CN106906184A - 一种促进肿瘤细胞生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括如下步骤：将肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养。本发明通过将CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子与肿瘤细胞共培养，意外发现，肿瘤细胞显著增长，相比于原来培养的效果，肿瘤细胞的增长数量高出了一倍；本发明的方法可用于肿瘤细胞的培养，实验方法简单易行，为肿瘤细胞用于其他研究奠定了基础。

Description

一种促进肿瘤细胞生长的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种促进肿瘤细胞生长的方法。
背景技术
IL15为白介素15，通常情况下用于NK细胞，树突状细胞和CD8细胞的先天免疫力和后天获得应性免疫力的激活过程，作为免疫调节剂可以增强体内免疫细胞(如：T细胞和NK细胞)的免疫活性。IL15可以结合IL15受体，比如：IL15受体α又名CD215，IL15受体β又名CD122和IL2受体γ又名CD132，阳性细胞。IL15的作用方式通过结合亲和力最高的CD215分子形成一个IL15-CD215复合物，随后这个复合物会把IL15呈递给CD122或者CD132阳性的免疫细胞(如：T细胞和NK细胞)进而激活CD122或者CD132阳性的免疫细胞发挥免疫监控和调节作用。
Chenoweth MJ等在《Journal of Immunology:baltimore,Md:》，2012，188(9):4149中发表了“IL-15Can Signal via IL-15Ra,JNK,and NF-kB To Drive RANTESProduction by Myeloid Cells”，其公开报道过IL15可以刺激CD45+CD215+细胞分泌RANTES，但是该研究未能联系IL15通过作用于CD45+CD215+细胞促进肿瘤细胞生长。
P Marra等在《Cancer Research》，2014 Sep 1；74(17):4908-21.doi:10.1158/0008-5472.CAN-14-0637发表了“IL15RA Drives Antagonistic Mechanisms of CancerDevelopment and Immune Control in Lymphocyte-Enriched Triple-Negative BreastCancers”，其中公开报道IL15可以激活CD215阳性细胞同时抑制CD215阳性凋亡最终促进CD215阳性细胞的生长，但是该研究未能联系IL15通过作用于CD215阳性细胞促进肿瘤细胞生长。
H Kuniyasu等在《Clinical Cancer Research》，2003，9(13):4802-10中发表了“Production of Interleukin 15 by Human Colon Cancer Cells Is Associated withInduction of Mucosal Hyperplasia,Angiogenesis,and Metastasis”，其中公开报道了表达IL15的肿瘤细胞能促进血管生成最终增强肿瘤细胞的转移，但是该研究未能联系IL15通过作用于CD215阳性细胞促进肿瘤细胞生长。
Moutih Rafei等在《Blood》，2007 109:2234-2242中发表了“AGMCSF and IL-15fusokine leads to paradoxical immunosuppression in vivo via asymmetrical JAK/STAT signaling through the IL-15 receptor complex”，公开了将IL15和GM-CSF融合形成一个新的复合物，这个复合物能显著促进肿瘤细胞生长，但是该研究未能联系IL15通过作用于CD215阳性细胞促进肿瘤细胞生长。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种促进肿瘤细胞生长的方法，通过IL15细胞因子促进CD45+CD215+细胞分泌促肿瘤细胞生长细胞因子，从而促进肿瘤细胞的生长。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种促进肿瘤细胞生长的方法，包括如下步骤：将肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养。
本发明中IL15通过刺激CD45+CD215+细胞分泌细胞因子IGF1，而IGF1作用于肿瘤细胞，最终促进肿瘤细胞生长。因此，通过将CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子与肿瘤细胞共培养，能够明显促进肿瘤细胞的生长，
根据本发明，所述肿瘤细胞为肺癌细胞，具体为A549肿瘤细胞。
根据本发明，所述CD45+CD215+细胞来自于小鼠体内，优选为第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，本发明中所述第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-来自于专利201310089275.2。
本发明中，所述CD45+CD215+细胞的制备方法是常规的流式细胞仪分选方法，具体步骤如下：
1)脱颈处死第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，随后浸泡在75％的酒精里面消毒杀菌15分钟；
2)在无菌环境取出小鼠的脾脏后在75％的酒精里浸泡消毒杀菌5分钟；
3)取出脾脏在无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)里洗去多余的75％酒精；
4)将脾脏置于100目的筛网，在3-5mL的PBS中研磨，制备成单细胞悬液；
5)把脾脏细胞转移到离心管中，300g离心5分钟；
6)弃上清加3-5mL的红细胞裂解液(eBioscience)，室温裂解5分钟；
7)加5mL PBS中和红细胞裂解液，300g离心5分钟；
8)弃上清，根据说明书孵育CD215-PE(eBioscience)和CD45-APC抗体(eBioscience)30分钟，再用10mLPBS洗去多余的抗体；
9)在分选型流式细胞仪(Beckman Coulter)里分选出CD45+CD215+细胞,分选出来的细胞用培养基重悬作为备用样本细胞。
根据本发明，经过不同CD45+CD215+细胞与肿瘤细胞在含有IL15培养基共培养的结果，所述CD45+CD215+细胞与所述肿瘤细胞的比例为(150-460):1，例如可以是150:1、155:1、160:1、165:1、170:1、175:1、180:1、185:1、190:1、195:1、200:1、205:1、210:1、220:1、230:1、240:1、250:1、260:1、270:1、280:1、290:1、300:1、310:1、320:1、330:1、340:1、350:1、360:1、370:1、380:1、390:1或400:1，优选为(180-350):1，进一步优选为300:1。
根据本发明，所述CD45+CD215+细胞的接种密度为(1-5)×104/mL，例如可以是1×104/mL、1.2×104/mL、1.5×104/mL、2×104/mL、2.5×104/mL、3×104/mL、3.5×104/mL、4×104/mL、4.5×104/mL或5×104/mL，优选为(1-3)×104/mL，进一步优选为2×104/mL。
根据本发明，所述IL15细胞因子的接种密度为50-600ng/mL，例如可以是50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、230ng/mL、250ng/mL、260ng/mL、280ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、380ng/mL、400ng/mL、420ng/mL、450ng/mL、480ng/mL、500ng/mL、520ng/mL、550ng/mL、580ng/mL或600ng/mL，优选为100-500ng/mL。
根据本发明，所述共培养的培养基包括1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素双抗(P/S)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，所述共培养的培养基为1640培养基、体积比为10％胎牛血清、体积比为1％青霉素/链霉素双抗和20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
根据本发明，所述共培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。
根据本发明，所述共培养的湿度为90-98％，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，优选为92-97％，进一步优选为95％。
根据本发明，所述共培养的CO2浓度为2-10％，例如可以是2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，优选为3-6％，进一步优选为5％；
根据本发明，所述共培养的时间为110-150h，例如可以是110h、112h、115h、120h、122h、125h、128h、130h、132h、135h、138h、140h、142h、145h、148h或150h，优选为115-130h，进一步优选为120h。
根据本发明，所述共培养的过程需要每1-4天进行半换液，例如可以是1天、2天、3天或4天，优选为1-3天进行半换液，进一步优选为2天进行半换液。
作为优选技术方案，所述促进肿瘤细胞生长的方法包括如下步骤：
(1)共培养的前一天在96孔板内种入25-35个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)用1640培养基、体积比为10％胎牛血清、体积比为1％青霉素/链霉素双抗、20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的培养基重悬的CD45+CD215+细胞，控制密度在(1-5)×104/mL；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入重悬的CD45+CD215+细胞80-120μL和IL15细胞因子50-600ng/mL；
(4)在温度35-40℃、湿度90-98％和CO2浓度2-10％下进行培养110-150h，培养期间每1-4天采用新鲜的培养基进行半换液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)发明人意外发现，当采用CD45+CD215+阳性细胞与肿瘤细胞进行共培养后，肿瘤细胞数量显著增长，相比于普通培养基培养，肿瘤细胞的数量增长了1倍以上；
(2)本发明的方法可用于肿瘤细胞的培养，实验方法简单易行，为肿瘤细胞用于其他研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明方法共培养肿瘤细胞的结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备CD45+CD215+细胞
所述CD45+CD215+阳性细胞的制备方法如下：
1)脱颈处死第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-，随后浸泡在75％的酒精里面消毒杀菌15分钟；
2)在无菌环境取出小鼠的脾脏后在75％的酒精里浸泡消毒杀菌5分钟；
3)取出脾脏在无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)里洗去多余的75％酒精；
4)将脾脏置于100目的筛网，在3-5mL的PBS中研磨，制备成单细胞悬液；
5)把脾脏细胞转移到离心管中，300g离心5分钟；
6)弃上清加3-5mL的红细胞裂解液(eBioscience)，室温裂解5分钟；
7)加5mL PBS中和红细胞裂解液，300g离心5分钟；
8)弃上清，根据说明书孵育CD215-PE(eBioscience)和CD45-APC抗体(eBioscience)30分钟，再用10mLPBS洗去多余的抗体；
9)在分选型流式细胞仪(Beckman Coulter)里分选出CD45+CD215+细胞,分选出来的细胞用培养基重悬作为备用样本细胞。
实施例2：肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养
(1)共培养的前一天在96孔板内种入30个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)用1640培养基、体积比为10％FBS、体积比为1％P/S、20ng/mL GM-CSF组成的培养基重悬的CD45+CD215+细胞，控制密度在2×104/mL；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入重悬的CD45+CD215+细胞100μL和IL15细胞因子500ng/mL；
(4)在温度37℃、湿度95％和CO2浓度5％下进行培养120h，培养期间每2天采用新鲜的培养基进行半换液。
(5)培养120小时后，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；
(6)加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；
(7)孵育结束后，检测450nm的吸光值。
实施例3：肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养
(1)共培养的前一天在96孔板内种入25个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)用1640培养基、体积比为10％FBS、体积比为1％P/S、20ng/mL GM-CSF组成的培养基重悬的CD45+CD215+细胞，控制密度在1×104/mL；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入重悬的CD45+CD215+细胞120μL和IL15细胞因子50ng/mL；
(4)在温度35℃、湿度90％和CO2浓度2％下进行培养150h，培养期间每4天采用新鲜的培养基进行半换液。
(5)培养120小时后，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；
(6)加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；
(7)孵育结束后，检测450nm的吸光值。
测量得到的吸光值与实施例2一致，后续试验都采用实施例2的方法制备的肿瘤细胞。
实施例4：肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养
(1)共培养的前一天在96孔板内种入35个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)用1640培养基、体积比为10％FBS、体积比为1％P/S、20ng/mL GM-CSF组成的培养基重悬的CD45+CD215+细胞，控制密度在5×104/mL；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入重悬的CD45+CD215+细胞80μL和IL15细胞因子600ng/mL；
(4)在温度40℃、湿度98％和CO2浓度10％下进行培养120h，培养期间每1天采用新鲜的培养基进行半换液。
(5)培养120小时后，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；
(6)加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；
(7)孵育结束后，检测450nm的吸光值。
测量得到的吸光值与实施例2一致，后续试验都采用实施例2的方法制备的肿瘤细胞。对比例1：肿瘤细胞的培养
(1)共培养的前一天在96孔板内种入30个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)配置1640培养基、体积比为10％FBS、体积比为1％P/S、20ng/mL GM-CSF组成的培养基；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入步骤(2)所述培养基100μL；
(4)在温度37℃、湿度95％和CO2浓度5％下进行培养120h，培养期间每2天采用新鲜的培养基进行半换液。
(5)培养120小时后，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；
(6)加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；
(7)孵育结束后，检测450nm的吸光值。
对比例2：肿瘤细胞与IL15细胞因子共培养
(1)共培养的前一天在96孔板内种入30个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)配置1640培养基、体积比为10％FBS、体积比为1％P/S、20ng/mL GM-CSF组成的培养基；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入步骤(2)所述培养基100μL和IL15细胞因子500ng/mL；
(4)在温度37℃、湿度95％和CO2浓度5％下进行培养120h，培养期间每2天采用新鲜的培养基进行半换液；
(5)培养120小时后，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；
(6)加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；
(7)孵育结束后，检测450nm的吸光值。
对比例3：肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞共培养
对比例3与实施例2的不同仅在于步骤(3)不加入IL15细胞因子，其他的培养方法和条件都与实施例2相同。
将实施例2和对比例1-3培养后的结果进行紫外分光光度计分析，具体的检测步骤为：将培养120小时后的培养液，用无菌PBS轻轻涮洗肿瘤细胞；加入100μL CCK8试剂，于温度37℃，湿度95％和5％CO2培养箱内孵育1-4小时；孵育结束后，检测450nm的吸光值。结果如图1所示，可以看出实施例2的吸光值最大，并且实施例2的吸光值为对比例1和对比例的2倍，说明实施例2中的肿瘤细胞数是对比例1和对比例2中肿瘤细胞的2倍。
综上所述，当采用CD45+CD215+阳性细胞与肿瘤细胞在含有IL15的培养基进行共培养后，肿瘤细胞数量显著增长。相比于普通培养基培养和肿瘤细胞与含有IL15的培养基培养和肿瘤细胞的数量增长了1倍以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种促进肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤细胞与CD45+CD215+细胞和IL15细胞因子共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为肺癌细胞；
优选地，所述CD45+CD215+细胞来自于小鼠体内，优选为第三代免疫缺陷小鼠NOD-scid-IL2Rγ-/-。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述CD45+CD215+细胞与所述肿瘤细胞的比例为(150-460):1，优选为(180-350):1，进一步优选为300:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述CD45+CD215+细胞的接种密度为(1-5)×104/mL，优选为(1-3)×104/mL，进一步优选为2×104/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述IL15细胞因子的接种密度为50-600ng/mL，优选为100-500ng/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述共培养的培养基包括1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；
优选地，所述共培养的培养基为1640培养基、体积比为10％胎牛血清、体积比为1％青霉素/链霉素双抗和20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述共培养的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，所述共培养的湿度为90-98％，优选为92-97％，进一步优选为95％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述共培养的CO2浓度为2-10％，优选为3-6％，进一步优选为5％；
优选地，所述共培养的时间为110-150h，优选为115-130h，进一步优选为120h；
优选地，所述共培养的过程需要每1-4天进行半换液，优选为1-3天进行半换液，进一步优选为2天进行半换液。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)共培养的前一天在96孔板内种入25-35个肿瘤细胞，过夜培养；
(2)用1640培养基、体积比为10％胎牛血清、体积比为1％青霉素/链霉素双抗、20ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的培养基重悬的CD45+CD215+细胞，控制密度在(1-5)×104/mL；
(3)培养前挑选出孔内肿瘤细胞数量为25-35的孔用于共培养，加入重悬的CD45+CD215+细胞80-120μL和IL15细胞因子50-600ng/mL；
(4)在温度35-40℃、湿度90-98％和CO2浓度2-10％下进行培养110-150h，培养期间每1-4天采用新鲜的培养基进行半换液。
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