킬 수 있다. 실질적으로 검출 챔버(300)의 깊이(H)를 1mm 이하로 함으로써 와류의 발생을 거의 방지할 수 있다.
검출 챔버(300)로 유입되는 유체 내에는 기포(bubble)가 포함될 수 있다. 미세유동장치(1)가 회전되어 검출 챔버(300)로 유체가 유입되면, 기포는 유체에 비하여 밀도가 작으므로 검출 챔버(300) 내에서 유체에 비하여 상대적으로 내측에 위치된다. "U"자 형태의 검출챔버(300)에서 검출부(320)는 유입부(310)에 비하여 외측에 배치되므로, 기포는 검출부(320)로 이송되지 못한다. 검출 챔버(300)가 유체로 모두 채워지는 경우에 기포는 검출 챔버(300)로 유입되지 못한다. 따라서, 검출부(320)에 존재하는 기포에 의한 표적 세포 검출시의 에러 요인을 저감할 수 있다. 검출부(320)는 회전중심(RC)으로부터 연장된 반경 방향의 선(도 1: L1) 상에 위치될 수 있다. 이와 같은 구성에 의하면, 미세유동장치(1)가 회전될 때에 검출부(320)에 가장 큰 원심력이 작용되므로, 기포의 검출부(320)에의 유입을 효과적으로 방지할 수 있다.
도 4는 검출부(320)의 다른 실시예의 사시도이며, 도 5는 도 4의 B-B 단면도이다. 도 4와 도 5를 참조하면, 검출부(320)에는 필터(322)의 일 예로서 멤브레인 필터(membrane filter)(340)가 채용된다.
멤브레인 필터(340)는 미세 구멍을 갖는 일층 또는 다층의 막 형상의 필터로서, 구멍(pore)의 크기에 따라서 원하는 크기의 생체 입자를 걸러낼 수 있다. 멤브레인 필터는 예를 들어 Silicon, PVDF(polyvinylidene fluoride), Polyethersulfone,　Polycarbonate, Glass Fiber, Polypropylene, Cellulose, Mixed cellulose esters,　 PTFE(Polytetrafluoroethylene), Polyethylene Terephthalate, PVC(Polyvinyl chloride), Nylon, Phosphocellulose, DEAE(Diethylaminoethyl cellulose) 등의 재료로 제조될 수 있다. 구멍의 모양은 예를 들어 원형, 사각형, 슬릿 형상, 글래스 파이버에 의한 불규칙한 형상 등 다양한 모양일 수 있다. 구멍의 크기는 수 ~ 수십㎛ 정도 일 수 있다. 예를 들어 혈액 내의 혈중종양체포를 검출하는 경우 구멍의 크기는 약 5~15㎛ 정도일 수 있다.
멤브레인 필터(340)는 상판(1001)과 하판(1002) 사이에 위치된다. 유입부(310)와 배출부(330)는 미세유동장치(1)의 두께 방향으로 단차지게 형성되며, 표적 세포를 포함하는 유체는 유입부(310)를 따라 멤브레인 필터(340)의 상면(341)으로부터 공급되며, 멤브레인 필터(340)를 통과하여 멤브레인 필터(340)의 하면(342)으로부터 배출부(330)로 흐른다.
예를 들어, 유입부(310)는 상판(1001)의 하판(1002)과 대향된 하면(1001-a)으로부터 상측으로 몰입되어 형성되며, 멤브레인 필터(340)의 상면(341)을 따라 연장된다. 배출부(330)는 하판(1002)의 상판(1001)과 대향된 상면(1002-a)으로부터 하측으로 몰입되어 형성되며, 멤브레인 필터(340)의 하면(342)을 따라 연장된다. 이와 같은 구성에 의하여, 표적 세포를 포함하는 유체는 유입부(310)-멤브레인 필터(340)-배출부(330)의 경로를 따라 흐르게 되며, 유체가 멤브레인 필터(340)를 통과하는 동안에 표적 세포는 멤브레인 필터(340)에 의하여 차단되어, 멤브레인 필터(340)의 상면(341)에 표적 세포가 포집될 수 있다.
멤브레인 필터(340)의 반경 방향의 양쪽 가장자리(335)(356)는 상판(1001)의 하면(1001-a)과 하판(1002)의 상면(1002-a)에 의하여 지지된다. 멤브레인 필터(340)의 유체의 흐름 방향의 양쪽 가장자리(343)(444)는 유입부(310)로부터 멤브레인 필터(340)의 상면(343)으로의 유체의 흐름, 멤브레인 필터(340)를 통과한 후에 멤브레인 필터(340)의 하면(342)으로부터 배출부(330)로의 유체의 흐름을 허용할 수 있도록 지지된다. 이에 의하여 멤브레인 필터(340)가 안정적으로 지지됨과 동시에 안정적인 유체의 흐름을 확보할 수 있다.
이를 위하여, 멤브레인 필터(340)의 유입부(310) 쪽의 가장자리(343)의 상면(341)과 하면(342)은 각각 하판(1002)의 상면(1002-a)과 상판(1001)에 마련된 제1지지부(351)에 의하여 지지된다. 멤브레인 필터(340)의 배출부(330) 쪽의 가장자리(344)의 상면(341)과 하면(342)은 각각 상판(1001)의 상면(1001-a)과 하판(1002)에 마련된 제2지지부(352)에 의하여 지지된다.
제1지지부(351)는 유입부(310)의 상부벽(315)로부터 하판(1002)을 향하여 연장되어 멤브레인 필터(340)의 상면(341)을 지지한다. 유입부(310)로부터 멤브레인 필터(340)의 상면(341)으로의 유체의 흐름 통로(353)를 형성하기 위하여, 제1지지부(351)의 폭(W1)은 유입부(310)의 검출부(320) 부근의 폭(W310)보다 작다. 도 4에는 2 개의 제1지지부(351)가 도시되어 있으나, 제1지지부(351)의 수는 도 4에 도시된 예에 의하여 한정되지 않는다.
제2지지부(352)는 배출부(330)의 하부벽(335)로부터 상판(1001)을 향하여 연장되어 멤브레인 필터(340)의 하면(342)을 지지한다. 유체가 멤브레인 필터(340)를 통과한 후, 멤브레인 필터(340)의 하면(342)으로부터 배출부(330)로 흐르는 흐름 통로(354)를 형성하기 위하여, 제2지지부(352)의 폭(W2)은 배출부(330)의 검출부(320) 부근의 폭(W330)보다 작다. 도 4에는 2 개의 제2지지부(352)가 도시되어 있으나, 제2지지부(352)의 수는 도 4에 도시된 예에 의하여 한정되지 않는다.
전술한 폐쇄된 밸브로서 미세유동 밸브가 채용될 수 있다. 도 6a와 도 6b는 폐쇄된 밸브의 일 예를 보여주는 단면도들이다. 폐쇄된 밸브는 상온에서 고체 상태인 밸브 물질(V1)을 포함할 수 있다. 밸브물질(V1)은 고화된 상태로 채널(C)에 존재함으로써 도 6a에 도시된 바와 같이 채널(C)을 차단한다. 밸브물질(V1)은 외부로부터 에너지를 공급받아 고온에서 용융되어 채널(C) 내의 공간으로 이동하며, 도 6b에 도시된 바와 같이 채널(C)을 개방한 채로 다시 응고된다.
외부에서 조사되는 에너지는 예를 들면 전자기파일 수 있으며, 에너지원은 레이저 빔을 조사하는 레이저 광원이거나, 가시광선 또는 적외선을 조사하는 발광소자(light emitting diode) 또는 제논램프(Xenon)일 수 있다. 레이저 광원인 경우 적어도 하나의 레이저 다이오드(laser diode)를 포함할 수 있다. 외부에너지원은 밸브 물질(V1)에 포함된 발열 입자가 흡수할 수 있는 전자기파의 파장에 따라 선택될 수 있다. 밸브물질(V1)로서는 COC(cyclic olefin copolymer), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PFA(perfluoralkoxy), PVC(polyvinylchloride), PP(polypropylene), PET(polyethylene terephthalate), PEEK(polyetheretherketone), PA(polyamide), PSU(polysulfone), 및 PVDF(polyvinylidene fluoride) 등의 열 가소성 수지가 채용될 수 있다. 또, 밸브물질(V1)로서, 상온에서 고체 상태인 상전이 물질이 채용될 수 있다. 상전이 물질은 왁스(wax)일 수 있다. 왁스는 가열되면 용융하여 액체 상태로 변하며, 부피 팽창한다. 왁스로는, 예컨대 파라핀 왁스(paraffin wax), 마이크로크리스탈린 왁스(microcrystalline wax), 합성 왁스(synthetic wax), 또는 천연 왁스(natural wax) 등이 채용될 수 있다. 상전이 물질은 겔(gel) 또는 열가소성 수지일 수도 있다. 겔로는, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylates), 또는 폴리비닐아미드(polyvinylamides) 등이 채용될 수 있다. 밸브 물질(V1)에는 전자기파 에너지를 흡수하여 발열하는 다수의 미세 발열입자가 분산될 수 있다. 미세 발열입자는 대략 0.1 mm 깊이와 1 mm 폭을 갖는 미세한 채널(C)을 자유롭게 통과할 수 있게 1 nm 내지 100 ㎛ 의 직경을 가질 수 있다. 미세 발열입자는 예컨대 레이저광 등에 의하여 전자기파 에너지가 공급되면 온도가 급격히 상승하여 발열하는 성질을 가지며, 왁스에 고르게 분산되는 성질을 갖는다. 이러한 성질을 갖도록 미세 발열입자는 금속 성분을 포함하는 코어(core)와, 소수성(疏水性) 표면 구조를 가질 수 있다. 예컨대, 미세 발열입자는 Fe로 이루어진 코어와, Fe에 결합되어 Fe를 감싸는 복수의 계면활성성분(surfactant)을 구비한 분자구조를 가질 수 있다. 미세 발열입자들은 캐리어 오일(carrrier oil)에 분산된 상태로 보관될 수 있다. 소수성 표면구조를 갖는 미세 발열입자가 고르게 분산될 수 있도록 캐리어 오일도 소수성일 수 있다. 용융된 상전이 물질에 미세 발열입자들이 분산된 캐리어 오일을 부어 혼합하고, 이 혼합물질을 채널(C)에 주입하고 응고시킴으로써 채널(C)을 막을 수 있다. 미세 발열입자는 위에서 예로 든 중합체(polymer) 입자에 한정되는 것은 아니며, 퀀텀 도트(quantum dot) 또는 자성비드(magnetic bead)의 형태도 가능하다. 또한, 미세 발열입자는 예컨대, Al2O3, TiO2, Ta2O3, Fe2O3, Fe3O4 또는, HfO2 와 같은 미세 금속 산화물일 수 있다. 한편, 밸브 물질(V1)은 미세 발열입자를 반드시 포함하여야 하는 것은 아니며, 미세 발열입자 없이 상전이 물질만으로 이루어질 수도 있다.
실시예
이하, 상술한 미세유동장치(1)를 이용한 표적 세포의 검출 방법의 일 예로서, 순환 종양 세포(CTC: circulating tumot cell)를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 항-사이토케라틴(cytokeratin: CK) 항체, 및 항-CD45 항체로 염색하는 과정을 설명한다.
[준비]: 순환 종양 세포가 혼탁된 시료를 시료 챔버(100)에 주입한다. 시약 챔버(210)에는 고정시약로서 4%(w/v) 파라포름알데히드를 주입한다. 시약 챔버(220)에는 투과화시약로서 0.1%(v/v) 트리톤 X-100를 주입한다. 시약 챔버(230)에는 염색시약로서 DAPI(invitrogen), FITC(BD 또는 R&D)이 접합된 항-CK 항체(BD 또는 R&D), 및 FITC(BD 또는 R&D)이 접합된 항-CD45 항체(BD 또는 R&D)를 주입한다. 시약 챔버(240)에는 세척액으로서 증류수를 주입한다. 본 실시예에서는 DAPI, FITC이 접합된 항-CK 항체, 및 FITC이 접합된 항-CD45 항체를 혼합하여 시약 챔버(230)에 주입하였으나, DAPI, FITC이 접합된 항-CK 항체, 및 FITC이 접합된 항-CD45 항체가 각각 별개의 시약 챔버(미도시)에 주입될 수도 있다.
[시료의 이송]: 미세유동장치(1)를 분석 장치(미도시)의 회전구동부(미도시)에 장착하고, 전자기파 발생기를 이용하여 시료 밸브(11)에 에너지를 공급하여 시료 밸브(11)를 개방한다. 그런 다음, 미세유동장치(1)를 회전시키면 원심력에 의하여 시료가 주채널(10)을 통하여 검출 챔버(300)로 이송된다. 시료는 유입부(310), 검출부(320), 및 배출부(330)로 이송된다. 검출 챔버(300)의 수용 용량을 넘어서는 초과 시료는 사이폰의 원리에 의하여 배출 채널(30)을 통하여 드레인 챔버(400)로 배출된다. 이 과정에서 순환 종양 세포는 검출부(320)의 필터(322)(도 2의 미소 간격(G) 또는 도 4의 멤브레인 필터(340))에 의하여 포집된다. 검출 챔버(300) 내의 시료가 평형을 이루면, 즉 유입부(310)와 배출부(330)의 수위가 동일하게 되면 시료는 더이상 드레인 챔버(400)로 배출되지 않는다. 검출 챔버(300)에는 시료가 채워지고 검출부(320)에 포집된 순환 종양 세포는 시료 내에 잠긴(wetting) 상태로 유지된다.
[순환 종양 세포의 고정화]: 미세유동장치(1)를 정지시키고, 시약 밸브(212)를 개방한 후에 미세유동장치(1)를 다시 회전시킨다. 원심력에 의하여 고정시약는 주채널(10)을 통하여 검출 챔버(300)로 공급된다. 검출 챔버(300) 내의 시료는 고정시약에 밀려 드레인 챔버(400)로 배출되며, 검출부(320)에 포집된 순환 종양 세포는 고정시약에 잠긴 상태로 유지된다. 이 상태에서 상온에서 약 10분간 인큐베이션시켜 순환 종양 세포를 검출부(320)에 고정화시킨다.
[순환 종양 세포의 투과화]: 미세유동장치(1)를 정지시키고, 시약 밸브(222)를 개방한 후에 미세유동장치(1)를 다시 회전시킨다. 원심력에 의하여 투과화시약가 주채널(10)을 통하여 검출 챔버(300)로 공급된다. 검출 챔버(300) 내의 고정시약는 투과화시약에 밀려 드레인 챔버(400)로 배출되며, 검출부(320)에 포집된 순환 종양 세포는 투과화시약에 잠긴 상태로 유지된다. 이 상태에서 상온에서 약 10분간 인큐베이션시켜 순환 종양 세포를 투과화시킨다.
[염색]: 미세유동장치(1)를 정지시키고, 시약 밸브(232)를 개방한 후에 미세유동장치(1)를 다시 회전시킨다. 원심력에 의하여 염색시약가 주채널(10)을 통하여 검출 챔버(300)로 공급된다. 검출 챔버(300) 내의 투과화시약는 염색시약에 밀려 드레인 챔버(400)로 배출되며, 검출부()에 포집된 순환 종양 세포는 염색시약에 잠긴 상태로 유지된다. 이 상태에서 상온에서 약 1시간동안 인큐베이션시켜 순환 종양 세포를 염색한다.
[세척]: 미세유동장치(1)를 정지시키고, 시약 밸브(242)를 개방한 후에 미세유동장치(1)를 다시 회전시킨다. 원심력에 의하여 세척제가 주채널(10)을 통하여 검출 챔버(300)로 공급된다. 검출 챔버(300) 내의 염색시약는 세척제에 밀려 드레인 챔버(400)로 배출되며, 검출부(320)에 포집된 순환 종양 세포는 세척제에 잠긴 상태로 유지된다.
상술한 과정에 의하여 순환 종양 세포의 염색이 완료된다. 분석을 위하여는 미세유동장치(1)를 정지시키고, 예를 들어 분석 장치의 전자 현미경을 이용하여 검출부(320)를 관찰하거나 또는 검출부(320)의 영상을 취득함으로써 염색된 순환 종양 세포를 검출할 수 있다.
비교예
한편, 비교예로서, 파파니클로아오우 스미어(Papanicloaou Smear) 방법으로 순환 종양 세포를 염색하는 과정을 설명하면 아래와 같다.
100 ㎖의 증류수에 60 ㎖의 빙초산(glacial acetic acid)을 첨가하여 혼합하고, 혼합된 용액을 2 L의 100%(v/v) 알콜(어떤 알콜인지 기재 요망)에 첨가하여 아세트산/알콜 고정화 용액을 준비한다. 준비된 아세트산/알콜 고정화 용액을 슬라이드 상에 준비된 순환 종양 세포를 포함하는 시료에 가하고 상온에서 약 15 분 동안 인큐베이션시킨다. 반응액을 제거하고, 순차적으로 적량의 100%(v/v) 알콜로 상온에서 약 2분, 적량의 70%(v/v) 알콜로 상온에서 약 2분, 및 적량의 50%(v/v) 알콜로 상온에서 약 2분 동안 인큐베이션시킨 다음, 세척한다.
세척된 세포에 적량의 헤마토자일린(haematoxylin)를 가하고 상온에서 약 4분 동안 인큐베이션시킨 다음, 세척한다. 적량의 아세트산/알콜을 가하고 5 초 동안 인큐베이션시켜 탈색시키고, 수돗물로 세척한다. 세척된 세포에 100%(v/v) 알콜을 가하여 탈수시키는 것을 2회 반복하였다.
탈수된 세포에 적량의 오렌지 G(Sigma-Aldrich)를 가하고 10 분 동안 인큐베이션시켜 염색한다. 염색된 세포를 100%(v/v) 알콜을 가하여 헹구는 것을 2회 반복한다.
헹군 세포에 적량의 EA-50(Sigma-Aldrich)를 가하고 2 분 동안 인큐베이션시켜 염색한다. 염색된 세포를 100%(v/v) 알콜을 가하여 헹구는 것을 2회 반복한다.
헹군 세포에 적량의 자일렌을 3회 가하여 세포를 탈색시킨다.
실시예와 비교예를 비교하여 보면, 본 실시예의 미세유동장치(1)에 따르면, 표적 세포의 검출 과정에 분석 장치 내에서 순차적인 과정을 통하여 자동으로 수행될 수 있다. 그러므로, 표적 세포의 검출결과가 작업자의 숙련도에 영향을 받지 않으므로 검출의 재현성 및 신뢰성을 향상시킬 수 있다. 또한, 표적 세포 검출 시간을 줄여 신속한 진단이 가능하다. 또한, 스미어 방식과 대비하여 슬라이드의 이동 과정없이 표적 세포를 액상에서 관찰할 수 있어, 시료의 대표성을 향상시킬 수 있다.
상기한 설명에서 많은 사항이 구체적으로 기재되어 있으나, 그들은 발명의 범위를 한정하는 것이라기보다, 실시 가능한 구성의 예시로서 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 의하여 정하여 질 것이 아니라 특허 청구범위에 기재된 기술적 사상에 의해 정하여져야 한다.
1...미세유동장치 10...주채널
11...시료 밸브 30...배출 채널
100...시료 챔버 200...시약 수용부
210, 220, 230, 240...시약 챔버 211, 221, 231, 241...시약 채널
212, 222, 232, 242...시약 밸브 300...검출 챔버
310...유입부 320...검출부
322...필터 323...미소 간격
324...돌출부 330...배출부
340...멤브레인 필터 351, 352...제1, 제2지지부
400...드레인 챔버 1001...상판
1002...하판

Claims (15)

  1. 원심력에 의하여 유체의 흐름을 유발하는 미세유동 장치로서,
    표적 세포가 포함된 시료가 수용되는 시료 챔버;
    상기 시료 챔버와 연결되는 유입부와, 상기 유입부로부터 외측으로 연장되며 상기 표적 세포가 포집되는 검출부와, 상기 검출부로부터 내측으로 연장된 배출부를 구비하는 U자 형태의 검출 챔버;
    상기 배출부와 연결된 드레임 챔버;
    상기 검출 챔버로 상기 표적 세포의 처리를 위한 하나 이상의 시약을 공급하는 시약 수용부;를 포함하는 미세유동장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검출부에는 상기 표적 세포가 포집되는 필터가 마련된 미세유동장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 검출 챔버의 하부벽과 상부벽을 각각 형성하는 하판과 상판을 구비하며,
    상기 필터는, 상기 하판으로부터 상기 상판을 향하여 돌출되어 그 상면과 상기 상판과의 사이에 미소 간격을 형성하는 돌출부를 포함하는 미세유동장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 돌출부의 상면에 상기 표적 세포가 고정되는 미세유동장치.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 돌출부의 상기 유입부 측의 면은 상기 상면을 향하여 상향 경사진 경사면인 미세유동장치.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 돌출부의 상면은 상기 미세유동장치의 회전중심으로부터 연장된 반경 방향의 선 상에 위치되는 미세유동장치.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 필터는 상기 표적 세포를 걸러내는 멤브레인 필터를 포함하는 미세유동장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유입부와 상기 배출부는 각각 상기 미세유동장치의 두께 방향으로 단차지게 형성되며,
    상기 유체는 상기 유입부를 따라 상기 멤브레인 필터의 상면으로 공급되며, 상기 멤브레인 필터를 통과하여 상기 멤브레인 필터의 하면을 따라 상기 배출부로 흐르는 미세유동장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출 챔버의 상부벽과 하부벽을 각각 형성하는 상판과 하판을 더 구비하며, 상기 유입부는 상기 상판의 하면으로부터 몰입되어 형성되며, 상기 배출부는 상기 하판의 상면으로부터 몰입되어 형성되는 미세유동장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 멤브레인 필터의 반경방향의 양쪽 가장자리는 상기 상판의 하면과 하판의 상면에 의하여 지지되며,
    상기 멤브레인 필터의 상기 유입부 쪽의 가장자리는 상기 유입부의 상부벽으로부터 돌출된 제1지지부와 상기 하판의 상면에 의하여 지지되며,
    상기 멤브레인 필터의 상기 배출부 쪽의 가장자리는 상기 상판의 하면과 상기 배출부의 하부벽으로부터 돌출된 제2지지부에 의하여 지지되며,
    상기 제1지지부의 폭은 상기 유입부의 상기 검출부 쪽의 폭보다 작으며,
    상기 제2지지부의 폭은 상기 배출부의 상기 검출부 쪽의 폭보다 작은 미세유동장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 챔버의 깊이는 1mm 이하인 미세유동장치.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 시약은 상기 표적 세포를 상기 검출부에 고정시키는 고정시약, 상기 표적 세포를 투과화 시키는 투과화시약, 상기 표적 세포의 특정 인자와 결합되는 염색시약 중 적어도 하나를 포함하는 미세유동장치.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 미세유동장치를 준비하고, 상기 시료 챔버와 상기 시약 수용부에 표적 세포를 포함하는 유체와 시약을 각각 주입하는 단계;
    상기 미세유동장치를 회전시켜, 원심력을 이용하여 상기 검출 챔버로 상기 유체를 공급하는 단계;
    상기 검출부에 마련된 필터를 이용하여 상기 표적 세포를 포집하고, 사이폰의 원리에 의하여 상기 검출 챔버의 수용 용량을 초과한 유체를 상기 드레인 챔버로 배출하는 단계;
    상기 검출 챔버로 상기 시약을 공급하여 상기 표적 세포를 염색하는 단계;를 포함하는 표적 세포 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 염색하는 단계는,
    상기 검출 챔버로 고정시약을 공급하여 상기 표적 세포를 상기 검출부에 고정시키는 단계;
    상기 검출 챔버로 투과화시약을 공급하여 상기 표적 세포를 투과화시키는 단계;
    상기 검출 챔버로 염색 시약을 공급하여 상기 표적 세포를 염색시키는 단계;를 포함하는 표적 세포 검출 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 검출 챔버의 깊이는 1mm 이하인 표적 세포 검출 방법.
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