ES2343710T3 - Ensayos de alto rendimiento basados en celulas, metodos de uso y kits. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar un reactivo específico de la diana que comprende las etapas de: a) seleccionar una célula que tiene una molécula diana seleccionada localizada en una porción seleccionada de las que están sobre la pared celular o en la célula, b) cultivar la célula en una placa (4) de filtro multipocillo hidrófilo con un medio de cultivo; c) poner en contacto las células cultivadas en un pocillo (10) de dicha placa de filtro multipocillo con un reactivo que comprende un ligando para una molécula diana seleccionada en o sobre la célula, siendo seleccionado el ligando de ligandos que contienen un marcador detectable y ligandos que son capaces de unirse a un ligando secundario que contiene un marcador detectable, d) lavar las células cultivadas en dicho pocillo por flujo por gravedad por lo menos una vez con un líquido de lavado para retirar cualquier reactivo que no esté unido a la molécula diana seleccionada de la célula para proporcionar una célula lavada; y e) buscar el ligando para indicar la presencia o ausencia de la molécula diana, caracterizado porque el tamaño medio de poro de la placa de filtro está entre 1 y 3,5 micrómetros y es suficiente para permitir que el medio de cultivo, líquido de lavado y ligandos sin unir pasen a través de ella bajo los efectos de la gravedad reteniendo las células cultivadas, y porque en la etapa d) se permite que algo de líquido de lavado permanezca en dicho pocillo para prevenir que dicho pocillo se seque.
Description
Ensayos de alto rendimiento basados en células,
métodos de uso y kits.
La invención se refiere a ensayos de alto
rendimiento basados en células, a métodos para usar tales ensayos y
a kits para tales ensayos. Más particularmente, se refiere a una
etapa de lavado/filtración basada en la gravedad para ensayos
celulares de alto rendimiento tales como inmunoensayos.
El uso de varios métodos para detectar las
interacciones entre una célula y otra entidad (generalmente un
fármaco o un candidato a fármaco, una toxina, contaminante
medioambiental, etc.) es bien conocido en la técnica. Están
generalmente disponibles varios de estos formatos de ensayo basado
en células. Estos ensayos se usan para detectar el efecto de un
compuesto de ensayo en la expresión de una o más moléculas
marcadoras (generalmente proteínas) de una célula.
Los ensayos basados en células generalmente
miden una respuesta distinguible que requiere un inmunoensayo para
una molécula marcadora específica de diferenciación tal como una
proteína sobre la pared celular o intracelular de la molécula.
Generalmente, por lo menos se añade un primer ligando (primer
anticuerpo u otra entidad) que se une a la molécula marcadora de la
célula y por sí mismo o con un ligando secundario (tal como un
anticuerpo secundario que tiene un marcador detectable) es capaz de
ser detectado, generalmente, por fluorometría, colorometría o
radiactividad.
Los inmunoensayos se complican por la necesidad
de retirar los ligandos sin unir antes de la etapa de detección.
Típicamente esto se ha conseguido con protocolos de lavado con
centrifugación. El nivel de líquido después de la adición de uno o
más ligandos es reducido y se añade un tampón de lavado a la
disolución. Esta se centrifuga a continuación y se retira el
sobrenadante dejando las células en un pequeño volumen de líquido.
Las etapas de lavado se repiten a menudo 3-8 veces
para asegurar la retirada sustancial de los materiales sin unir.
Este es un procedimiento que lleva tiempo y está
limitado en el número de tubos que pueden ser procesados en un
tiempo dado por una persona. No es tampoco fácilmente compatible con
la automatización si lo es de algún modo. Adicionalmente, la
cantidad retirada y de dónde es retirada varía y conduce a la
pérdida de células por decantación y debido al estrés o muerte
debida a la falta de líquido (si se ha retirado demasiado).
Similarmente, el número de lavados se debe mantener alto para
asegurar que se retira suficiente reactivo de fondo de modo que se
pueda hacer una medida precisa.
El documento US 2001/0055776 A1 sugirió el uso
de vacío con una placa de filtro multipocillo para proporcionar un
formato de más alto rendimiento. El bajo vacío es difícil de
controlar y cada pocillo varía en su respuesta al bajo vacío. Esto
conduce a resultados inconsistentes entre pocillos, secándose
algunos pocillos mientras que otros retienen demasiado fluido
conduciendo a falsas señales positivas. Lo que es más importante, la
recuperación de células es sustancialmente baja, aunque en algunos
casos puede permitir un ensayo usando el bajo número de
células
restantes.
restantes.
Somos conscientes de la publicación de patente
internacional WO 9524648 (Fodstad Oeystein et al.) que se
refiere a un método y aparato para detectar células diana
específicas de una manera única y que ahorra tiempo, usando
partículas paramagnéticas, anticuerpos que reconocen las porciones
Fc de anticuerpos que se asocian a células diana y anticuerpos que
se asocian a células diana dirigidos a determinantes de antígeno
específico en las membranas de la célula diana. La incubación de la
suspensión de células con detergente y/o segundos anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo, premarcados o no con agentes
fluorescentes, metalocoloides, radioisótopos, complejos de biotina
o ciertas enzimas que permiten la visualización, incrementa
drásticamente la especificidad del método. El método y aparato
descrito proporciona un soporte sólido y un registro permanente que
se ve fácilmente por microscopía, permite la vista y cuantificación
de toda la muestra en lugar de pequeñas fracciones de ella y
permite el uso de grandes volúmenes de muestra para ser analizados,
el dispositivo se puede escanear también automáticamente por
tecnología densitométrica convencional. El método y aparato se puede
usar para el aislamiento de las células diana por aplicación de
campos magnéticos, y se describe un kit y aparato para realizar el
método según la invención.
La falta de un ensayo de alta
viabilidad/retención de células y alto rendimiento es un cuello de
botella significativo en la consecución de todo el potencial de la
proteonómica para el descubrimiento de fármacos. La presente
invención proporciona tal solución.
En la presente invención se colocan células en
una placa multipocillo y se cultivan. Cuando se va a realizar el
ensayo, se usa la gravedad para separar por lavado los ligandos sin
unir en lugar del vacío o centrifugación. Las células se examinan a
continuación para detectar el ligando unido.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un
ensayo de placa de filtro multipocillo por flujo por gravedad.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un
ensayo de placa de filtro multipocillo que tiene un filtro de
policarbonato por flujo por gravedad.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células
usado en un ensayo de placa de filtro multipocillo que tiene un
filtro de policarbonato hidrófilo por flujo por gravedad.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en
una placa de filtro multipocillo que tiene un filtro de
policarbonato hidrófilo con un tamaño de poro de alrededor de 3
micrómetros por flujo por gravedad.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un
ensayo de placa de filtro multipocillo por flujo por gravedad para
obtener una alta retención de células.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar un método para detectar un reactivo
específico de una diana que comprende las etapas de:
- a.
- seleccionar una célula que tiene una molécula diana seleccionada localizada en una posición seleccionada del grupo que consiste en estar sobre la pared celular o en la célula,
- b.
- cultivar la célula en una placa de filtro multipocillo;
- c.
- poner en contacto la célula con un reactivo que comprende un ligando para una molécula diana seleccionada dentro o sobre la célula, siendo seleccionado el ligando del grupo que consiste en ligandos que contienen un marcador detectable y ligandos que son capaces de unirse a un ligando secundario que contiene un marcador detectable,
- d.
- lavar la célula con flujo por gravedad por lo menos una vez para retirar cualquier reactivo que no está unido a la molécula diana seleccionada de la célula para proporcionar una célula lavada; y
- e.
- buscar el ligando para indicar la presencia o ausencia de la molécula diana (incluyendo las alteraciones en el estado funcional de las proteínas tales como fosforilación de las proteínas).
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un anticuerpo primario y uno secundario como ligando
en el método.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar un anticuerpo primario y uno secundario como
ligando en el método y detectar la unión del anticuerpo primario a
la molécula diana por medio del uso de fluorescencia,
quimioluminiscencia, colorometría o detección radiactiva del
anticuerpo secundario que está unido al anticuerpo primario.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un dispositivo para la filtración por gravedad de
fluidos de lavado y reactivos sin unir formado de una placa de
filtro que tiene dos o más pocillos, estando cubierto el fondo de
cada pocillo con una membrana porosa; una placa portadora que tiene
pocillos iguales en número y en registro con los pocillos de la
placa de filtro, teniendo los pocillos del portador las partes
superiores e inferiores abiertas; y una bandeja de recogida.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar una placa de filtro con una membrana
hidrófila que tiene un tamaño de poro de alrededor de 1 a 3,5
\mum (micrómetros), preferentemente alrededor de 3 \mum.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar una placa portadora que tiene pocillos cuyo
diámetro interno es por lo menos ligeramente más grande que el
diámetro exterior de los pocillos de la placa de filtro con la que
interacciona.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar una placa de filtro con una membrana hidrófila y una
placa portadora que tiene pocillos cuyas superficies internas se han
convertido en hidrófilas.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un kit formado por una placa de filtro multipocillo,
un portador de placas, un colector de residuos para uso en el lavado
de células por flujo por gravedad.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar un kit formado por una placa de filtro multipocillo
que tiene una membrana hidrófila, un portador de placas, un colector
de residuos/reactivo para uso en el lavado de células por flujo por
gravedad.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un kit formado de una placa de filtro multipocillo que
tiene una membrana de policarbonato hidrófilo con un tamaño de poro
de alrededor de 3 \mum, un portador de placas, un colector de
residuos/reactivo para su uso en el lavado de células por flujo por
gravedad, un primer anticuerpo capaz de unirse a la proteína
marcadora y un segundo anticuerpo capaz de unirse al primer
anticuerpo, en el que el segundo anticuerpo tiene una entidad que es
capaz de ser detectada.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un kit con un anticuerpo secundario que es capaz de ser
detectado por fluorescencia, colorometría o radiactividad.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un kit con un anticuerpo secundario que es capaz de ser
detectado por citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra una realización del
dispositivo de la presente invención en un vista en despiece
ordenado en perspectiva.
La Figura 2 muestra una realización del
dispositivo de la presente invención en vista en despiece ordenado
en corte transversal.
La Figura 3 muestra una realización alternativa
de la placa de filtro usada en el dispositivo de la presente
invención en vista de arriba a abajo.
La Figura 4 muestra un dispositivo de absorción
usado en el dispositivo de la presente invención en vista en corte
transversal.
La Figura 5 muestra otra realización en vista en
corte transversal.
La Figura 6 muestra un método según la presente
invención en formato de diagrama de bloques.
La Figura 7 muestra un segundo método según la
presente invención en formato de diagrama de bloques.
La Figura 8 muestra datos del Ejemplo 1.
La Figura 9 muestra datos del Ejemplo 2.
Las Figuras 10A y B muestran datos del Ejemplo
3.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención es un ensayo basado en células de
flujo rápido y un kit y método de uso relacionado que se puede
usar, por ejemplo, para analizar compuestos de ensayo para ver su
efecto en el crecimiento y diferenciación celular como se indica
por la expresión de proteínas marcadoras de una célula. Los
componentes de la invención se describen con detalle a
continuación. Brevemente, las células se cultivan sobre una placa de
filtro. La placa de filtro comprende un material fosforescente de
bajo fondo con poros que permiten que las células se cultiven sobre
la placa de filtro y se laven in situ. La pérdida de células
se minimiza usando filtración por gravedad para las etapas de
lavado.
Las células sobre la placa se ponen en contacto
con un reactivo que comprende un ligando que se une específicamente
a la molécula marcadora de la célula, típicamente un proteína y a un
agente detectable. El agente detectable puede ser un ion lantánido
quelado a un agente de quelación, y el agente de quelación se une al
ligando o puede ser cualquiera de los anticuerpos comercialmente
disponibles y similares que tienen una entidad detectable formada o
unida a él. El medio de cultivo celular se puede retirar, si se
desea, antes de que las células se pongan en contacto con el
reactivo. Opcionalmente, el reactivo se puede añadir directamente al
sobrenadante del cultivo celular. La adición directa evita las
etapas de lavado adicional e incrementa adicionalmente la
naturaleza de alto rendimiento del ensayo.
Después de lavar las células para retirar el
reactivo sin unir, se puede medir la detección, tal como por
fluorescencia, quimioluminiscencia, radiactividad, o colorometría,
asociada al agente detectable. La detección de la entidad indica la
unión del ligando a la molécula marcadora y por lo tanto se puede
usar para detectar la presencia de la molécula marcadora. En una
realización que usa fluorescencia, se pueden minimizar las
características de fluorescencia de alto fondo de los ensayos
basados en células usando medidas de fluorescencia con resolución
temporal de la fluorescencia.
En una realización de la invención, el ligando
es un solo anticuerpo primario, que disminuye el tiempo de proceso
con relación a ensayos que usan anticuerpo tanto primario como
secundario. Alternativamente, se pueden usar dos ligandos, tales
como un anticuerpo primario y uno secundario, o un primer ligando
acoplado a biotina y un segundo ligando que comprende avidina o
estreptavidina.
El método de la invención se puede usar, entre
otros, para monitorizar la diferenciación de una célula, para
verificar la viabilidad de la célula, o para examinar compuestos de
ensayo para ver varios efectos de expresión de proteína marcadora.
Debido a que la detección de proteína marcadora se puede llevar a
cabo usando la misma placa de filtro en la que se cultivan las
células, el método se adapta fácilmente para uso en formatos de
análisis de alto rendimiento, aliviando de este modo un
significativo cuello de botella en el análisis de compuestos de
ensayo para ver los efectos deseados o no deseados in
vivo.
La invención proporciona también un kit de
ensayo para uso en los métodos de análisis y detección de la
invención. El kit comprende un ligando para una molécula marcadora,
una entidad detectable como parte del ligando para la molécula
marcadora o un ligando secundario que se une solo al primer ligando,
una placa de filtro apropiada para cultivar células, una placa
portadora para sujetar la placa de filtro y una placa de recogida
del filtrado. La placa de filtro en el kit preferentemente tiene un
material de fosforescencia de bajo fondo con poros de un tamaño que
permiten que las células cultivadas sobre la placa de filtro se
laven in situ por flujo por gravedad. Opcionalmente, el kit
de ensayo también incluye una célula que es capaz de expresar una
proteína marcadora. Si se desea, se pueden proporcionar en el kit
de ensayo instrucciones para varios métodos de la invención.
Las células que se pueden usar en la detección y
métodos de análisis de la invención no están limitadas a ningún
tipo en particular pero generalmente serán células de mamífero,
preferentemente humanas. Tales células incluyen cultivos de células
primarias así como líneas celulares normales o neoplásticas. Se
pueden cultivar células únicas o múltiples, por ejemplo, mantenidas
in vitro. En una realización, la célula es una célula
progenitora que es capaz de diferenciación adicional, tal como una
célula madre del hueso, testículos, o epitelio escamoso
estratificado, una célula madre embrionaria, una célula progenitora
neutra, una célula progenitora glial, o una célula progenitora
hematopoyética, que incluye una célula madre granulocítica,
monocítica, eritroide, megacariocítica, mieloide, y linfoide.
Se puede usar cualquier medio en el que se puede
cultivar un tipo de célula particular para la expresión de la
molécula marcadora que se va a detectar en el método de la
invención. La selección de un medio de cultivo apropiado para un
tipo de célula dado, así como otras condiciones de cultivo tales
como temperatura y porcentaje de dióxido de carbono, está
completamente dentro de la experiencia de los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney ed.,
1986).
Las moléculas marcadoras que se pueden detectar
según la invención son típicamente proteínas y se pueden determinar
por la naturaleza de la célula que se está cultivando e incluyen
proteínas tanto de la superficie celular como intracelulares. La
invención no está limitada al uso de alguna proteína marcadora en
particular. Si se va a detectar una proteína marcadora
intracelular, las células preferentemente se fijan y permeabilizan,
como se sabe en la técnica, antes de la incubación con el primer
ligando o con el segundo ligando que contiene una entidad
detectable. La proteínas marcadoras intracelulares que se pueden
detectar según la invención incluyen, pero no están limitadas a,
hemoglobina A, citoqueratinas, citoquinas (por ejemplo,
IL-4, IFN_{\gamma}), actina, moléculas de
transducción de señal, fosfatasa ácida resistente a tartrato (un
marcador para la diferenciación de osteoblastos), factor de von
Willebrand, y marcadores de diferenciación de progenitor neuronal,
tales como GFAP, MAP2, betatubulina III, y nestina.
Las proteínas marcadoras que se pueden detectar
para evaluar la toxicidad de varios compuestos de ensayo son
aquellas que están presentes en muchos tipos de célula, e incluyen
proteínas tales como aldehído deshidrogenasa (ALDH), colágeno,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, factor de elongación 1-alfa y gamma
actina. Las proteínas marcadoras que se pueden detectar para
evaluar el efecto de los compuestos de ensayo en el ciclo celular
incluyen varias proteínas de microtúbulo y microfilamento. Otras
proteínas marcadoras, que son específicas del tipo o etapa celular,
se pueden detectar para evaluar el efecto de los compuestos de
ensayo en la diferenciación celular. Estos marcadores incluyen, por
ejemplo, marcadores hematopoyéticos, tales como hemoglobina A,
glicoforina A, gpIIbIIIa, el receptor de eritropoyetina, CD11b,
CD19, CD33, CD34, CD36, CD41, MO1, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, OKT16,
OKM1, OKM5, Leu7, Leu9, Leu M1, y Leu M3; proteínas marcadoras
específicas de neuronas, tales como acetilcolinesterasa, proteínas
marcadoras específicas de glial, tales como proteína ácida fibrilar
glial (GFAP) y proteína básica de mielina; y otras proteínas
encontradas sólo en células especializadas, tales como antígeno
globular de grasa de leche humana (HMFG), queratinas y
cristalinas.
Opcionalmente, se pueden detectar dos o más
proteínas marcadoras en la misma célula o cultivo celular,
simultánea o secuencialmente, usando ligandos que se unen
específicamente a cada una de las proteínas marcadoras. Para la
detección simultánea, por ejemplo, se pueden usar ligandos
diferentes que tienen máximos de excitación y/o emisión
distinguibles para su entidad detectable respectiva.
Típicamente, un ligando que se une
específicamente a una proteína marcadora se une a la proteína
marcadora con una afinidad que es por lo menos de 2 a 3 veces,
preferentemente de 5 a 10 veces, incluso más preferentemente 20
veces más alta que la afinidad con la que el ligando se une a otras
proteínas cuando se usa en un ensayo de unión apropiado. Si el
ligando es un anticuerpo, por ejemplo, los ensayos apropiados
incluyen ensayos inmunoquímicos, tales como un radioinmunoensayo de
Western blot, o ensayos inmunocitoquímicos. Preferentemente, un
anticuerpo que se une específicamente a una proteína marcadora no
detecta otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y puede
inmunoprecipitar la proteína marcadora en disolución. La afinidad de
unión de un ligando a un receptor, o de un ligando que es un
receptor a su propio ligando, se puede ensayar por
radioinmunoensayo, amortiguación de la fluorescencia, u otros
ensayos apropiados conocidos en la técnica. Se usan convenientemente
en el método de la invención anticuerpos, tales como anticuerpos
monoclonales o policlonales, anticuerpos de una cadena, fragmentos
Fab, fragmentos (Fab`)2, y similares. El término "anticuerpo"
como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones se
pretende que abarque todas estas alternativas.
En otra realización de la invención, un primer
ligando, tal como un anticuerpo primario o un ligando marcado con
biotina, avidina, o estrepavidina, está unido a la proteína
marcadora. Un segundo ligando conjugado a un quelato de lantanido u
otra entidad detectable se une a continuación al primer ligando. Por
ejemplo, el primer ligando puede ser un anticuerpo primario y el
segundo ligando puede ser un anticuerpo secundario. Muchos pares de
anticuerpo primario-secundario son bien conocidos en
la técnica y se pueden usar en esta realización de la invención.
Alternativamente, el primer ligando puede comprender un resto
biotina y el segundo ligando puede comprender avidina o
estrepavidina. Si se desea, el primer ligando puede comprender
avidina o estreptavidina y el segundo ligando puede comprender
biotina. Otros pares de unión específica se pueden usar también,
como es sabido en la técnica.
La detección puede ser cualitativa o
cuantitativa. La fluorescencia preferentemente se detecta por un
método que usa retraso del tiempo, que reduce o elimina la
contribución de la fluorescencia de fondo no específica a la señal
detectada. Un método preferido de detección es fluorometría con
resolución temporal. El uso de entidades radiactivas se puede usar
también así como el uso de varias entidades colorométricas.
Las etapas de lavado necesarias para retirar el
ligando no unido contribuyen al carácter de trabajo intensivo en
mano de obra de los inmunoensayos y disminuye su rendimiento.
Además, la pérdida de células durante los lavados o durante la
transferencia de un cultivo de células es siempre una preocupación
importante. En el presente ensayo, este problema se ha eliminado
esencialmente por el uso de placas de filtro poroso sobre las que
se cultivan y lavan por gravedad in situ las células. El
tamaño de poro medio de la placa de filtro es suficiente para
permitir que el medio de cultivo, fluido de lavado, y ligandos sin
unir, etc., pasen a través suyo bajo los efectos de la gravedad
reteniendo las células cultivadas. En ausencia de volumen de líquido
suficiente en un pocillo, el tamaño medio de poro es tal que los
efectos de tensión superficial son suficientes para que el filtro
actúe como placa de cultivo para células que varían en tamaño, por
ejemplo, de 5 \mum a 30 \mum de diámetro. Las placas de filtro
útiles en los métodos de la invención típicamente tienen tamaños
medios de poro entre 1,0 y 3,5 \mum, e incluso más preferentemente
alrededor de 3,0 \mum.
De este modo, la placa de filtro ideal para uso
en los métodos de la invención es el cultivo celular compatible y
está construida, por lo menos en la superficie, de un material de
membrana que tiene baja fosforescencia de fondo y bajas propiedades
de unión de proteína no específica. Un fondo de fosforescencia
aceptablemente bajo es preferentemente alrededor de 10.000 cuentas
o menos, más preferentemente alrededor de 5.000 cuentas o menos,
incluso más preferentemente alrededor de 500 cuentas o menos, como
se miden, por ejemplo, usando un espectrofluorímetro (por ejemplo,
Victor or Victor^{2TM} de EG&G Wallac, o el equivalente).
Adicionalmente, las placas deben tener una velocidad de filtración
por gravedad aceptablemente alta y venir con cubiertas tanto del
fondo como de la parte superior para minimizar la evaporación.
Preferentemente, las placas están disponibles en los bien conocidos
formatos de 96 o 384 pocillos y tienen un material de membrana que
es transparente para permitir la observación de las
células.
células.
Los materiales apropiados para uso en placas de
filtro en esta invención se pueden investigar usando técnicas de
análisis de rutina. Deberían ser generalmente apropiados materiales
que tienen baja fosforescencia, bajas propiedades de unión a
proteína no específica, propiedades que son compatibles con los
requerimientos de cultivo de células, y que pueden formar poros con
diámetros medios que permiten que las células sean tanto cultivadas
en la placa de filtro como lavadas in situ, tal como
policarbonato.
Se examinaron numerosas placas de filtro
comercialmente disponibles para determinar su idoneidad para el uso
en el ensayo de esta invención. Se ha determinado que la placa de
filtro MultiScreen® disponible de Millipore Corporation of
Billerica, Massachusetts exhibe fosforescencia de fondo de
aproximadamente 5.000 cuentas, con excitación a 340 nm y emisión a
615 nm. Una placa de filtro todavía más preferida es la placa de
membrana de policarbonato negro designada como placa
"MultiScreen® Fluorescence" disponible de Millipore Corporation
de Billerica, Massachusetts.
Los compuestos de ensayo que se van a analizar
para ver la capacidad para afectar a la expresión de la molécula
marcadora pueden ser cualquier agente farmacológico ya conocido en
la técnica o pueden ser compuestos que previamente se desconoce que
tengan ninguna actividad farmacológica. Las substancias de ensayo
pueden ser naturales o sintetizadas en el laboratorio. Se pueden
aislar de microorganismos, animales, o plantas o se pueden producir
recombinantemente o por métodos químicos conocidos en la
técnica.
Debido a que la presente invención conduce a
análisis de alto rendimiento, los compuestos de ensayo típicamente
se obtienen de librerías de compuestos. Los métodos de generar
librerías combinatorias de compuestos de ensayo son conocidos en la
técnica e incluyen, pero no están limitados a, la formación de
"librerías biológicas", librerías en fase de disolución o fase
sólida en paralelo espacialmente accesibles, métodos de librería
sintética que requieren deconvolución, el método de librería "una
bolita un compuesto", y métodos de librería sintética usando
selección de cromatografía de afinidad (15.21). El enfoque de
librería biológica está limitado a librerías de polipéptido,
mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a
polipéptidos, oligómeros no polipéptidos o librerías de pequeñas
moléculas de compuestos (13). La presente invención, sin embargo, no
ésta de ningún modo limitada al método para generar, o a la fuente
de compuestos de ensayo potenciales.
Los compuestos de ensayo se pueden presentar a
las células, por ejemplo, en disolución, sobre bolitas, plásmidos,
o fagos, véase la patente de EE.UU. No. 5.223.409, incorporada aquí
como referencia. Opcionalmente, el grado hasta el que el compuesto
de ensayo afecta a la expresión de la molécula marcadora se puede
cuantificar. Por ejemplo, se puede cuantificar la fluorescencia
asociada a un ion lantanido en presencia del compuesto de ensayo
(primera fluorescencia), y se puede medir la fluorescencia asociada
al ion lantanido en ausencia del compuesto de ensayo (segunda
fluorescencia) de cada uno. La substracción de la segunda
fluorescencia de la primera fluorescencia proporciona la diferencia
entre las dos fluorescencias y, por lo tanto, el grado hasta el que
el compuesto de ensayo afecta a la expresión de la molécula
marcadora en este caso una proteína. Preferentemente, la primera y
segunda fluorescencia están asociadas al mismo tipo de entidad
detectable en este caso ion lantánido (por ejemplo, Europio), de
modo que se puede efectuar una comparación efectiva.
El dispositivo de la presente invención
preferentemente comprende tres componentes como se muestra en la
Figura 1, una placa 2 de filtro multipocillo, una placa 4 portadora
y una bandeja 6 o colector de recogida del filtrado. La placa 2 de
filtro multipocillo tiene una serie de dos o más pocillos 8 que se
extienden hacia abajo desde una superficie 10 superior
sustancialmente plana. El número de pocillos puede variar
dependiendo del volumen requerido y del tamaño de la placa 2.
Típicamente varían de 8, 24, 48, 96 o 384 pocillos por placa 2.
Cada pocillo 8 tiene un filtro 12 poroso unido a
su porción inferior que sella selectivamente el pocillo 8. La placa
4 portadora tiene una serie de pocillos 10 abiertos que se extienden
por ella. Los pocillos 10 tienen un diámetro interno que es
ligeramente más grande que el diámetro externo de los pocillos 8 de
la placa 2 multipocillo. Los pocillos 10 son el mismo número y
están en registro con los pocillos 8 de la placa 2 multipocillo.
En una realización, el diámetro interno de los
pocillos 10 de la placa 4 portadora es suficientemente grande de
modo que hay una separación (\sim0,2 a 0,5 milímetros) entre el
diámetro interno de los pocillos 10 del portador y los pocillos 8
de la placa cuando se inserta la placa 2 multipocillo dentro de la
placa 4 portadora.
En otra realización, el diámetro interno de los
pocillos 10 de la placa 4 portadora es inherentemente hidrófilo tal
como por la selección de un polímero hidrófilo o se vuelve hidrófilo
por el uso de un revestimiento. Alternativamente o adicionalmente,
los fondos abiertos de los pocillos 10 de la placa portadora se
pueden estrechar para formar colectores o canalones 14 para el
líquido que pasa a través de ellos. Esos limitan la contaminación
cruzada y la salpicadura durante el lavado y otras etapas del
líquido del presente procedimiento.
En una realización adicional, la bandeja 6 puede
contener un dispositivo 16 de absorción tal como una almohadilla
absorbente o un conjunto de nervaduras (mostradas en la Figura 5)
que se asientan en la bandeja debajo de los pocillos 8 de la placa
2 multipocillo. El dispositivo de absorción se usa para arrastrar
las gotas de líquido formadas sobre la superficie del fondo
exterior de los filtros de los pocillos 8 más rápidamente y
completamente hacia la bandeja 6 de recogida de filtrado. El
absorbente está separado del fondo del filtro. Varios de tales
dispositivos de absorción se muestran en el documento US 6.989.099 y
se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
La membrana puede ser una membrana microporosa
formada de un polímero seleccionado de olefinas tales como
polietileno que incluye polietileno de ultra-alto
peso molecular, polipropileno, copolímeros de EVA y
alfa-olefinas, polímeros olefínicos de metaloceno,
policarbonato, copolímeros de vinilo tales como PVC, poliamidas
tales como nailón, poliésteres, celulosa, acetato de celulosa,
celulosa regenerada, composites de celulosa, polisulfona,
poliétersulfona, poliarilsulfona, polifenilsulfona,
poliacrilonitrilo, poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), y
sus mezclas.
La membrana seleccionada depende del tamaño de
las células usadas en la aplicación, las características de flujo
deseado y similares.
Preferentemente, la membrana se selecciona de
policarbonato, PVDF, un nailón (tal como Nylon 66) o polietersulfona
(PES).
Preferentemente, la membrana es hidrófila
inherentemente o por la adición de un segundo polímero mezclado con
el polímero base (tal como PVP con polisulfona) o el uso de
revestimientos reticulados, injertados o si no irreversiblemente
revestidos sobre la membrana como es bien conocido en la técnica,
véase los documentos US 4.618.533 y US 4.944.879. Las membranas
preferidas son policarbonato, PVDF o PES con un revestimiento
hidrófilo aplicado como en el documento US 4.618.533. Tales
membranas están disponibles de varias fuentes incluyendo Millipore
Corporation de Billerica, Massachusetts con los nombres comerciales
de membranas de PVDF hidrófilo Durapore®, membranas de PES
hidrófilo Millipore Express® o Millipore Express ® Plus o membranas
de policarbonato hidrófilo Isopore^{TM}.
El tamaño de poro debe ser suficientemente
pequeño para prevenir que las células sean arrastradas dentro o a
través de los poros de la membrana, pero suficientemente grandes
para permitir buenas características de flujo y su tamaño óptimo
dependerá del tipo de células y es de alrededor de 1 \mum y
alrededor de 3,5 \mum y preferentemente entre alrededor de 2 y 3
\mum. La mayor parte de las células tienen un diámetro mayor de 7
\mum (con la excepción de las plaquetas, 3 \mum, y los glóbulos
rojos, 5\mum) y el uso de una membrana que tenga un tamaño de
poro de alrededor de 3 \mum previene que las células pasen a su
través mientras que proporciona un caudal aceptable.
Se pueden usar membranas simétricas o
asimétricas. Las membranas simétricas tienen un tamaño de poro
sustancialmente consistente a través de su grosor (generalmente
menor de 2 veces de diferencia en tamaños de poro de una primera
cara a la segunda cara opuesta de la membrana). La membrana
asimétrica tiene un tamaño de poro que varía por lo menos en una
porción del camino a través de su grosor y a menudo todo el camino a
través del grosor de la membrana (generalmente de 2 a 1000 veces la
diferencia de tamaños de poro de una primera cara a la segunda cara
opuesta de la membrana). Las membranas simétricas son preferidas en
una realización. Las membranas asimétricas con el lado más cerrado
mirando hacia las células son preferidas en otra realización. Las
membranas asimétricas con el tamaño de poro del lado abierto menor
de alrededor de 5 micrómetros y que miran hacia las células son las
preferidas en otra realización de la presente invención.
El dispositivo de la presente invención puede
tener también miembros guía en la placa 4 portadora de la placa 2
multipocillo y/o la placa 6 de recogida para mantener los distintos
componentes juntos alineados. Como se muestra en este ejemplo un
borde 18 sobre la placa 4 portadora se usa para centrar y alinearla
sobre la placa 6 de recogida. La placa 2 multipocillo está centrada
en la placa 4 portadora por inserción de los pocillos 8 de la placa
multipocillo en los pocillos 10 de la placa 4 portadora.
Si se desea, se pueden usar también clavijas de
alineamiento, esquinas rebajadas sobre las placas (2,4) y otros
dispositivos bien conocidos para asegurar que las placas se
ensamblan solo en una dirección si se desea.
Como se muestra en la Figura 3, la placa 2A
multipocillo puede ser una placa diseñada específicamente para
cultivar células. Tal placa está disponible de Millipore Corporation
de Billerica, Massachusetts y se vende como la placa celular
MultiScreen® CaCo_{2}. Contiene los pocillos 8A y adyacente a cada
pocillo 8A está un puerto 9 que proporciona acceso a un pocillo
cerrado (no mostrado) que contiene el medio en el que se cultivan
las células.
El dispositivo de la presente invención está
ensamblado de modo que los pocillos 8 y 8A de la placa 2 o 2A
multipocillo están por lo menos parcialmente insertados en los
pocillos 10 de la placa 6 portadora. La placa 4 portadora se encaja
o se fija a la placa 6 de recogida o se fijó antes de la inserción
de la placa 2 o 2A multipocillo.
Un procedimiento de la presente invención
(mostrado en la Figura 6) es en una primera etapa 100 para tener
primero células cultivadas en la placa 2 o 2A multipocillo que está
colocada en una bandeja de cultivo celular (no mostrada) hasta que
las células han alcanzado una densidad deseada. En la segunda etapa
102, la placa 2 o 2A multipocillo se retira a continuación de la
bandeja de cultivo y se coloca dentro de la placa 4 portadora como
se describe anteriormente.
La placa 4 portadora se ha fijado ya a la placa
6 de recogida o si no, a continuación junto con la placa 2
multipocillo emparejada se fijan en la parte superior del placa de
recogida.
Cada pocillo 8 contendrá el nivel más bajo de
líquido que soporta la viabilidad de las células. Sin embargo, el
nivel es insuficiente para vencer la resistencia al flujo de los
poros del filtro.
Dependiendo del sistema de detección usado, se
añade por lo menos un reactivo a uno o más pocillos y se deja
incubar de modo que pueda interaccionar con la célula o molécula
marcadora expresada por la célula en la tercera etapa 104. El
reactivo sin unir se lava a continuación una o más veces añadiendo
simplemente tampón de lavado (tal como agua, agua tamponada,
disolución salina y similares) a un volumen que crea una altura
frontal suficiente para permitir que el líquido penetre en los
poros del filtro y fluya fuera del pocillo bajo la influencia de la
gravedad a través de la placa 10 portadora y dentro de la placa 6 de
recogida en la cuarta etapa 106.
Si se desea, se pueden añadir secuencialmente
reactivos adicionales, tales como anticuerpos secundarios, usando
uno o más lavados entre la(s) adición(es) según se
desee para retirar cualquier material sin unir, reduciendo de este
modo el ruido de fondo típicamente provocado por los materiales no
unidos que están presentes durante la etapa de detección.
La presencia/ausencia y su deseada cantidad de
la molécula marcadora se detecta a continuación en la última etapa
108. Los reactivos detectores típicos incluyen pero no están
limitados a anticuerpos, colorantes, ligandos, productos químicos
quimiluminiscentes, isótopos radiactivos y compuestos y similares.
Se detectan generalmente usando métodos tales como fluorometría,
citometría de flujo, colorometría, radiactividad, medidas de
densidad óptica y similares.
En otro procedimiento según la presente
invención, las células se cultivan en otra parte en una primera
etapa 100A y se añaden a los pocillos 8 en la placa 2 multipocillo.
A partir que aquí, el procedimiento es sustancialmente idéntico al
descrito anteriormente.
En cualquiera de los procedimientos, pero
especialmente en el procedimiento que usa células añadidas a los
pocillos 8 de la placa 2 multipocillo, por lo menos la placa 4
portadora es prehumedecida antes del uso. Preferentemente el filtro
de la placa 2 multipocillo se prehumedece también para mejorar el
flujo del líquido cuando se desee. Esto se puede conseguir
prehumedeciendo cualquiera de los dos componentes separadamente o
cuando ambos se van a prehumedecer prehumedeciéndolos
simultáneamente en forma de subunidad ensamblada.
Se pueden usar disoluciones salinas equilibradas
tamponadas y similares para prehumedecer los filtros y las
superficies de la placa 4 portadora.
Se ha encontrado que cuando las placas
portadoras se vuelven hidrófilas, tal como usando tratamiento de
plasma, el tiempo necesario para tener flujo por gravedad del
líquido a través del sistema se reduce a la mitad. Un sistema
típico generalmente fluirá en alrededor de 2 a alrededor de 5
minutos dependiendo de varios parámetros tales como los líquidos
usados, su volumen en el pocillos, la densidad de las células en el
pocillo. El mismo sistema que tiene placas portadoras hidrófilas
fluye en alrededor de 1 a 2 minutos.
Como el sistema funciona por gravedad, la
cantidad de líquido añadido es importante ya que la altura frontal
o la presión del volumen del líquido mismo hace funcionar el
procedimiento de filtración.
Generalmente, se ha encontrado que un pocillo de
una placa de 96 pocillos que usa una membrana de policarbonato
hidrófilo de 3 micrómetros de tamaño de poro contendrá alrededor de
100 \mul de líquido sin ningún flujo. La adición de disolución de
lavado crea suficiente altura frontal para provocar un flujo basado
en la gravedad a través del sistema a una velocidad apreciable.
Típicamente, se usa de alrededor de 100 a 250 \mul de fluido de
lavado adicional, dependiendo del volumen del pocillo y la velocidad
y minuciosidad deseada para el lavado.
En algunos casos, el uso de vibración o balanceo
puede ayudar a la velocidad del procedimiento, aunque no es
requerido.
Una vez que el nivel del líquido llega a un
volumen suficientemente bajo, se detiene la filtración ya que el
líquido ya no es capaz de vencer la resistencia inherente contra el
flujo. Esta es una interesante y útil característica de la presente
invención ya que evita que los pocillos se sequen como puede ocurrir
con la filtración a vacío o centrifugación. Adicionalmente, ya que
la fuerza (gravedad) es suave sobre las células y el líquido, hay
poco daño celular o lisis y poco o ningún espumado del líquido que
pueda obscurecer la detección. Finalmente, la pérdida de células
debida a la filtración se minimiza comparada con el vacío o la
centrifugación, cuyas fuerzas son suficientemente altas como para
arrastrar las células por la fuerza dentro y/o a través del
filtro.
La presente invención se puede usar con las
células que flotan libres (suspensión) así como con las células
adherentes. Si se usan células adherentes, se prefiere que sean
cultivadas sobre un portador tal como bolitas microportadoras, no
tejidos u otros sistemas de soporte de modo que los caminos hacia
los poros en la placa sean todavía accesibles para el fluido.
Alternativamente se pueden cultivar las células adherentes a menos
de las densidades óptimas o tripsinizar las células antes del
procedimiento.
Las placas, kit y procedimiento de la presente
invención se pueden automatizar fácilmente con cualquier manipulador
de líquidos comercial. Todo lo que se necesita hacer es regular la
cantidad de líquido añadido en cada etapa y/o añadir una etapa de
prehumedecimiento como se describe anteriormente de modo que se
consiga flujo solo cuando se desee, y regular el tiempo entre las
etapas así como el número de etapas para asegurar que se dedica
suficiente tiempo para cada etapa de lavado para permitir la
retirada adecuada de los materiales sin unir.
\vskip1.000000\baselineskip
La filtración basada en la gravedad de células
para ensayos basados en células se realizó usando el siguiente
protocolo:
Se cultivaron células Jurkat (línea de células
limfoblásticas T) en dos placas de filtro de 96 pocillos que
contienen un filtro de policarbonato hidrófilo de 3 micrómetros de
tamaño de poro, (volumen final de 100 \mul, en medio completo que
contiene FCS (suero bovino fetal) al 10%: el ensayo contenía 100.000
células por pocillo.
El día del ensayo, el fondo de cada placa de
filtro se prehumedeció usando PBS, y se colocó en una placa
portadora.
Los dispositivos ensamblados se colocaron a
continuación sobre un colector de filtrado de líquido.
Las células se lavaron añadiendo 200 \mul de
tampón de lavado (PBS que contiene FBS o BSA al 1%) por pocillo.
Una vez que se añadió el tampón de lavado a los
pocillos, el líquido comenzó a salir de los pocillos formando
gotitas y goteó sobre el colector vía gravedad (mientras que las
células fueron retenidas dentro de los pocillos). El líquido
drenado se recogió en el colector de líquido.
Después de alrededor de 2 minutos se alcanzó el
equilibrio en el que saldría poco o nada líquido de los pocillos.
Había alrededor de 100 \mul de líquido restante en los
pocillos.
Se añadieron unos 200 \mul adicionales de
tampón de lavado.
En una placa, las células se trataron a
continuación con un anticuerpo específico de CD45
(anti-CD45) (Placa de la invención). La otra placa
(Placa de control) se trató con un anticuerpo de control (isotipo)
(\sim 3 \mug/ml de concentración final para los anticuerpos en
ambos casos) y se incubaron durante 30 minutos. El líquido
permaneció dentro de los pocillos y las células no se secaron
durante la incubación.
Los anticuerpos sin unir en exceso se retiraron
lavando como se indicó anteriormente en las etapas 3 y 4 tres
veces.
Se añadió un anticuerpo secundario, anticuerpo
conjugado Alexa 488 (disponible de Invitrogen Corporation) a los
pocillos de cada placa y se incubó durante 30 minutos, y a
continuación se lavó tres veces como se indicó anteriormente en las
etapas 3 y 4.
Las muestras de células preparadas se analizaron
usando un citómetro de flujo de sobremesa Guava (detección
fluorescente).
Como se muestra en la Figura 8, los histogramas
muestran poblaciones transparentes de células teñidas con el
anticuerpo antiCD45 (panel del lado izquierdo). Las células de
control teñidas solo con el anticuerpo isotipo se muestran en el
panel de la derecha. Un resumen tabulado de la medida de
fluorescencia se muestra también en la Figura 8.
En este ejemplo, se analizaron células según el
protocolo del Ejemplo 1 y se compararon con el lavado de células
preparadas por el procedimiento de vacío del documento US
2001/0055776A1.
Para el método de la presente invención las
células se lavaron 6 veces.
Para el método de vacío, se usó una placa de
filtro de policarbonato de 0,4 \mum de tamaño de poro y se lavó 3
veces a 0,167 bar como se describe en la referida solicitud
anterior.
Las células restantes en ambas placas se
midieron por medida luminiscente basada en ATP.
Como se muestra en la Figura 9, el número de
células introducidas en cada pocillo se lista en el eje X de la
gráfica. El porcentaje de recuperación se muestra respectivamente
para el método y dispositivo según la presente invención y la de la
técnica anterior. Las barras lineales que sobresalen de las barras
macizas representan la variación que se encontró en los pocillos
individuales comparada con la media mostrada por las barras macizas
del gráfico. Como se puede ver claramente, la presente invención
proporcionó sorprendente e inesperadamente una significativamente
mejor retención de células que la del método de vacío de la técnica
anterior. En la mayor parte de los casos, el rendimiento fue más de
4 veces mejor que el que la técnica anterior.
Se realizó un ensayo de apóptosis basado en
células usando filtración basada en la gravedad.
La exposición de células vivas a inhibidores de
caspasas marcados con fluorocromo (FLICAs) dio como resultado la
captación de estos reactivos por células apoptóticas ya que los
FLICAs se unen a caspasas activadas (Smolewski et al.,
2001). Las células se trataron con concentración creciente del bien
conocido inductor de apóptosis (Estaurosporina) durante 2 horas a
37ºC. Después de la inducción, las células se trataron con FLICA. Se
retiraron los FLICAs sin unir de las células no apoptóticas lavando
por gravedad las células con tampón de lavado 4 veces. Después de
lavar por gravedad las células marcadas con FLICAs
(FAM-VAD-FMK, FLICA de pancaspasas)
se examinaron por citometría de flujo.
Se muestran en las Figuras 10A y B los
histogramas de citometría de flujo de células teñidas con
FAM-VAD-FMK de muestras inducidas
(10, 0,63, 0,06 micromolar de Estaurosporina) y de control no
inducidas. El incremento de la población celular apoptótica
(poblaciones verdes de cada histograma) como función de la
concentración creciente del inductor (Estaurosporina) debería ser
obvio para cualquiera entrenado en la técnica.
La Figura 10B muestra el porcentaje de población
positiva a FAM numéricamente representado basado en los análisis de
citometría de flujo. Fíjense en la respuesta a la dosis.
Claims (8)
1. Un método para detectar un reactivo
específico de la diana que comprende las etapas de:
- a)
- seleccionar una célula que tiene una molécula diana seleccionada localizada en una porción seleccionada de las que están sobre la pared celular o en la célula,
- b)
- cultivar la célula en una placa (4) de filtro multipocillo hidrófilo con un medio de cultivo;
- c)
- poner en contacto las células cultivadas en un pocillo (10) de dicha placa de filtro multipocillo con un reactivo que comprende un ligando para una molécula diana seleccionada en o sobre la célula, siendo seleccionado el ligando de ligandos que contienen un marcador detectable y ligandos que son capaces de unirse a un ligando secundario que contiene un marcador detectable,
- d)
- lavar las células cultivadas en dicho pocillo por flujo por gravedad por lo menos una vez con un líquido de lavado para retirar cualquier reactivo que no esté unido a la molécula diana seleccionada de la célula para proporcionar una célula lavada; y
- e)
- buscar el ligando para indicar la presencia o ausencia de la molécula diana,
caracterizado porque el tamaño medio de
poro de la placa de filtro está entre 1 y 3,5 micrómetros y es
suficiente para permitir que el medio de cultivo, líquido de lavado
y ligandos sin unir pasen a través de ella bajo los efectos de la
gravedad reteniendo las células cultivadas, y porque en la etapa d)
se permite que algo de líquido de lavado permanezca en dicho
pocillo para prevenir que dicho pocillo se seque.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la placa de filtro tiene baja fluorescencia de fondo, y comprende
adicionalmente, entre las etapas d) y e):
- d1)
- añadir un ligando secundario a dicho pocillo capaz de unirse al ligando primario y que tiene un marcador detectable, y
- d2)
- lavar las células cultivadas en dicho pocillo con flujo por gravedad por lo menos una vez con un líquido de lavado para retirar cualquier ligando secundario que no esté unido a la molécula diana seleccionada de la célula, para proporcionar una célula lavada,
en el que, en la etapa d2) se permite que algo
de líquido de lavado permanezca en dicho pocillo para prevenir que
dicho pocillo se seque.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el
que la placa tiene:
- a)
- un filtro de policarbonato; o
- b)
- un tamaño medio de poro de alrededor de 3 micrómetros.
4. El método de cualquier reivindicación
precedente, en el que el ligando tiene una entidad detectable
seleccionada de materiales fluorescentes, materiales radiactivos,
quimioluminiscencia, medidas de absorbancia de luz y densidad
óptica.
5. El método de la reivindicación 1 o 2, en el
que la molécula diana es una proteína marcadora, tal como
- a)
- proteína marcadora que es una proteína marcadora específica de una célula, o
- b)
- proteína marcadora que es una proteína de la superficie celular, o
- c)
- proteína marcadora que es una proteína intracelular de la célula.
6. El método de la reivindicación 1 o 2,
adaptado para detectar un inmunoensayo, en el que la molécula diana
es una proteína diana, el filtro está formado de policarbonato
hidrófilo poroso que tiene un tamaño de poro nominal de alrededor
de 3 micrómetros; el reactivo es por lo menos un anticuerpo para la
proteína diana seleccionada y se usa un dispositivo de detección
para buscar el anticuerpo para indicar la presencia o ausencia de la
proteína diana.
7. Un kit para realizar inmunoensayos, que
comprende una placa (2) multipocillo que tiene una membrana (12)
hidrófila con un tamaño medio de poro entre 1 y 3,5 micrómetros, un
portador (4) multipocillo hidrófilo que tiene una parte superior
abierta y un fondo abierto estando los pocillos alineados y capaces
de estar en registro con los pocillos de la placa de filtro, y una
bandeja (6) de recogida de filtrado capaz de soportar la superficie
inferior del portador sobre sus superficies superiores y la placa de
filtro soportada sobre las superficies superiores del portador.
8. El kit de la reivindicación 7,
- a)
- en el que la membrana es un filtro de policarbonato que tiene un tamaño de poro de alrededor de 3 micrómetros, o
- b)
- que comprende adicionalmente un primer anticuerpo para unirse a una proteína marcadora de una célula, o
- c)
- que comprende adicionalmente un primer anticuerpo para unirse a una proteína marcadora de una célula y un segundo anticuerpo que contiene una entidad detectable en el que el segundo anticuerpo es capaz de unirse al primer anticuerpo, o
- d)
- que comprende adicionalmente uno o más tampones de lavado.
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