PL238511B3 - Insert do pojemnika do wirowania, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości oraz pojemnik zawierający ten insert - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy insertu do pojemnika do wirowania, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości. W innym aspekcie wynalazek dotyczy także pojemnika zawierającego ten insert. Rozwiązanie będące przedmiotem wynalazku należy do dziedziny pojemników służących do celów laboratoryjnych, a zwłaszcza do probówek specjalnie przystosowanych do celów wirowania.

Niniejsze zgłoszenie jest zgłoszeniem dodatkowym do zgłoszenia wynalazku pt. „Insert oraz sposób rozdziału płynów z wykorzystaniem gradientu gęstości”, dokonanego w dn. 15.09.2015 r. w Urzędzie Patentowym RP i oznaczonym numerem P.413910. Przedstawione w nim urządzenie dotyczy insertu, pojemnika z insertem oraz sposobu rozdziału płynów z wykorzystaniem tego pojemnika przy wykorzystaniu gradientu gęstości przy użyciu wirowania.

Stan techniki

Pobieranie, oczyszczanie, rozdział na frakcje i/lub utrwalanie próbek płynów ustrojowych, w tym krwi, odgrywają ważną rolę m.in. w diagnostyce medycznej oraz w badaniach klinicznych. W przypadku konwencjonalnych systemów i metod zbierania próbek krwi na dużą skalę, próbki krwi pobrane od pacjenta mogą być rozdzielane na różne frakcje za pomocą wirowania, filtracji lub elutriacji, a następnie przechowywane do późniejszego użycia lub dalszych badań. Rozdzielone składniki krwi zazwyczaj zawierają frakcje krwinek czerwonych, krwinek białych, płytek krwi i osocza. Rozdzielenie krwi na jej frakcje można przeprowadzić w sposób ciągły, podczas pobierania krwi lub w etapach następujących już po jej pobraniu. Rozdzielenie krwi na różne składniki w wysoce sterylnych warunkach jest kluczowe dla wielu zastosowań terapeutycznych oraz dla celów badań klinicznych.

Istnieje wiele metod rozdziału krwi na jej frakcje. Metody znane w stanie techniki wymagają zastosowania wysokiej klasy specjalistycznych urządzeń medycznych/badawczych oraz wysoce wykwalifikowanego personelu do ich prawidłowej obsługi.

Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO8805331, znana jest technika służąca do oddzielenia białych krwinek (leukocytów) od czerwonych krwinek (erytrocytów), która polega na zmieszaniu próbki krwi z roboczym roztworem, który agreguje ze sobą czerwone krwinki, a tym samym zwiększa ich prędkość sedymentacji. Gęstość roboczych rozdzielających płynów jest tak dobrana, aby sedymentacja białych krwinek była minimalnie zmieniona i aby białe krwinki nie opadały na dno i w efekcie mogły być pobrane z górnej części rozdzielonego płynu po tym jak czerwone krwinki opadną.

W innej technice, w której roztwór roboczy agregujący czerwone krwinki nie jest wymieszany z krwią, krew jest precyzyjnie rozlewana na powierzchni roboczych płynów rozdzielających po czym czerwone krwinki aglutynują lub agregują pod wpływem powierzchniowego kontaktu z roboczymi płynami rozdzielającymi w efekcie czego opadają na dno tejże tubki. Jest kilka dobrze znanych wielopolimerowych związków, które powodują aglutynację czerwonych krwinek, np. FICOLL 400 (Pharmacia Fine Chemicals, Szwecja). Separacja krwi może przebiegać pod wpływem grawitacji lub pod wpływem wirowania. Większość białych krwinek pozostaje na granicy faz, jednak tego typu wcześniej opracowane systemy nie są skuteczne w separacji białych krwinek na subpopulacje, czyli np. na populacje jednojądrzastych białych krwinek (PBMC) i białych krwinek o jądrze segmentowanym (PMN). W szczególności, poszukuje się jednoetapowej metody, wykorzystującej medium do rozdziału o jednej gęstości, która pozwoliłaby na rozdzielenie białych krwinek w pełnej krwi na subpopulacje.

Aby dokonać wspomnianego rozdziału białych krwinek na subpopulacje, jedna ze znanych metod polega na izolacji białych jednojądrzastych krwinek (PBMC) w oparciu o proces wirowania, gdzie w pierwszym etapie wykorzystuje się mieszaninę Isopaque-Ficoll (Nyegaard & Co., Norwegia), mający jako główny składnik metrizoat sodu, w kolejnym etapie izoluje się białe krwinki o segmentowanym jądrze przy użyciu dekstranu lub żelatyny , które to powodują sedymentację czerwonych krwinek. Inna metoda wykorzystuje nieciągłe gradienty gęstości gdzie dwa lub więcej roboczych płynów rozdzielających jest wlewanych warstwowo jeden na drugi. Gęstości są tak dobrane aby (nieciągły) gradient był w odpowiednim/wymaganym zakresie - dostosowanym do gęstości rozdzielanych substancji.

Z kolei amerykańskie zgłoszenie patentowe nr US4824560 A ujawnia sposoby i środki wirowania w rurkowatym pojemniku mającym co najmniej dwie przylegające komory, które są ze sobą połączone wąskim, w zasadzie kapilarnym otworem. Do funkcjonowania, płyn roboczy jest umieszczany w dolnej komorze, natomiast płyn, który ma zostać rozdzielony na frakcje jest umieszczony w górnej komorze, przy czym nie ma potrzeby stosowania specjalnych środków ostrożności w celu uniknięcia mieszania się płynów przed rozpoczęciem wirowania. Metoda ta ma kilka zalet w stosunku do opisa

PL 238 511 B3 nych powyżej metod manualnych, ma też wadę polegającą na tym, że wąskie połączenie obydwu komór, nawet podczas wirowania stawia opór uniemożliwiając efektywne przejście komórkom krwi między komorami tak aby krew mogła zostać rozdzielona na frakcje.

Problemem pojawiającym się w opisanych powyżej manualnych metodach separacji polega na przygotowaniu próbki do tego procesu, a w szczególności na warstwowym ułożeniu wlewanych płynów służących do rozdziału o różnej gęstości oraz materiału badanego np. krwi. Istotne jest, aby płyny się ze sobą nie mieszały i żeby wytworzyła się granica faz pomiędzy płynami o różnej gęstości. Aby osiągnąć ten stan opracowano różne techniki i umiejętności pozwalające na prawidłowe przygotowanie płynów służących do separacji i krwi, które najczęściej ostrożnie wprowadza się np. pipetą do pojemnika celem ich dalszego rozdziału na frakcje stosując wirowanie na gradiencie stężeń. Niestety procedury te są uciążliwe, trudne w wykonaniu, wprowadzają możliwość pojawienia się niekontrolowanych błędów ludzkich, a dodatkowo wymagają wysoko wykwalifikowanego personelu, co wiąże się z wysokimi kosztami eksploatacji, ogranicza powtarzalność procedury i uniemożliwia przeprowadzanie separacji/rozdziału na szeroką skalę.

Celem rozwiązania według wynalazku było uzyskanie narzędzia do szybkiego i częściowo automatycznego rozdziału płynów na frakcje o różnej gęstości np. płynów biologicznych, w tym krwi, które dodatkowo może pozwalać na oczyszczanie, izolację i utrwalanie próbek biologicznych.

Definicje

W obrębie opisu wynalazku i zastrzeżeń patentowych następujące terminy należy rozumieć zgodnie z poniższymi definicjami:

„pojemnik” stanowi dowolny zbiornik do gromadzenia płynów, który jest dostosowany do wirowania np. probówki do wirowania, „prowadnica” to element insertu, który służy do nadawania określonego kierunku przepływu cieczy z komory górnej do komory dolnej przez otwór w przegrodzie, przy czym prowadnica powinna być takiej wielkości, aby umożliwić rozlewanie się badanej cieczy na znajdującym się na dnie pojemnika medium do rozdziału. Prowadnicą zgodną z ww. definicją może być ścianka pojemnika lub inna struktura wewnątrz pojemnika np. spirala, wydłużona tuleja, etc.

Szczegółowy opis wynalazku

Istotą wynalazku jest insert do pojemnika do wirowania, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości, zwłaszcza cieczy stanowiących zawiesiny i/lub płyny biologiczne charakteryzujący się tym, że insert jest wyposażony jest w przegrodę dzielącą wnętrze pojemnika na co najmniej dwie komory w układzie wertykalnym - komorę górną oraz komorę dolną, przy c zym przegroda posiada otwór, do którego przylega prowadnica, po której spływają ciecze, zwłaszcza płyn biologiczny, do komory dolnej pojemnika do wirowania.

Korzystnie, gdy prowadnicę stanowi wewnętrzna ściana pojemnika, spirala, lejek lub pionowe elementy w kształcie wydłużonego walca.

Równie korzystnie, gdy przegrodę stanowią dwa przylegające do siebie powierzchnie z otworami, zwłaszcza w kształcie spłaszczonych krążków dopasowanych do przekroju pojemnika o przekroju poprzecznym zbliżonym do koła, przy czym powierzchnie są ze sobą ruchomo połączone, mogą być względem siebie dowolnie ustawiane umożliwiając zamykanie światła otworów.

Korzystnie, gdy komora górna może posiadać dodatkowo pionową przegrodę lub przegrody dzielące ją na podkomory, przy czym każda z podkomór posiada otwór.

W innym aspekcie wynalazek dotyczy pojemnika do wirowania zawierającego insert do pojemnika do wirowania według wynalazku, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości, zwłaszcza cieczy stanowiących zawiesiny lub płyny biologiczne, przy czym urządzenie to wyposażone jest w przegrodę dzielącą wnętrze pojemnika na komorę górną oraz komorę dolną, przy czym przegroda posiada otwór, a przy otworze znajduje się prowadnica, po której spływają płyny, zwłaszcza płyn separowany, do komory dolnej pojemnika do wirowania.

Dla lepszego zrozumienia wynalazek przedstawiono w przykładzie wykonania zilustrowanym na rysunku nie stanowiącym ograniczenia wnioskowanej ochrony, na którym:

fig. 1 ilustruje pojemnik w kształcie probówki do wirowania wraz z insertem, przeznaczony do zbierania płynów, w tym zwłaszcza materiału biologicznego, a następnie do jego rozdziela

PL 238 511 B3 nia/separacji, który - zgodnie z wynalazkiem - umożliwia warstwowe ułożenie płynów umieszczonych w pojemniku przed wirowaniem;

fig. 2 i 3 ilustruje odpowiednio przekrój podłużny i widok z boku pojemnika w kształcie probówki do wirowania, w której dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku dysk i przegroda insertu są od siebie oddalone;

fig. 4 i 5 ilustruje odpowiednio widok z boku i przekrój podłużny pojemnika w kształcie probówki z widocznym zwężającym się światłem probówki wraz ze wzrostem grubości jej ścianki, fig. 6 ilustruje przekrój poprzeczny przez pojemnik w kształcie probówki w przykładzie bez przegrody pionowej, ale z uwidocznionym kanałem powietrznym, fig. 7a i 7b ilustruje odpowiednio widok z boku i przekrój poprzeczny górnej część insertu w postaci dysku z niepełną przegrodą, fig. 8a i 8b ilustruje odpowiednio widok z boku i przekrój poprzeczny górnej część insertu w postaci dysku z przegrodą w kształcie prostokąta, fig. 9a i 9b ilustruje odpowiednio widok z boku i przekrój poprzeczny górnej część insertu w postaci dysku z przegrodą w kształcie trzech prostokątów, fig. 10a i 10b ilustruje odpowiednio widok z boku i przekrój poprzeczny górnej część insertu w postaci dysku z przegrodą w kształcie dwóch przecinających się krzyżowo prostokątów, fig. 11a i 11b ilustruje odpowiednio przekrój poprzeczny i widok z boku przegrody w kształcie dysku z wycięciem.

fig. 12 ilustruje jeden z przykładów wykonania rozwiązania według wynalazku, w którym insert jest nasadzany na pojemnik do wirowania, fig. 13 i 13a ilustruje insert odpowiednio przekrój z boku i z góry przystosowany do podłączania komory górnej wyposażony w prowadnicę w kształcie wydłużonego walca, fig. 14 i 14a ilustruje insert odpowiednio przekrój z boku i z góry wyposażony w prowadnicę w postaci ośmiu wydłużonych walców, fig. 15 i 15a ilustruje insert odpowiednio przekrój z boku i z góry wyposażony w prowadnicę w kształcie spirali, fig. 16, 16a i 16b ilustruje insert odpowiednio przekrój z boku i z góry oraz przybliżenie na prowadnicę, wyposażony w prowadnicę w kształcie lejka.

P r z y k ł a d 1

Jak pokazano na fig. 1, w pierwszym przykładzie wykonania insert 6 do pojemnika do wirowania w postaci probówki składa się z przegrody 7 w kształcie płaskiego krążka szczelnie przylegającej do wewnętrznych ścianek pojemnika 1 oraz z dysku 8 wyposażonego w pełną przegrodę pionową 11. Insert w tym przykładzie umieszczony jest wewnątrz pojemnika 1 stanowiącego probówkę do wirowania o średnicy 0,23. Insert 6 w tym przykładzie jest wykonany z tworzywa sztucznego, ale mógłby być wykonany także z innym materiałów. Jak pokazano na fig. 12, insert 6 może być także umieszczony w dodatkowym pojemniku, który może być nakładany na pojemnik 1 do wirowania, wówczas insert 6 znajduje się na zewnątrz pojemnika 1.

W związku z tym, że ścianka pojemnika 1 w kształcie probówki stanowi prowadnicę 12 i poszerza się stopniowo w głąb pojemnika 1 (fig. 4 i 5) i jednocześnie światło probówki stopniowo maleje w kierunku jej dna. W tym przykładzie wykonania ścianka wewnętrzna pojemnika 1 stanowi prowadnicę 12, która pozwala cieczom spływać z komory górnej 2 do komory dolnej 3 przez otwór 4. Płyny - zwłaszcza płyny będące separowanymi biologicznymi płynami biologicznymi - spływają na dno pojemnika 1 po prowadnicy 12 stanowiącej ściankę i układają się warstwowo na dnie pojemnika 1. Spływanie cieczy po prowadnicy 12 zapobiega wzburzaniu płynów do rozdziału, które mogłoby powodować błędy w rozdziale badanych cieczy.

W tym przykładzie przegroda 7 ma kształt płaskiego krążka o przekroju poprzecznym w kształcie koła (fig. 11a, fig. 11b) i jest ściśle dopasowana swoim kształtem do kształtu przekroju poprzecznego pojemnika 1, tak więc średnica z jej wierzchniej strony jest większa niż ze strony dolnej, a przekrój podłużny przegrody 7 jest zbliżony do spłaszczonego odwróconego trapezu. Przegroda 7 dzieli pojemnik 1 na komorę górną 2 i komorę dolną 3. Przegroda w przykładzie posiada otwór 4 stanowiący wcięcie w kształcie zbliżone do półokręgu.

Jak pokazano na fig. 8a i 8b, przegroda pionowa 11 może być w kształcie prostokąta, który przylega ściśle do ścianki wewnętrznej pojemnika 1, wtenczas przegroda pionowa 11 umieszczona na dysku 8 dzieli komorę górną 2 pojemnika 1 w kształcie probówki na dwie podkomory 10a, 10b. W każdej z połówek dysku 8 utworzonego przez przegrodę 11 znajduje się po jednym otworze 5

PL 238 511 B3 w kształcie wycięcia, które można zamykać dyskiem 8. W przykładzie wykonania otwory 5 w kształcie wycięcia w dysku 8 są w kształcie półokręgu. W innych realizacjach rozwiązania według wynalazku jest również możliwe stosowanie dysków 8 z innymi kształtem otworów 5. Od kształtu otworów 4, 5 oraz ich wzajemnego ułożenia względem siebie zależy szybkość przepływu cieczy z komory górnej 2 do komory dolnej 3.

W tym przykładzie otwory 4, 5 w kształcie wcięć o promieniu wycięcia 0,115 są takiego samego kształtu. W innych wersjach przykładu wykonania otwory 4, 5 mogą mieć inne kształty i mogą się różnić od siebie kształtem, ale ich średnica powinna być większa niż 0,1. Przy takim ustawieniu przegrody 7 i dysku 8, że wycięcia 4, 5 się na siebie nie nakładają, przepływ płynów pomiędzy komorą górną 2 a komorą dolną 3 jest zablokowany i właściwe przelewanie się płynów nie może mieć miejsca.

W tym przykładzie wykonania pojemnik 1 wyposażony jest w wieczko 9. W jednej wersji przykładu wieczko 9 posiada szczelinę, przez którą przechodzi górna część przegrody pionowej 11 insertu 6. Takie położenie pionowej przegrody pionowej 11 umożliwia zmianę położenie dysku 8 względem przegrody 7 przez przekręcenie wystającej części tejże przegrody a tym samym ruchomej części wieczka 9. Pojemnik 1 i wieczko 9 posiada gwint i stanowi nakrętkę. Alternatywnie używa się wieczka bez szczeliny 91, gdzie przegroda pionowa 11 insertu jest dopasowana do długości pojemnika 1 tak, aby po zakręceniu wieczka 9 przegroda pionowa 11 szczelnie przylegała do wewnętrznej powierzchni wieczka 9.Wieczko 9 może być z tworzywa sztucznego i może posiadać skalibrowaną skalę obrotu/przekręcenia. Na pojemniku 1 do wirowania i na wieczku 9 mogą być zaznaczone oznaczenia ułatwiające prawidłowe dopasowanie/ułożenie otworów 4, 5 w stosunku do siebie.

Alternatywnie w innych wersjach przykładu wykonania możliwe są różne kształty i ułożenia przegrody pionowej 8. Jak pokazano na fig. 7a i 7b, przegroda pionowa 11 może nie przylegać do ścianek pojemnika 1, wtenczas przegroda pionowa 11 umieszczona na dysku 8 dzieli probówkę tylko na dwie komory - komorę górną 2 oraz komorę dolną 3, a komora górna 2 nie jest podzielona na dodatkowe podkomory. W tej wersji, dysk 8 jest wyposażony w jeden otwór 4 w kształcie wycięcie, przy czym kształt dysku 8 w innej wersji przykładu mógłby się ograniczać do zamknięcia otworów 4 w przegrodzie 7.

Jak pokazano na fig. 9a i 9b, przegroda pionowa 11 może składać się z trzech elementów w kształcie prostokąta połączonych ze sobą dłuższymi bokami, których boki przylegają ściśle do ścianki wewnętrznej pojemnika 1, wtenczas przegroda pionowa 11 umieszczona na dysku 8 dzieli komorę górną 2 pojemnika 1 w kształcie probówki na trzy podkomory. W tej wersji, dysk 8 jest wyposażony w trzy wycięcia 5, po jednym w każdej z podkomór.

Jak pokazano na fig. 10a i 10b, przegroda pionowa 11 może składać się z czterech prostokątów połączonych ze sobą, których boki przylegają ściśle do ścianki wewnętrznej pojemnika 1, wtenczas przegroda pionowa 11 umieszczona na dysku 8 dzieli komorę górną 2 pojemnika 1 w kształcie probówki na cztery podkomory. W tej wersji, dysk 8 jest wyposażony w cztery wycięcia 5, po jednym w każdej z podkomór.

Insert 6 może być także stosowany w pojemnikach 1 o innych kształtach niż probówka do wirowania przedstawiona w przykładzie wykonania z tym, że musi być możliwość jego wirowania.

P r z y k ł a d 2

Fig. 13 i 13a przedstawia inny przykład wykonania rozwiązania według wynalazku, w którym insert 6 posiada przegrodę 7, która nie posiada komory górnej natomiast umożliwia podłączenie, przez rurkę 16, do przegrody komory górnej w postaci pojemnika (np. probówki, woreczka) z medium do separacji lub z cieczą do rozdziału. Następnie, przegroda wyposażona jest w prowadnicę 12 w kształcie wydłużonego walca, który jest przymocowany do przegrody 7 i znajduje się w takiej odległości od otworu 4, który umożliwia cieczy przepływ z komory górnej przez rurkę 16 następnie otwór w przegrodzie po prowadnicy do komory dolnej 3.W tym przykładzie wykonania, wydłużony walec stanowiący prowadnicę 12 jest takiej długości, aby materiał badany rozlewał się na powierzchni medium do wirowania na gradiencie nie powodując istotnych zaburzeń medium do separacji.

P r z y k ł a d 3

Fig. 14 i 14a przedstawia inny przykład wykonania rozwiązania według wynalazku, w którym insert 6 posiada przegrodę 7, wyposażoną w prowadnicę 12 w kształcie 8 wydłużonych walców, które są przymocowany do przegrody 7 i znajdują się w takiej odległości od otworu 4, który umożliwia cieczy przepływ z komory górnej przez otwór w przegrodzie po prowadnicy do komory dolnej 3.W tym przykładzie wykonania, wydłużone walce stanowiące prowadnicę 12 są takiej długości,

PL 238 511 B3 aby materiał badany rozlewał się na powierzchni medium do wi rowania na gradiencie nie powodując istotnych zaburzeń medium do separacji.

P r z y k ł a d 4

Z kolei fig. 15 i 15a przedstawia jeszcze inny przykład rozwiązania według wynalazku, w którym insert 6 posiada przegrodę 7 wyposażoną w prowadnicę 12 w kształcie spirali. Analogicznie jak w przykładzie 2, długość spirali powinna być taka, aby materiał badany rozlewał się na powierzchni medium do wirowania na gradiencie nie powodując tym samym istotnych zaburzeń medium do separacji.

P r z y k ł a d 5

Fig. 16, 16a i 16b przedstawia jeszcze inny przykład rozwiązania według wynalazku, w którym insert 6 posiada przegrodę 7 wyposażoną w prowadnicę 12 w kształcie lejka. Przy czym otwory 4 w przegrodzie 7 kierują ciecze z komory górnej tak, aby spływały po zewnętrznej powierzchni lejka na dno komory dolnej 3. Analogicznie jak w przykładzie 2, długość spirali powinna być taka, aby materiał badany rozlewał się na powierzchni medium do wirowania na gradiencie nie powodując tym samym istotnych zaburzeń medium do separacji.

P r z y k ł a d 6

Sposób wydzielenia frakcji o pożądanym zakresie gęstości z próbki zawierającej frakcje o różnej gęstości według wynalazku można zrealizować w ten sposób, że w poszczególnych podkomorach 10a, 10b górnej komory 2 umieszczono dwa różne media do separacji w gradiencie gęstości, pierwsze medium ma gęstość 1,119 g/ml drugie medium ma gęstość 1,077 g/ml (odpowiednio Histopaque 1,119 oraz Histopaque 1,077 Sigma Aldrich), przy czym otwory 4, 5 stanowiące wcięcia - odpowiednio przegrody 7 i dysku 8 - nie nachodzą na siebie pozostając w pozycji zamkniętej. Następnie zmieniając położenie dysku 8 poprzez jego przekręcenie, wycięcia 4, 5 nachodzą na siebie na tyle, aby umożliwić przepływ medium z komory górnej 2 do komory dolnej 3. Przepływ następuje po prowadnicy 12 stanowiącej wewnętrzną ściankę pojemnika 1. W związku z tym, że położenie otworów 4, 5 stanowiących wycięcie w przegrodzie 7 i dysku 8 z przykładu przylegają do prowadnicy 12 stanowiącej ściankę pojemnika 1. Dodawanie mediów następuje w kolejności od najwyższej do najniższej gęstości, a pomiędzy mediami o różnej gęstości tworzy się granica faz. Następnie do jednej z pustych podkomór 10 z zamkniętym przepływem pomiędzy komorą górną 2 oraz komorą dolną 3 dodaje się ciecz lub mieszaninę przeznaczoną do rozdzielenia na frakcje o różnej gęstości pod wpływem wirowania np. krew natywną lub rozcieńczoną.

Wielkość prześwitu tworzonego przez otwory 4, 5 stanowiące wycięcia odpowiednio przegrody 7 oraz dysku 8 może być kontrolowana przez regulacje wzajemnego położenia przegrody 7 i dysku 8. Powolne przekręcenie górnej części insertu 11, a tym samym dysku 8, powoduje stopniowe zwiększanie szybkości przepływu płynu do momentu, gdy uzyska się zakładaną prędkość przepływu cieczy pomiędzy komorami 2, 3. Przez regulację wielkości wzajemnego nakładania się otworu 4 i otworu 5, przepływ cieczy może być kontrolowany w celu utworzenia ciągłego przepływu laminarnego po ściance 12 pojemnika 1 do wirowania. Budowa przegrody 7 i dysku 8 według wynalazku zapewnia bardzo łagodne wlewanie się płynu z komory górnej 2 do komory dolnej 3 pojemnika 1 do wirowania w taki sposób, że powierzchnia cieczy jest nienaruszona i kolejny płyn wlewany z komory górnej 2 nie miesza się z płynem obecnym w komorze dolnej 3.

Po warstwowym wlaniu dwóch mediów do separacji w gradiencie gęstości płyny te układają się warstwami jeden na drugim ze względu na różną gęstość, dodano badaną próbkę w postaci krwi, choć możliwe jest stosowanie różnych rodzajów płynów do rozdziału, w tym natywne lub rozcieńczonych próbek biologicznych. Krew najpierw umieszczona została w podkomorze 10a, a następnie po przekręceniu dysku 8 insertu 6 w taki sposób, że otwór 4 przegrody 7 pokrywa się przynajmniej w części z odpowiednim otworem 5 dysku 8 insertu 6 i umożliwia przepływ krwi po ściance 12 pojemnika 1 z podkomory 10a do dolnej komory 3 rozlewając się na powierzchni uprzednio tam umieszczonych mediów do separacji. Ze względu na budowę insertu 6 nie jest konieczne, aby materiał biologiczny był umieszczany w pojemniku 1 z nadzwyczajną precyzją i ostrożnością.

Następnie krew w komorze dolnej 3 pojemnika 1 wiruje się wg sposobów ogólnie znanych w dziedzinie. W trakcie wirowania następuje dwukierunkowy przepływ płynów w ramach różnych przedziałów tworzonych przez płyny rozdzielające o różnej gęstości w komorze dolnej 3, a na końcu wirowania tworzy się ciągły gradient gęstości z czerwonymi krwinkami osiadającymi na dnie tworzącymi najniżej usytuowaną warstwę, wyższą warstwę stanowi ciecz o gęstości 1,119 g/ml, następna wyżej usytuowana warstwa to białe krwinki o jądrach segmentowanych, powyżej znajduje się warstwa

PL 238 511 B3 utworzona przez ciecz o gęstości 1,077 g/ml, powyżej znajduje się warstwa białych krwinek jednojądrzastych, powyżej jako najwyższa warstwa znajduje się osocze. Po wyjęciu insertu, każda z warstw komórek / lub cieczy może być usunięta przez zasysanie za pomocą pipety lub dekantacji.

P r z y k ł a d 7

Insert oraz sposób według wynalazku stosuje się na przykład do oddzielania pożądanego podzbioru komórek krwi. W przykładzie wykonania pobrano dziesięć próbek krwi od zdrowych ochotników (po 20 ml krewi żylnej) do komercyjnie dostępnych probówek z kwasem wersenowym (EDTA) (probówka EDTA, Becton Dickinson). W tym eksperymencie objętość probówki do wirowania 1 będących istotą wynalazku wynosiła 50 ml, zastosowano również dwa media do separacji o różnej gęstości (Histopaque 1.119 oraz Histopaque 1.077 Sigma Aldrich). Zastosowane media do separacji miały neutralne pH, były izotoniczne do płynów ustrojowych, pierwsze medium do separacji miało gęstość 1,119 g/ml, natomiast drugie miało gęstość 1,077 g/ml.

Następnie umieszczono 10 ml medium do separacji o gęstości 1,119 g/ml w podkomorze 10a komory górnej 2 pojemnika 1 do wirowania wyposażonego w insert 6 według wynalazku. Drugie medium o gęstości 1,077 g/ml o objętości 10 ml zostało umieszczone w podkomorze 10b komory górnej 2, a następnie warstwowo nałożono je na pierwsze medium z wykorzystaniem insertu 6 według wynalazku opisanego powyżej. W eksperymencie przegroda rozdzielająca miała grubość 0,08 a wycięcia 4, 5 przegrody 7 i dysku 8 miały promień 0,115. Następnie pobraną krew z kwasem wersenowym (EDTA) umieszczono w podkomorze 10a komory górnej 2. Każda próbka krwi została nałożono warstwowo na powierzchnie mediów do separacji za pomocą insertu 6 według wynalazku opisanego powyżej.

W kolejnym kroku wszystkie probówki wirowano z prędkością 700 g (przy minimalnym przyspieszeniu i bez aktywnego hamowania) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W procesie wirowania na gradiencie gęstości, krew rozdzielono na cztery frakcje: osocze, jednojądrzaste białe krwinki (PBMC), białe krwinki o jądrze segmentowanym (PMN), i czerwonek krwinki. Czystość frakcji PBMC i PMN została potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość PBMC i PMN w ich frakcjach wynosiła odpowiednio 95% i 92%. Komórki PBMC i PMN były niewykrywalne we frakcji osocza. Wyizolowane osocze, PBMC i PMN były odpowiednie do dalszych analiz, w tym, ale nie ograniczając się do analizy: RNA, mikro-RNA, DNA mitochondrialnego, DNA jądrowego, białka i fenotypowania komórek.

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Insert do pojemnika do wirowania, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości, zwłaszcza cieczy stanowiących zawiesiny i/lub płyny biologiczne, znamienny tym, że insert jest wyposażony jest w przegrodę (7) dzielącą wnętrze pojemnika (1) na co najmniej dwie komory w układzie wertykalnym - komorę górną (2) oraz komorę dolną (3), przy czym przegroda (7) posiada otwór (4), do którego przylega prowadnica (12), po której spływają ciecze, zwłaszcza płyn biologiczny, do komory dolnej (3) pojemnika (1) do wirowania.

2. Insert według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadnicę (12) stanowi wewnętrzna ściana pojemnika (1), spirala, lejek lub pionowe elementy w kształcie wydłużonego walca.

3. Insert według zastrz. 1, znamienny tym, że przegrodę (7) stanowią dwa przylegające do siebie powierzchnie z otworami, zwłaszcza w kształcie spłaszczonych krążków dopasowanych do przekroju pojemnika (1) o przekroju poprzecznym zbliżonym do koła, przy czym powierzchnie są ze sobą ruchomo połączone, mogą być względem siebie dowolnie ustawiane umożliwiając zamykanie światła otworów (4).

4. Insert według zastrz. 1 znamienny tym, że komora górna (2) może posiadać dodatkowo pionową przegrodę (11) lub przegrody dzielące ją na podkomory (10), przy czym każda z podkomór (10) posiada otwór (4, 5).

5. Pojemnik (1) do wirowania zawierający insert (6) do pojemnika (1) do wirowania, zwłaszcza do probówki, do rozdziału cieczy na frakcje o pożądanym zakresie gęstości metodą wirowania na gradiencie gęstości, zwłaszcza cieczy stanowiących zawiesiny lub płyny biologiczne, przy czym urządzenie to wyposażone jest w przegrodę (7) dzielącą wnętrze pojemnika (1) na komorę górną (2) oraz komorę dolną (3), przy czym przegroda (7) posiada otwór (4), a przy otworze znajduje się prowadnica (12), po której spływają płyny, zwłaszcza płyn separowany, do komory dolnej (3) pojemnika (1) do wirowania.