CN101988049A - 共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及涉及一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法。所说的转基因细胞能稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的转基因细胞BaF3细胞。它可通过下述方法制备：利用PCR技术扩增了小鼠Rae-1ε基因和小鼠膜表达型的IL-15基因，将它们分别插入到真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点，获得重组载体，将重组载体转染小鼠肿瘤细胞株BaF3，经抗生素筛选和流式细胞仪分选后，获得转基因细胞。该转基因细胞可为IKDC提供三重的刺激信号，作为体外高效扩增和活化IKDC的工具。此外，该转基因细胞还可以用于抗肿瘤的免疫治疗研究。

Description

共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和小鼠视黄酸早期转录因子1ε（retinoic acid early transcript 1ε，Rae-1ε）基因的转基因细胞及其制备方法。

背景技术

最近发现的一类能够分泌IFN-γ并具有杀伤功能的新型树突状细胞亚群（IFN-γ producing killer dendritic cells，IKDC）兼具NK细胞和树突状细胞（dendritic cells ，DC）的表面标记和功能。已有的研究表明，IKDC直接杀伤肿瘤细胞后，可进一步将肿瘤细胞衍生的肿瘤抗原提呈给T细胞，从而启动抗肿瘤的适应性免疫应答。因此，IKDC在肿瘤的免疫治疗中具有良好的应用前景。目前获取IKDC主要有两种方法，一是直接分选法：取小鼠相应的淋巴组织，制备成单细胞悬液，通过流式细胞仪（FACS）的方法直接分选获得CD11cdimB220⁺NK1.1⁺CD49b⁺的IKDC。但是，IKDC在小鼠体内的含量极少，只占脾脏CD11c⁺细胞的1-2%（约5000个）和骨髓CD11c⁺细胞的2%，用直接分选法获得的IKDC数量远远不能满足过继免疫治疗所需的细胞数。另一种是体外用白细胞介素15（IL-15）扩增IKDC：首先常规培养骨髓来源的DC，然后利用磁珠分选法富集CD49b⁺细胞，再从CD49b⁺细胞中FACS分选出CD11c^dimB220⁺NK1.1⁺的IKDC，最后将IKDC与饲养细胞和重组的IL-15共培养，通过饲养细胞反式提呈IL-15，扩增IKDC，这种体外扩增IKDC的方式不仅操作繁琐，而且饲养细胞反式递呈IL-15只作用于邻近细胞，缺少递呈的靶向性，实验数据也显示对IKDC扩增效率比较低（仅能出现10-30倍的数量增长）。因此，如何体外高效扩增IKDC，成为基于IKDC过继免疫治疗的关键因素。

发明内容

本发明通过Rae-1ε /NKG2D的“搭桥”作用（给肿瘤细胞BaF3转染Rae-1基因），将肿瘤细胞和IKDC紧密连接在一起，同时给肿瘤细胞转染小鼠膜型IL-15（mbIL-15）基因，使肿瘤细胞膜上表达IL-15，从而靶向性反式递呈IL-15，达到高效刺激IKDC增殖的目的。

本发明所采用的技术方案是：首先通过PCR技术克隆小鼠Rae-1ε基因，然后利用重叠PCR技术将小鼠CD8α分子的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码序列和CD8α的跨膜区和胞内区的编码序列拼接起来，获得膜表达型IL-15的编码基因（命名为mb15）。将Rae-1ε基因和mb15基因分别插入真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点中，构建成重组真核表达载体pV/mb15/RAE-1ε。将pV/mb15/RAE-1ε用脂质体转染法转染BaF3细胞，通过潮霉素筛选以及FACS分选的方法，获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的BaF3细胞，命名为BaF3/mb15/RAE。

本发明方法制备的转基因细胞具备以下的优点：1. 提高了扩增IKDC的靶向性：该转基因细胞可通过其表面的Rae-1ε靶向性作用于表达活化型受体NKG2D的IKDC。2. 简化体外IKDC扩增的操作步骤：可用该转基因细胞直接扩增常规骨髓来源的DC，然后再通过FACS分选经扩增后的IKDC，不仅操作步骤减少而且富集率高。3. 经济：该转基因细胞表达膜型IL-15，用于扩增IKDC时，不需要购买商品化的重组IL-15。4. 实用性强：该转基因细胞除了可以诱导IKDC的活化和增殖外，也可应用于其他既表达NKG2D，又依赖于IL-15生长的细胞的活化和增殖，如NK细胞。5. 延伸性强：可在已经获得的转基因细胞的基础上，再转入其他的关键分子，如共刺激分子，赋予该转基因细胞新的功能。

附图说明

图1 是重组质粒pV/mb15/RAE-1ε的构建策略。

图2是BaF3/mb15/RAE细胞促进NK细胞高分泌IFN-γ

免疫磁珠法分选脾脏NK细胞与BaF3细胞或BaF3/mb15/RAE 细胞共培养，24小时后收集培养上清。（A）利用CBA技术检测上清中IFN-γ的分泌水平。（B）IFN-γ的分泌量以mean±SD的方式表示，*P<.05。

图3是 BaF3/mb15/RAE细胞促进NK细胞增殖

图示的刺激细胞与NK细胞共培养，1、3、5天后收集细胞，用APC标记的抗NK1.1抗体、FITC标记的抗CD3抗体和7-AAD 染色，FACS法计算CD3^-NK1.1⁺7-AAD^-的活细胞数。

具体实施方式

有关原材料说明：

1.      CD8α cDNA为已经发表的序列（NCBI序列号：BC030679）。

2.      IL-15 cDNA为已经发表的序列（NCBI序列号：NM_008357）。

3.      RAE-1ε cDNA为已经发表的序列（NCBI序列号：FJ594067）。

4.      pVITRO2-mcs、pcDNA3.1(+)和pORF9-mIL-15真核表达载体为 Invitrogene 公司的产品。

5.      含RAE-1ε cDNA的载体pMX-pie由美国加利福尼亚大学 Lewiss L Lanier 教授馈赠。

 6.     pcDNA3/RAE-1ε由本室构建。可向公众提供20年。具体构建过程如下：用PCR技术扩增RAE-1ε基因，上下游引物序列如下：5'-CAGGGTACCATGGCCAAGGCAGCAGTGACCAA-3'（SEQ ID NO：8）和5' -TAAGCGGCCGCTCACATCGCAAATGCAAATGCAAATAAT-3'（SEQ ID NO：9），上游引物5'端引入Kpn I酶切位点，下游引物5'端引入Not I酶切位点。以质粒pMX-pie为模板扩增RAE-1ε基因。用Kpn I和Not I对回收纯化的RAE-1ε基因进行双酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点中Kpn I和Not I酶切位点之间，得到含RAE-1ε基因的重组载体，命名为pcDNA3/RAE-1ε。

7.      Primer STAR??PCR扩增试剂盒为大连宝生物公司的产品。

 8.     小鼠原B细胞（BaF3）购自上海麦莎公司。

（一）重组真核表达载体pV/mb15/RAE-1ε的构建

(1) 用PCR技术扩增RAE-1ε的编码基因。

上下游引物序列如下:5'-CACAGATCTATGGCCAAGGCAGCAGTGACCAA -3'（SEQ ID NO：1）和5'- GCCCTCGAGTCACATCGCAAATGCAAATGCAA -3'（SEQ ID NO：2），上游引物5'端引入Bgl II酶切位点，下游引物5'端引入Xho I酶切位点。以质粒pcDNA3/RAE-1ε为模板作为模板扩增RAE-1ε基因。

 (2)用重叠PCR技术扩增膜型IL-15的编码基因。

第一步PCR：上游引物P1为5'-ATGGCCTCACCGTTGACCCGCTTTCTG

TCGCTGAACCTGCTGCTGCTGGGTAACTGGATAGATGTAAGATATGACC-3' （SEQ ID NO：3），其5'端引入编码CD8α信号肽 的cDNA片段;下游引物P2为5'-AGACCCGCCTCCACCGGACGTGTTGATGAACATTT-3'（SEQ ID NO：4），其5' 端引入5个氨基酸长度的Linker编码序列。以含小鼠IL-15基因的质粒pORF9-mIL-15为模板扩增。

第二步PCR：上游引物P3为：5'-GGTGGAGGCGGGTCTATTTACATCTGG

GCACCCT -3'（SEQ ID NO：5），其5'端引入5个氨基酸长度的Linker编码序列;下游引物P4为：5'- ACTGTCGACTTACACAATTTTCTCTGAAGGTCT -3'（SEQ ID NO：6），其5'端引入Sal I酶切位点。提取CD8α⁺ T细胞的总RNA，通过RT-PCR方法获得CD8α 的全长cDNA，以CD8α 的cDNA为模板扩增。

第三步PCR：上游引物P5为：5'-TCAGGATCCATGGCCTCACCGTTGACCC -3'（SEQ ID NO：7），其5'端引入BamH I酶切位点。下游引物同前述的P4。以第一步和第二步PCR纯化回收的产物为模板进行扩增。扩增产物即膜型IL-15的编码基因。

上述所有PCR的扩增体系均为50μl：5×Primer STAR??缓冲液10 μl， 200 μmol/L dNTPs，200 nmol/L正、反向引物, 50ng 模板DNA，2.5 U Primer STAR??HS DNA聚合酶。PCR程序为98℃预变性2 min，98℃ 变性10 s ， 68℃退火和延伸 1min，共30个循环，最后一次延伸68℃ 7min。所有扩增产物均用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化。

 (3) pV/mb15/RAE-1ε的构建

用BamHI和Sal I对回收纯化的膜型IL-15的编码基因进行双酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pVITRO2-mcs多克隆位点1中BamHI和Sal I酶切位点之间，得到表达膜型IL-15的重组载体，命名为pV/mb15。

用Bgl II 和Xho I对回收纯化的RAE-1ε基因进行双酶切，经Agarose Gel DNA Purification kit回收纯化后，亚克隆入pV/mb15多克隆位点2中Bgl II 和Xho I酶切位点之间，得到双表达膜型IL-15和RAE-1ε的重组载体，命名为pV/mb15/RAE-1ε。

（二）稳定共表达膜型IL-15和RAE-1ε的转基因细胞的构建

利用脂质体转染法将pV/mb15/RAE-1ε转染入BaF3细胞。具体步骤如下：取对数期的BaF3细胞用无血清培养基洗2 次，于12 孔板中每孔加入2×10⁵ 个细胞，每孔1ml体系。取2μg 的质粒用无血清的培养液稀释至总量50μL , 取4μL 的脂质体用无血清培养基稀释至总量50μL, 两者混合, 微混匀, 室温孵育20 min , 每孔加入100μL的复合物。37 °C 48 h后弃上清，更换含200μg/mL潮霉素的完全培养基继续培养。经2-3周后的潮霉素筛选后，收集细胞，FACS检测BaF3细胞膜表面IL-15和RAE-1ε的表达情况。通过FACS的分选功能收集共表达IL-15和RAE-1ε的BaF3细胞，继续培养。3-4周后再次FACS验证转基因细胞表面IL-15和RAE-1ε的共表达，最终获得稳定共表达膜型IL-15和RAE-1ε的转基因细胞BaF3/mb15/RAE。

（三）转基因细胞的应用

将BaF3/mb15/RAE-1ε细胞与NK细胞共培养，检测其对NK细胞增殖和IFN-γ分泌的影响。具体步骤如下：用丝裂霉素(终浓度30μg/mL)作用于BaF3/mb15/RAE细胞，37°C 1h后，用无菌的PBS洗涤细胞三次，作为刺激细胞备用；利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏来源的NK细胞；将1×10⁵ 个BaF3/mb15/RAE细胞与NK细胞以1：1的比例共培养，24h后收集培养上清，用BD公司的CBA法检测上清中IFN-γ的分泌情况。此外，在共培养后的1d、3d和5d分别收集细胞，用APC标记的抗NK1.1抗体、FITC标记的抗CD3抗体和 7-AAD对细胞进行染色，FACS法检测CD3^-NK1.1⁺7-AAD^-的活细胞数量。以丝裂霉素处理后的BaF3细胞作为对照细胞。结果如图2所示，与BaF3细胞相比，BaF3/mb15/RAE细胞能促进NK细胞分泌更高水平的IFN-γ；此外，与BaF3细胞相比，BaF3/mb15/RAE细胞能明显促进NK细胞的增殖，并且随着培养时间的延长，单独培养的NK细胞和与BaF3共培养的NK细胞逐渐凋亡，而与BaF3/mb15/RAE共培养的NK细胞仍能明显增殖(图3)。

以上结果表明，共表达膜型IL-15和RAE-1ε的BaF3/mb15/RAE转基因细胞，可用于体外高效扩增表达NKG2D的NK细胞，同时增强了NK细胞的生物学活性。该结果为我们进一步利用BaF3/mb15/RAE细胞高效扩增和活化既表达NKG2D，又依赖于IL-15生长的免疫细胞（如IKDC）提供了实验依据，从而为肿瘤的细胞过继免疫治疗提供研究工具。

Claims (2)

1.一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞，其特征在于，是能稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的转基因细胞BaF3细胞。

2.制备权利要求1所述共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞的方法，其特征在于，是先利用PCR克隆小鼠Rae-1ε基因，然后利用重叠PCR将小鼠CD8α分子的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码序列和CD8α的跨膜区和胞内区的编码序列拼接起来，获得膜表达型IL-15的编码基因mb15；将Rae-1ε基因和mb15基因分别插入真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点中，构建成重组真核表达载体pV/mb15/RAE-1ε；再将pV/mb15/RAE-1ε用脂质体转染法转染BaF3细胞，通过潮霉素筛选以及FACS分选的方法，获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的转基因细胞。

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