CN103415349A - 使用辅助液体分离悬浮液中各组分的方法与系统 - Google Patents
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Abstract
公开了分离悬浮液中各组分物质的方法与系统。在一个方面中,将怀疑含有目标物质的悬浮液和辅助流体加入到试管中。该辅助流体的密度大于悬浮液,与悬浮液流体不混溶,且相对于悬浮液物质呈惰性。添加漂浮物到试管中,和一起离心试管,漂浮物,悬浮液和辅助流体,且辅助流体占据试管底部。漂浮物的密度小于辅助流体的密度,这使得漂浮物能悬浮在悬浮液的轴向层状物质内。结果,漂浮物使含有目标物质的层的轴向长度在漂浮物的外表面和试管的内表面之间膨胀。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年11月8日提交的临时申请No.61/556,882的权益。
技术领域
本发明的公开内容一般地涉及密度-基流体分离,和尤其通过离心分层的悬浮液各组分的分离和轴向膨胀的系统与方法。
背景技术
悬浮液常常包括难以检测、提取和分离以供分析的感兴趣的材料。例如,全血是流体内各物质的悬浮液。这些物质包括在称为血浆的蛋白质流体内的数十亿的红细胞和白细胞以及血小板。常规地检验全血的变态组织或细胞(例如卵子、胎细胞、内皮细胞、寄生虫、细菌和炎症细胞)和病毒(其中包括HIV,细胞巨化病毒,肝炎C病毒,和Epstein-Barr病毒)。目前,从业者、研究者和与操作血样的那些人尝试分开、分离并提取外周血样中的一些组分以供检测。分离血样所使用的典型技术包括在载片上涂抹血液薄膜并使薄膜染色的步骤,其中染色方式使得一些组分能被明视场显微镜法检测。
另一方面,在悬浮液中出现的具有非常低浓度的感兴趣的物质特别难以(如果不是不可能的话)使用许多已有技术检测并分析。考虑例如循环肿瘤细胞("CTC")(它们是从肿瘤中脱离的癌细胞)在血流内循环,且可被视为随后在不同组织内额外肿瘤生长的种子(即转移)。精确地检测并分析CTC的能力对于肿瘤学家和癌症研究者来说是尤其感兴趣的。然而,CTC在外周全血样品内以非常低的数量存在。例如,对于诊断和治疗癌症患者来说,含有少至5CTC的7.5ml外周全血样被视为临床相关。换句话说,在7.5ml血样内检测1个CTC相当于在约100亿个红细胞和白细胞的背景中检测1个CTC,这是极端耗时、昂贵和使用血液薄膜分析难以实现的。
因此,从业者、研究者和与操作悬浮液的那些人员继续寻求精确地分析悬浮液存在或者不存在感兴趣的稀有物质的系统与方法。
发明概述
公开了分离悬浮液中各组分物质的方法与系统。在一个方面中,将怀疑含有目标物质的悬浮液和辅助流体加入到试管中。辅助流体的密度大于悬浮液,在悬浮液流体内不混溶,且相对于悬浮液物质是惰性的。添加漂浮物到试管中,和一起离心试管、漂浮物、悬浮液和辅助流体,从而引起各种悬浮液物质沿着试管的长轴根据每一物质的密度分离成不同层,且辅助流体占据试管底部。选择漂浮物使得密度小于辅助流体的密度且与目标物质的密度大致匹配。辅助流体使得漂浮物能悬浮在悬浮液的轴向层状物质内。结果,在漂浮物的外表面和试管的内表面之间漂浮物使含有目标物质的层的轴向长度膨胀。
附图说明
图1A-1B示出了两个例举的试管和漂浮物体系的等大视图。
图2示出了图1所示的试管和漂浮物体系的例举漂浮物的等大视图。
图3-5示出了不同类型漂浮物的实例。
图6A-6C示出了使用具有辅助流体的例举试管和漂浮物体系。
图7A-7B示出了添加了辅助流体的试管和漂浮物体系的例举试管。
图8示出了具有辅助流体的离心过的试管和漂浮物体系的实例。
图9示出了具有辅助流体的离心过的试管和漂浮物体系的实例。
详细说明
公开了分离悬浮液中各组分物质的方法与系统。将详细说明组织成两个子部分:(1)在第一子部分中提供各种试管和漂浮物体系的一般说明。(2)在第二子部分中提供使用试管和漂浮物体系分离悬浮液中各组分物质的方法与系统的实例。
试管与漂浮物体系
图1A示出了例举的试管和漂浮物体系100的等大视图。系统100包括试管102和在悬浮液106内悬浮的漂浮物104。在图1A的实例中,试管102具有圆形截面,第一密闭端108,和第二开放端110。调节开放端110的尺寸,以接收塞子或盖帽112。试管也可具有调节大小以接收塞子或盖帽的两个开放端,例如图1B所示的例举试管和漂浮物体系120。系统120类似于系统100,所不同的是,试管102被试管122替代,所述试管122包括为分别接收盖帽112和盖帽128而构造的两个开放端124和126。试管102和122具有通常圆柱几何形状,但也可具有分别朝开放端110和124变宽的锥变的几何形状。虽然试管102和122具有圆形截面,但在其他实施方案中,试管102和122可具有椭圆形,正方形,三角形,矩形,八边形,或基本上伸长试管长度的任何其他合适的截面形状。试管102和122可由透明或半透明的挠性材料例如挠性塑料或其他合适的材料构成。
图2示出了图1中所示的漂浮物104的等大视图。漂浮物104包括主体202,锥形的锥变端204,圆顶形端部206,和在主体202上径向间隔且轴向取向的齿条(spline)208。齿条208提供与试管102的内壁的密封咬合。在可供替代的实施方案中,可各自独立地改变齿条的数目,齿条的间隔,和齿条的厚度。齿条208也可被折断或者分割。调节主体202的大小以具有比试管102的内径小的外径,从而在主体202的外表面和试管102的内壁之间确定流体保留通道。齿条208之间的主体202的表面可以是扁平、曲线或者具有另一合适的几何形状。在图2的实例中,齿条208和主体202形成单一结构。
实施方案包括漂其他类型的几何形状的浮物端部盖帽。图3示出了具有两个锥形端部盖帽302和304的例举漂浮物300的等大视图。漂浮物300的主体306包括与漂浮物104相同的结构元件(即齿条和钻孔)。漂浮物也可包括两个圆形形状的端部盖帽。漂浮物端部盖帽可包括其他几何形状,且不打算限制到本文描述的形状。
在其他实施方案中,漂浮物104的主体可包括各种不同的支持结构以供分离目标物质,支持试管壁,或者在离心过程中绕漂浮物导引悬浮液流体。图4和5示出了两类不同的主体结构元件的实例。这些实施方案不打算限制到这两个实例上。在图4中,漂浮物400的主体402类似于漂浮物104,所不同的是主体402包括给可变形试管提供支持的许多突出物404。在可供替代的实施方案中,可改变突出物的数量和图案。在图5中,漂浮物500的主体502包括单一连续的螺旋结构或绕主体502盘旋的脊梁(ridge)504,从而产生螺旋通道506。在其他实施方案中,螺旋脊梁504可以成环或者被折断或分割,以允许流体在螺旋脊梁504的相邻轮回之间流动。在各种实施方案中,可独立地改变螺旋脊梁的间隔和肋条厚度。
漂浮物可由各种不同的材料构成,其中包括但不限于硬质有机或无机材料,和硬质塑料材料,例如聚氧亚甲基(""),聚苯乙烯,丙烯腈丁二烯苯乙烯("ABS")共聚物,芳族聚碳酸酯,芳族聚酯,羧甲基纤维素,乙基纤维素,乙烯乙酸乙烯酯共聚物,尼龙,聚缩醛,聚乙酸酯,聚丙烯腈和其他腈树脂,聚丙烯腈-氯乙烯共聚物,聚酰胺,芳族聚酰胺,聚酰胺-酰亚胺,聚丙烯酸酯,聚芳醚,聚芳硫醚,聚芳基砜,聚苯并咪唑,聚对苯二甲酸丁二酯,聚碳酸酯,聚酯,聚酯酰亚胺,聚醚砜,聚醚酰亚胺,聚醚酮,聚醚醚酮,聚对苯二甲酸乙二酯,聚酰亚胺,聚甲基丙烯酸酯,聚烯烃(例如,聚乙烯,聚丙烯),聚异质同晶体,聚噁二唑,聚对二甲苯,聚苯醚("PPO"),改性PPO,聚苯乙烯,聚砜,含氟聚合物例如聚四氟乙烯,聚氨酯,聚乙酸乙烯酯,聚乙烯醇,聚乙烯基卤例如聚氯乙烯,聚氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物,聚乙烯吡咯烷酮,聚偏氯乙烯,特殊性能高分子,聚苯乙烯,聚碳酸酯,聚丙烯,丙烯腈丁二烯-苯乙烯共聚物和其他。
分离悬浮液中各组分的方法与系统的实例
图6A示出了根据相关的材料密度,分离悬浮液中各组分物质的系统600的实例。系统600包括试管和漂浮物体系100(与以上参考图1A所述的一样),且包括置于试管102底部内的辅助流体602。流体602是密度大于漂浮物104的密度且在约25℃下粘度小于约500厘沲的液体物质。结果,漂浮物104驻留在流体602的表面上,或者如图6A所示,仅仅小部分漂浮物进入流体602的顶部。换句话说,选择流体602的组成,以便漂浮物104没有显著量地下沉到流体602内。
图6B示出了具有添加到试管102内的例举悬浮液604的系统600。悬浮液604可以是在悬浮液流体内悬浮的由颗粒形式的许多不同固体物质组成的非均相流体。除了具有密度大于漂浮物104的流体602以外,流体602的密度还大于与悬浮液604中的组分物质有关的密度,且密度大于悬浮液流体。选择流体602的组成,以便流体602在悬浮液流体内不混溶,且相对于悬浮液物质为惰性。一种或多种该物质可以是分析的目标,且称为“目标物质”。构造漂浮物104具有与目标物质大致相同的密度。结果,漂浮物104悬浮在流体602上部的悬浮液604内部。
为了同悬浮液604内的其他物质分开并分离目标物质,一起离心图6B中所示的试管,漂浮物,悬浮液和辅助流体一段时间。离心产生离心力,所述离心力引起悬浮液中的物质沿着试管102的长轴分离成不同的层。根据范围从位于流体602上的最高密度物质到位于离流体602最远的最低密度物质的相关密度,各物质层分离并分层。由于流体602在悬浮液流体内不混溶,因此流体602没有与悬浮液流体混合,这防止这两种流体的密度变化,并防止层状悬浮液物质内的密度梯度的改变。
假设例如悬浮液604由三种组分物质组成。图6C示出了在将沿着试管长轴分离的悬浮液604中的三种组分物质离心成三层606-608之后的试管和漂浮物体系600。层608含有最高密度的物质,它占据流体602直接上方的区域,和层606含有最低密度的物质,它占据在漂浮物104顶部周围处的区域。中间层607含有目标物质,它的密度介于最低和最高密度物质之间。注意在图6C的实例中,选择密度与目标物质的密度大致匹配的漂浮物104。流体602的密度将确保在离心过程中漂浮物104保持悬浮在悬浮液604内部。换句话说,当分离各物质时,轴向定位漂浮物104的主体,以大致匹配目标物质的位置。结果,漂浮物104使层607铺开,结果目标物质位于漂浮物104的主体和试管102的内壁之间的窄区域内。
在其他实施方案中,在添加漂浮物之前,可添加悬浮液到试管中。图7A示出了具有位于试管102底部的辅助流体602的试管102的实例。图7B示出了在随后的时间处具有加入到试管102中的悬浮液604的试管102。如上所述,流体602的密度大于悬浮液物质和悬浮液流体,且流体602与悬浮液流体不混溶且相对于悬浮液的组分物质为惰性。结果,悬浮液604漂浮或驻留在流体602之上,且不与流体602混合。然后可添加漂浮物104到试管102中,且离心内容物以将组分物质沿着试管102的长轴分离成各层,这与以上参考图6B和6C所述的一样。
可与各种不同的悬浮液一起使用该方法与系统。特别地,可与悬浮液(它们是生物流体样品)一起使用该方法与系统。生物流体样品的实例包括但不限于例如血液,大便,精液,脑脊髓液,乳头吸出流体,唾液,羊水,阴道分泌物,粘膜分泌物,水状体,玻璃状液,呕吐物,和任何其他生理流体或半固体。辅助流体与水不混溶,相对于样品中生物组分物质呈惰性。合适的辅助流体的实例包括但不限于全氟酮,例如全氟环戊酮和全氟环己酮,氟化酮,氢氟醚,氢氟烃,全氟烃,全氟聚醚,硅和硅-基液体,例如苯基甲基硅氧烷。对于生物流体样品来说,辅助流体可以是密度大于约1.09g/ml的苯基甲基硅氧烷,和漂浮物的密度范围为约1.0-约2.0g/ml。
图8示出了具有位于试管102底部的辅助流体802的离心系统800的实例。试管102还包括全血样品804,在离心之后,所述全血样品804分离成六层:(1)堆积的红细胞,(2)网状细胞,(3)粒细胞,(4)淋巴细胞/单核细胞,(5)血小板和(6)血浆。网状细胞,粒细胞,淋巴细胞/单核细胞,血小板层形成淡黄色的涂层,且是检测一些变态和癌症常常分析的层。当悬浮液是血样,例如图8所示的样品时,漂浮物104的密度可以是约1.05g/mL,和所选的流体802的粘度小于约15厘沲,和密度大于约1.679g/ml。如图8所示,根据范围从最高密度物质,位于流体802之上的红细胞806,到最低密度物质,最远离流体802的血浆808的相关密度,将血样组分在试管102内轴向分离成各层。在没有漂浮物104的情况下,含淡黄色涂层的各层是薄的,且可能难以提取以供分析。但如图8的实例中所示,漂浮物104使在漂浮物104的主体和试管102的内壁之间的淡黄色涂层膨胀,这使得待分析的淡黄色涂层和相关材料通过试管102壁。由于流体802在水中不混溶,且密度大于水,因此流体802不与淡黄色涂布层结合。另外,由于流体802的密度大于漂浮物104,因此流体802填充试管102的底部和漂浮物104之间的空间。结果,漂浮物104保持与样品804一起悬浮。
为了鉴定并测定悬浮液中目标物质的存在,可用荧光标记物标记目标物质颗粒。在离心之后,用光辐照试管,诱导光子从荧光标记物中发射。可使用荧光来证实目标物质的存在并鉴定。例如,目标物质颗粒可以是某些类型的细胞,例如CTC,囊泡,脂质体,或具有密闭膜的天然存在或者人工制备的微观单元。荧光分子与特异地结合到目标物质颗粒上的分子或其他颗粒共轭。当施加合适的刺激时,荧光分子发出在已知波长范围内的光,这取决于特定的荧光分子。如上所述,漂浮物具有选择的密度,以便当一起离心试管、漂浮物、辅助流体和悬浮液时,定位漂浮物在与目标颗粒大致相同的液面处。在离心之后,目标颗粒定位在漂浮物的外表面和试管的内壁之间,和当施加合适的刺激时,荧光分子发出荧光。为了防止辅助流体干扰来自荧光分子的荧光,当暴露于刺激下时,所选的辅助流体不发出荧光,且相对于荧光分子呈惰性。
含辅助流体的试管和漂浮物体系便于分析小的悬浮液体积,其方式与其中使用不具有辅助流体的试管和漂浮物体系分析较大体积的悬浮液相同。图9示出了具有位于试管102底部的辅助流体902的离心过的试管和漂浮物体系900的实例。在这一实例中,待分析的悬浮液是淡黄色的涂层904,它包括非常低体积的生物样品。如图9的实例中所示,流体902填充在试管102的底部和漂浮物104之间的空间,以便在离心过程中,淡黄色涂布层可分离并在漂浮物104的主体和试管102的内壁之间铺开。在这一实例中,漂浮物104的密度大于约1.090g/mL,为约1.21g/mL。换句话说,可使用辅助流体来增加试管的体积,以便可离心非常小体积的悬浮液,并以与离心并分析较大体积悬浮液相同的方式分析。
另外,由于辅助流体在水中不混溶,且不与悬浮液各组分物质反应,因此,辅助流体使得能进行细胞内蛋白质分析且不担心血液组分的密度性能变化。细胞内的蛋白质分析技术包括细胞内蛋白质染色,荧光就地杂化,或者支化DNA(即,"bDNA"—分析mRNA表达水平的工具)分析。在分析之前,通过分离并固定目标细胞,辅助这些技术。然而,在固定并渗透细胞之后,辅助流体使得细胞局部定位在漂浮物表面上,这在其他情况下会干扰其密度性能。可以被染色的一些分子内蛋白质包括但不限于细胞角蛋白("CK"),肌动蛋白,Arp2/3,冠蛋白,肌萎缩蛋白,FtsZ,肌浆球蛋白,血影蛋白,微管蛋白,胶原,组织蛋白酶D,ALDH,TWIST1,PBGD,和MAGE。例如,可在鉴定并列举血样中的CTC中,使用CK染色,和随后诊断各种细胞事件。
为了阐述的目的,前述说明使用具体的命名法,以提供公开内容的彻底理解。然而,对于本领域技术人员来说,显而易见的是,不要求具体细节,以便实践本文描述的系统与方法。例如,以上描述的方法与系统不打算限制于使用图1A为代表的试管和漂浮物体系100。可以与使用图1B所示的试管和漂浮物体系120相同的方式进行方法实施方案。为了阐述和说明的目的,作为实例列出具体实施方案的前述说明。它们不打算为穷举或者限制本发明的公开内容到所描述的精确形式上。显然,鉴于上述教导,许多改性和变化是可能的。显示并描述各实施方案,以便最好地解释本发明公开内容的原理和实际的应用,进而使得本领域的其他技术人员能最好地利用本发明的公开内容和具有各种改性的各种实施方案,因为它们适合于预期的特定应用。本发明公开内容的范围拟通过下述权利要求及其等价方案定义。
Claims (22)
1.一种分离悬浮液中各组分物质的系统,该系统包括:
具有开放端以接收悬浮液的试管;
插入到该试管内的漂浮物,该漂浮物的密度与悬浮液中目标物质的密度大致匹配;和
置于试管内的辅助流体,该辅助流体的密度大于所述漂浮物且大于所述悬浮液。
2.权利要求1的系统,其中悬浮液包括悬浮液流体且辅助流体与该悬浮液流体不混溶。
3.权利要求1的系统,其中辅助流体相对于悬浮液的组分物质为惰性。
4.权利要求1的系统,进一步包括用荧光分子标记的目标物质,当暴露于刺激物下时辅助流体不发出荧光,其中所述刺激物刺激荧光分子发出荧光,和辅助流体相对于荧光分子为惰性。
5.权利要求1的系统,其中辅助流体进一步包括全氟酮,氟化酮,氢氟醚,氢氟烃,全氟烃,和全氟聚醚中的一种或多种。
6.权利要求1的系统,其中辅助流体进一步包括硅液体和硅-基液体之一。
7.权利要求1的系统,其中辅助流体是密度大于1.090g/mL的苯基甲基硅氧烷。
8.权利要求1的系统,其中辅助流体的粘度小于501厘沲。
9.权利要求1的系统,其中漂浮物的密度为约1.0-2.0g/mL。
10.权利要求1的系统,其中辅助流体的密度大于约1.090g/mL。
11.一种分离悬浮液中各组分物质的方法,该方法包括:
添加辅助流体到试管中;
将漂浮物插入到试管中,该漂浮物的密度小于辅助流体的密度;
添加悬浮液到该试管中,该悬浮液的密度小于辅助流体的密度;和
将悬浮液物质沿着试管的长轴分离成不同层,以在漂浮物和试管之间分离目标物质,其中辅助流体填充漂浮物的底部和试管底部之间的空间。
12.权利要求11的方法,其中沿着试管的长轴分离悬浮液物质成不同层进一步包括离心试管、漂浮物、辅助流体和悬浮液。
13.权利要求11的方法,其中漂浮物的密度与悬浮液的目标物质的密度大致匹配。
14.权利要求11的方法,进一步包括施加刺激物,以刺激来自悬浮液中荧光标记目标物质的荧光,其中当暴露于刺激物下时辅助流体不发出荧光且相对于荧光分子呈惰性。
15.权利要求11的方法,其中悬浮液包括悬浮液流体和与该悬浮液流体不混溶的辅助流体。
16.权利要求11的方法,其中辅助流体相对于悬浮液各组分物质呈惰性。
17.权利要求11的方法,其中辅助流体进一步包括全氟酮,氟化酮,氢氟醚,氢氟烃,全氟烃和全氟聚醚中的一种或多种。
18.权利要求11的方法,其中辅助流体进一步包括硅液体和硅-基液体之一。
19.权利要求11的方法,其中辅助流体是密度大于1.090g/mL的苯基甲基硅氧烷。
20.权利要求11的方法,其中辅助流体的粘度小于501厘沲。
21.权利要求11的方法,其中漂浮物的密度为约1.0-2.0g/mL。
22.权利要求11的方法,其中辅助流体的密度大于约1.090g/mL。
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